Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt Diclophenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

Đặng Thị Hiền

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO NHŨ TƢƠNG
NHỎ MẮT DICLOFENAC VÀ BƢỚC ĐẦU
ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA CHẾ PHẨM
Chuyên ngành:
Công nghệ dƣợc phẩm và Bào chế thuốc
Mã số: 62720402

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC

Hà Nội, năm 2016


Công trình đã đƣợc hoàn thành tại:
Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội.
Bộ môn Vật lý - Hóa lý Trường Đại học Dược Hà Nội
Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội
Viện Kiểm nghiệm, nghiên cứu dược và trang thiết bị Y tế quân đội
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Trần Linh
PGS.TS. Nguyễn Văn Long

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường
Họp tại:
Vào hồi

giờ

ngày

Có thể tìm hiểu luận án tại:

tháng

năm 2016.

- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Đại học Dược Hà Nội.


CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
ADC
AIC
AUC
AUMC
BCS
CĐDH
CDH
Cmax

Acid diclofenac
The Akaike information criterion

The area under the curve (Diện tích dưới đường cong)
Area under the first moment curve (Diện tích dưới đường
cong ở thời điểm đầu).
Biopharmaceutical Classification System (Bảng phân loại sinh
dược học)
Chất đồng diện hoạt
Chất diện hoạt
Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa)

GP

Công thức bào chế
Chỉ tiêu chất lượng
Công thức tối ưu
Dược chất
Dung dịch
Đồng nhất hóa
Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc – thực
phẩm)
Giải phóng

GPDC

Giải phóng dược chất

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)

HQC

High quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ cao)

IPM
IVIVC

Isopropyl myristat
In vitro – in vivo correlation (tương quan in vitro – in vivo)

KTG
LC-MS

Kích thước giọt
Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối
phổ)

CTBC
CTCL
CTTƯ
DC
DD
ĐNH
FDA


LLOQ

Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới)

LQC

Lower quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp)

MCT

Medium-chain triglycerides (triglycerid có acid béo mạch
trung bình)
Middle quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ
trung bình)
Mean residence time (Thời gian lưu trung bình)
Môi trường
Môi trường phân tán
Natri diclofenac
Nano nhũ tương

MQC
MRT
MT
MTPT
NaDC
NNT
PdI
RSD
SD
SKD
TCCS
TEM
Tmax

Polydispersity index (chỉ số đa phân tán)

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)
Standard deviation (Độ lệch chuẩn)
Sinh khả dụng
Tiêu chuẩn cơ sở
Transmission electron microscopy (Hiển vi điện tử truyền
qua)
Maximum time (Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa)


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Công nghệ nano đã và đang tạo ra một cuộc cách mạng lớn trong bào
chế thuốc hiện đại. Sử dụng công nghệ nano để thiết kế các hệ phân phối
thuốc mới đã tạo nên sự phát triển của ngành y học, hứa hẹn những tiến bộ
đột phá trong điều trị và chẩn đoán. Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp
dược phẩm Việt Nam, các chế phẩm được bào chế theo công nghệ nano vẫn
còn mới mẻ và chưa được ứng dụng vào sản xuất.
Diclofenac là một DC điển hình của nhóm NSAIDs, có khả năng
ngăn chặn sự co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm
viêm và đau trong tổn thương biểu mô giác mạc sau phẫu thuật. Diclofenac
là một dược chất có độ hòa tan kém, các chế phẩm thuốc nhỏ mắt
diclofenac hiện có trên thị trường chủ yếu ở dạng dung dịch có hiệu quả
điều trị không cao.
NNT là một trong số các hệ bào chế có cấu trúc nano đã và đang
nhận được sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh, NNT làm tăng tỉ lệ hấp thu thuốc vào các mô
bên trong mắt, tăng thời gian lưu thuốc trước giác mạc, cải thiện SKD và
hiệu quả điều trị tại mắt. Các nghiên cứu cũng chỉ ra đây là hệ phân phối
thuốc tại mắt tiềm năng cho các DC thuộc nhóm II, III trong bảng phân loại
sinh dược học (BCS).

Chính vì vậy, nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt chứa
diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm là vấn đề cấp
thiết, có ý nghĩa khoa học, góp phần phát triển nghiên cứu, bào chế thuốc
theo công nghệ nano ở Việt Nam.
Mục tiêu của luận án
1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ
mắt diclofenac 0,1% ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Nâng quy mô bào chế, dự thảo được tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ
ổn định cho nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1%.

1


3. Đánh giá được sinh khả dụng của chế phẩm trên thỏ thí nghiệm và
bước đầu thiết lập được tương quan in vitro – in vivo của chế phẩm.
Những đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam, nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac được
tiến hành nghiên cứu tương đối đầy đủ: từ lựa chọn công thức bào chế, xây
dựng quy trình bào chế, nâng quy mô, dự thảo tiêu chuẩn cơ sở, nghiên cứu
độ ổn định, đánh giá SKD in vivo trên súc vật đến thiết lập tương quan
in vitro – in vivo. Luận án đã có những đóng góp mới như sau:
- Xây dựng công thức và quy trình bào chế cơ bản nano nhũ tương
nhỏ mắt diclofenac bằng thiết bị siêu âm, thiết bị siêu âm kết hợp đồng nhất
hóa áp suất cao, thiết bị phân cắt tốc độ cao.
- Xây dựng mô hình đánh giá SKD của chế phẩm nano nhũ tương
nhỏ mắt chứa diclofenac trên mắt thỏ. Mô hình này cho thấy, chế phẩm có
khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc và làm tăng thấm dược
chất qua giác mạc nên cải thiện SKD của chế phẩm hơn so với dạng dung
dịch đối chiếu.
- Xây dựng mô hình và thiết lập tương quan in vitro – in vivo. Tương

quan sau khi thiết lập được ứng dụng trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho
chế phẩm và có thể sử dụng để nghiên cứu phát triển sản phẩm, kiểm soát
chất lượng sản phẩm.
Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 149 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục, 58
bảng, 37 hình, 165 tài liệu tham khảo. Bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang),
tổng quan (32 trang), nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp
nghiên cứu (21 trang), Kết quả nghiên cứu (73 trang), Bàn luận (20 trang),
Kết luận, đề xuất (2 trang), Danh mục các công trình đã công bố liên quan
đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang).

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. THÔNG TIN VỀ DƢỢC CHẤT ACID DICLOFENAC
1.1.1. Công thức hóa học

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid diclofenac
1.1.2. Đặc tính lý hóa
 Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng hoắc gần trắng, hơi hút ẩm, rất
ít tan trong nước, độ tan phụ thuộc pH. Tan tốt trong dầu thực vật.
 Tính chất hóa học:
- Tính acid yếu, pKa = 4,0.
1.1.3. Tác dụng, chỉ định
Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid - NSAIDs, có tác
dụng ức chế tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo ra tác dụng chống viêm, giảm
đau mạnh.
Hiện nay trên thị trường mới chỉ có DD thuốc nhỏ mắt chứa NaDC.
Chỉ định: DD nhỏ mắt 0,1% NaDC giảm đau các tổn thương biểu mô do

chấn thương, phẫu thuật, điều trị viêm sau phẫu thuật, các bệnh viêm mạn
tính không lây nhiễm, ngăn ngừa thu hẹp đồng tử trong phẫu thuật đục thủy
tinh thể, giảm các triệu chứng do viêm màng kết mạc.
1.2. NANO NHŨ TƢƠNG .
1.2.1. Khái niệm
NNT là hệ phân tán siêu vi dị thể, có phân bố KTG nằm trong
khoảng từ 20 - 500 nm, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan,
trong đó một chất lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được
phân tán vào chất lỏng thứ hai là MTPT (pha ngoại, pha liên tục), được ổn
định bằng CDH và CĐDH.

3


1.2.2. Thành phần
NNT được hình thành bởi sự hòa trộn của pha dầu, pha nước, CDH,
CĐDH và một số thành phần khác.
1.2.3. Kỹ thuật bào chế nano nhũ tƣơng
1.2.3.1. Kỹ thuật phân tán hay nhũ hóa sử dụng năng lượng cao
Kỹ thuật này có thể được thực hiện trên các thiết bị như: thiết bị
ĐNH phân cắt tốc độ cao, thiết bị ĐNH áp suất cao, thiết bị siêu âm.
1.2.3.2. Kỹ thuật tự nhũ hóa hay nhũ hóa sử dụng năng lượng thấp
Bao gồm các phương pháp: phương pháp điểm đảo pha, phương pháp
nhiệt độ đảo pha, phương pháp tự nhũ hóa
1.2.4. Đặc tính của nano nhũ tƣơng
Các đặc tính quan trọng của NNT bao gồm phân bố KTG và chỉ số
đa phân tán, đặc tính động học, hiệu điện thế bề mặt (thế zeta), độ nhớt.
1.2.5. Ƣu nhƣợc điểm của nano nhũ tƣơng
Ƣu điểm: Tăng độ tan của dược chất, tăng sự ổn định của dược chất, bảo
vệ dược chất khỏi sự thủy phân và oxy hóa, tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng, tác

dụng tại đích, tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng được trên nhiều đường
dùng. Tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng được trên nhiều đường dùng.
Nhƣợc điểm: Sử dụng nồng độ cao chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt. Độ
ổn định bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH, khó khăn trong quá trình bảo quản.
1.3. NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT
1.3.1. Đặc điểm cấu tạo của mắt liên quan đến hấp thu dƣợc chất.
Mắt cấu tạo bởi 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong. Các yếu tố
trước giác mạc cộng với thời gian tiếp xúc với màng hấp thu ngắn là lý do
chính làm cho lượng thuốc được hấp thu vào các mô bên trong thấp hơn 5%
tổng lượng thuốc được đưa vào.
1.3.2. Một số nghiên cứu về nano nhũ tƣơng nhỏ mắt
NNT dùng cho nhãn khoa được nghiên cứu với nhiều các hợp chất
khác nhau như: dorzolamid, ganciclovir, flurbiprofen axetil, acetazolamid,
azithromycin, timolol maleat. Các kết quả nghiên cứu đều chứng minh sự
cải thiện SKD của dạng thuốc NNT so với các dạng thuốc thông thường.

4


1.3.3. Đánh giá sinh khả dụng của nano nhũ tƣơng trên mắt
1.3.3.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro
- Màng GP: màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có giới hạn KLPT
thường 12 - 14 kDa; đôi khi sử dụng màng lọc cellulose acetat với kích
thước lỗ lọc thường là 0,2 µm.
- Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 hoặc DD
nước mắt nhân tạo. Môi trường khuếch tán được điều nhiệt, duy trì ở một
khoảng nhiệt độ thích hợp và được khuấy trộn với tốc độ nhất định.
- Nhiệt độ: 34 ± 0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) hoặc 37 ± 0,5ºC.
- Thiết bị đánh giá GP thuốc: bình Franz, thiết bị thẩm tách micro
hoặc thiết bị thử hòa tan khác.

1.3.2.2. Đánh giá sinh khả dụng in vivo
Với những thuốc mà đích tác dụng là trong nhãn cầu thì định lượng
DC trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là khu vực trung gian vận
chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt. Đây cũng là phương
pháp được chọn để đánh giá SKD NNT nhỏ mắt diclofenac.
1.3.3.3. Tương quan in vitro – in vivo
Mối tương quan in vitro – in vivo là một mô hình toán học mô tả mối
quan hệ giữa đặc tính in vitro của một dạng bào chế và đáp ứng in vivo
tương ứng. Thông thường, đặc tính in vitro chính là tốc độ và/hoặc mức độ
GPDC và đáp ứng in vivo là nồng độ thuốc trong máu hay lượng thuốc
được hấp thu. Sau khi tương quan được thiết lập, những thông số thu được
từ kết quả nghiên cứu in vitro sẽ dùng để thay thế cho những thông số thu
được từ kết quả nghiên cứu in vivo vốn tiêu tốn rất nhiều tiền của, thời gian,
nhân lực và làm tăng giá thành sản phẩm của thuốc. Kết quả này cũng là cơ
sở xét miễn nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học; cơ sở dùng
để đánh giá ứng dụng của các đặc điểm và phương pháp thử hòa tan; cơ sở
cho kiểm tra chất lượng sản xuất và lựa chọn công thức thuốc thích hợp.

5


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn DĐVN IV, tiêu chuẩn nhà sản xuất, tinh khiết phân tích và dùng cho
HPLC.
2.1.2. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị bào chế và đánh giá tin cậy: máy siêu âm cầm

tay Labsonic®M – Sartorius, máy ĐNH phân cắt Unidriver X1000, máy
ĐNH dưới áp suất cao EmulsiFlex – C5, hệ thống đánh giá GP thuốc qua
màng Hanson Research, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260
Infinite, kính hiển vi điện tử truyền qua EMLab – NIHE, máy đo phân bố
kích thước tiểu phân và thế zeta Zetasizer Nano ZS90.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xây dựng công thức, quy trình bào chế NNT diclofenac
và đánh giá một số đặc tính của chế phẩm.
- Nâng quy mô bào chế, và dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của NNT
nhỏ mắt diclofenac.
- Bước đầu đánh giá SKD của NNT nhỏ mắt diclofenac trên mắt thỏ
thí nghiệm.
- Thiết lập tương quan in vitro – in vivo và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
của chế phẩm NNT nhỏ mắt diclofenac.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp bào chế nano nhũ tƣơng diclofenac
Bước 1: Hòa tan hoàn toàn DC vào pha dầu (dung môi pha dầu, CDH
thân dầu, CĐDH) ở nhiệt độ 60 – 65oC. Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha
nước (dung môi – nước cất pha tiêm, CDH thân nước, CĐDH thân nước, hệ
đệm, chất bảo quản) lên 65 – 70oC. Bước 3: Tiến hành nhũ hóa pha dầu vào
pha nước bằng thiết bị siêu âm hoặc thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất
cao hoặc thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao. Bước 4: Điều chỉnh pH và thể
tích. Bước 5: Lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm để tiệt khuẩn. Bước 6:
Đóng lọ thuốc nhỏ mắt đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm.

6


Với những mẫu cần đánh giá độ vô khuẩn thì pha dầu cần được tiệt
khuẩn bằng nhiệt khô, pha nước được lọc tiệt khuẩn và quy trình 6 bước

được thực hiện trong buồng pha chế vô khuẩn Bioair Topsafe 1.2
2.3.2. Phƣơng pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh
DD đối chiếu là dung dịch thuốc nhỏ mắt NaDC được pha theo CT
tham khảo trong tài liệu Thực tập bào chế.
2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá một số đặc tính của hệ nano nhũ tƣơng
2.3.3.1. Các đặc tính vật lý của hệ nano nhũ tương
a. Phân bố kích thước giọt: Sử dụng máy quang phổ photon ánh sáng
Zetasizer Nano ZS90.
b. Hình thái giọt nhũ tương: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
EMLab – NIHE.
c. Thế zeta: Sử dụng thiết bị đo thế zeta: Zetasizer Nano ZS90.
d. Độ nhớt: Sử dụng nhớt kế Brookfield với đầu đo S1, tốc độ quay là 400
vòng/phút, nhiệt độ đo 25 ± 2oC.
e. Độ bền của hệ: Trong điều kiện thường và điều kiện khắc nghiệt.
2.3.3.2. pH: Thử theo dược điển Việt Nam IV (phụ lục 6.2).
2.3.3.3. Định lượng dược chất trong nano nhũ tương
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện
như sau: Pha tĩnh: Cột InertSustain®C8 (GL Science – Nhật Bản), kích
thước 150 mm × 4,6 mm (octyl silica gel; 5 µm).
 Dung dịch đệm phosphat pH 2,5: pha dung dịch gồm acid phosphoric
0,01 M và natri dihydrophosphat 0,01 M rồi điều chỉnh pH tới 2,5 bằng hai
thành phần này (nếu cần).
 Pha động: hỗn hợp methanol và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ
lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, rồi siêu âm 15 phút. Tốc
độ dòng pha động: 1 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. Detector UV
bước sóng: 276 nm.
 Tiến hành: Chuẩn bị DD chuẩn (NaDC/methanol, 40g/ml), DD thử
(NNT/methanol). Lọc DD chuẩn và thử qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành
sắc ký lần lượt với DD chuẩn và DD thử. Tính nồng độ ADC trong một chế
phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của DD chuẩn, DD thử và

hàm lượng C14H10Cl2NNaO2 trong NaDC chuẩn.

7


2.3.3.4. Phương pháp xác định tỉ lệ dược chất được nhũ tương hóa
Thêm natri clorid đến bão hòa vào 40 ml NNT, rồi tiến hành li tâm
với tốc độ 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 40  2oC, trong 30 phút để tách riêng
2 pha dầu và nước. Định lượng dược chất trong pha nước bằng HPLC
tương tự mục 2.3.3.3.
2.3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro
Sử dụng thiết bị đánh giá sự GP thuốc: bình Franz. Ngăn nhận chứa 7
ml môi trường, ngăn cho là 1 ống trụ tròn, đường kính trong 1 cm, chứa
được 1 ml mẫu.
Điều kiện thử: Màng GP: màng cellulose acetat 0,2 µm hoặc màng
Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12 - 14
kD. Diện tích bề mặt màng khuếch tán: 0,785 cm2. Môi trường khuếch tán:
DD đệm phosphat pH 7,4 (trong nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo:
có thay đổi môi trường, bổ sung CDH, dung môi). Thể tích môi trường
khuếch tán: 7 ml. Nhiệt độ môi trường khuếch tán: 34,0 ± 0,5ºC. Tốc độ
khuấy: 400 vòng/phút. Lượng mẫu NNT đem thử: 1 ml.
Lấy mẫu:
- Lấy mẫu tại thời điểm nhất định, mỗi thời điểm lấy mẫu 1 lần, mỗi
lần 1 ml và đồng thời bổ sung 1 ml môi trường khuếch tán mới.
- Lượng DC GP tại từng thời điểm được xác định bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mẫu lấy xong được tiêm thẳng vào hệ thống sắc
ký.
2.3.3.6. Thử vô khuẩn
Thử theo dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 13.7, Phương pháp màng
lọc).

2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu độ ổn định
Việc khảo sát độ ổn định của thuốc được thực hiện dựa theo Hướng
dẫn của ASEAN với một số điều chỉnh. Cụ thể như sau:
- Đối tượng thử: Mẫu nano nhũ tương diclofenac được đóng trong lọ
thuốc nhỏ mắt bằng HDPE đậy kín.
Điều kiện bảo quản và chu kỳ lấy mẫu kiểm tra: ngăn mát tủ lạnh (5
± 3 oC); điều kiện thực trong phòng thí nghiệm (15 – 35oC; 60 - 90%); lão
hóa cấp tốc (trong tủ vi khí hậu) (40 ± 2oC; 75 ± 5%). Định kỳ (0, 1, 3, 6)
tháng lấy mẫu kiểm tra. Định kỳ khảo sát các chỉ tiêu: tính chất, giới hạn

8


cho phép về thể tích, định tính, định lượng, phần trăm dược chất giải phóng
in vitro theo thời gian, kích thước giọt nhũ tương và PdI, thế zeta, độ nhớt,
pH, độ vô khuẩn, tỷ lệ dược chất được nhũ tương hoá.
2.3.5. Phƣơng pháp thử kích ứng mắt
Thử nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-10: 2002 (E); B.3 “Ocular
Irritation test”.
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu sinh khả dụng
2.3.6.1.Phương pháp định lượng dược chất trong dịch tiền phòng
DC có trong dịch tiền phòng của mắt thỏ sau khi nhỏ DD hoặc NNT
nhỏ mắt diclofenac được định lượng bằng phương pháp HPLC với detector
mảng diod (DAD).
2.3.6.2.Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền
phòng
Quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo
hướng dẫn của FDA về tính chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính,
giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và
khác ngày), độ ổn định của mẫu định lượng.

2.3.6.3.Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học
+ Quy trình xử lý mẫu và phân tích
Do nồng độ acid diclofenac (ADC) trong dịch tiền phòng khá thấp nên
phải thêm chuẩn để ADC trong mẫu đạt nồng độ trong khoảng tuyến tính đã
khảo sát (500 – 8000 ng/ml). Dịch tiền phòng sau đó được ly tâm ở tốc độ
12000 vòng/phút, tách lấy dịch trong rồi định lượng bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao trong các điều kiện sau như mục 2.3.3.3 với thể tích
tiêm mẫu: 50 µL.
+ Quy trình đánh giá sinh khả dụng:
Chuẩn bị 6 lô thỏ, mỗi lô gồm 12 con thỏ có trọng lượng từ 2,5 – 3 kg.
Lần lượt nhỏ vào mắt trái 0,05 ml NNT, nhỏ vào mắt phải 0,05 ml DD. Ghi
lại thời điểm nhỏ thuốc.
Lấy mẫu: Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định.
Lấy mẫu tại 12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10,
20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút. Sử dụng kim tiêm
đường kính 30 gauge. Thể tích dịch tiền phòng lấy ra là 100 μL. Xử lý mẫu
sau đó phân tích bằng phương pháp HPLC.

9


Tính toán và xử lý số liệu: Các thông số dược động học (AUC, AUMC, λz)
được tính toán bằng phương pháp không dựa trên mô hình ngăn với sự trợ
giúp của phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3.
2.3.7. Phƣơng pháp xây dựng tƣơng quan in vitro – in vivo
2.3.7.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường giải phóng tới sự giải
phóng dược chất in vitro
Điều kiện: tương tự mục 2.3.3.2
Mẫu thử: 1 ml nano nhũ tương diclofenac 0,093% pha chế ở quy mô
100 ml theo quy trình được lựa chọn. Màng giải phóng: màng Spectra/Por®

2 Dialysis Membrane. Môi trường khuếch tán: DD đệm phosphat với các
pH khác nhau 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 và có thêm CDH Tween 80, ethanol
làm tăng độ tan của DC, tăng khả năng giải phóng DC.
Lấy mẫu: Lấy mẫu tại thời điểm 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50
phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút, 105 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút, lấy
mẫu một lần, mỗi lần lấy 1mL rồi bổ sung 1mL môi trường khuếch tán mới.
Lượng DC giải phóng từ NNT được xác định bằng phương pháp HPLC.
2.3.7.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng dược chất in vitro
Sử dụng phần mềm Phoenix WinNolin 6.3, khớp các số liệu của từng
môi trường giải phóng và lựa chọn mô hình phù hợp nhất (Hill, Weibull,
Double Weibull, Makoid-Banakar ) trên tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC).
Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất.
2.3.7.3. Thiết lập mô hình tương quan phù hợp
Sử dụng phần mềm Phoenix IVIVC Toolkit 2.2, mối quan hệ giữa
tỷ lệ hấp thu in vivo và tỷ lệ giải phóng in vitro được thiết lập trên các mô
hình sau: Mô hình 1 (PT1): Fabs=AbsScale*Fdiss(Tscale*Tvivo)
Mô hình 2 (PT2): Fabs=AbsScale*Fdiss(Tscale*Tvivo-Tshift)
Mô hình 3 (PT3): Fabs=AbsScale*[Fdiss(Tscale*Tvivo-Tshift)-AbsBase]
Trong đó: Fabs: là (tỷ lệ) giải phóng in vivo dạng NNT so lượng giải
phóng in vivo tối đa của dạng dung dịch; AbsScale: là tỷ lệ quy đổi hấp thu
in vivo với giải phóng in vitro; Fdiss: là tỷ lệ giải phóng in vitro; Tscale: là tỷ
lệ quy đổi thời gian hấp thu in vivo với thời gian giải phóng in vitro; Tvivo:
thời điểm hấp thu in vivo; Tshift: thời gian tiềm tàng; AbsBase: tỷ lệ hấp thu
cơ sở.

10


2.3.8. Phƣơng pháp ghi và xử lý số liệu
Sử dụng các phần mềm Microsoft Excel 2013, SPSS, MODDE 8.0,

INFORM 3.2, FormRules 2.0 và INForm 3.2, Phoenix WinNonlin 6.3,
Phoenix IVIVC Toolkit 2.2.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất trong mẫu nano
nhũ tƣơng và môi trƣờng giải phóng
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu đối với
diclofenac. Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính
giữa giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac. Kết quả khảo sát cho
thấy phương pháp có độ đúng cao với khả năng thu hồi trung bình 100,68%
và độ lệch chuẩn tương đối 1,59% (< 2%). Với điều kiện sắc ký đã chọn,
phương pháp định lượng acid diclofenac có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn
tương đối ở 3 nồng độ đều nhỏ hơn 2%.
3.2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế nano nhũ tƣơng
Nano nhũ tương được tiến hành bào chế theo quy trình mục 2.3.1
bằng các kỹ thuật bào chế khác nhau: kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật siêu âm kết
hợp đồng nhất hóa áp suất cao và kỹ thuật phân cắt tốc độ cao.
3.2.1. Bào chế nano nhũ tương bằng phương pháp siêu âm
3.2.1.1. Xác định công thức bào chế cơ bản của nano nhũ tương
a. Lựa chọn thành phần: Dược chất, tá dược tạo pha dầu, pha nước, CDH,
CĐDH và một số thành phần khác.
b. Xác định khoảng tỉ lệ các thành phần: Dược chất ADC (0,093%, dung
môi pha dầu (2 – 4%), CDH thân nước (2 – 4%), CDH thân dầu (0,5 –
1%), Chất đồng diện hoạt (0,5 – 1,5%), đệm (0,1 – 0,2 mol/l), pH 6,5 –
7,5, glycerin 5%, nước cất pha tiêm vừa đủ 100%.
c. Thiết kế thí nghiệm và kết quả: Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết
kế thí nghiệm theo nguyên tắc hợp tử tại tâm: thu được bảng thiết kế thí
nghiệm gồm 23 công thức.

11

3.2.1.2. Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm
Qua khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm 15 phút để bào chế nano nhũ
tương với quy mô mẻ 100 ml.
3.2.1.3. Xác định quy trình bào chế cơ bản bằng phương pháp siêu âm
Với mỗi công thức, 100 ml NNT được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm
với các bước 1, 2, 4, 5, 6 theo quy trình mục 2.3.1, trong đó:
- Bước 3: Tiến hành ĐNH nhũ tương sử dụng máy siêu âm với tần số
30000 Hz, biên độ 100 µm, siêu âm liên tục trong thời gian 15 phút.
3.2.1.4. Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến đặc
tính vật lý và khả năng giải phóng dược chất in vitro của nano nhũ tương
Phân tích mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập và các biến
phụ thuộc, xử lý số liệu bằng phần mềm FormRules 2.0. Các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng GPDC của NNT: Lượng Span 80 tăng và lượng
Transcutol HP giảm, hỗn hợp Tw 80/Cre EL làm tăng phần trăm giải phóng
của dược chất. Các yếu tố ảnh hưởng tới độ bền của NNT: Khi hệ đệm là
borat thì NNT ADC ổn định nhất. Khoảng pH càng thấp thì độ bền hệ càng
cao, ở pH lớn hơn thì độ bền hệ giảm. Loại dung môi pha dầu là Miglyol,
Labrafac hay IPM ít ảnh hưởng tới độ bền của hệ; tuy nhiên với pha dầu là
Miglyol cho thấy hệ độ bền hệ cao nhất. Các yếu tố ảnh hưởng tới KTG của
NNT: thành phần dầu là IPM ít làm ảnh hưởng tới sự thay đổi KTG, với
thành phần dầu là Miglyol và Labrafac đều làm tăng kích thước giọt tuy
nhiên lượng dầu thay đổi không ảnh hưởng tới KTG. Tỉ lệ chất diện hoạt
thân nước Tw/Cre tăng sẽ làm tăng kích thước giọt. Các yếu tố làm ảnh
hưởng tới thế zeta: thành phần đệm borat với lượng đệm nhỏ cũng làm tăng
thế zeta của hệ nano nhũ tương và làm tăng sự ổn định của hệ. Lượng
Transcutol HP tăng làm tăng nhẹ thế zeta của hệ nhưng không đáng kể.
3.2.1.5. Tối ưu hóa công thức bào chế nano nhũ tương
Lựa chọn được 3 công thức tối ưu khi thay đổi thành phần dầu:

12


Bảng 3.22: Thành phần công thức NNT đƣợc lựa chọn
Stt

DC

X1

X2
(%)

X3

X4

X5 X6

(%) (%) (%)

X7

X8
(mol/l)

X9

CT1

ADC Tw/Cr : 1/1

2

Miglyol

2

0,5 0,5 Borat

0,14

7,5

CT2

ADC Tw/Cr : 1/1

2

IPM

2

0,5 0,5 Borat

0,14

7,5

CT3

ADC Tw/Cr : 1/1

2

Labrafac

2 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5
PG
Tiến hành bào chế 100 ml mẫu NNT theo công thức tối ưu 1, 2, 3 có
thành phần như ở bảng 3.22 và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng. Kết quả
cho thấy các CTTƯ đều mang đặc tính của chế phẩm NNT. CTTƯ 1 và 2
được tiến hành lựa chọn để tiến hành thử nghiệm tiếp theo với kỹ thuật bào
chế siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao.
3.2.2. Bào chế nano nhũ tƣơng bằng kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng
nhất hóa áp suất cao
5 CT được lựa chọn để khảo sát cụ thể như sau: CT1, CT 16 và CT
20 (Bảng 3.17), CTTƯ1 và CTTƯ 2 (Bảng 3.22) để tiến hành khảo sát bào
chế bằng thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao. Mỗi CT bào chế 100 ml
bằng kỹ thuật siêu âm theo mục 3.2.1.3, sau đó tiến hành ĐNH liên tục 50
ml mẫu NNT trong 12 phút ở áp suất 500 bar.
Tiến hành đánh giá một số CTCL của NNT bào chế bằng thiết bị siêu
âm và siêu âm + ĐNH sau thời gian 12 phút. Kết quả cho thấy quá trình
đồng nhất hóa sau siêu âm là không cần thiết. Vì thế quy trình này không
được lựa chọn để bào chế NNT cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Bào chế nano nhũ tƣơng bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao
3.2.3.1. Xác định công thức bào chế cơ bản
Các thành phần công thức được lựa chọn tương tự như phương
pháp siêu âm, tuy nhiên trong quá trình tham khảo tài liệu có điều chỉnh lại

tỷ lệ một số thành phần (dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt) thấp hơn
so với thành phần công thức bào chế bằng thiết bị siêu âm với mong muốn
đạt được chế phẩm nano nhũ tương cho phân bố KTTP đồng nhất, đạt tỷ lệ
nhũ hóa cao, nhũ tương ổn định, đạt phần trăm giải phóng dược chất cao và
không gây kích ứng mắt.

13


3.2.3.2. Xác định quy trình bào chế cơ bản bằng máy phân cắt tốc độ
cao
Bước 1, 2, 4, 5, 6: Tương tự phương pháp siêu âm. Bước 3: Tiến hành
đồng nhất hóa nhũ tương sử dụng máy phân cắt tốc độ cao với tốc độ phân
cắt được khảo sát từ 10000 vòng/phút đến 16000 vòng/phút. Thời gian phân
cắt từ 5 - 10 phút.
3.2.3.3. Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo nguyên
tắc hợp tử tại tâm. Thiết kế thí nghiệm được 30 công thức.
3.2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của các thành phần công thức đến một số
đặc tính vật lý của nano nhũ tƣơng
a. Các đặc tính vật lý của hệ
Phân tích mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập và các biến
phụ thuộc, xử lý số liệu bằng phần mềm FormRules 2.0. Các yếu tố ảnh
hưởng đến KTG của NNT: Tỉ lệ Transcutol HP càng tăng thì KTG tại pic
của NNT càng tăng. Tỉ lệ CDH càng tăng thì KTG tại pic càng tăng. Nếu tỉ
lệ CDH nằm trong khoảng 1 - 1,5 % thì KTG nhỏ và hầu như không có sự
thay đổi. Khi CDH tăng đến 2%, KTG tại pic tăng mạnh. KTG cũng giảm
khi thời gian phân cắt tăng. Tốc độ phân cắt tăng từ 10000 đến 13000 vòng/
phút cho thấy làm giảm KTG. Tốc độ phân cắt khoảng 13000 vòng/phút sẽ
cho KTG thu được từ các mẫu NNT là nhỏ nhất. Nếu tăng tốc độ phân cắt

từ 13000 đến 16000 vòng/phút sẽ làm KTG tăng dần.
Các yếu tố ảnh hưởng đến thế điện tích bề mặt của NNT: Tỉ lệ CDH
thân nước càng giảm, Transcutol HP càng tăng, tỉ lệ Span 80 càng tăng thì
thế zeta càng giảm làm tăng độ ổn định của hệ. Tỉ lệ CDH thân nước có ảnh
hưởng lớn nhất, tuy nhiên khi tỉ lệ nằm trong khoảng 1 - 1,5% thì thế zeta ở
mức thấp nhất, và không thay đổi nhiều.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra NNT được bào chế bằng thiết bị phân cắt
tốc độ cao cho thấy các mẫu NNT được bào chế ở quy mô nhỏ dễ bị mắc
kẹt lại trong thiết bị do đó cho tỉ lệ nhũ hóa không cao, hệ NNT kém ổn
định (thế zeta < 30 mV). Thiết bị có cấu tạo phức tạp khó đảm bảo được
tiêu chí vô khuẩn trong bào chế thuốc nhỏ mắt. Vì vậy thiết bị này cũng
không được lựa chọn cho quy trình bào chế NNT trong các nghiên cứu tiếp
theo.

14


3.3. NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ
Kỹ thuật siêu âm là một trong 3 kỹ thuật được sử dụng trong quá
trình nhũ hóa bào chế nano nhũ tương diclofenac, đây là kỹ thuật cho thấy
nhiều ưu điểm khi sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Do đó kỹ thuật này
được lựa chọn trong nghiên cứu nâng quy mô.
Mẫu nano nhũ tương bào chế theo thành phần CTTƯ 2 có phân bố
KTG dưới 200 nm, GTTĐ của thế zeta < 30 mV, PdI < 0,3 khi được bào
chế bằng các kỹ thuật khác nhau, chính vì thế mẫu NNT bào chế theo thành
phần CTTƯ 2 được lựa chọn để tiến hành khảo sát thời gian siêu âm phù
hợp khi nâng quy mô lên 1000 ml.
3.3.1. Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm khi nâng quy mô
Kết quả chỉ ra rằng lựa chọn thời gian siêu âm là 45 phút cho quy
trình nâng quy mô bào chế lên 1000 ml là hợp lý và có ý nghĩa thống kê.

3.3.2. Đánh giá tính lặp lại của quy trình khi nâng quy mô bào chế
Bào chế mẫu nano nhũ tương theo thành phần CTTƯ 2 với 3 mẻ (mẻ:
001, 002, 003) ở quy mô 1000 ml theo quy trình mục 3.2.1.3 và mục 3.3.1.
Tiến hành đánh giá các CTCL theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3.
Nhận thấy các chỉ tiêu này đều nằm trong giới hạn cho phép. Kết quả cho
thấy không có sự khác nhau về các chỉ tiêu chất lượng giữa 3 mẻ bào chế ở
quy mô 1000 ml ở cùng điều kiện nghiên cứu (P > 0,05).
3.4. DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG CỦA NANO NHŨ
TƢƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC
Căn cứ vào các nghiên cứu đã trình bày ở mục 3.2, 3.3 và tham
khảo “PL 1.14: Thuốc nhỏ mắt” trong DĐVN IV, dự thảo tiêu chuẩn chất
lượng của NNT nhỏ mắt diclofenac được xây dựng như sau: tính chất (NNT
màu trắng đục hoặc trong mờ, không mùi); giới hạn cho phép về thể tích
(nằm trong giới hạn 100% đến 110% thể tích ghi trên nhãn); định tính
(dương tính với diclofenac); định lượng (phải đạt từ 90,0 đến 110,0% so với
hàm lượng ghi trên nhãn); phần trăm DC GP in vitro theo thời gian qua
màng Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 1214 kD. Môi trường đệm phosphat pH 7,4 (1 giờ: < 10%, 2 giờ: 10 – 15%, 3
giờ: 15 – 25%); KTG nhũ tương (phải nhỏ hơn 200 nm); chỉ số đa phân tán
(PdI) (phải nhỏ hơn 0,4); thế zeta (phải không dưới 30 mV); độ nhớt (độ

15


nhớt của chế phẩm phải từ 4,0 đến 6,0 cP); pH (6,0 – 8,0); độ vô khuẩn
(đạt vô khuẩn); tỉ lệ DC được nhũ tương hoá (không dưới 90%).
3.5. Đánh giá độ ổn định của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt
Kết quả đánh giá tuy có thay đổi, nhưng các chỉ tiêu chất lượng vẫn
nằm trong giới hạn cho phép trong TCCS sau 6 tháng bảo quản ở cả 3 điều
kiện. Tính toán dự đoán thọ bằng phần mềm Minitab 17.2.1, tuổi thọ chế
phẩm bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC dài hơn trên 24 tháng. Như vậy, nano

nhũ tương nhỏ mắt nên được bảo quản ở 2 – 8oC và hạn dùng thực tế cần
được xác định dựa trên số liệu nghiên cứu dài hạn đầy đủ (dự kiến là 24
tháng).
3.6. Khảo sát đặc tính của mẫu nano nhũ tƣơng đƣợc lựa chọn để đánh
giá sinh khả dụng
Mẫu nano nhũ tương theo CTTƯ 2 (bảng 3.22) được tiến hành bào
chế với quy mô 100 ml theo mục 3.2.1.3. Mẫu nano nhũ tương sau bào chế
được đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng theo các phương pháp đã nêu mục
2.3.3. Sau đây là một số kết quả thu được:
a. Hình thức: NNT có màu trắng đục, đồng nhất, để lâu không bị phân lớp.
b. Hình thái hệ

Hình 3.31: Ảnh TEM của nano nhũ tƣơng diclofenac
Nhận xét: Ảnh TEM của NNT cho thấy: các tiểu phân đều có hình
tròn, tách rời nhau, và có lớp CDH và CĐDH (màu nhạt hơn) bao xung
quanh các tiểu phân.

16


c. Phân bố kích thước giọt: KTG TB của NNT là 174,4 ± 9,83 nm (n=3)
và PdI là 0,226 ± 0,24 (n = 3).
d. Thế zeta: Thế zeta TB bằng – 45,3 ± 2,29 mV (n = 3), đảm bảo ổn định,
không bị tách lớp trong quá trình bảo quản.
e. Độ nhớt: Độ nhớt của thuốc nhỏ mắt liên quan đến khả năng gây kích
ứng mắt và thời gian lưu giữ ở mắt. Độ nhớt TB sau 3 lần đo của NNT là
5,08 ± 0,01 cP (n = 3). Độ nhớt tương đối thấp, sẽ làm giảm kích ứng mắt.
f. Độ bền: Độ bền của NNT được đánh giá theo mục 2.3.3.1.e. Kết quả cho
thấy NNT không tách lớp khi bảo quản ở điều kiện thực trong phòng thí
nghiệm. Luộc sôi trong 1 giờ: NNT không bị tách lớp (độ bền: mức 4).

g. Định lượng: Định lượng DC có trong mẫu NNT bằng phương pháp
HPLC như trình bày ở mục 2.3.2.3, thu được hàm lượng ADC là 100,74 ±
3,35 % (n = 3).
Đánh giá GP qua màng trong thời gian giải phóng 1, 2, 3 giờ thu kết
quả như sau: Tỉ lệ DC GP (%): 1 giờ (6,59 ± 0,02); 2 giờ (14,58 ± 0,25); 3
giờ (19,24 ± 0,21).
Đánh giá phần trăm DC được nhũ tương hóa và tính toán kết quả
theo mục 2.3.3.4, thu được: phần trăm nhũ hóa DC: 98,87 ± 0,13% (n = 3)
Căn cứ dự thảo chỉ tiêu chất lượng ở mục 3.4, kết luận mẫu nano nhũ
tương bào chế theo công thức CTTƯ 2 mang đầy đủ các tiêu chuẩn của một
chế phẩm NNT và được lựa chọn để tiếp tục đánh giá thử kích ứng và SKD
trên mắt thỏ thí nghiệm.
3.7. Thử kích ứng mắt trên thỏ
Kết quả nghiên cứu chỉ ra nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac không
có các dấu hiệu gây kích ứng trên mắt thỏ.
3.8. Nghiên cứu sinh khả dụng của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt trên thỏ
thí nghiệm
3.8.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng diclofenac trong dịch tiền
phòng
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng có tính đặc
hiệu đối với acid diclofenac. Trong khoảng nồng độ khảo sát, có sự tương
quan tuyến tính giữa nồng độ diclofenac trong thủy dịch với diện tích pic
thu được, giới hạn định lượng dưới là 516,3 ng/ml. Phương pháp định

17


lượng đạt độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày. Diclofenac trong
thủy dịch và trong mẫu xử lý đạt độ ổn định trong 24 giờ.
3.8.2. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dƣợc động học

3.8.2.1. Xác định nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng
Bố trí 6 lô thỏ thí nghiệm theo quy trình đã mô tả với quy ước là mắt
trái nhỏ dạng nano nhũ tương và mắt phải nhỏ dạng dung dịch. Tính toán và
xử lý số liệu theo phương pháp đã trình bày thu được kết quả nồng độ dược
chất – thời gian của hai dạng bào chế như hình 3.33. Kết quả cho thấy đồ thị
nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng biến thiên khá phức tạp và có sự dao động
lớn của giá trị nồng độ này giữa các cá thể thỏ.

Hình 3.33: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong nồng độ - thời gian (n = 6)
3.8.2.2. Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nano
nhũ tương so với dung dịch
Kết quả được trình bày ở bảng 3.53
Bảng 3.53. Tỉ lệ giải phóng in vivo của NNT so với dung dịch
Thời
gian(phút)
**

10

20

30

40

50

60

75

90

105 120 150 180

0,949 0,949 1,087 1,229 1,230 1,232 1,232 1,232 1,439 1,649 1,649 1,649

**Tỉ lệ giải phóng in vivo của NNT so với dung dịch

18


3.8.2.3. Khảo sát một vài thông số dược động học
Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, lựa chọn phương pháp
không dựa trên mô hình ngăn để tính toán các thông số λz, Cmax, Tmax,
AUC0-180, AUC0-∞, MRT. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.54
Bảng 3.54: Các thông số dƣợc động học tính toán nhờ phần mềm
Phoenix WinNonlin 6.3
Thông số

NNT

Dung dịch

λz (phút-1)
Cmax (ng/ml)
Tmax (phút)
AUC0-180 (ng/mlphút)
AUC0-∞ (ng/mlphút)
MRT (phút)

0,016
2191
120
246220
295216
113,81

0,014
1546
10
176440
207575
104,68

Như vậy có thể sơ bộ nhận xét, dạng nano nhũ tương có Cmax và AUC
cao hơn, Tmax và MRT dài hơn so với dung dịch nhỏ mắt.
3.9. Xây dựng tƣơng quan in vitro – in vivo trong thiết kế công thức
nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac
3.9.1. Đánh giá giải phóng dƣợc chất in vitro
Tiến hành thử nghiệm giải phóng, lựa chọn các môi trường giải
phóng là các hệ đệm phosphat có pH 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4. Màng giải
phóng là màng thẩm tích. Kết quả nhận thấy khi pH của môi trường đệm
càng tăng thì phần trăm DC GP tăng theo thời gian bởi lẽ ADC ít tan trong
nước, có độ tan thay đổi theo pH. Khi môi trường đệm có tính base hơn làm
tăng độ tan của ADC từ đó phần trăm DC GP qua màng thẩm tích tăng và
cao hơn ở môi trường đệm có pH cao (môi trường đệm phosphat pH 7,4 sau
3 giờ GP được 32,09% DC) và môi trường đệm phosphat pH 7,4 có chứa
Tw 80 và ethanol phần trăm DC GP sau 3 giờ đạt mức cao nhất gần 40%
(khi môi trường đệm chứa 30% ethanol và 0,2% Tw 80 thì sau 3 giờ GP

được 38,86% DC).

19


3.9.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng
Kết quả cho thấy mô hình GP DC trong các môi trường khác nhau
tương đối phù hợp với mô hình Double Weibull (với 6 điều kiện thử GP),
sau đó là mô hình Hill (với 4 điều kiện thử GP), mô hình Weibull (với 3
điều kiện thử GP) và mô hình Makoid-Banakar (với 2 điều kiện thử GP).
3.9.3. Thiết lập tƣơng quan
Mô hình tương quan phù hợp nhất là mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất
Môi trường đệm phosphat pH 5,8 tương ứng với mô hình Weibull mô tả tốt
nhất sự GP. Mô hình tương quan PT1:
(Thời gian: Tvivo =
=
)
là mô hình tương quan in vitro – in vivo của NNT diclofenac; mô hình này
được lựa chọn trong các hướng nghiên cứu tiếp theo của luận án.
3.9.4. Ứng dụng tƣơng quan in vitro – in vivo trong xây dựng chỉ tiêu
giải phóng dƣợc chất của nano nhũ tƣơng
Kết quả cho thấy khi thay đổi môi trường giải phóng đệm phosphat
pH 7,4 bằng môi trường đệm phosphat pH 5,8; kiểm định t-test cho thấy
không có sự khác nhau về phần trăm giải phóng dược chất giữa mẫu nano
nhũ tương được bào chế ở quy mô 100 ml và các mẻ 001*, 002*, 003* ở
quy mô 1000 ml (* với P > 0,05) trong cùng điều kiện. Phân tích phương
sai ANOVA cho thấy không có sự khác nhau về phần trăm giải phóng dược
chất ở cùng thời điểm nghiên cứu ở 3 mẻ 001*, 002*, 003* với quy mô
1000 ml (* với Pvalue > 0,05). Căn cứ nghiên cứu đã thực hiện tại mục 3.4,
3.5, 3.6, 3.7, tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm nano nhũ tương được đề xuất.

Bảng 3.58. Tiêu chuẩn chất lƣợng của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac

STT
1
2
3

Yêu cầu

CTCL
Tính chất

Lọ chất dẻo HDPE 10 ml, màu trắng, bên
trong có chứa NNT màu trắng đục hoặc
trong mờ, không mùi
Giới hạn cho phép về Thể tích nhũ tương nằm trong giới hạn
thể tích
100% đến 110% thể tích ghi trên nhãn
Định tính
Dương tính với diclofenac

20


STT

Yêu cầu

CTCL

8

Hàm lượng ADC (C14H11Cl2NO2) phải đạt
từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi
trên nhãn
Phần trăm DC GP in 1giờ: < 10%
vitro theo thời gian tại 2 giờ: 10 – 15%
môi trường pH 5,8*
3 giờ: 15 – 25%
KTG nhũ tương
KTG nhũ tương TB phải nhỏ hơn 200 nm,
chỉ số đa phân tán (PdI) phải nhỏ hơn 0,4
Thế zeta
Giá trị tuyệt đối của thế zeta phải không
dưới 30 mV
pH
6,0 – 8,0

9

Độ vô khuẩn

4
5
6
7

Định lượng

Đạt vô khuẩn

*Màng giải phóng: màng Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane (hãng
Spectrum Laboratories) 12-14 kD.
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. Về acid diclofenac
Từ các kết quả nghiên cứu khảo sát ban đầu và tham khảo tài liệu
nghiên cứu trước đó, acid diclofenac đã được nhóm nghiên cứu lựa chọn để
bào chế NNT nhỏ mắt diclofenac. Đây được coi là nghiên cứu đầu tiên lựa
chọn DC là ADC cho chế phẩm thuốc nhỏ mắt.
4.2. Về bào chế nano nhũ tƣơng
4.2.1. Về công thức bào chế
Dung môi pha dầu có vai trò rất quan trọng trong hệ do nó ảnh
hưởng đến việc hình thành nhũ tương và độ tan của DC. Thành phần dầu
IPM khi thay đổi về lượng cũng ít ảnh hưởng tới kích thước giọt tuy nhiên
với thành phần dầu Miglyol, Labrafac tăng sẽ làm tăng kích thước giọt.
Trong nghiên cứu, lựa chọn ba CDH không ion hóa là: Cre EL (HLB
12 - 14), Tw 80 (HLB 15), Span 80 (HLB 4,3) – là những CDH dung hợp
tốt với mắt. Hơn nữa, các chất diện hoạt được lựa chọn cũng cho tổng chỉ
số HLB nằm trong khoảng từ 8 – 18 sẽ dễ dàng tạo NNT dầu/ nước.
Transcutol HP được lựa chọn là CĐDH, cũng là đồng dung môi (do có khả
năng hòa tan nhiều DC, làm tăng độ tan của DC trong pha dầu) và có nhiều
ưu điểm: ít kích ứng, đã được sử dụng cho các chế phẩm nhãn khoa, có khả
năng cải thiện tính thấm DC qua giác mạc.

21