Bai tieu luan CAM BIEN SINH HOC DIEN HOA CA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

----------

TIỂU LUẬN
CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ĐO CO2 HÒA TAN
SỬ DỤNG ENZYME ANHYDRASE CARBONIC

MÔN HỌC: CẢM BIẾN SINH HỌC
HỌ VÀ TÊN: PHẠM ĐỨC HẬU
GIẢNG VIÊN: TS. LÊ THỊ HIÊN
Ngành: Vật lý kỹ thuật và công nghệ nano

HÀ NỘI, 11/2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

TIỂU LUẬN
CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ĐO CO2 HÒA TAN
SỬ DỤNG ENZYME ANHYDRASE CARBONIC

MÔN HỌC: CẢM BIẾN SINH HỌC

HỌ VÀ TÊN: PHẠM ĐỨC HẬU
GIẢNG VIÊN: TS. LÊ THỊ HIÊN
Ngành: Vật lý kỹ thuật và công nghệ nano
HÀ NỘI, 11/2016

MỞ ĐẦU
Carbonic (carbon dioxide) là một trong những loại khí quan trọng trong môi trường,
được hình thành từ các phản ứng sinh hóa của cơ thể sinh vật, cũng như là quá trình đốt cháy
các chất có chứa các liên kết carbon. Carbonic góp phần trong quá trình quang hợp ở thực vật,
tạo ra nguồn hữu cơ cho sự phát triển cho sinh giới. CO2 hòa tan trong nước giờ đây là một
trong những ứng dụng quan trọng của các ngành công nghiệp giải khát, bảo quản thực phẩm.
Vấn đề đặt ra để xác định nồng độ CO2. Các kỹ thuật phân tích và định tính chất khí
này. Một số phương pháp phổ biến hiện nay như các thiết xác định nồng độ CO2 bằng tia
hồng ngoại, bằng cách đo phổ phát xạ. Cảm biến được sử dụng hiệu quả nhất với khi CO2 là
chất khí, hồng ngoại được sử dụng với bước sóng 4,2 nm. Tuy nhiên để xác định nồng độ của
CO2 hòa tan trong nước thì cảm biến không thể hoạt động. Nó bị cản trở bởi nước các vấn đề
liên quan đến độ hòa tan trong nước của CO2.
Nhiều cảm biến quang học đã được phát triển và cải tiến để phát hiện và đo CO2 hòa tan
trong nước. Ưu điểm của các loại cảm biến này là có độ bền cơ học cao, dễ sản xuất. Tuy
nhiên nhược điểm lớn nhất đó lại là độ nhạy và độ chính xác không cao. Hơn thế, cảm biến
CO2 quang học đáp ứng chậm khi đo CO2 hòa tan, do ảnh hưởng của môi trường nước.
Vì những hạn chế của cảm biến quang đó. Trong bài tiểu luận này chúng ta sẽ tìm hiểu
một loại cảm biến điện hóa, và sử dụng đầu dò là enzyme carbonic anhydrase (CA).


I. Giới thiệu CO2 và enzyme Carbonic anhydrase (CA).
1. Giới thiệu CO2
Điôxít cacbon hay cacbon điôxít (các tên gọi khác thán khí, anhiđrít
cacbonic, khí cacbonic) là một hợp chất ở điều kiện bình thường có dạng khí trong khí
quyển Trái Đất, bao gồm một nguyên tử cacbon và hai nguyên tử ôxy. Là một hợp
chất hóa học được biết đến rộng rãi, nó thường xuyên được gọi theo công thức hóa học
là CO2. Trong dạng rắn, nó được gọi là băng khô.

Hình 1: Hình ảnh phân tử CO2.

Điôxít cacbon thu được từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm cả khí thoát ra từ
các núi lửa, sản phẩm cháy của các hợp chất hữu cơ và hoạt động hô hấp của các sinh
vật sống hiếu khí. Nó cũng được một số vi sinh vật sản xuất từ sự lên men và sự hô
hấp của tế bào. Các loài thực vật hấp thụ điôxít cacbon trong quá trình quang hợp, và
sử dụng cả cacbon và ôxy để tạo ra các cacbohyđrat. Ngoài ra, thực vật cũng giải
phóng ôxy trở lại khí quyển, ôxy này sẽ được các sinh vật dị dưỡng sử dụng trong quá
trình hô hấp, tạo thành một chu trình. Nó có mặt trong khí quyển Trái Đất với nồng độ
thấp và tác động như một khí gây hiệu ứng nhà kính. Nó là thành phần chính trong chu
trình cacbon.
Điôxít cacbon là một khí không màu mà khi hít thở phải ở nồng độ cao (nguy
hiểm do nó gắn liền với rủi ro ngạt thở) tạo ra vị chua trong miệng và cảm giác nhói ở
mũi và cổ họng. Các hiệu ứng này là do khí hòa tan trong màng nhầy và nước bọt, tạo
ra dung dịch yếu của axít cacbonic.
Tỷ trọng riêng của nó ở 25 °C là 1,98 kg m−3, khoảng 1,5 lần nặng hơn không
khí. Phân tử điôxít cacbon (O=C=O) chứa hai liên kết đôi và có hình dạng tuyến tính.
Nó không có lưỡng cực điện. Do nó là hợp chất đã bị ôxi hóa hoàn toàn nên về mặt
hóa học nó không hoạt động lắm và cụ thể là không cháy.
Ở nhiệt độ dưới -78 °C, điôxít cacbon ngưng tụ lại thành các tinh thể màu trắng
gọi là băng khô. Điôxít cacbon lỏng chỉ được tạo ra dưới áp suất trên 5,1 barơ; ở diều


kiện áp suất khí quyển, nó chuyển trực tiếp từ các pha khí sang rắn hay ngược lại theo
một quá trình gọi là thăng hoa.
Nước sẽ hấp thụ một lượng nhất định điôxít cacbon, và nhiều hơn lượng này khi
khí bị nén. Khoảng 1% điôxít cacbon hòa tan chuyển hóa thành axít cacbonic. Axít
cacbonic phân ly một phần thành các ion bicacbonat (HCO3-) và cacbonat (CO3−2).

Hình 2: Phản ứng phân tử CO2 với nước.

Thử nghiệm tìm điôxít cacbon. Khi một nguồn lửa được đưa vào ống thử có chứa
điôxít cacbon thì ngọn lửa sẽ tắt ngay lập tức do điôxít cacbon không duy trì sự cháy.
(Một số loại bình cứu hỏa chứa điôxít cacbon hay các chất khi phản ứng với nhau sẽ
tạo ra nó dùng để dập lửa). Để xác nhận tiếp theo là khí này là điôxít cacbon thì khí
được dẫn qua dung dịch hiđrôxít canxi(Ca(OH)2) trong. Dung dịch hiđrôxít canxi sẽ
chuyển thành màu sữa do sự tạo thành của cacbonat canxi.

2. enzyme Carbonic anhydrase (CA).
CA là một metalloprotein có ion điều hành là ion kẽm, một ion hóa trị 2, điều
hành hoạt động thông qua việc làm âm hóa tại các vị trí histidine trong phân tử (vị trí
này làm cấu trúc H-O-H của nước trở thành H-O(-)—H(+), rất thuận lợi để tạo HCO3và H+ trực tiếp từ CO2 và H2O mà không trải qua trung gian H2CO3. Chính vì vậy,
phản ứng xảy ra với hằng số vào khoảng 106 (một trong những con số nhanh nhất
của hệ thống sống).

Hình 3: Hoạt động của enzyme andydrase carbonic.


Từ hình 3 ta thấy phản ứng thuận chiều đã được gia tốc thêm 1 triệu lần, làm
hằng số tổng hợp lúc này vào khoảng 0.1. Khi đó ion H+ và HCO3- được hình thành.
Có nhiều dạng CA trong tự nhiên. Đơn cử dạng α-CA được nghiên cứu rõ ràng
nhất hiện diện ở động vật. Ion Zn2+ kết hợp với vòng nhẫn imidazole (imidazole
rings) của 3 phân tử Histidine: His94, His96, His119.

Hình 4: Hình ảnh cấu tạo andydrase carbonic.

Hình 5: Hình ảnh protein andydrase carbonic.

Chức năng chính của enzyme này ở động vật là xúc tác sự chuyển đổi qua
lại giữa CO2 và HCO3- để duy trì cân bằng acid-base trong máu và trong các mô khác,
và giúp vận chuyển CO2 ra khỏi các mô.

Có ít nhất 14 đồng dạng α-CA khác nhau ở động vật hữu nhũ. Thực vật có 1
dạng khác gọi là β-CA, mà theo quan điểm tiến hóa là 1 loại enzyme khác biệt với αCA, nhưng tham gia vào cùng một phản ứng hóa học và cũng sử dụng ion Zn2+ ở vị trí
hoạt động của nó. Ở thực vật, CA giúp tăng nồng độ của CO2 trong lục
lạp (chloroplast) để tăng tốc độ carboxyl hóa enzyme RuBisCO. Đó là phản ứng hợp
nhất CO2 vào phân tử đường carbon hữu cơ trong quá trình quang hợp, và chỉ có thể sử
dụng dạng CO2 từ carbon chứ không thể từ carbonic acid hay bicarbonate. CA chứa
cadmium (cadmium-containing carbonic anhydrase) được tìm thấy ở các loài tảo cát
(diatoms) dưới biển trong điều kiện nồng độ kẽm bị giới hạn. Trên đại dương, nồng độ
kẽm thường thấp đến nỗi nó có thể giới hạn sự phát triển của các loài thực vật trôi


nổi (phytoplankton) mà điển hình là tảo cát. Và trong bài nghiên cứu ta sẽ lấy từ động
vật là bò.

II. Cảm biến sinh học, cấu tạo của cảm biến điện hóa CA.

Hình 6: Hình ảnh mô hình một cảm biến sinh học.

Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp bao gồm các bộ phận:
Đầu thu sinh học: có thể là các enzyme, DNA, miễn dịch.. có chức năng
nhận biết các tác nhân hay gọi là cơ chất.
Bộ phận chuyển đổi tín hiệu: dựa vào các thay đổi của đầu thu Điện hóa,
pH... để đưa ra các tín hiệu cho bộ phận xử lý.
Bộ phận xử lý và đọc tín hiệu: đưa ra các tín hiệu cho người dùng dựa vào
bộ phận chuyển đổi tín hiệu trước đó.
Cảm biến sinh học điện hóa sử dụng enzyme CA có cấu tạo bao gồm:
Lớp enzyme.
Lớp chất hữu cơ quinone.
Thanh graphite.
Ống dẫn silicon.

Sợi dây dẫn bằng đồng.
Đầu cắm.


Hình 7: Cấu tạo cảm biến sinh học điện hóa CA.

Chúng ta sẽ có phần đầu thu sinh học sẽ là lớp enzyme được kết nối với cực điện
là thanh graphite, thanh điện cực đã được chức năng hóa bằng lớp quinone. Phần dây
dẫn ở đây sử dụng là dây đồng được dẫn truyền đến đầu cắm và được sử lý tín hiệu bởi
phần mềm PSTAT10 AUTOLAB trên hệ máy tính Windows. Lớp các điện được sử
dụng là ống silicone.


III.

Phương pháp chế tạo và nguyên lý hoạt động.

Chuẩn bị:
CA từ hồng cầu bò (EC 4.2.1.1).
Protein albumin huyết thanh bò.
Glutaraldehyde (GA) (G-5882).
p-Benzoquinone.

Hình 9 ảnh cấu tạo của glutaraldehyde và p-benzoquinone.

Hình 10: Điện cực làm bằng graphite (cacbon).

Điện cực được làm từ thanh cacbon dài 1cm và có đường kính 4mm được ngâm
trong nước sôi 1h và rửa sạch với acetone.

Hình 11: Phần điện cực lớp cách điện và dây dẫn.

Dây dẫn điện được sử dụng bằng đồng. Điện cực được đưa vào ống silicone để
cách điện.
Điện cực được đưa vào ống silicone để cách điện.
Cuối cùng lớp các bề mặt điện cực được rửa với acetone rồi bổ sung pbenzoquinone và để khô trong không khí 1h rồi kiểm tra cách điện bằng Cyclic
voltammetry.


Hình 12: Phần điện cực lớp cách điện dây dẫn được kết hợp với enzyme và có lớp hữu
cơ quinone.

Enzyme CA và Protein albumin với các nồng độ lần lượt như sau 10 mg/ml và 50
mg/ml,và được pha với tỷ lệ 1:1.
Sau 2 phút, cho glutaraldehyde (25mg/ml trong nước cất) bằng một nửa của hỗn
hợp BSA.CA rồi đến điện cực và để trong không khí 2 giờ để tạo điều kiện cho
enzyme liên kết ngang. Cuối cùng là kết hợp thiết bị cảm biến với đầu cắm.


Hình 13: Phản ứng của p-Benzoquinone.

Nguyên lý làm việc của cảm biến là sau khi lớp enzyme CA xúc tác phản ứng
giữa CO2 và H2O tạo ra H+, thì lớp p-Benzoquinone sẽ được chuyển hóa thành
Hydroquinone bằng các nhận H+ và điện tích được cung cấp. Lớp sau đó
Hydroquinone sẽ phản ứng ngược lại trở thành p-Benzoquinone và tạo ra điện tích dẫn
vào điện cực và được bộ phận xử lý tín hiệu đưa ra các kết quả.


IV.

Các đánh giá về cảm biến.

Hình 14: Thời gian đáp ứng của các loại cảm biến điện hóa với các đầu dò khác
nhau ở các nồng độ CO2 hòa tan khác nhau.

Dựa vào hình 14 ta thấy với các loại cảm biến: hình tròn là cảm biến không có
lớp enzyme CA, tiếp theo hình vuông là điện cực đã chức năng hó với Tris-HCL, cuối
cùng là hình tam giác là cảm biến sinh học có đầu dò là enzyme CA. Như hình đã thể
hiện, nhận thấy với cảm biến sinh học có đầu dò là enzyme CA thì thời gian đáp ứng
của cảm biến là nhanh, và có tính ổn định cao trong nhiều trường hợp, các giá trị thời
gian dần tăng lên và tính ổn định giảm đối với các cảm biến còn lại.


Hình 15: Các giá trị điện thế ở các nồng độ CO2 hòa tan khác nhau.

Ở đây nhóm nghiên cứu đã sử dụng hai loại cảm biến để so sánh là cảm biến điện
hóa với đầu dò không được gắn enzyme và trường hợp cảm biến sinh học có đầu dò là
lớp enzyme CA. Dựa vào hình 15 ta thấy với các nồng độ tăng giần thì nguồn điện
cung cấp cho hai loại cảm biến cũng tăng dần, tuy nhiên ở cảm biến sinh học với đầu
dò CA điện thế cung cấp là lớn hơn, điều này chứng tỏ quá trình chuyển hóa lớp pBenquinone là nhiều hơn. Và cũng chứng tỏ độ nhạy cũng như tính chính xác của cảm
biến sinh học CA là vượt trội hơn nhiều.


Hình 16: Ảnh hưởng của nồng độ p-Benquinone đến cảm biến.

Tiếp theo ta sẽ xét các nồng độ p-Benquinone khác nhau từ 5µl - 20µl, với các
điều kiện điện thế làm việc là -100 mV, nhiệt độ là 00C, với lượng tạo ra đầu dò
CA/BSA ban đầu là 20 µl. Ta nhận thấy với 5 µl dòng điện cảm biến nhận được chỉ
vào khoảng 0,5 µA, tuy nhiên với các nồng độ từ 10 µl đến 20 µl, các giá trị giao động

trong khoảng 1,4 µA – 1,8 µA, với các sai số là 0,4 µA, ta kết luận trong khoảng 10 µl
đến 20 µl nồng độ PBQ thì cảm biến hoạt động với hiệu suất cao nhất.


Hình 17: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến cảm biến.

Trong điều kiện giới hạn của lượng enzyme nên trong khảo sát này ta chỉ thay
đổi lượng CA/BSA trong khoảng 5 - 20 µl. Với các điều kiện 10 µl PBQ điện thế hoạt
động -100mV và nhiệt độ là 00C. Dựa vào hình 17 ta thấy rằng trong khoảng enzyme
ta xét thì hiệu suất hoạt động của cảm biến sinh học CA là tương đối ổn định.


Hình 18: Ảnh hưởng của điện thế đến cảm biến.

Tiếp theo nhóm nghiên cứu đã thay đổi điện thế hoạt động với các giá trị điện thế
thay đổi từ -300mV đến 300mV. Với các điều kiện là có 10 µl PQB, 15 µl CA/BSA
và nhiệt độ là 00C. Nhận thấy giá trị-100mV thì hiệu suất của cảm biến sinh học CA là
cao nhất. Vậy nên trong các trường hợp khảo sát ta luôn để giá trị điện cực làm việc là
-100mV.


Hình 18: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến cảm biến.

Một vấn đề ta muốn khảo sát đó là nhiệt độ thi đo nồng độ CO 2. Với các
điều kiện hoạt động của cảm biến sinh học CA làm việc tốt nhất như đã đề cập ở
trên. Dựa vào hình 18 nhận thấy với các giá trị từ 0 0C đến 200C thì cảm biến
hoạt động tốt nhất. Nhưng với nhiệt độ cao hơn trên 20 0C thì ta thấy hoạt động
của cảm biến đã bắt đầu không tốt. Một lý do có thể do ở nhiệt độ cao thì nồng
độ CO2 trong nước bắt đầu có xu hướng giảm.

KẾT LUẬN

Qua đây nghiên cứu ta đã góp phần cải tiến, nâng cấp thiết bị đo đạc nồng độ
CO2 hòa tan trong nước. Chúng ta đều biết ứng dụng cực kỳ quan trọng của CO2 trong
tự nhiên đến các ngành công nghiệp giải khát, làm lạnh và bảo qua thực phẩm. Vì vậy
việc cải tiến cảm biến là một phần cốt lõi của lịch sử. Việc phát hiện và sử dụng
enzyme CA cũng là một bước tiến quan trọng. Enzyme CA có trong hầu hết các sinh
vật, với cơ thể con người nó cực kì quan trọng trong vấn đề đào thải ở thận.... vậy nên
việc nghiên cứu và sử dụng enzyme CA góp phần rất nhiều trong y học chữa trị các
bệnh ở người.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

/>carbonic_anhydase_in_electrochemical_biosensors_for_dissolved_CO2
/>