ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803) SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803)
SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE

HÀ NỘI, 12/2016


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CÁ LĂNG CHẤM (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803)
SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE

Sinh viên
: Bùi Hà My
Ngành
: Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn : TS. Trần Thị Thúy Hà
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1
TS. Nguyễn Hữu Đức
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

HÀ NỘI, 12/2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong luận văn là do chính tôi trực tiếp thực hiện.
Các số liệu và kết quả được công bố trong luận văn là hoàn toàn trung thực,
chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Sinh viên

Bùi Hà My

3


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Thúy Hà,
Giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học Thủy sản, Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng
Thủy sản I và TS. Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Động vật,
Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Cảm ơn Thầy Cô đã
hướng dẫn, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quí báu về
chuyên môn lẫn cuộc sống, trong suốt quá trình em thực hiện Khóa luận Tốt nghiệp.
Tiếp theo, em gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn bộ nhân viên của Trung tâm

Công nghệ sinh học Thủy sản, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, đặc biệt là CN.
Nguyễn Thị Hương đã luôn tận tình chỉ bảo, dạy dỗ và giúp đỡ em không chỉ trong
công việc mà cả trong cuộc sống.
Đồng thời, em xin cảm ơn toàn thể các Thầy Cô giáo trong Khoa Công nghệ
Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã truyền dạy những kiến thức quí báu
trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Cuối cùng, từ tận đáy lòng, em gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất tới
gia đình, bạn bè – những người thân yêu nhất đã luôn ở bên cạnh động viên và ủng hộ
em trong suốt quá trình học tập.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng
Sinh viên

Bùi Hà My

4

năm 2016


MỤC LỤC

5


DANH MỤC HÌNH

6

DANH MỤC BẢNG

7


PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Giới thiệu
Việt Nam với hệ thống sông ngòi dày đặc có điều kiện vô cùng thuận lợi cho
sự phát triển của khai thác và nuôi trồng thủy sản. Hơn nữa, chất lượng đời sống
của người dân ngày càng được cải thiện dẫn đến tăng nhu cầu tiêu thụ sản phẩm
thủy hải sản chất lượng. Vì vậy, việc lựa chọn đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế
cao để khai thác và nuôi trồng ngày càng trở nên quan trọng đối với người sản xuất.
Cá Lăng Chấm Hemibagrus gutattus (Lacepède, 1803) là loài cá hoang dã có
giá trị kinh tế cao của hệ thống sông Hồng. Thịt cá thơm, ngon, ít xương dăm và
được coi là một trong những đặc sản nước ngọt hàng đầu của miền Bắc. Loài cá này
từng chiếm tỉ lệ khá lớn trong sản lượng cá đánh bắt tự nhiên tại một số tỉnh miền
núi trong những năm 1960 – 1970 (Mai Đình Yên, 1983). Tuy nhiên, những năm
gần đây, do sự khai thác ồ ạt quá mức của con người, sản lượng cá Lăng Chấm đã
suy giảm đáng kể. Hiện nay, cá Lăng Chấm được xếp vào Sách đỏ Việt Nam ở mức
nguy cấp bậc V (Bộ Khoa học – Công nghệ và môi trường, 1992)
Đối diện với thực trạng cần bảo vệ gấp của cá Lăng Chấm và thực tế nhu cầu
của thị trường với các sản phẩm thủy sản chất lượng cao, việc nghiên cứu sinh sản
nhân tạo cá Lăng Chấm trở thành biện pháp hữu hiệu để bảo tồn đồng thời phát huy
được giá trị kinh tế của loài cái này. Lựa chọn cá giống tốt là một trong những yếu
tố quan trọng nhất quyết định thành công của việc nghiên cứu sinh sản nhân tạo.
Xét về mặt di truyền, sự giao phối cận huyết là nguyên nhân gây ra một số tác động
tiêu cực như tăng tỉ lệ đồng hợp tử dẫn đến cơ hội biểu hiện gene lặn gây chết gia
tăng, suy thoái cận huyết và giảm biến dị di truyền (Falconer, 1989). Tất cả những

biểu hiện trên đều dẫn đến sự sụt giảm chất lượng giống (Mair, 1997). Vì vậy, tiến
hành đánh giá đa dạng di truyền cho cá Lăng Chấm góp phần cung cấp nguồn thông
tin hữu hiệu về mặt di truyền cho công tác chọn giống loài cá này.
Theo Ferguson (1994), biến dị di truyền là nguồn gốc cơ sở đem lại thành
công lớn cho các chương trình nuôi và chọn giống. Trong khi đó, các chỉ thị phân tử
DNA cho phép theo dõi và khai thác biến dị di truyền trên toàn bộ bộ gene (Liu và
Cordes 2004). Vì vậy, các kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử DNA (DNA-based
markes) là những công cụ hữu ích để đánh giá đa dạng di truyền trên các đối tượng
8


thủy sản nói chung và cá Lăng Chấm nói riêng. Là một trong những chỉ thị được sử
dụng phổ biến hiện nay, chỉ thị microsatellite cho thấy hiệu quả cao trong việc
nghiên cứu cấu trúc di truyền của sinh vật, quá trình tiến hóa, cung cấp các thông tin
làm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo giống. Do đó, nhiều nghiên cứu sử dụng
microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền trên đối tượng thủy sản đã được công bố
cả trong nước và trên thế giới.
Tại Việt Nam hiện nay, nghiên cứu cá Lăng Chấm mới chỉ được nghiên cứu
sinh sản nhân tạo hay nuôi thương phẩm mà chưa có một công trình nào về đánh giá
đa dạng di truyền của loài thủy sản này. Xuất phát từ tình hình thực tế đó, tôi tiến
hành nghiên cứu “Đánh giá đa dạng di truyền cá Lăng Chấm (Hemibagrus
guttatus Lacepède, 1803) bằng chỉ thị phân tử Microsatellite”
1.2. Mục đích
• Đánh giá đa dạng di truyền các quần đàn cá Lăng Chấm.
• Xác định mối quan hệ di truyền của các quần đàn cá Lăng Chấm, góp
phần phục vụ công tác bảo tồn và lai tạo loài cá quý hiếm này.
1.3. Nội dung nghiên cứu
• Tách chiết DNA tổng số 4 quần đàn cá Lăng Chấm.
• Lựa chọn và tối ưu 3 cặp chỉ thị microsatellite cho cá Lăng Chấm.
• Tiến hành PCR đoạn gene cần quan tâm.

• Điện di trên hệ thống GeXP.
• Đọc kết quả và phân tích số liệu sau thí nghiệm để xác định mối quan hệ
di truyền của các quần đàn cá Lăng Chấm.

9


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Cá Lăng Chấm
2.1.1. Phân loại học

Hình 2.1. Cá Lăng chấm Hemibagrus guttatus (Lacepède, 1803)
(Nguồn: />Cá Lăng Chấm Hemibagrus guttatus (Lacepède, 1803) thuộc:
Bộ cá Hồng nhung Characiformes
Họ cá Lăng Bagridae
Giống cá Lăng Hemibagrus
Loài Cá Lăng Chấm Hemibagrus guttatus (Lacépède, 1803).
Tên địa phương: cá Lăng hoặc cá Quất
2.1.2. Phân bố
Trên thế giới hiện nay, cá Lăng Chấm phân bố tập trung ở Trung Quốc, Thái
Lan Việt Nam và Campuchia (Chu xin lua, 1990; Robert Tyson, 1995; Mai Đình
Yên 1978). Ở Việt Nam, cá Lăng Chấm phân bố chủ yếu ở các sông lớn ở các tỉnh
phía Bắc như hệ thống sông Hồng, sông Đà, sông Thao, hạ lưu sông Hồng, sông
Chảy,... Họ Cá Lăng Bagridae ở Việt Nam có 7 giống thuộc18 loài trong đó giống
Hemibagrus có 3 loài (Nguyễn Văn Hảo, 1993 ; Mai Đình Yên, 1978 ; Mai Đình
Yên, 1983), và cá Lăng Chấm H.guttatus là loài có kích thước lớn nhất. Theo Mai
Đình Yên, 1963, cá Lăng cỡ lớn tối đa tới 40kg.
10

2.1.3. Đặc điểm sinh học
Cá Lăng Chấm có thân trần dài, viền lưng hơi nhô lên. Phần trước vây lưng
dẹp bằng. Phần sau vây lưng dẹp bên dần dần. Đầu rộng bẹt và tương đối dài. Mõm
rộng, mé trướ hơi bằng. Mắt ở phía trên và nửa trước của đầu. Vây lưng có viền
ngoài hơi nhô lên, khởi điểm tới mút mõm bằng tới ½ của chiều dài gốc vây mỡ.
Tia vây lưng cuối là gai cứng, phía trước trơn, phía sau có răng cưa rõ. Lưng xám
đen, bụng trắng nhạt. Bên thân có nhiều chấm đen to nhỏ không theo qui tắc.
Cá Lăng Chấm thuộc loại sinh trưởng tương đối nhanh. Trong 4 năm đầu
tăng nhanh về chiều dài đạt 13 – 17cm/năm, sau giảm dần, ở lứa 9 + – 12+ tuổi còn 4
– 7 cm/năm. Về khối lượng năm đầu tăng 30 – 60g, năm thứ 2 tăng 190 – 240g, từ
năm thứ 5 tăng 1.000 – 1.400g/năm, những năm cuối giảm (Phạm Báu và cộng sự,
2000).
Khai thác cá Lăng Chấm có 2 mùa: Mùa chính từ trước mùa lũ tháng 3-6 (cá
di cư sinh sản) và mùa phụ từ tháng 9 – 10 (cá đi trú đông). Ngư cụ khai thác chính
là xung điện, các loại câu, lưới thưa ( />2.1.4. Một số nghiên cứu về cá Lăng Chấm
Hiện nay, trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng có rất ít nghiên
cứu trên đối tượng cá Lăng Chấm. Các nghiên cứu ngoài nước được thực hiện chủ
yếu tại Trung Quốc và tạm thời mới chỉ tiến hành việc giải trình tự gene ti thể của
loài cá này (Tian và cộng sự, 2016). Tại Việt Nam, cá Lăng Chấm mới chỉ được
nghiên cứu nhằm mục đích sinh sản nhân tạo và sản xuất giống thương phẩm mà
chưa có các đề tài nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyn của loài cá này.
2.2. Đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là khái niệm đề cập tới những biến dị của các alleles và
kiểu gene bên trong các cá thể của một quần thể, một loài hoặc giữa các loài với
nhau (United Nations, 1992). Sự đa dạng này được thể hiện qua kiểu hình, các đặc
điểm sinh lý, các biểu hiện hành vi giữa các cá thể và các quần thể khác nhau
(Frankham và cộng sự, 2002). Có nhiều cấp độ khác nhau của đa dạng di truyền: từ
cấp độ gene (cấp độ phân tử) đến các cấp độ cao hơn như cá thể, quần thể, loài, và
cao nhất ở cấp độ hệ sinh thái (FAO, 2009).
11

Biến dị di truyền là yếu tố quyết định tính đa dạng di truyền. Xét về mặt
chức năng, các biến dị di truyền có thể phân loại thành biến dị trung tính, có hại
hoặc có lợi (Hedrick, 2001). Những biến đổi về thông tin di truyền này thường xuất
phát từ đột biến và tái tổ hợp. Trong khi các biến dị trung tính thường được lưu trữ
với mục đích bảo tồn đa dạng di truyền thì các biến dị có hại và có lợi đóng vai trò
vô cùng quan trọng trong sự tồn tại của quần thể (Toro và Caballero, 2005).
Đa dạng di truyền thường bị mất đi cùng với sự biến mất của các nguồn biến
dị trong quần thể. Vì vậy, bảo tồn đa dạng di truyền có liên quan mật thiết tới việc
bảo vệ được nguồn biến dị hoặc qua việc làm phát sinh các đột biến mới (ngẫu
nhiên hoặc nhân tạo qua thực nghiệm). Đa dạng di truyền cần thiết được bảo toàn
để động vật, vật nuôi có thể đáp ứng được các hướng chọn giống theo các chỉ tiêu
kinh tế mong muốn, đáp ứng các cải biến theo nhu cầu của người tiêu dùng (thịt
nạc, trứng gà có vỏ màu nâu...), với các biến đổi môi trường sống (bò sữa nuôi ở
vùng nhiệt đới) và đáp ứng được các yêu cầu, chức năng mới.
-

2.2.1. Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền
Điện di protein: kỹ thuật phân tích các protein khác nhau - sự biểu hiện tương ứng

-

của các alen khác nhau trong một cá thể.
Bản đồ giới hạn: dựa trên hoạt động của những enzyme rất đặc hiệu của vi
khuẩn. Các enzyme này giúp ngăn chặn các sai hỏng của DNA gây ra bởi
virus bằng cách cắt bỏ các sai hỏng này ở những điểm đặc hiệu. Việc phân
tích các điểm cắt này (điểm giới hạn) cho phép phân tích một cách chính xác

-

trình tự các gene.
Giải trình tự DNA và RNA: một hướng nghiên cứu khác cho phép phân tích
tất cả các DNA. Ribosome là các bào quan có chức năng tổng hợp protein.
Các acid ribonucleic (RNA) - thành phần của các ribosome thường được sử
dụng. RNA 16S (16S là tiểu đơn vị của phân tử RNA ribosome) - cấu trúc
được quan tâm đặc biệt( />Ở cấp độ phân tử, đa dạng di truyền thường được định lượng bằng:

-

Tần số kiểu gene và kiểu hình
Tỉ lệ locus đa hình
Mức dị hợp tử quan sát và kì vọng

12


Sự khác biệt về di truyền các quần thể thường được đánh giá dựa trên
khoảng cách di truyền giữa chúng (Nei, 1987; Laval và cộng sự, 2002) và hệ số sai
khác di truyền FST của Wright (1969). Bên cạnh đó, tiêu chuẩn được sử dụng phổ
biến nhất để đánh giá đa dạng di truyền trong các quần thể là mức hợp tử kì vọng,
hay sự đa dạng gene Đó là khả năng chọn được ngẫu nhiên hai alleles khác nhau trong các
quần thể (Nei, 1973).
Sự duy trì đa dạng di truyền là một trong những vấn đế đang được quan tâm
nhất hiện nay, đặc biệt là khi các loài tự nhiên và cả các dòng, giống sản xuất đang
dần biến mất ở mức độ báo động, do nhu cầu sử dụng nguồn thực phẩm động vật
ngày càng tăng.
2.2.2. Các kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Từ những năm 1990, nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ, chỉ thị phân
tử đã trở thành công cụ hàng đầu để mô tả các đặc điểm của đa dạng di truyền.

Những cải tiến trong hai thập kỉ qua về các kĩ thuật đa hình DNA và kèm theo phân
tích số liệu đã làm tăng đáng kể khả năng hiểu biết của con người về mối quan hệ di
truyền giữa các loài ở mức độ phân tử.
Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP)
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là chỉ thị được Bostein
sử dụng năm 1980 để lập bản đồ gene có liên quan đến bệnh ở người.
Nguyên lý của việc sử dụng chỉ thị RFLP dựa trên việc số đoạn cắt của một
phân tử DNA bởi một enzyme cắt giới hạn là đặc hiệu cho từng phân tử khác nhau
(Dowling và cộng sự, 1996). Khi có sự thay đổi về trình tự nucleotide làm thay đổi
vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn sẽ dẫn đến sự thay đổi chiều dài các đoạn
cắt. Chính sự khác nhau này đã làm nên sự đa hình của các trình tự DNA. Những
biến đổi tạo ra hoặc làm mất đi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn thường là
kết quả của đột biến trong hệ gene xảy ra theo thời gian.
Các đoạn cắt được phân tách bằng điện di và tiến hành lai theo phương pháp
Southern Blot với một mẫu dò DNA đã đánh dấu tại một vị trí locus đặc hiệu Từ
kết quả lai, có thể đánh giá được sự đa hình của locus quan tâm trên các phân tử
DNA của các cá thể khác nhau. Sự đa hình trong locus gene của một loài có thể
được sử dụng để phân biệt các cá thể, quần thể, loài.
13


RFLP có ưu điểm là một chỉ thị đồng trội (cho phép phân biệt dạng đồng hợp
tử và dị hợp tử), có tính lặp lại cao nhưng không yêu cầu biết trước thông tin về
chuỗi trình tự. Tuy nhiên, để thực RLFP, chất lượng DNA phải rất sạch và số lượng
lớn, đồng thời việc xây dựng mẫu dò phức tạp, mức độ đa hình thấp, tốn công lao
động và ảnh hưởng đến sức khỏe người nghiên cứu do có sử dụng phóng xạ.
Hiện nay, cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn
giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần
khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các enzyme cắt giới
hạn, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc nhuộm bạc. PCRRFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp

RFLP.
Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên
RAPD là chỉ thị DNA phân tử được William cùng cộng sự đề xuất năm 1990
và được hoàn thiện bởi Wilsh và Mc Clelland (1990). RAPD là chỉ thị hoạt động
dựa trên nguyên lý như sau:
Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gene giống nhau hoàn toàn thì sản phẩm PCR
thu được sẽ gồm các đoạn DNA giống hoàn toàn nhau về kích thước và cấu trúc.
Ngược lại, nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gene khác nhau sẽ quan sát được sự đa
hình giữa các mẫu. Vì vậy, chỉ thị RAPD sử dụng các mồi ngắn (8 – 20 nulecotides)
được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện phản ứng PCR đánh giá sự đa hình giữa các
cá thể.
Tuy RAPD là một kỹ thuật đơn giản, có thể thực hiện nhanh với chi phí ít
nhưng phương pháp RAPD lại có nhược điểm là chỉ thị trội và có khả năng lặp lại
thấp, dễ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố ngoại cảnh (chất lượng và số lượng khuôn
DNA, nồng độ của các thành phần phản ứng PCR...).
Phân tích DNA ty thể
DNA ty thể là vật liệu di truyền có số lượng bản sao lớn, không tái tổ hợp
nằm ở ngoài nhân được di truyền theo dòng mẹ. DNA ty thể có tỷ lệ đột biến cao
hơn 5-10 lần so với hệ gene trong nhân, đặc biệt hơn cả là vùng D-loop
(displacement loop) hay còn gọi là vùng điều khiển của DNA ty thể có tỷ lệ thay
đổi rất cao. Đây là vùng không được dịch mã, chứa các trình tự khởi đầu cho quá
trình tái bản và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gene trong vùng
14


mã hóa. Tốc độ biến đổi nhanh của DNA ty thể so với DNA trong nhân có thể là do
ty thể thiếu hụt các cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến
dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn xảy ra ngay cả trong cùng một loài
(Bruford và cộng sự, 2003). Do đó, chúng thường được sử dụng trong các nghiên
cứu về đa dạng di truyền, phân loại và nguồn gốc tiến hoá của các loài.

Sự khác nhau về trình tự DNA ty thể giữa các cá thể hay quần thể có thể
được phân tích gián tiếp thông qua việc phân tích vị trí cắt giới hạn hay trực tiếp
thông qua trình tự DNA (Cunningham và cộng sự, 1990; Loftus và cộng sự, 1994).
Trong phân tích vị trí cắt giới hạn, DNA ty thể được cắt bởi enzym giới hạn, sau đó
các đoạn phân cắt được phân tách bằng điện di trên gel. Kết quả này có thể được sử
dụng để đánh giá khác biệt di truyền và lịch sử tiến hóa của các quần thể và loài. Về
phân tích trình tự DNA, các gene ty thể được giải trình tự trực tiếp sử dụng các mồi
phổ quát hay mồi đặc hiệu loài cho phép khuếch đại các trình tự lên đến vài nghìn
cặp nucleotit. Vì các gene khác nhau trong hệ gene DNA ty thể biến đổi ở mức độ
khác nhau, các gene biến đổi nhanh có thể được phân tích để xác định mối quan hệ
của các quần thể khác nhau, trong khi các gene biến đổi chậm có thể được sử dụng
để giải đáp các câu hỏi mang tính hệ thống liên quan đến các loài có họ hàng xa.
Tuy nhiên, so với các kĩ thuật khác hạn chế của việc nghiên cứu DNA ty thể là tốn
kém công sức và chi phí do phải tách riêng ty thể khỏi tế bào. Vì vậy, việc đánh giá
đa dạng di truyền giữa các quần thể thực hiện với số lượng mẫu lớn thì việc nghiên
cứu DNA ty thể vẫn không là lựa chọn ưu điểm nhất.
2.3. Chỉ thị Microsatellite và ứng dụng trong nghiên cứu di truyền
2.3.1. Khái niệm
Microsatellite thường dùng để chỉ các trình tự DNA chứa các đơn vị lặp lại
ngắn từ 2 – 6 bp (thường là 4 bp) và có chiều dài nhỏ hơn 150 bp. Các đơn vị lặp lại
này có thể có cấu tạo từ 1 loại nucleotide hoặc cả từ 4 loại nucleotide.
Sự hình thành microsatellite đến nay vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên có hai
giả thuyết được chấp là do quá trình bắt chéo lỗi khi giảm phân hoặc do sự trượt lỗi
trong quá trình sao mã.
2.3.2. Tính chất
Ở sinh vật nhân chuẩn, microsatellite tồn tại rải rác ở những vị trí khác nhau
trong toàn bộ hệ gene và có tính đa hình cao (Tóth và cộng sự, 2000). Các
15

microsatellite đặc trưng bởi số lần lặp lại của các đơn vị lặp như (GT)n, (CA)n,
(CT)n,...Chính sự khác nhau trong số lần lặp lại này đã khiến các alleles trên cùng
một locus gene có thể có các kích thước khác nhau, tạo ra sự đa hình được ứng
dụng trong nghiên cứu.
Hiện nay, hầu hết phân tích đa hình microsatellite được dựa vào PCR. Sau
khi phát hiện các đoạn DNA mang trình tự lặp lại, cần xác định được trình tự tại các
vùng biên của các vùng lặp này. Các cặp mồi được thiết kế tương ứng dựa theo
trình tự vùng biên và để khuếch đại đoạn gene quan tâm. Kết quả kiểm tra có thể
được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản. Việc thử nghiệm nhiều cặp mồi
trong cùng một phản ứng PCR (multi-PCR) cũng thường được tiến hành nhằm tiết kiệm
thời gian và chi phí.
Xác định microsatellite trên một loài nào đó thì cũng có thể áp dụng trên
những loài khác có quan hệ gần gũi. Như vậy, chỉ thị microsatellite cung cấp một
phổ ứng dụng rộng rãi và linh động để thực hiện các nghiên cứu trên các đối tượng
khác nhau
2.3.3. Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm
-

Microsatellite là chỉ thị đồng trội, cho phép phân biệt cá thể dị hợp tử và
đồng hợp tử giữa các cá thể trong quần thể. Tính đồng trội của microsatellite
sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền

-

quần thể dựa trên chỉ thị này so với những chỉ thị khác như AFLP và RAPD.
Chỉ thị có tính đa hình cao do tỷ lệ đột biến cao (Jeffreys và cộng sự, 1988;
Weber, 1990). Ngoài ra, sự biến đổi của microsatellite là độc lập với tuổi,
giới tính, môi trường, vì vậy có thể phát hiện ở giai đoạn sớm của quá trình

-

phát triển, rút ngắn thời gian và chi phí nghiên cứu.
Có thể tự động hóa bằng máy giải trình tự tự động với mồi được đánh dấu huỳnh
quang.
Nhược điểm

-

Phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống
lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa. Điểm đột biến trong vị trí
bắt cặp của mồi trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố alen không giá trị

16


(null alen), nơi mà mồi microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong
thí nghiệm PCR.
-

Sự bắt cặp giữa mồi và trình tự đích có thể giảm tính đặc hiệu do sự phân kì
trong trình tự ở vùng liên kết. Vì vậy, chỉ thị microsatellite đòi hỏi công sức
và giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa
hình (Nguyễn Đức Thành, 2014).
2.3.4. Ứng dụng của chỉ thị microsatellite
Microsatellite được ứng dụng rộng rãi trong một loạt các nghiên cứu di

truyền phân tử như thiết lập bản đồ di truyền đối với nhiều loài sinh vật khác nhau
(Crawford và cộng sự, 1995; Vaiman và cộng sự, 1996), phân tích cấu trúc quần thể
(Bruford và Wayne, 1993; Schlötterer và Pemberton, 1994) và xây dựng mối quan

hệ di truyền giữa các quần thể (Takezaki và Nei, 1996). Microsatellite cũng cho
phép xác định các locus quy định tính trạng số lượng ở nhiều loài gia súc (Georges
và cộng sự, 1993). Ngoài ra, sự phân bố của các alen được sử dụng trong các nghiên
cứu dòng chảy gen (Gottelli và cộng sự, 1994).

17


Trong lĩnh vực thủy sản, microsatellite là một trong những chỉ thị phân tử
được lựa chọn để đánh giá di truyền các dòng thuộc các chương trình chọn giống.
Chúng cho phép phân tích biến dị di truyền và cấu trúc phả hệ nhằm tạo ra ưu thế
lai, chọn lọc các dòng được cải tiến về mặt di truyền, làm giảm giao phối cận huyết,
tăng hiệu quả trong chọn giống (Chistiakov, 2005). Một số loài cá như cá hồi Đại
Tây Dương (Salmo salar), cá bơn (Maximus scophthalmus),...và tôm (Penaeus
monodon) là các đối tượng đã được đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị
microsatellite. Tại Việt Nam, microsatellite được sử dụng nhiều trong đánh giá di
truyền trên các đối tượng như Tôm thẻ chân trắng, cá Anh Vũ...
2.4. Tách chiết DNA
2.4.1. Nguyên lý
Để thực hiện các nghiên cứu trên bộ gene, việc cần thiết trước tiên đó là tách
chiết acid nucleic ra khỏi tế bào, tạo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu. Quy trình
tách chiết này thường gồm ba bước cơ bản:
-

Phá vỡ tế bào để bộc lộ acid nucleics, chuẩn bị cho các bước tiếp theo.
Tách acid nucleics ra khỏi các thành phần khác của tế bào, đặc biệt là

-

protein.

Tinh sạch và tái hòa tan nucleic acids.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để tách chiết

DNA tổng số ra khỏi tế bào, từ các quy trình đơn giản đến phức tạp. Thông thường,
bước đầu tiên trong quá trình tách chiết đó là phá vỡ màng tế bào, màng nhân bằng
việc sử dụng các enzyme hoặc các chất tẩy rửa. Quá trình này cần phải thực hiện
cẩn thận để tránh làm đứt gãy quá nhiều các phân tử DNA, gây ảnh hưởng đến thí
nghiệm về sau (Nicholl, 2008).
Sau khi DNA tổng số đã được bộc lộ, protein trong tế bào cần được loại bỏ
để có DNA tinh sạch. Có thể sử dụng hỗn hợp phenol/chloroform để gây biến tính
protein hoặc sử dụng muối amonium acetate để kết tủa protein và tách khỏi DNA
bằng ly tâm. DNA tổng số trong dung dịch được kết tủa bằng ethanol 100% hoặc
isopropanol, sau đó được tái hòa tan trong nước tinh khiết theo nồng độ mong
muốn.
2.4.2. Kiểm tra chất lượng DNA

18


DNA sau khi tách chiết cần được kiểm tra nhằm đảm bảo chất lượng đầu vào
cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang (OD): là phương
pháp cho biết nồng độ tương đối của DNA có trong dung dịch mẫu.
Việc xác định nồng độ DNA bằng mật độ quang được thực hiện trên cơ sở
DNA có tính chất hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do có thành
phần cấu tạo từ các base nitơ. Sự hấp thụ ánh sáng ở đây được tính bằng đơn vị OD
(Optical Density). Nồng độ DNA được xác định gián tiếp qua giá trị OD 260 của dung
dịch theo quy tắc sau:
1 đơn vị OD260 = 50 μg/ml DNA sợi đôi = 33 μg/ml DNA mạch đơn.
Như vậy, nồng độ DNA mạch kép có trong mẫu là:

CDNA (μg/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha loãng.
Mặt khác, để kiểm tra độ tinh sạch của Dna, người ta đo thêm giá trị OD 280
và OD230 (bước sóng 280 nm và 230 nm lần lượt là các đỉnh hấp thụ cực đại của
protein và RNA). Dung dịch DNA tổng số được xem là sạch khi OD 260/280 =
1,8 – 2,2 và OD 260/230 = 1,8 – 2,2.
Điện di định tính DNA
Do DNA mang điện tích âm, dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA khác
nhau về kích thước, mức độ cuộn xoắn sẽ được phân tách trên bản gel phân tích do
chúng có tốc độ di chuyển khác nhau. DNA có kích thước càng lớn, tốc độ di
chuyển càng chậm và tạo vạch băng có vị trí cao hơn trên bản gel. Ngược lại, DNA
có kích thước nhỏ, dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel và tạo các dải băng ở vị trí thấp
hơn. Mỗi một băng điện di thường phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng
kích thước.
Có hai loại gel thường được sử dụng trong phân tách DNA đó là: gel agarose
và gel polyacrylamide.

19


Bảng 2.1. Mối tương quan giữa kích thước đoạn DNA phân tích và nồng độ bản gel
Nồng độ

Kích thước

agarose (%) trong gel
0,3
0,6
0,7
0,9
1,2

1,5
2,0

DNA mạch thẳng (kb)
60 – 5
20 – 1
10 – 0,8
7 – 0,5
6 – 0,4
4 – 0,2
3 – 0,1

( />
Qua việc chạy điện di phân tách DNA có thể quan sát được một cách định
tính về nồng độ và độ nguyên vẹn của DNA. Khi tách chiết DNA tổng số, yêu cầu
băng điện di có kích thước lớn, biểu thị DNA trong mẫu ít bị đứt gãy.
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.5.1. Nguyên lý
Kĩ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase
được Kary Mullis phát minh vào năm 1983. Một cách ngắn gọn, PCR được định
nghĩa là kĩ thuật cho phép nhân nhanh in vitro tạo ra số lượng lớn một đọan DNA.
Nguyên lý cơ bản của phản ứng PCR là sử dụng DNA polymerase kết hợp
cặp mồi đặc hiệu trong một chu trình nhiệt hợp lý để khuếch đại một đoạn gene
quan tâm. Đầu tiên, các phân tử DNA được biến tính thành các sợi đơn để mồi gắn
vào, sau đó DNA polymerase kéo dài mồi, tổng hợp mạch DNA mới bổ sung với
mạch khuôn. Sự biến tính, gắn mồi và kéo dài của các phân tử DNA có trong mẫu
được thực hiện lặp đi lặp lại trong suốt thời gian thực hiện phản ứng. Kết quả là số
lượng các bản sao của đoạn gene quan tâm tăng lên nhanh chóng khi kết thúc phản ứng
khuếch đại (S.B. Primrose, 2006).

20


Hình 2.2. Phản ứng PCR
(Nguồn: />
2.5.2. Thành phần phản ứng PCR
Một phản ứng PCR cơ bản gồm 6 thành phần sau:
DNA mạch khuôn
DNA mạch khuôn sử dụng trong phản ứng PCR phải có độ nguyên vẹn cao
và đạt được độ tinh sạch nhất định. Lượng DNA khuôn thường sử dụng là 20 – 100
ng trong thể tích phản ứng 20 – 100 μl. Việc bổ sung lượng DNA khuôn ban đầu
lớn thường dẫn đến việc tổng hợp các sản phẩm không đặc hiệu.
Phản ứng PCR thường chỉ được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, có
chiều dài từ 200 – 2000 bp trong khoảng 30 – 40 chu kỳ.
dNTPs
dNTPs là nguồn nguyên liệu để xây dựng các mạch DNA mới. Nồng độ của
mỗi loại dNTP (ATP, GTP, TTP, CTP) trong hỗn hợp phản ứng thường dùng là 200
mM. Nếu sử dụng dNTP với nồng độ cao có thể dẫn tới sự tương tác với Mg 2+ gây
ảnh hưởng xấu tới phản ứng. Bên cạnh đó, sự mất cân bằng trong thành phần các
dNTP có thể tăng tỉ lệ lỗi sao chép của DNA polymerase.
Ion Mg2+
Ion Mg2+ có vai trò quan trọng trong phản ứng PCR. Chúng hình thành các
phức chất ở dạng hòa tan với dNTP, giúp dNTP liên kết lại với nhau. Đồng thời,
Mg2+ có thể tăng cường hoạt tính trùng hợp của polymerase. Vì vậy, nếu nồng độ
21


Mg2+ thấp thì hiệu suất của phản ứng PCR giảm. Tuy nhiên nếu nồng độ này cao thì
dẫn đến sự tích lũy sản phẩm không đặc hiệu.
Nồng độ Mg2+ thường sử dụng là 2 mM, tuy nhiên còn phụ thuộc vào loại

enzyme, DNA mẫu và dung dịch đệm sử dụng.
Taq polymerase
Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus
aquaticus. Khả năng chịu nhiệt của DNA polymerase này là cơ sở để áp dụng nó
trong chu trình nhiệt của phản ứng PCR.
Thông thường, sử dụng 1 – 2 đơn vị enzyme/ 25 μl thể tích PCR. Nếu nồng
độ enzyme quá ít, không tạo đủ lượng sản phẩm cần thiết. Ngược lại, nếu nồng độ
enzyme quá cao dẫn đến sự xuất hiện của các sản không chuyên. Hàm lượng
enzyme sử dụng phụ thuộc vào DNA khuôn và số chu kỳ phản ứng.
Hiện nay do một số hạn chế của Taq polymerase (như thiếu chức năng sửa
lỗi trên mạch DNA mới, ghép nhầm dNTP...) người ta đã phát triển một số loại
DNA polymerase sử dụng trong phản ứng PCR như Tli – và Pfu – polymerase hoặc
recombinant Taq polymerase.
Mồi
Mồi là các đoạn oligonucleotide ngắn, thường có chiều dài từ 18 – 25
nucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn, có chức năng làm
mồi khởi động để DNA polymerase thực hiện phản ứng sao chép. Cặp mồi thiết kết
cần có đủ các đặc trưng sau:
-

Tính đặc hiệu (Specificity): đặc hiệu cho trình tự mục tiêu nhân lên, tránh
gây hiện tượng lai không đặc hiệu. Nên có 45 – 60% G/C nhưng không nên
chứa poly G hoặc poly C, vị trí đầu 3’ nên kết thúc bằng G hoặc C để tránh
hiện tượng bắt cặp nhầm. Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ
CACACA) hoặc chuỗi lặp đơn (TTTT) để tránh bắt cặp nhầm.

-

Tính ổn định (Stabililty): hình thành dạng sợi đôi bền vững với DNA khuôn.
Nhiệt độ nóng chảy của giữa mồi xuôi và mồi ngược không nên chênh nhau

quá 5oC. Nhiệt độ gắn mồi nên gần tiến sát tới nhiệt độ nóng chảy để có được
sự liên kết tốt nhất giữa mồi và DNA khuôn.
22


-

Tính tương thích (Compatibility): mồi được dùng như một cặp nền cần hoạt
động được trong cùng điều kiện PCR.
Thời gian gắn mồi dao động 30 – 60 giây với nồng độ mồi sử dụng khoảng

từ 100 đến 500 nM.
Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước sạch, loại bỏ ion để tránh gây
tạp nhiễm cho phản ứng.
2.5.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm có các giai đoạn chính sau: biến
tính, gắn mồi và kéo dài.
Giai đoạn biến tính (Denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép được duỗi
xoắn và tách nhau ra dưới tác động của nhiệt độ cao (94 – 95oC).
Giai đoạn gắn mồi (Annealing): khi nhiệt độ phản ứng giảm xuống (55 –
60oC), các mồi gắn vào các sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung.
Giai đoạn kéo dài (Extension): phản ứng trùng hợp phân tử DNA được thực
hiện nhờ DNA polymerase ở khoảng 72oC để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên
tắc bổ sung với sợi khuôn.

23


PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Khóa luận được tiến hành từ 8/2016 – 12/2016 tại Trung tâm Công nghệ sinh
học Thủy sản (Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng Thủy sản I) và Khoa Công nghệ sinh
học (Học viện Nông nghiệp Việt Nam).
3.2. Đối tượng nghiên cứu
Cá Lăng Chấm (Hemibagrus guttatus Lacepède, 1803).
3.3. Nội dung nghiên cứu
• Tách chiết DNA tổng số 4 quần đàn cá Lăng Chấm.
• Lựa chọn và tối ưu 3 cặp chỉ thị microsatellite cho cá Lăng Chấm.
• Tiến hành PCR đoạn gene cần quan tâm.
• Điện di trên hệ thống GeXP.
• Đọc kết quả và phân tích số liệu sau thí nghiệm để xác định mối quan hệ
di truyền của các quần đàn cá Lăng Chấm.
3.4. Vật liệu nghiên cứu
3.4.1. Vật liệu
Mẫu vây ngực của bốn quần thể cá Lăng Chấm có nguồn gốc khác nhau thu
nhận từ Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Giang và Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản
nước ngọt Miền Bắc.
3.4.2. Dụng cụ, hóa chất
Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất được sử dụng để tiến hành thí nghiệm của
đề tài được trình bày trong các bảng dưới đây:

24


STT Tên thiết bị

Xuất xứ

1

Pipette

2

Ống eppendorf

Đức

3

Đầu côn

Đức

4

Panh, kéo

Việt Nam

5

Máy voltex

Mỹ

6

Máy khuấy từ

Đức

7

Hệ thống máy điện di

Anh

8

Hệ thống buồng chụp UV

Anh

9

Máy ly tâm lạnh 5804R

Đức

10

Máy ly tâm thường

Đức

11

Máy đo Nanodrop

Đức

12

Cân phân tích

Mỹ

13

Lò vi sóng

Trung Quốc

14

Bể ổn nhiệt

Đức

15

Hệ thống máy giải trình tự genBộ gen Lab GeXP

Mỹ

16

Tủ hút khí độc Esco ADC-4B1

Đức

17

Tủ lạnh sâu –25 ºC
Tủ lạnh 4ºC

18

Phần Lan

Nhật Bản

PCR tốc độ cao Eppendorf
Đức
Bảng 3.1. Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Bảng 3.2. Các dung dịch hóa chất sử dụng

STT
1

Dung dịch
Solution 1 (100 ml)

3
4
5
6

Solution 2
(Amonium axetat 7,5M)
Protein K (20 mg/ml)
Đệm TAE 1X (100 ml)
Ethanol 70% (100 ml)
Gel agarose 0,8% (70 ml)

7

Gel agarose 2% (70ml)

2

Thành phần
H2O cất hai lần + 0,121 (g) Tris HCl 10mM + 3,72
(g) EDTA 100mM + 2 (g) SDS 2%; pH = 8,0
56,25g Amonium axetat + 100ml H2O
0,01g Protein K + 500µl nước deion
1 ml TAE 50X + 90 ml H2O cất hai lần
30 ml H2O cất hai lần + 70 ml Ethanol 100%
0,56 g agarose + 70 ml TAE 1X
1,4 g agarose + 70 ml TAE 1X
25