NGHIÊN cứu ẢNH HƯỞNG của một số ELICITOR lên KHẢ NĂNG TÍCH lũy SOLASODINE ở tế bào IN VITRO của cây cà GAI LEO (solanum hainanense hance)

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY
SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA
CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

HUẾ - 2016


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY
SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA
CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance)

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật
Mã số: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc
2. PGS.TS. Cao Đăng Nguyên

HUẾ - 2016


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi, các số liệu và
kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa
từng được công bố trong bất kỳ công trình khác. Những tài liệu tham khảo có nguồn
gốc rõ ràng.
Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Thừa Thiên Huế, tháng 9 năm 2016
Tác giả

Nguyễn Hữu Thuần Anh


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và
sâu sắc nhất đến Thầy giáo GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tâm
giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận án và cả trong cuộc sống hàng ngày. Xin trân trọng cám ơn thầy giáo
PGS.TS. Cao Đăng Nguyên đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực
hiện luận án.
Tôi xin chân thành cám ơn Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh
học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã tạo điều kiện cho tôi được

thực hiện luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp,
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn
2011-2014) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô giáo, các anh chị em đồng
nghiệp, các anh chị em học viên, sinh viên đã động viên, quan tâm và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình làm luận án. Đặc biệt cảm ơn các tác giả có tên trong
các bài báo khoa học đã công bố đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình tiến
hành các thí nghiệm của luận án.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình tôi đã luôn luôn giúp
đỡ, động viên và khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần.
Xin trân trọng cảm ơn!

Nguyễn Hữu Thuần Anh


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chư ng . TỔNG QUAN T I LIỆU ......................................................................4
1.1 SẢ

XUẤT

P

ẤT T Ứ ẤP TỪ

U

ẤY T B

T Ự

V T .........................................................................................................................4
1.1 1

ác phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật ................................................5

1.1 2 Sản xuất các hợp chất thứ cấp ....................................................................7
113

ác nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp b ng nuôi cấy tế bào thực vật....10

12 Ứ

T RĐ

ẤT T Ứ ẤP TR

U

Ả T

ẤY T B

Ả

T

Y

P

T Ự V T ..........................13

1.2.1. Elicitor ......................................................................................................13
1.2.2. Nghiên cứu ứng dụng elicitor trong nuôi cấy tế bào thực vật ..................18
13

Y

........................................................................................22

1 3 1 Đặc điểm sinh học ....................................................................................22
1.3 2

ác nghiên cứu về solasodine ..................................................................25

133

ác nghiên cứu khác trên đối tượng cà gai leo ........................................33

Chư ng 2. ĐỐI TƯ NG NỘI DUNG V PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU .35

21 Đ
22

T

ỨU ........................................................................35
U

ỨU ...........................................................................35

2 2 1 Xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy solasodine của tế bào cà
gai leo. ................................................................................................................35


2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến khả năng sinh trưởng và tích lũy
solasodine của tế bào cà gai leo: ........................................................................35
2.2.3. Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine lên khả năng
ức chế collagenase .............................................................................................36
2.2.4. Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro
của cây cà gai leo. ...............................................................................................36
23 P

P

P

ỨU ..................................................................36

2 3 1 Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật ..........................................36
2 3 2 Phương pháp h a sinh ..............................................................................38

2 3 3 X l số liệu .............................................................................................39
Chư ng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................40
31 S

TR Ở

V T

YS

S

ỦA T BÀO CÀ GAI LEO....40

3 1 1 Sinh trưởng của tế bào ..............................................................................40
3 1 2 Tích lũy solasodine của tế bào .................................................................41
3.2. Ả

ỞNG CỦA ELICITOR

S

TR Ở

V

T

Y

SOLASODINE CỦA T BÀO CÀ GAI LEO ......................................................42
3.2.1. Ảnh hưởng của methyl jasmonate ............................................................42
3.2.1.1. Nồng độ methyl jasmonate ................................................................42
3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy .............................................................................44
3.2.1.3. Thời điểm cảm ứng ............................................................................46
3.2.3. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men .........................................................47
3.2.3.1. Nồng độ dịch chiết nấm men .............................................................47
3.2.3.2. Thời gian nuôi cấy .............................................................................49
3.2.3.3. Thời điểm cảm ứng ............................................................................50
3.2.4. Ảnh hưởng của salicylic acid ...................................................................52
3.2.4.1. Nồng độ salicylic acid ........................................................................52
3.2.4.2. Thời gian nuôi cấy .............................................................................53
3.2.4.3. Thời điểm cảm ứng ............................................................................55
3.2.5. Ảnh hưởng kết hợp của các elicitor..........................................................56
3.2.5.1. Nồng độ các elicitor ...........................................................................56


3.2.5.2. Thời gian nuôi cấy .............................................................................58
3.2.5.3. Thời điểm cảm ứng ............................................................................59
3.3. KHẢ

S TS

B

HOẠT TÍNH CỦA SOLASODINE TỪ DỊCH CHI T

T BÀO CÀ GAI LEO ..........................................................................................60
3.4. QUY TRÌNH SẢN XUẤT SOLASODINE HI U SUẤT CAO TỪ T BÀO
IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHI M ........61

3.4.1. Nuôi cấy tạo nguyên liệu ..........................................................................61
3.4.1.1. Nuôi cấy cây in vitro ..........................................................................61
3.4.1.2. Nuôi cấy tạo callus .............................................................................62
3.4.1.3. Nuôi cấy tạo tế bào huyền phù ...........................................................62
3.4.2. Nuôi cấy sản xuất solasodine ...................................................................63
3.4.3. Thu sinh khối tế bào và tách chiết solasodine ..........................................63
Chư ng 4. B N LUẬN ...........................................................................................66
41 S
4.2. Ả

TR Ở

V T

YS

S

.........................................66

ỞNG CỦA METHYL JASMONATE ............................................66

4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ methyl jasmonate ..............................................67
4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian x lý methyl jasmonate ...................................68
4.3. Ả

ỞNG CỦA DỊCH CHI T NẤM MEN ...........................................70

4.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết nấm men ...........................................70
4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian x lý dịch chiết nấm men ................................72

4.4. Ả

ỞNG CỦA SALICYLIC ACID ......................................................73

4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ salicylic acid .....................................................74
4.4.2. Ảnh hưởng của thời gian x lý salicylic acid ...........................................76
4.5. Ả

ỞNG PH I H P CÁC ELICITOR ................................................76

4.6. SO SÁNH HI U QUẢ GIỮA CÁC ELICITOR ...........................................78
KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ .....................................................................................81
DANH MỤC C C CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

:

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA

:

benzyladenine

BAP

:

benzylamino purine

cs

:

cộng sự

HCTC

:

hợp chất thứ cấp

HPLC

:

high performance liquid chromatography (sắc ký lỏng
hiệu năng cao)

IAA

:

indole-3-acetic acid

KIN

:

kinetin

KTST

:

kích thích sinh trưởng

MeJA

:

methyl jasmonate

MS

:

Murashige and Skoog (1962)

NAA

:

naphthaleneacetic acid

SA

:

salicylic acid

YE

:

yeast extract (dịch chiết nấm men)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

Tên bảng

bảng
1.1

Trang

Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so sánh với cây tự
nhiên

10

1.2

Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp

14

1.3

Tổng hợp một số loài Solanum sinh ra solasodine

28

3.1

Ảnh hưởng của MeJ lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo

43

3.2

3.3

3.4
3.5
3.6

3.7

3.8
3.9

3.10

3.11

3.12

Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng tích lũy solasodine của tế
bào cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm x l MeJ

50 µM lên sinh trưởng

của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng
tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của Y lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của YE lên khả năng tích lũy solasodine của tế bào
cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh
trưởng của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng tích
lũy solasodine của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của S lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của SA lên khả năng tích lũy solasodine của tế bào
cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM S

lên sinh trưởng

của tế bào cà gai leo

Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng tích
lũy solasodine của tế bào cà gai leo

43

46

47
48
48

51

51
52
52

55

55


3.13

3.14

3.15

3.16

3.17

Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor lên sinh trưởng và tích
lũy solasodine của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor lên sinh trưởng và tích lũy
solasodine của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM S và 3 g/ Y đến
khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM S

và 3 g/ Y đến

khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo
Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên
collagenase

56

57

60

60

61


DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ SƠ ĐỒ
Số hiệu
hình

1.1
1.2
2.1
3.1

Tên hình, biểu đồ s đồ

Trang

Cấu trúc hóa học của solasodine

25

on đường khả thi tổng hợp steroid trong thực vật cải tiến từ của
Kaneko và cs (1976)
Cây cà gai leo in vitro
Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo không x

26
35

lý

elicitor sau 7 tuần nuôi cấy

40

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo
3.2

trong môi trường không x lý elicitor sau 4 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L

41

2,4-D; tốc độ lắc 150 vòng/phút
3.3

Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo không x
lý elicitor sau 7 tuần nuôi cấy

42

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo
3.4

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0
mg/L 2,4-D bổ sung 50 µM MeJA (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc

44

độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy
3.5

3.6

Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM
MeJA sau 7 tuần nuôi cấy
Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
50 µM MeJA sau 7 tuần nuôi cấy

45

45

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo
3.7

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0
mg/L 2,4-D bổ sung 3 g/L YE (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc độ

49

lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy
3.8

Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L
YE sau 7 tuần nuôi cấy

49


3.9

Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
3g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy

50

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo

3.10

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0
mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA (lúc bắt đầu nuôi cấy) với tốc

53

độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy
3.11

3.12

Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150
µM SA sau 7 tuần nuôi cấy
Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
150 µM SA sau 7 tuần nuôi cấy

54

54

(a) Dịch huyền phù tế bào và (b) sinh khối tươi tế bào cà gai leo
3.13

trong môi trường MS có 40 g/L sucrose; 0,1 mg/L BAP và 1,0
mg/L 2,4-D bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE (lúc bắt đầu nuôi

57

cấy) với tốc độ lắc 150 vòng/phút sau 4 tuần nuôi cấy

3.14

3.15

Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150
µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy
Đường cong tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo khi bổ
sung 150 µM SA và 3 g/L YE sau 7 tuần nuôi cấy

58

59

3.16

Cây cà gai leo in vitro trong môi trường S0 sau 4 tuần nuôi cấy

61

3.17

Callus cà gai leo in vitro trong môi trường S2 sau 4 tuần nuôi cấy

62

3.18
3.19
3.20

Tế bào cà gai leo nuôi cấy trong môi trường S3 tốc độ lắc 150

vòng/phút
Dịch chiết solasodine
Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế
bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm

63
64
65


MỞ ĐẦU
T nh ấp thi t

ađ t i

Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để s dụng trong y học cổ truyền, làm nguyên
liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu Trong đ , trên 2/3 khối lượng này được
khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Khối lượng
dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa
vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đ , còn nhiều loài dược liệu
khác vẫn được thu hái, s dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa c những con
số thống kê cụ thể [10].
Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) còn gọi là cà quạnh, cà gai dây,
cà quýnh, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b’rongoon (Ba

a), c tên khoa học khác là

Solanum procumben Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae) [18]. Trong thành phần h a
học của cà gai leo, solasodine là hợp chất chính, đây là một steroid alkaloid được
tìm thấy ở khoảng 250 loài cây khác nhau thuộc họ

chúng thường tồn tại ở dạng glycoside

à, đặc biệt là chi Solanum,

ác nghiên cứu trước đây cho thấy

solasodine c hoạt tính kháng viêm và bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư (đặc
biệt là ngăn ngừa ung thư da) Solasodine còn là tiền chất để sản xuất các loại
corticosteroid, testosteroid và thuốc tránh thai

goài ra, chúng còn c tác dụng

chống oxy h a, ngăn ngừa xơ gan [14]. Gần đây, nghiên cứu cho thấy solasodine
còn có tác dụng bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở người như Herpes simplex,
H. zoster và H. genitalis (Chating và cs), bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của
vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu… [64].
Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai leo được khai thác chủ yếu từ nguồn
hoang dại, chúng thường phân tán manh múm và chất lượng không đồng đều, trữ
lượng có giới hạn và hiện đang cạn kiệt do bị thu hái bừa bãi. Vì thế, nguồn nguyên
liệu này không đủ để đáp ứng cho việc nghiên cứu và điều trị.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt
nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật Phương pháp này với
những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong thời
1


gian ngắn, hàm lượng hợp chất thứ cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy
trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học
trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những kh khăn n i trên [63].
licitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ

vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC
trong tế bào đ [65]. Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung
elicitor vào môi trường nuôi cấy là phương thức để thu được các sản phẩm HCTC
có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. S dụng các elicitor sinh học và phi
sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy tế bào vừa có thể rút
ngắn thời gian lại đạt năng suất cao [42]. Nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù có
bổ sung elicitor đã được thực hiện thành công ở một số đối tượng như cây nhân sâm
(Panax ginseng) [60], [99], rau má (Centella asiatica) [57], giây dác (Cayratia
trifolia) [87], sen tuyết (Saussurea medusa) [106], [112], Pueraria tuberosa [80] …
Các elicitor thường được s

dụng trong các nghiên cứu là methyl jasmonate

(MeJA), salicylic acid (SA), dịch chiết nấm men (YE), jasmonic acid (JA), ethrel,
chitosan... [57], [62], [65].
Hiện nay đã c một số nghiên cứu sản xuất glycoalkaloid toàn phần nói
chung và solasodine nói riêng từ cây cà gai leo, tuy nhiên hiệu suất chưa cao
Nghiên cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid toàn phần trong callus cà gai leo cho
thấy hàm lượng đạt cao nhất 128,17 mg/g khối lượng khô sau 7 tuần nuôi cấy [56].
Các tác giả cũng đã khảo sát khả năng tích lũy solasodine trong tế bào cà gai leo và
kết quả cho thấy hàm lượng cao nhất thu được là 121,01 mg/g khối lượng khô sau 4
tuần nuôi cấy [59]. Những nghiên cứu này đều thu được kết quả là hàm lượng
glycoalkaloid toàn phần hay solasodine trong callus và tế bào đều cao hơn so với
cây tự nhiên, tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao S dụng các elicitor thực vật có thể
cải thiện được vấn đề này.
Xuất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng c a một
số elicitor lên khả năng t h lũy solasodine ở t bào in vitro c a cây cà gai leo
(Solanum hainanense Hance).

p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù

tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự
2


nhiên cho các nghiên cứu trong lĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở
cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế bào để ứng dụng
trong lĩnh vực dược phẩm sau này.
M

tiêu

ađ t i

Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế
bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).
Ý ngh a hoa họ v thự tiễn

Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá
trị về khả năng tích lũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung
các elicitor Đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và
giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học b ng con đường nuôi cấy tế
bào thực vật.
Đề tài là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất
hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu b ng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào
việc bảo vệ và chăm s c sức khỏe cộng đồng.
Những đ ng g p

ới

a luận n

Đây là một trong những công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ảnh
hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế
bào cà gai leo. Kết quả của luận án là đáng tin cậy và có thể s dụng để tiếp tục
nghiên cứu phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn
Ph

vi nghiên ứu
Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí

nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học,
Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014

3


Chư ng .
TỔNG QUAN T I LIỆU
1. . SẢN

UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NUÔI CẤY TẾ B O

THỰC VẬT
Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện in vitro c định
hướng thành những cấu trúc biệt h a hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính
toàn năng của tế bào thực vật [42].
Nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng lớn trong việc cải thiện khả năng tổng
hợp các HCTC có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không

thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp b ng phương pháp h a
học. Sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được
mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này

u điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào

thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn
lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các HCTC
từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều HCTC được sản xuất trong suốt
quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng
phân h a cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không
xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp c khuynh hướng ngưng tạo
thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi
cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có
sự tiếp xúc với môi trường khác các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện
ở một mức độ nào đ trong khối để tạo thành các HCTC [7].
Nuôi cấy tế bào thực vật sinh trưởng chậm hơn so với vi khuẩn, thời gian
nhân đôi trong khoảng 24-72 giờ. Sự khác nhau này dẫn đến việc phải s dụng các
điều kiện vô trùng tuyệt đối cho nuôi cấy tế bào thực vật Thông thường, tế bào nuôi
cấy không quang hợp, vì vậy phải bổ sung đường làm nguồn carbon Đây là nguồn
năng lượng hiệu quả nhất để sản xuất HCTC. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào nhanh
4


hơn so với nuôi cấy callus hay mô, cơ quan; thao tác dễ dàng và có khả năng tương
thích với các thiết bị nuôi cấy tế bào s dụng cho vi sinh vật [79].
1.1.1. C

phư ng ph p nu i ấy t

o thực vật

1.1.1.1. Nuôi cấy mẻ
Nuôi cấy mẻ là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian nuôi cấy
không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sinh khối hay sản phẩm
cuối cùng của quá trình trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trường thay đổi
theo thời gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy
mẻ được xem là một hệ thống đ ng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo
một số pha nhất định với những điều kiện đặc trưng [8].
Trước khi nuôi cấy mẻ, cần thiết phải tiến hành cấy chuyển. Quá trình nuôi
cấy đầu tiên trong bình tam giác, sau đ tế bào nuôi cấy được đưa vào hệ lên men
nhỏ, rồi cấy chuyển vào hệ lên men lớn hơn

ứ tiếp tục như vậy cho đến khi đạt

được thể tích thích hợp Điều kiện bên trong hệ lên men sẽ thay đổi trong một chu
kỳ nuôi cấy mẻ, với sản phẩm và nồng độ tế bào tăng trong khi chất dinh dưỡng cạn
kiệt dần

hưng không c thành phần nào được bổ sung vào trong chu kỳ nuôi cấy.

Tất cả mẻ nuôi cấy sẽ được thu hồi khi sản phẩm thứ cấp đạt giá trị cực đại [8].
Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc với tốc độ 50-200 vòng/phút hoặc
có thể nuôi cấy trong hệ lên men có cánh khuấy và sục khí tạo thuận lợi cho sự trao
đổi khí, sự lưu thông của môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cũng như gia tăng
sự tiếp xúc giữa tế bào nuôi cấy với môi trường Trong đ , nuôi cấy dịch huyền phù
chứa các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng.
Thường khởi đầu b ng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng
chuyển động (lắc hoặc khuấy) [8].

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những
chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch
huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các
mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng c những dịch huyền
phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ

5


tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và
có thể điều chỉnh b ng cách thay đổi thành phần môi trường [63].
1.1.1.2. Nuôi cấy mẻ

đ ạn

Phương pháp nuôi cấy mẻ hai giai đoạn được áp dụng đối với nhiều loại tế
bào thực vật, và thành công đầu tiên là sản xuất hợp chất shikonin Trong phương
pháp này, hai môi trường được s dụng. Trong hệ lên men đầu tiên, điều kiện nuôi
cấy được tối ưu h a cho sản xuất sinh khối tế bào Sau đ , các tế bào được tập trung
và đưa vào hệ lên men thứ hai chứa môi trường kích thích sự tổng hợp các sản
phẩm thứ cấp [8].
1.1.1.3. Nuôi cấy mẻ có cung cấp d

dưỡng

Đây là một hình thức khác của hệ thống nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào nuôi cấy
sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này các chất dinh
dưỡng mới sẽ được cung cấp thêm vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ
Trong hệ lên men này, có hệ thống điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được
thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng hoặc sự tích lũy

T

Tuy nhiên, trong trường hợp này thể tích dịch nuôi sẽ tăng lên, môi trường dinh
dưỡng dưới dạng đậm đặc sẽ được s dụng để hạn chế vấn đề này Đây vẫn được
gọi là nuôi cấy mẻ vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng vẫn được thu hồi
theo từng mẻ [8].
1.1.1.4. Nuôi cấy liên tục
hược điểm của nuôi cấy mẻ là tốn thời gian kh trùng và cấy chuyển. Nuôi
cấy liên tục là phương pháp kinh tế hơn vì giúp kéo dài thời gian nuôi cấy hay kéo
dài pha log ít nhất vài tháng. Ở hệ thống này, dòng đi vào (môi trường mới) b ng
với dòng đi ra (môi trường + tế bào và hợp chất trao đổi) để giữ thể tích luôn không
đổi, và điều kiện của hệ thống luôn duy trì ổn định [79].
Do vậy, trong phương pháp nuôi cấy liên tục không những kích thước trung
bình, trạng thái sinh lý của tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và
không phụ thuộc vào thời gian, điều này một mặt tạo điều kiện nghiên cứu sinh
trưởng và sinh lý của tế bào, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất tế bào ở qui mô
công nghiệp [8].
6


Bản chất của quá trình nuôi cấy liên tục ở trạng thái ổn định cũng c thuận
lợi do dễ dàng điều chỉnh hơn hệ lên men mẻ. Trong suốt thời gian nuôi cấy mẻ,
nhiệt lượng, sự sản xuất kiềm hoặc acid, và sự tiêu hao oxygen sẽ biến thiên từ các
tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới tốc độ rất cao trong suốt pha log muộn. Vì vậy, điều
chỉnh môi trường của một hệ thống như thế kh hơn nhiều so với quá trình liên tục
ở trạng thái ổn định các tốc độ sản xuất và tiêu thụ là h ng số [79].
Về lý thuyết, nuôi cấy liên tục là phương pháp nuôi cấy đầy triển vọng để thu
được các sản phẩm với nồng độ cao; Seki và cs (1997), Phisalaphong và Linden
(1999) đã nghiên cứu tăng hiệu suất paclitaxel b ng nuôi cấy liên tục tế bào Taxus

cuspidata và s dụng nuôi cấy bán liên tục tế bào T. canadensis [94].
Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chế trong nuôi cấy liên tục. Các tế bào luôn ở
trạng thái sinh l không đổi, nhưng sự tích lũy các HCTC thường diễn ra trong các
tế bào có tốc độ sinh trưởng thấp. Vì vậy, kỹ thuật này chỉ nên áp dụng cho những
sản phẩm trao đổi nào được sản xuất trong quá trình sinh trưởng. Nhược điểm thứ
hai của nuôi cấy liên tục là thời gian nuôi cấy dài làm tăng khả năng dễ bị nhiễm bởi
vi sinh vật (Ramawat và Merillon, 2004).
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện và sản xuất
các hoạt chất sinh học có giá trị. Khả năng ứng dụng của phương pháp này thể hiện
qua việc có rất nhiều công trình nghiên cứu mới được công bố. Những năm gần đây,
sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi
nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này, đặc biệt là khả năng c thể thay đổi nguồn lợi
các hoạt chất sinh học từ thực vật b ng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào

u thế về

mặt nguyên lý của công nghệ này là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để
tách chiết một tỷ lệ lớn lượng dược chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].
1.1.2. Sản uất
1.

h p hất thứ ấp
p

ấ

ấp

Hiện tượng trao đổi chất thứ cấp đã được công nhận từ giai đoạn sớm của thí
nghiệm thực vật hiện đại. Trong công trình xuất bản năm 1873, Julius Sachs, một

người tiên phong trong sinh lý thực vật, đã mô tả như sau: " húng ta c thể chỉ rõ
các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất như là các hợp chất được tạo ra bởi
7


trao đổi chất, nhưng chúng không chỉ được s dụng cho việc hình thành các tế bào
mới. Vai trò quan trọng khác của những hợp chất này đối với việc kiểm soát bên
trong thực vật vẫn chưa được biết đến" Sachs không đề cập đến những chức năng
của các sản phẩm phụ mà ngày nay được biết đến là các HCTC (dẫn theo
Neumannn, 2009) [66].
Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một lượng nhỏ (nhỏ hơn 1%
trọng lượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và phát triển của thực vật.
Mặc dù vai trò của

T dường như không được thừa nhận trong việc duy trì quá

trình sống cơ bản của thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng lại có vai trò
quan trọng trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường. Nghiên cứu chất trao
đổi thứ cấp thực chất là lĩnh vực hấp dẫn của sinh lý học thực vật nói riêng hay thực
vật học nói chung [66].
Các HCTC có tác dụng dược lý hoặc độc tính đến con người và động vật
được gọi là các hoạt chất sinh học ở thực vật. Hoạt chất sinh học điển hình ở thực
vật cũng được hình thành như các HCTC [27].
1.1.2.2. Vai trò củ
H T

p

ấ

ấp

được sản xuất trong cơ thể thực vật bên cạnh con đường sinh tổng

hợp và chuyển h a sơ cấp của các hợp chất đích trong quá trình sinh trưởng và phát
triển (như carbohydrate, amino acid, protein và lipid)

húng c thể được xem như

là những sản phẩm hóa sinh "dự trữ" trong tế bào thực vật và không cần thiết cho
các chức năng hàng ngày của cây. Trong hệ thống phát sinh loài, hoạt chất sinh học
thứ cấp ở thực vật được tổng hợp một cách ngẫu nhiên nhưng chúng có những vai
trò nhất định. Một số trong chúng có khả năng nắm giữ các vai trò quan trọng trong
đời sống thực vật. Ví dụ, flavonoid có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do được sinh
ra trong quá trình quang hợp; terpenoid có thể thu hút côn trùng thụ phấn, phát tán
hạt, hoặc ức chế cạnh tranh giữa các loài thực vật; alkaloid giúp tránh sự tấn công
của động vật ăn cỏ hoặc các loại côn trùng (phytoalexin). HCTC còn có tác dụng
phát tín hiệu phân t tế bào hoặc mang những chức năng khác trong cơ thể thực vật.
Việc sản xuất các HCTC ở thực vật thường tuân theo quy luật

o đ , hầu hết các

loài thực vật, ngay cả những loài cây lương thực phổ biến cũng c khả năng sản
8


xuất những loại hợp chất này. Tuy nhiên, các loài thực vật c độc tính hoặc dược
tính điển hình chứa những hoạt chất sinh học mạnh với nồng độ cao hơn so với các
loại cây lương thực [27].
Tế bào thực vật đã được s dụng thành công như là một nhà máy sản xuất

lượng lớn

T dưới các điều kiện cụ thể [66]. Sản xuất HCTC b ng nuôi cấy tế

bào thực vật giúp khắc phục những kh khăn của phương pháp truyền thống như
rút ngắn thời gian, giảm chi phí nhân công, vấn đề mặt b ng và nhất là có thể thu
được một lượng lớn sản phẩm như mong muốn. Ngày nay, phương pháp này đã
được ứng dụng rộng rãi trên quy mô lớn và ngày càng có nhiều nghiên cứu chuyên
sâu nh m điều khiển để tăng hàm lượng các

T tích lũy trong tế bào thực vật

được nuôi cấy.
Các nghiên cứu cho thấy r ng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất
các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đ được chiết từ cây
ngoài tự nhiên (Bảng 1.1) [63].
u điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng
tin cậy dựa trên cơ sở:
- Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các yếu
tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng.
- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên.
- Chọn giống cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn
- Với việc tự động h a, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển
hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên.
- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.
- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng
cao hơn cây hoàn chỉnh [64].

9

Bảng 1.1. Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so sánh với cây tự nhiên [63]
Hiệu suất (% dw)
HCTC

Loài thực vật

Nuôi cấy
t bào

Cây tự nhiên

Shikonin

Lithospermum erythrorhizon

20,00 (s)

1,50

Ginsenoside

Panax ginseng

27,00 (c)

4,50

Anthraquinones

Morinda citrifolia

18,00 (s)

2,20

Ajmalicine

Catharanthus roseus

1,00 (s)

0,30

Rosmarinic acid

Coleus blumeii

15,00 (s)

3,00

Ubiquinone-10

Nicotiana tabacum

0,036 (s)

0,0003

Diosgenin

Dioscorea deltoides

2,00 (s)

2,00

Berberine

Thalictrurn minor

10,00 (s)

0,01

Berberine

Coptis japonica

10,00 (s)

2,00-4,00

Anthraquinone

Galium verum

5,40 (s)

1,20

Anthraquinone

G. aparbze

3,80 (s)

0,20

Nicotine

N. tabacum

3,40 (c)

2,00

Bisoclaurine

Stephania cepharantha

2,30 (s)

0,80

Tripdiolide

Tripterygium wilfordii

0,05 (s)

0,001

* Chú thích: (c): nuôi cấy callus; (s): nuôi cấy huyền phù.
1.1.3. C

nghiên ứu sản uất h p hất thứ ấp

ng nu i ấy t

o thự vật

ư

1.

Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, mô thực vật ngoại sinh từ cây
hoàn chỉnh được nuôi cấy huyền phù trong điều kiện vô trùng. Nhiều sản phẩm trao
đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn
trong cây hoàn chỉnh [42]. Các HCTC không chỉ là gia vị, chất tạo màu, tạo mùi mà
hầu hết là dược liệu.
Ở nước ta, một số dược liệu cũng được nghiên cứu tách chiết từ tế bào thực
vật. Chẳng hạn, vincristin, vinblastin từ tế bào dừa cạn, solasodine từ tế bào cà gai
leo, curcumin từ tế bào nghệ đen, asiaticoside từ tế bào rau má …
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một trong những loài cây dược liệu
10


chứa nhiều alkaloid. Từ dừa cạn người ta chiết được các chất chữa ung thư như

vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin Tuy nhiên, hàm
lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp Bùi Văn ệ và Nguyễn Ngọc
Hồng (2006) đã nghiên cứu khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số chất kích thích
sinh trưởng lên quá trình tạo sinh khối tế bào và tích lũy alkaloid toàn phần có trong
dịch nuôi cấy [5].
Solasodine là một hợp chất chính trong cây cà gai leo (S. hainanense) có
nhiều tác dụng dược l đã được nghiên cứu và công bố Solasodine được tách chiết
từ cây tự nhiên nhưng hàm lượng chưa cao và nguồn nguyên liệu ngày càng khan
hiếm. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2010) đã nghiên cứu sản xuất solasodine từ callus
cây cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine tích lũy
trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi
[56]. Nhóm tác giả này (2011) cũng tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy tế bào cà gai leo
trong chai tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine tích lũy trong tế bào
cao hơn trong callus [59].
Asiaticoside là hoạt chất chính của rau má (Centella asiatica), có hoạt tính
chống oxy hóa, chữa lành vết bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp
collagen [7]. Mặc dù có nhiều hoạt tính quan trọng nhưng hàm lượng asiaticoside
trong cây rau má không đáng kể. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên cứu
tạo callus và khảo sát khả năng tích lũy asiaticoside trong callus cây rau má [6].
Thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù cây rau má và khảo sát sự tích lũy asiaticoside
trong tế bào nuôi cấy cũng đã được Loc và An (2010) nghiên cứu [55].
Quinone là một nhóm chức nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư,
chữa phong, chống hen suyễn

được xác nhận có trong thành phần của Drosera

burmanni, là một loài thực vật bắt mồi nhỏ, thân thảo, mang nhiều giá trị ứng dụng.
Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền
phù tế bào cây D. burmanni cho mục tiêu thu nhận quinone. Kết quả ghi nhận hàm
lượng Plumbagin (một trong nhóm những hợp chất naphthoquinone) trong sinh khối

tế bào là 0,02% [11].
Dịch chiết các loài Drosera đã từng được chứng minh về khả năng kháng
11


oxy hóa từ rất nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như từ khả năng trị liệu trong
những bài thuốc dân gian. Quách Ngô Diễm Phương và cs (2011) đã sàng lọc và ly
trích thành công một hợp chất flavonoid từ phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng
oxy hóa từ sinh khối cây D. indica nuôi cấy in vitro. Hợp chất được tinh sạch và xác
định cấu trúc là quercetin [13].
ư c

1.

Một số dược chất có nguồn gốc thực vật như mao địa hoàng từ Digitalis
purpurea chữa trị rối loạn tim mạch, codeine từ cây anh túc (Papaver somniferum)
làm thuốc giảm đau, an thần, vinblastine và vincristine từ cây dừa cạn (C. roseus)
điều trị bệnh bạch cầu và quinine từ cây C. officinalis bệnh sốt rét. Routian và
Nickell nhận được b ng sáng chế đầu tiên về sản xuất một số hợp chất b ng nuôi
cấy tế bào thực vật vào năm 1956

hiều nhà nghiên cứu đã sản xuất các hợp chất

có ích b ng nuôi cấy rễ tơ, callus và tế bào huyền phù. Sự đa dạng của các nguyên
liệu thực vật có thể thích ứng với nuôi cấy rễ tơ và callus

uôi cấy tế bào huyền

phù Thalictrum minus sản xuất stomachic và berberine. Nuôi cấy callus Stizolobium
hassjo sản xuất thuốc chữa parkinson L-dopa. Nuôi cấy huyền phù Hyoscyamus

niger sản xuất một dẫn xuất của hyoscyamine chống tác động kiểu cholin [94].
gười ta cũng đã thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây cà phê
(Coffea arabica), betalain trong callus củ cải đường, berberin từ tế bào cây Coptis
japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể
berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần b ng phương
pháp nuôi cấy tế bào). Những chất này được s dụng rộng rãi trong công nghiệp
hương liệu và trong y học [92].
Rễ của cây nhân sâm (P. ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có tác
dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể... Trong rễ của
nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau Trong đ , ginsenoside-Rb có
hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích Furuya và cs (Đại học Kitasato,
Nhật) đã nghiên cứu nuôi cấy mô callus P. ginseng từ những năm 1970

aisha

(1990) đã nghiên cứu quy trình sản xuất trên quy mô lớn, s dụng nhiều kiểu hệ lên
men khác nhau

ăm 1990, Staba (Đại học Minnesota, Mỹ) cũng đã thu được các tế
12


bào nuôi cấy P. ginseng chứa ginsenoside

hoi (1993) đã nghiên cứu nuôi cấy P.

ginseng trên quy mô công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới
hàm lượng saponin trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin
tổng số được tìm thấy trong callus nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung
5,00 mg/L 2,4-

và 1,00 mg/

, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên

môi trường có 10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (dẫn theo Misawa, 1994) [63].
Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và thân trên môi trường B5 bổ sung
2 mg/L 2,4- hoặc

òng tế bào được tạo ra từ callus c nguồn gốc từ thân và lá

Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và nuôi trong 6 tuần thì
cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol [64].
hất tanshinone và cryptotanshinone của cây Salvia miltiorrhiza c tác dụng
ngăn ngừa biến chứng thiếu máu cục bộ ở cơ tim; tanshinone

đã th nghiệm thành

công trong điều trị lâm sàng chứng đau thắt ngực ở Trung Quốc Vincristine và
vinblastine được sản xuất b ng nuôi cấy tế bào ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus)
là các indole alkaloid đã trở thành thuốc c giá trị trong h a trị liệu ung thư (theo
Vijaya, 2010) [103].
1.2. ỨNG DỤNG ELICITOR ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY H P
CHẤT THỨ CẤP TRONG NUÔI CẤY TẾ B O THỰC VẬT
1.2.1. Elicitor
1.
licitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ
vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC
trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng
hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor [65].

licitor bao gồm các chất c nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ
thực vật b ng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh). Trên cơ sở bản chất tự nhiên,
elicitor c thể được phân thành 2 nh m là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học
- Elicitor p

s

là các chất c nguồn gốc không thuộc sinh vật học,

gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật l như s ng siêu âm, áp
suất, nhiệt độ, và p
13