ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN HEO RỪNG TÂY NGUYÊN ( Sus crofa )

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
= = = =*** = = = =

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH GEN CAST TRÊN
HEO RỪNG TÂY NGUYÊN ( Sus crofa )
TS. Nguyễn Văn Hạnh
Viện công nghệ sinh học
Giáo viên hướng dẫn

:
TS. Nguyễn Hữu Đức
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Sinh viên thực hiện

:

Trần Thị Loan

Lớp

:

K58CNSHD

Mã sinh viên

:

586926

Hà Nội – 09/2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do chính tôi trực tiếp thực hiện.Các
số liệu và kết quả được công bố trong khóa luận là hoàn toàn trung thực, chính xác và
chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

Sinh viên

năm 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn
Hạnh, phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh là người đã trực tiếp hướng dẫn, đã
tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, đồng thời tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu
Đức – Phó trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học động vật
– Khoa Công nghệ sinh học – Học viện nông nghiệp Việt Nam đã luôn bên cạnh, chỉ bảo,
hướng dẫn, động viên và cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình hoàn

thành khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Việt Linh, ThS. Đỗ Trung Kiên, đã luôn
tận tình chỉ bảo,luôn theo sát thí nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ ích và kịp
thời cho tôi ngay từ những ngày đầu tiên tôi bước vào phòng thí nghiệm.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học,
Học viện nông nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập
tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến bố, mẹ và toàn thể những
người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi trong
suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

Sinh viên

năm 2016


MỤC LỤC

4.1 Kết quả tách chiết DNA
4.2 Nhân gen CAST và xác định đa hình gen CAST
4.2.1 Kết quả nhân gen CAST
4.2.2 Xác định đa hình gen CAST bằng PCR - RFLP
4.3 Tần số kiểu gen và tần số alen
4.4 Mối liên kết giữa năng suất thịt heo rừng với đa hình gen CAST
4.5 Mối liên kết giữa chất lượng thịt heo rừng với đa hình gen CAST
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận
5.2 Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO


PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Đặt vấn đề
Heo rừng là loài vật nuôi mới phổ biến hiện nay ở nhiều tỉnh thành trong cả nước bởi
phẩm chất thịt thơm ngon, gần như không có mỡ, ít cholesteron và đặc biệt có da dầy, giòn
ngậy.Nhờ nguồn thức ăn tự nhiên nên thịt heo rừng được xem là loại thực phẩm sạch,
thơm ngon và bổ dưỡng, mặc dù được đưa vào thực đơn của các nhà hàng chưa lâu nhưng
loại thịt đặc sản này đã nhanh chóng được người tiêu dùng Việt Nam ưa chuộng, và còn
xuất đi các thị trường trên thế giới.Phong trào chăn nuôi heo rừng ngày càng lan rộng do
giá thịt hơi khá hấp dẫn và nhu cầu tiêu dùng đang ngày càng tăng mạnh.Trước nhu cầu
của thị trường,các tính trạng liên kết với chất lượng thịt: tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc và độ
ngọt của thịt đang rất được quan tâm nghiên cứu.Với sự phát triển của các kỹ thuật hiện
đại trong sinh học, đã hình thành xu hướng nghiên cứu chọn lọc giống vật nuôi dựa vào
các chỉ thị ADN. Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị ADN, sẽ rút ngắn thời gian
và tăng khả năng chính xác và hiệu quả chọn lọc. Do vậy, nhiều công trình phân tích đa
hình gen của các giống heo chung và của heo rừng nói riêng ngày càng xuất hiện nhiều.
Nghiên cứu để tìm ra mối liên kết của đa hình gen với các tính trạng kinh tế của các giống
heo rừng ( đặc biệt là heo rừng Tây Nguyên) rất quan trọng trong công tác giống.
Nhờ thành tựu giải mã gen ở heo và sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền
phân tử, đã có rất nhiều chỉ thị di truyền phân tử liên quan đến các tính trạng có ý nghĩa
kinh tế của heo như tốc độ sinh trưởng, chất lượng thịt, tỷ lệ nạc, khả năng sinh sản, chống
chịu bệnh…đã được xác định. Cho đến nay, có rất nhiều gen ảnh hưởng đến chất lượng
thịt đã được xác định như: CAST, MYF5, RYR1 … Nhưng theo Brym và Kaminski
(2006) có bốn gen ảnh hưởng mạnh nhất là: RYR1, PRKAG3, CAST và IGF2. Gen
calpastatin (CAST) là một trong những gen có vai trò quan trọng trong đa dạng di truyền
ảnh hưởng đến chất lượng của thịt như độ mềm, độ rỉ dịch, hương vị. Ở heo, CAST nằm

trên nhiễm sắc thể 2 (2q2.1- 2q2.4) (Ernst et al., 1998). Kết quả nghiên cứu của
Rybarczyk et al. (2008) cho thấy đa hình gen CAST/HinfI có ảnh hưởng đến chất lượng
thịt của heo, cụ thể là kiểu gen AB có ảnh hưởng đến thịt đùi, bắp thịt, còn kiểu gen BB và
AA thì ảnh hưởng đến thịt thăn. Bên cạnh đó, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều
nghiên cứu đa hình và đánh giá tần số kiểu gen CAST trên một số giống heo (Meishan,
Landrace, Yorkshire, Duroc, Pietrain, Hampshire và các tổ hợp lai thương phẩm của
chúng) cũng cho thấy đa hình này có ảnh hưởng đến chất lượng thịt.Chính vì vậy,chúng
tôi tiến hành xác định tính đa hình của một số gen liên quan đến chất lượng thịt heo rừng ,
góp phần phát triển chỉ thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống thông qua
việc nghiên cứu “ Phân tích đa hình gen CAST trên heo rừng Tây Nguyên’’
-

1.2. Mục tiêu
Sàng lọc được một số điểm đa hình nucleotide (SNPs) trong gen CAST trên các giống heo
Tây Nguyên nghiên cứu.


-

-

Tìm được mối tương quan giữa các SNPs đặc trưng trong gen CAST ảnh hưởng đến chỉ số
tăng trọng và chất lượng thịt heo rừng Tây Nguyên.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Thu thập 34 mẫu lợn rừng Tây Nguyên: 18 mẫu lợn đực và 16 mẫu lợn cái
Tách chiết DNA từ mẫu tai heo rừng Tây Nguyên
Đánh giá đa hình kiểu gen CAST
Phân tích mối tương quan giữa các SNPs đặc trưng liên kết với tính trạng tăng trọng và
chất lượng thịt heo rừng Tây Nguyên.
Thu thập hình ảnh, phân tích kết quả và viết báo cáo.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của heo rừng
2.1.1 Nguồn gốc
Heo rừng thuộc giới động vật (Animalia), ngành dây sống (Chordata), phân ngành có
xương sống(Vertebrata), nhóm động vật có hàm (Gnathosomata), lớp có vú (Mamalia),
phân lớp thú cao hay thú có nhau (Eutheria), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ heo (Sus),
loài heo rừng (Sus Scrofa).
Theo tài liệu trường Đại học University of Michichan Museum of Zoology (2006),
heo rừng có tên khoa học là Sus scrofa. Heo rừng bắt nguồn từ Châu Âu, Châu Á và Bắc
Phi.Tuy nhiên theo chân con người, nay đã có mặt nhiều nơi trên thế giói. Sống chủ yếu
vùng núi, ẩm ướt.
Heo rừng là giống heo hoang dã đang được thuần hóa, được chia thành hai nhóm
giống: nhóm giống mặt dài và nhóm giống mặt ngắn.
Heo rừng hay còn được gọi là lợn lòi, được coi là tổ tiên của heo nhà.
2.1.2 Đặc điểm ngoại hình
Heo rừng có thân hình cân đối, nhanh nhẹn, di chuyển linh hoạt, hơi gầy, dài đòn,
lưng thẳng, bụng thon, chân dài, nhỏ và móng nhọn, cổ dài, đầu nhỏ, mõm dài và nhọn, tai
nhỏ vểnh và thính, mũi rất thính và khỏe, gốc chân lông có 3 ngọn, lông mọc theo sống
lưng và cổ dày. Phần vai trước thường cao hơn chân sau làm cho hình dạng của heo rừng
vai cao mông thấp. Mông, bụng gọn, đuôi dài không bao giờ cong uốn lại như heo nhà và
luôn ve vẩy. Hai vai và bên trên của 2 chân phía trước đều có u hoặc tấm mỡ sụn lồi ra
thành chai cứng. Độ lớn và dày của u chai cứng hoặc tấm mỡ sụn này tăng theo tuổi (3 - 5
cm). Mặt heo rừng dài, mõm nhọn, tai nhỏ dựng đứng ép sát đầu. Mắt to, lồi, màu đen, híp
phần cuối đuôi mắt, tia nhìn dữ tợn. Mũi heo rừng mềm nhưng mạnh khỏe phù hợp với
phương thức kiếm ăn trong cuộc sống hoang dã của chúng là đào bới đất, dũi mô đất mới
để đào củ, gốc cây, các côn trùng...Răng nanh là đặc điểm nổi bật của heo rừng. Răng nanh
mọc dài ra khỏi mõm khi lợn 2 - 4 năm tuổi. Heo rừng có 4 răng nanh dài, mỗi bên mọc 2
cái, mỗi cái mọc ở 1/4 hàm. Heo rừng là động vật ăn tạp nên ngoài đặc điểm răng nanh

phát triển đặc biệt trên thì heo rừng cũng giống như các động vật nuôi con bằng sữa khác
về sự không phát triển lắm của hệ thống răng, heo rừng có 44 răng. Răng cửa phía hàm
dưới dài, hẹp và chìa thẳng ra phía trước để làm nhiệm vụ như cái xẻng. Răng hàm trong,
răng cấm mọc trong cùng có cỡ rất lớn bằng với răng hàm cái thứ nhất và thứ 2 cộng lại.
Cấu tạo của xương mặt và xương hộp sọ làm heo rừng có hàm mõm dài, phần này thường
chiếm 75% đầu lâu sọ.Trên sống lưng heo rừng từ trán cho đến sát đuôi có mào lông
(bờm), mỗi sợi lông dài khoảng 6 - 15 cm.Riêng heo rừng con trong 4 tháng đầu tiên có bộ
lông sọc dưa rất đẹp được tạo bởi những đường vằn màu nâu vàng lẫn trắng chạy dài theo
thân mình hoặc màu nâu nhạt hoặc đỏ nhạt chạy trên nền lông đen tùy giống. Bộ lông này


giúp lợn con ngụy trang để giấu mình và đánh lạc hướng kẻ thù trong môi trường tranh tối
tranh sáng trong rừng.Trong khoảng 2 - 6 tháng, các sọc dưa nhạt màu dần và ở 1 năm tuổi,
chúng có bộ lông chính thức mang màu đặc trưng của giống ổn định cho đến khi chết.
2.1.3 Khả năng sinh trưởng và sinh sản của giống heo rừng
Chúng thường đẻ mỗi năm 2 lứa, mỗi lứa từ 8 – 12 con. Heo sơ sinh có trọng lượng
0,5 – 0,9kg/con. Heo rừng 7 – 8 tháng tuổi có thể trọng 30 – 50kg. Có chu kỳ động dục là
21 ngày, động dục trong 3 ngày liên tục, thời gian chửa là 115 ngày (100-140) ngày. Số
con đẻ 1 lứa là 1 đến 12 con, trung bình là 4 đến 8 con. Tuổi thành thục sinh dục là 8-10
tháng tuổi, nhưng thường đẻ lần 1 sau 18 tháng và tuổi đẻ đến 5 năm. Cho con bú đến 3-4
tháng. Có tuổi thọ đến 27 năm. Sống thành từng đàn có khi đến 100 con và thường là 20
con.Chúng có những điểm đa hình đặc trưng, phân biệt với heo rừng các nước và có mối
quan hệ di truyền gần gũi với heo rừng châu Á, tuy nhiên hoàn toàn khác biệt với heo rừng
lai Thái Lan về mặt di truyền.
 Các đặc điểm về khả năng sinh sản:
-

Tuổi động dục lần đầu: 6 - 7 tháng tuổi

-

Trọng lượng động dục lần đầu: 18 - 20 kg

-

Tuổi phối giống: 7 - 8 tháng tuổi

-

Trọng lượng lúc phối: 30 - 35 kg

-

Thời gian mang thai: 110 - 130 ngày

-

Thời gian động dục: 2 - 3 ngày (đối với nái tơ) và 3 - 4 ngày (đối với nái rạ)

-

Chu kỳ động dục: 20 - 22 ngày

-

Hệ số đẻ: 1,2 - 1,3 lứa/năm

-

Số con mỗi lứa: 5 - 8 con

2.2 Chất lượng thịt của giống heo rừng Tây Nguyên
Thịt heo rừng vốn được xem là đặc sản, được nhiều người ưa chuộng vì thịt heo rừng
săn chắc nhờ vận động liên tục, heo rừng được hấp thụ những chất bổ dưỡng từ nguồn
thức ăn là cây cỏ tự nhiên nên thịt heo rừng nhiều nạc, ít mỡ, da giòn. Thịt heo rừng chắc,
ngọt thịt, thơm, hàm lượng cholesteron thấp, rất được ưa chuộng. Hiện nay thịt heo rừng
thuộc loại đặc sản, thị trường có nhu cầu tiêu thụ nhiều, giá bán cao.
Thịt heo rừng chứa 17% protein, 0,5% lipid, có vị ngọt, tính bình, không độc, có tác
dụng tư bổ, nhuận da, trị hư nhược, trừ kinh giản, cầm máu, chữa sốt rét, động kinh, băng
huyết, kiết lỵ ra máu.


Thịt heo rừng còn giúp ta bù đắp được những loại vitamin mà rau củ và trái cây không
có hoặc có rất ít.Chẳng hạn như vitamin B1, B2, B6, B12, A và D. Vitamin B1 có vai trò
là chất xúc tác trong quá trình chuyển hóa các chất thành năng lượng, tăng cường hoạt
động của não bộ, giúp cơ thể chống lại mệt mỏi, suy nhược.Lượng vitamin B1 trong thịt
lợn rừng còn cao hơn gấp 6 đến 10 lần so với loại thịt khác.Vitamin B2 thì có tác dụng đào
thải độc tố và tốt cho làn da.Nếu thiếu loại vitamin này thì sẽ có nguy cơ cao mắc phải các
bệnh viêm da, nhất là ở phụ nữ.Trong thịt nạc heo rừng có chứa nhiều vitamin nhóm B
tương đối cao. Nhóm Vitamin B này giúp thúc đẩy chuyển hóa Carb, Fat, Protein thành
Glucose dành cho các hoạt động cơ bắp. Vitamin A thì lại có vai trò giúp cho đôi mắt
được sáng khỏe, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Còn vitamin D giữ vai trò quan
trong trong việc hấp thu canxi cho xương chắc khỏe.
2.3 Năng suất và phẩm chất thịt heo
2.3.1 Các chỉ tiêu đánh giá năng suất thịt
Tỷ lệ thịt xẻ của heo cao khoảng 70% so với bò 55% và dê cừu 50%. Tỷ lệ phần thịt
có giá trị cao (thăn, đùi sau) chiếm gần 50% so với thịt xẻ. Hàm lượng protein có trong thịt
heo khoảng 20%. Và phẩm chất thịt heo tốt sẽ có màu hồng, mịn, đàn hồi, thịt sẽ không bị
tái màu, rỉ dịch và có vị chua. Đánh giá năng suất quày thịt để xác định đặc điểm về giống
heo và các giai đoạn nuôi thịt, vỗ béo.Ngoài ra, còn đánh giá chỉ tiêu khẩu phần ăn, các

chế độ kích thích sinh trưởng khác nhau (Lê Thị Mến, 2010). Năng suất chăn nuôi heo thịt
là chỉ tiêu rất quan trọng, nó ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi heo. Đặc biệt
trong nền kinh tế thị trường như hiện nay thì yếu tố năng suất liên quan trực tiếp đến sự
thành công hay thất bại của các cơ sở chăn nuôi. Một số chỉ tiêu chính thường dùng đánh
giá năng suất chăn nuôi heo như sau: khối lượng hơi (khối lượng heo trước khi giết mổ sau
khi cho nhịn ăn trong 24 giờ), khối lượng móc hàm (khối lượng sau khi đã chọc tiết, cạo
lông, lấy hết cơ quan nội tạng), tỷ lệ móc hàm, khối lượng thịt xẻ (từ khối lượng móc hàm,
cắt đầu, 4 chân và bóc 2 lá mỡ bụng), tỷ lệ thịt xẻ, độ dày mỡ lưng, độ dài thăn thịt, diện
tích cơ thăn (Nguyễn Thiện và Võ Trọng Hốt, 2007).
2.3.2 Các chỉ tiêu đánh giá phẩm chất thịt
Đánh giá chất lượng thịt là phần quan trọng để xác định sự thành công của chăn nuôi
heo. Thông qua quá trình đánh giá chất lượng thịt, các nhà chăn nuôi có thể đánh giá được
hiệu quả chọn lọc giống và quản lý (Hội Đồng Hạt Cốc Chăn Nuôi Mỹ, 1996). Chất lượng
của thịt thường do một số yếu tố cấu thành như: màu sắc, độ chắc, độ đóng vân mỡ, tính
giữ dịch chất và hình thái bên ngoài. Đối với người tiêu dùng để lựa chọn thịt tốt thì họ
thường hay dựa vào màu sắc, độ mềm, tính chất giữ dịch và mùi của sản phẩm sau khi nấu
(Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2000).
 Màu sắc
Theo hệ thống phân loại thịt thông thường có ba nhóm:
PSE (pale, solf exudative): thịt có màu tái, mềm và rỉ dịch (pH < 5,3)
RFN (normal): thịt có màu đỏ hồng, đàn hồi và dịch hơi dính tay (pH 5,4-5,7)
DFD (dark, firm and dry): thịt sậm màu, cứng và khô (pH > 6)
Thịt tươi có màu đỏ tươi hoặc màu hồng đỏ thẩm. Màu đỏ này là do hàm lượng sắc
tố cơ (myoglobin), là loại protein hòa tan trong nhục chất. Sắc tố cơ là nơi dự trữ oxy dành
cho hoạt động của tế bào cơ. Hàm lượng sắc tố thay đổi tùy theo giống heo, tuổi, sự vận


động của bắp cơ và vị trí cơ thể học. Những bắp cơ nào hoạt động càng nhiều thì máu
cung cấp càng lớn và đòi hỏi oxy càng nhiều nên bắp cơ càng sậm màu. Các bắp cơ chạy
dọc theo sống lưng (thịt thăn), vùng đùi có cơ bán màng, cơ bán gân, cơ nhị đầu đùi

thường nhạt màu hơn các bắp cơ khác.
Phân loại thịt dựa vào cách cho điểm màu sắc, thể chất mô cơ lúc 24 giờ sau khi hạ
thịt bảo quản lạnh được đề nghị như sau: tái nhạt (P), đỏ (R) và sẫm (D). Màu cơ sẫm có
thể do tăng số lượng chất tạo màu trong thức ăn, do các va chạm trước khi giết mổ, thiếu
diện tích tiếp xúc với oxy hoặc diện tích thoát nước, hoặc sản sinh tối thiểu acid lactic
trong quá trình làm lạnh. Màu hồng xám nhạt có thể gây ra do sự chuyển hóa nhanh
glycogen trong cơ thành acid lactic sau khi giết mổ. Thịt màu sẫm có thời gian tươi ngắn
vì thiếu acid và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển (Hội Đồng Hạt Cốc Chăn
Nuôi Mỹ, 1996).
 Độ vân mỡ
Vân mỡ có quan hệ mật thiết với giá trị dinh dưỡng và phẩm chất thịt heo, miếng thịt
có cả mỡ và nạc xen lẫn vào nhau thì hấp dẫn hơn, thơm ngon hơn, có giá trị dinh dưỡng
cao hơn. Độ vân mỡ là sự tích mỡ giữa các bó sợi cơ trong thịt nạc mà ta có thể nhìn thấy
được. Sự đóng vân mỡ ít cho thịt ngọt và ngon sau khi nấu chín. Nếu vân mỡ quá ít hoặc
thiếu vân mỡ thì thịt có thể không ngon và ít ngọt như mong muốn. Trái lại, quá nhiều vân
mỡ cũng không làm cho thịt ngon hơn và dễ bị ngán ăn, người tiêu thụ không ưa thích.
Thường thì tổng số acid béo không no trong thịt nạc cao hơn mỡ dưới da. Cơ thể con
người không tổng hợp được các acid béo thiết yếu không no này (acid linoleic và acid
linolenic). Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipid từ 2,5-3,5% là cần thiết cho bữa
ăn có chất lượng cho con người.(Nguyễn Thiện và Võ Trọng Hốt, 2007).
 Độ mềm và tính giữ dịch chất
Độ rỉ dịch rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá trình chế biến, tồn trữ cũng
như phân phối cho người buôn bán lẻ. Độ mềm và tính giữ dịch chất có liên quan
đến kết cấu mô học và sinh hóa của thịt. Đặc tính của protein thịt là dễ bị biến tính
bởi nhiệt độ cao, độ acid (pH thấp) và nồng độ muối. Khi độ pH giảm sẽ dẫn đến
làm siết chặt các chuỗi polypeptide từ đó làm cho độ rỉ dịch của thịt giảm. Thịt tái
màu thì độ rỉ dịch cao , ngược lại thịt sậm màu thì độ rỉ dịch thấp
(pH >6) Như vậy, độ rỉ dịch của thịt liên quan chặt chẽ với độ pH (Nguyễn Thiện và Võ
Trọng Hốt, 2007).
Acid lactic là sản phẩm của sự thủy phân glycogen ở cơ trong điều kiện kỵ khí,

làm cho pH thịt giảm dần sau khi hạ thịt và phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng dự
trữ glycogen trong bắp cơ. Thú khỏe mạnh, nuôi dưỡng tốt, nghỉ ngơi đầy đủ, không
bị stress trước khi giết mổ thì pH bắp cơ giảm dần từ khoảng 7,2-7,0 xuống 5,6-5,4.
Tốc độ sản sinh acid tăng nhanh trên những con heo bị stress, sốt trước khi hạ thịt
hoặc bị kích động trước khi hạ thịt, dẫn đến tình trạng PSE ở thịt. Trái lại, thú bị
kiệt sức, năng lượng dự trữ thấp do stress và do nhịn ăn quá 16 giờ trước khi hạ thịt
thì pH cuối cùng đạt 6,3, hậu quả là thịt bị DFD. Sau ki nấu chín thịt PSE trở nên
dai, nhạt nhẽo và có vị chua. Thịt DFD giữ chất dịch tốt hơn nhưng khô và cứng.
Hai loại thịt này đều không hấp dẫn người tiêu dùng. Người tiêu dùng không thích
chọn quày thịt PSE hay DFD vì khó chế biến, không ngon và dễ bị hư hỏng bởi vi
sinh vật. Do đó nên tối đa hạn chế việc gây stress cho heo trong lúc vận chuyển và
giết mổ, hạ thịt đúng cách và hạ nhanh nhiệt độ thân thịt sau khi giết mổ (Nguyễn
Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2000).


 Độ pH của thịt

Độ pH của thịt thường được đo sau khi giết mổ khoảng một giờ và sau khi giữ
lạnh 24 giờ. Thông thường pH giảm mạnh từ sau khi giết mổ đến 45 phút, sau đó
giảm chậm dần, tùy quày thịt mà pH khác nhau sau 24 giờ. Nếu thịt có độ pH giảm
chậm sau khi giết mổ và đạt mức 6,2 thì thường đây là loại thịt DFD, tức là loại thịt
có màu đậm, chắc và khô. Nếu sau khi giết mổ pH giảm cực nhanh trong 45 phút
đến mức từ 5,0 đến 5,3 và kéo theo đó là nhiệt độ thịt tăng lên đến 42-43°C, rồi độ
pH tăng lên đạt 5,4-6,0 vào lúc 24 giờ thì đây là thịt PSE, tức thịt có màu nhạt, mềm
và rỉ dịch. Nếu sau khi giết mổ độ pH giảm dần dần và đạt khoảng 6,2 trong 45
phút, sau đó đạt mức 5,8-5,9 vào lúc 24 giờ thì đây là thịt bình thường (Nguyễn
Thiện và Võ Trọng Hốt, 2007).Ngoài ra, đánh giá chất lượng thịt heo còn căn cứ vào các
thành phần trong thịt: vật chất khô, protein, lipid và chỉ số iod. Heo đạt tỷ lệ thịt cao và
phẩm chất thịt tốt thì trong 100 g thịt nạc có khảng 18 tới 21 g protein và 126,8 kcal năng
lượng. Nếu sử dụng thức ăn có nhiều lipid thì sẽ cho mỡ heo có chỉ số iod gần giống như

của thức ăn. Qua nhiều thí nghiệm người ta kết luận rằng acid béo heo ăn vào cơ thể hình
thành nên mỡ cơ thể, vì vậy mỡ cơ thể có tính chất tương tự như tính chất lipid của thức ăn
(Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2000).
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất thịt
Dinh dưỡng: là yếu tố quan trọng nhất trong các yếu tố ngoại cảnh chi phối
đến sinh trưởng và khả năng cho thịt của heo. Lượng thức ăn cho ăn cũng như thành
phần dinh dưỡng của thức ăn sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ tăng trọng của heo.
Mức cho ăn cao sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng và chất lượng thịt xẻ khi heo đạt
khối lượng 90 kg (Nguyễn Thiện và Võ Trọng Hốt, 2007). Năng lượng và protein là
yếu tố quan trọng giúp cho việc điều khiển tốc độ tăng trọng, tỷ lệ nạc và tiêu tốn
thức ăn của heo thịt. Thức ăn có mức độ dinh dưỡng khác nhau cũng ảnh hưởng đến
phẩm chất thịt. Các khẩu phần có mức năng lượng cao và mức protein thấp thì heo
sẽ tích lũy mỡ nhiều hơn so với những khẩu phần có mức năng lượng thấp, hàm
lượng protein cao. Bổ sung các acid amin cần thiết vào khẩu phần như lysine thì
tăng trọng cao, tỷ lệ nạc cao, giảm lượng mỡ thân thịt, tăng diện tích cơ dài lưng và
tiết kiệm lượng protein ăn vào.
Môi trường xung quanh: nhiệt độ và ẩm độ ảnh hưởng chủ yếu đến năng suất
thịt. Ở nhiệt độ cao và ẩm độ cao cơ thể phải tăng cường quá trình tỏa nhiệt thông
qua hô hấp để cân bằng nhiệt. Ngoài ra khi nhiệt độ cao sẽ làm cho heo thu nhận
thức ăn giảm, ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa thức ăn. Nhiệt độ thấp thì cũng
ảnh hưởng đến tăng trọng và tăng cường quá trình trao đổi chất của heo. Các nhân
tố stress cũng ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và sức sản xuất của heo như nhiệt độ
chuồng nuôi, tiểu khí hậu, cho ăn không theo khẩu phần, cân gia súc…(Nguyễn
Thiện và Võ Trọng Hốt, 2007)
Sức khỏe và khối lượng ban đầu: sức khỏe và khối lượng cai sữa ảnh hưởng
chủ yếu đến năng suất. Khối lượng cai sữa có ảnh hưởng đến khối lượng xuất
chuồng. Có một mối tương quan dương chặt chẽ giữa khối lượng bắt đầu nuôi và
khối lượng giết thịt có thể làm một chỉ số chọn lọc (Nguyễn Thiện và Võ Trọng
Hốt, 2007).
Phái tính: theo Nguyễn Thiện (2009), thú thiến có sự suy giảm về trao đổi chất

ở cả thú đực và thú cái, sự ảnh hưởng này biểu hiện rõ hơn ở thú đực. Nguyên nhân


là do kích thích tố sinh dục làm tăng trao đổi chất ở cả thú đực và thú cái. Các chỉ
tiêu năng suất cũng như phẩm chất thịt giữa heo đực, heo đực thiến và heo cái thì
khác nhau. Heo đực không thiến sẽ có mùi đặc trưng của con đực, mức độ mùi phụ
thuộc vào tuổi giết thịt, tốc độ tăng trưởng, mức độ thành thục sinh dục...mùi này có
ảnh hưởng không tốt đến chất lượng thịt. Con đực ngoại thường có tốc độ tăng
trọng cao, hệ số chuyển hóa khẩu phần cũng như độ dày mỡ lưng thấp hơn những
con đực thiến và con cái. Tuy nhiên heo đực nội thì có thời gian thành thục về tính
sớm hơn.
Tuổi: tuổi giết thịt của heo có ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất thịt. Nếu
giết thịt sớm thì năng suất thấp vì giai đoan này tăng trọng chưa cao. Nhưng nuôi
kéo dài thì mức tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng cao. Khi tuổi tăng, mỡ trong cơ,
nitơ trong protein tăng lên. Tuổi giết thịt từ năm đến tám tháng tùy theo giống, chế
độ dinh dưỡng, giá cả thị trường.
Di truyền: các tính trạng kinh tế như năng suất thịt, phẩm chất thịt, sức kháng
bệnh tự nhiên…thường được kiểm soát bởi nhiều gen. Đến nay có khoảng vài ngàn
gen ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất thịt đã được nghiên cứu và đánh giá.
Di truyền: các tính trạng kinh tế như năng suất thịt, phẩm chất thịt, sức kháng
bệnh tự nhiên…thường được kiểm soát bởi nhiều gen. Đến nay có khoảng vài ngàn
gen ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất thịt đã được nghiên cứu và đánh giá
(Nguyễn Thiện và Võ Trọng Hốt, 2007)
2.4. Gen Calpastatin
2.4.1 Sơ lược về gen Calpastatin
Tên calpastatin (CAST) lần đầu tiên được đề xuất cho protein đặc hiệu ức chế
calpains vào năm 1979 bởi Takashi Murachi. Calpastatin chỉ có mặt trong các mô
động vật có xương sống, còn bộ gen của Drosophila (ruồi giấm), C. elegans, và
nấm Saccharomyces cerevisiae không chứa chuỗi calpastatin (Goll et al., 2004).
CAST là chất nội sinh đặc hiệu tác động ức chế cysteine protease kích hoạt

canxi bởi calpains trong các tế bào động vật. Nó quy định về tốc độ và mức độ mềm
thịt sau khi chết. Các hoạt động của calpastatin có liên quan chặt chẽ với tốc độ tăng
trưởng và tỷ lệ trao đổi chất, phân giải protein và độ dai của thịt (Goll et al., 2004).
Ở heo gen CAST đã được xác định nằm trên nhiễm sắc thể 2 (2q2.1-2q2.4) (Ernst et
al., 1998). Nhân bản trình tự cho thấy rằng CAST là một polypeptide ức chế đa đầu
(Takano et al, 2004)
2.4.2 Một số nghiên cứu sự ảnh hưởng của đa hình gen CAST trên năng suất, chất
lượng thịt trên thế giới
Nghiên cứu của Krzecioa et al. (2008) đã chỉ ra sự ảnh hưởng kiểu gen CAST/RsaI
trên thân thịt và chất lượng thịt heo Landrace x Yorkshire, Landrace x Duroc, (Landrace x
Yorkshire) x Duroc, (Landrace x Yorkshire) x (Duroc x Pietrain). Kết quả cho thấy có ba
kiểu gen được xác định tại CAST/RsaI AA, AB, BB. Kiểu gen BB cho trọng lượng thịt
cao nhất của vai, lưng. Nhưng độ dài than ngắn hơn 2,04 cm so với các con có kiểu gen
AA. Kiểu gen BB cho trọng lượng cao nhất của thịt thăn đồng thời dài thịt thăn ngắn
nhất.Nghiên cứu của Rybarczyk et al. (2008) về đa hình CAST/HinfI và CAST/Hpy188I
đến chất lượng thịt heo của heo lai Germa Landrace x German Lagre White và Leicoma x


German Lagre White. Kết quả xác định CAST/HinfI có ba kiểu gen AA, AB, BB với tần
số alen A là 0,04, alen B là 0,96. CAST/Hpy188I cũng có ba kiểu gen AA, AB, BB với tần
số alen A là 0,78, alen B 0,22. Kiểu gen AB có ảnh hưởng đến thịt đùi, bắp thịt, còn kiểu
gen BB và AA thì ảnh hưởng đến thịt thăn. Thịt heo kiểu gen AB có pH 24 giờ và pH 48
giờ cao hơn, ít rỉ dịch hơn.Thịt có kiểu BB sắc vàng nhiều hơn, màu đỏ cũng nhiều hơn so
với thịt heo có kiểu gen AB.
Theo Wang et al. (2007), nghiên cứu đa hình của gen CAST trong giống heo
Meishan và năm giống heo khác (Sutai, Yorkshire × Sutai, Landrace × Sutai, Duroc ×
Landrace x Yorkshire, PIC lai) ở Trung Quốc. Kết quả có ba kiểu gen đã được xác định.
Kiểu gen AA thể hiện ba băng 963 bp, 806 bp và 222bp; các kiểu gen AB bị cắt cho bốn
băng 1028 bp, 963 bp, 806 bp và 222 bp và kiểu gen BB cho hai băng 1028 bp và bp 963.
Chỉ có kiểu gen DD/CAST/HinfI và kiểu gen FF tại CAST/MspI được tìm thấy ở

Meishan. Kiểu gen FF của CAST/MspI thì thịt có ít béo, mỡ lưng mỏng hơn, thịt ngon hơn
so với hai kiểu gen khác. Ở Meishan FF có chất lượng thịt tốt. Các giống Sutai được phát
triển từ giống Duroc (50%) và Mi Sơn (50%). Sutai có tần số FF thấp nhất. Nghiên cứu
của Kłosowska et al. (2008) trên giống heo Pietrain x (Large White Ba Lan x Landrace Ba
Lan), Large White Hà Lan x Landrace. Kết quả xác định được ba kiểu gen EE, EF, FF.
Những cá thể có kiểu gen EE ở CAST thì nhận thấy diện tích cơ thăn nhỏ hơn những con
khác có các kiểu gen EF và FF. Đồng thời kiểu gen FF thì các sợi cơ trong một bó cơ
nhiều hơn so với các con có kiểu gen EE, EF.Theo nghiên cứu của Kocwin et al. (2002) về
ảnh hưởng của CAST đến chất lượng thịt heo (Large White Ba Lan x Landrace Ba Lan) x
(Hampshire x Pietrain).Kết quả đã xác định được 3 kiểu gen AA, AB và BB trên
CAST/RsaI, kiểu gen BB của CAST/RsaI cho giá trị pH45 = 6,39 và có giá trị L*= 47,73.
Kiểu gen AB ở CAST cho pH = 6,12. Kiểu gen AA thể hiện giá trị pH45 = 6,40 cao nhất.
Đa hình ở CAST/RsaI có ảnh hưởng đến giá trị pH45 trong cơ thăn.
2.5 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction. Đây là kỹ thuật sinh học
phân tử cho phép nhân bản một đoạn ADN mong muốn từ hệ gen AND của cơ thể sinh vật
thành nhiều bản sao, kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis và cộng sự
phát minh năm 1985 và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring
Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm
1993. Kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn
thế giới.
Nguyên lý:
Kỹ thuật tổng hợp ADN ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép
ADN trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:
Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzym helicase.
- Kết hợp với enzym ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp ADN mới trong môi trường
thích hợp.
- Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt,
chủ động.
Điều kiện phản ứng PCR:

Theo Nguyễn Hoàng Lộc et al. (2007), thì để thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần
phải có đầy đủ các thành phần sau đây:


Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không
chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt …
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (Mg2+): nồng độ của Mg2+ có thể ảnh hưởng
đến nhiệt độ biến tính của ADN khuôn mẫu, quá trình ủ của primer, tính đặc hiệu của phản
ứng PCR, hoạt động của Taq polymerase và độ chính xác của kết quả. Thành phần dung
dịch đệm của phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại emzym polymerase sử dụng trong
PCR, thường chứa muối đệm HCl 10mM, KCl 50mM và MgCl2 1,5 mM. dNTP (deoxy
nucleoside triphotphat) là đơn vị để có thể tổng hợp các bản sao của ADN đích. dNTP có
cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, pH = 7, nồng độ thường dùng là 10
mM (2,5mM mỗi loại) được bảo quản ở -20°C. Bốn loại dNTP được sử dụng cần có nồng
độ tương đương nhau gồm: Adenin (dATP),Thyamin (dTAP), Cytosine (dCTP), Guanine
(dGTP). Mồi (primer) là những đoạn ADN sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến
phản ứng dây chuyền tổng hợp ADN. Chúng nhận ra phần ADN được nhân lên, bắt cặp bổ
sung với một đầu của ADN mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều
ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forwark primer) và một mồi ngược (reverse primer).
Enzym ADN polymerase (Taq pol) là enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotit A,
T, G, C vào mạch ADN mới tổng hợp, nồng độ Taq pol thích hợp là từ 1-2,5 unit cho
100μl dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0.5 đơn vị/25μl. ADN mẫu
(ADN template) là mẫu ADN mà chúng ta sử dụng để khuếch đại. Có thể là ADN kép,
đơn hoặc ARN được tách chiếc từ đối tượng được nghiên cứu. ADN khuôn có độ nguyên
vẹn cao tránh lẫn tạp chất.
Chu kỳ nhiệt:
Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (thường
từ 25 đến 75 chu kỳ).
+ Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi ADN từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn.
Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi ADN ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng

lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi ADN
+ Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2
sợi ADN tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi AND đơn.
+ Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi ADN mới giống chuỗi ADN gốc. ADN
polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA.
2.6 Điện di agarose
Theo Phạm Hồng Sơn (2006), phương pháp điện di trong gel (keo) thường được sử
dụng để phân ly (phân đoạn) ADN, ARN, Oligonucleotit, protein. Thông thường sử dụng
gel agarose phân li acid nucleic lớn hơn 1 kb. Nguyên lí của việc điện di ADN là khi ở
trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử ADN dịch chuyển về phía anode với
tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các đoạn
ADN càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung (giếng tải mẫu)
các đoạn ADN khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn
đó có các đoạn ADN khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng-band) khác nhau tương ứng
với các độ lớn của chúng.
Quy trình được thực hiện theo Kirkpatrick (1990):
- Chuẩn bị gel agarose, đệm điện di TAE 1X. Cân 1g bột agarose rồi hòa tan vào 100ml
dung dịch đệm TAE 1X (gel agarose 1%). Đun sôi dung dịch agarose cho đến khi tan hoàn
toàn, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 50 - 60°C. Cài lược để tạo các giếng nhỏ, đổ gel vào


khuôn. Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong 30 phút. Tháo lược ra khỏi khuôn và đặt
bản gel vào bể điện di, bổ sung đệm TAE 1X tới khi ngập bản gel. Đệm có vai trò cung
cấp ion đảm bảo điện trường đều trong quá trình điện di.
- Tra mẫu điện di. Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng
nồng độ DNA cao hoặc thấp. Mẫu DNA được trộn đều với loading dye 6X với tỷ lệ mẫu :
loading dye là 5:1 (chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát vừa có tác dụng gắn
DNA vào để DNA lắng xuống đáy giếng). Tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Điện di ở
cường độ dòng điện một chiều với hiệu điện thế 70V trong khoảng 40 phút đến khi quan
sát được thấy băng màu chạy được 2/3 bản gel thì dừng lại.

- Nhuộm DNA bằng EtBr.Bản gel được gỡ ra và nhuộm với dung dịch ethidium bromide
0,5 µg/ml trong khoảng 10 phút rồi lấy bản gel ra rửa lại bằng nước.
- Quan sát và chụp ảnh. Bản gel được đặt dưới ánh sáng tia tử ngoại (bước sóng 302 nm),
chụp ảnh kiểm tra kết quả điện di.
 
2.7 Kỹ thuật PCR-RFLP
Kỹ thuật RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism) là kỹ thuật nghiên cứu
tính đa hình chiều dài của các phân đoạn ADN dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn
(Restriction Enzyme, RE). Sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giớn hạn, sẽ tạo ra những
đoạn ADN có chiều dài khác nhau được phân tích bằng một kỹ thuật phân đoạn kích
thước, thường dùng sử dụng là điện di trên gel agarose (Phạm Hồng Sơn, 2006)
Sự sai khác về kích thước của các đoạn cắt thu được khi cắt ADN của nhân hay của cơ
quan tử hay toàn bộ cơ thể bằng enzym giới hạn được gọi là “sự đa hình chiều dài của các
đoạn giới hạn”.Các đoạn cắt ra của ADN (với cùng một loại enzym) với kích thước hay
chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem xét tính đa hình
kiểu hình và kiểu gen (ADN).
Kỹ thuật PCR- RFLP được tiến hành theo các bước:
Tách chiết và tinh sạch DNA
Khuếch đại DNA cần nghiên cứu bằng phương pháp PCR.
Sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn.
Điện di trên gel agarose và đọc kết quả.


PHẦN 3 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu
 Hóa chất
Một số hóa chất dùng trong quá trình tách ADN như: Proteinase K, phenol

chloroform đệm 1x SSC, Isopropanol, Ethanol, đệm TE , dung dịch 100% và 80%

Ethanol,...
- Một số hóa chất được dùng trong phản ứng PCR như: Bufer, dNTP, MgCl2, Taq
polymerase, nước cất hai lần, Agarose, đệm TAE, loading buffer, Ethidium
Bromide,...
Hai primer: CAST mồi xuôi,CAST mồi ngược.
Enzym giới hạn trong kỹ thuật PCR- RFLP
 Dụng cụ và thiết bị: Túi nylon, pipet, tube PCR, tube ly tâm, micropipet, đầu côn, giấy
thấm, gang tay, và một số dụng cụ khác: Tủ mát, tủ đông, máy ly tâm, máy lắc, máy PCR,
máy khử trùng dụng cụ, bộ điện di, lò vi sóng, cân điện tử,...
 Đối tượng thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên 34 mẫu tai heo rừng Tây Nguyên: 18 mẫu lợn đực và 16
mẫu lợn cái
3.2 Phương pháp thí nghiệm
3.2.1 Thu thập mẫu
Mỗi mẫu lấy khoảng 200 mg sau đó mang về phòng thí nghiệm trữ ở -20°C, chuẩn bị cho
quá trình tách chiết DNA


3.2.2 Tách chiết DNA
Nguyên tắc: Có nhiều phương pháp sử dụng cho tách chiết DNA.Việc tách chiết
DNA/RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa
DNA/RNA.Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp
nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác
nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan.
Các bước tiến hành:
•
•
•
•
•

•
•
-

-

Cắt nhỏ 20mg mẫu mô tai heo cho vào ống eppendorf 1,5 ml và thêm 180 µl Digestion
Solution
Thêm 20 µl Proteinase K Solution, mix bằng vortex trong 15 giây
Ủ 56°C trong 3h
Thêm 20 µl RNase A Solution, mix đều bằng vortex và để 10 phút ở nhiệt độ phòng
Thêm 200 µl Lysis Solution và mix đều bằng vortex trong 15 giây
Thêm 400 µl Ethanol 50% và mix đều bằng vortex
Ly tâm nhẹ sau đó chuyển dung dịch vào cột GeneJet Genomic DNA Purification Column
đã gắn với ống 2ml.Ly tâm 6000rpm trong 1 phút
Chuyển cột sang ống 2ml mới và thêm 500 µl dung dịchWash buffer I( đã bổ sung
Ethanol) ly tâm 8000 rpm trong 1 phút
Đổ dịch lắng trong ống 2ml và thêm 500 µl Wash buffer II ( đã bổ sung Ethanol) ly tâm ở
12000 rpm trong 3 phút và chuyển cột sang ống 1.5ml
Thêm 200 µl Elution Buffer vào cột để 2 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 8000rpm
trong 1 phút.
Loại bỏ cột và bảo quản mẫu DNA ở nhiệt độ -20°C
3.2.3 Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agarose
Pha gel, đổ bản gel: sử dụng đệm TAE 1X, agarose 1%
Load 2 µl DNA khuyếch đại với 1 µl loading dye 6X, mix đều
2 µl DNA ladder được nhỏ vào 1 giếng để làm thang chuẩn so sánh kích thước
Dùng pipette hút và nhỏ vào giếng trên bản gel
Điện di bản gel trong điện trường 70V trong 35 phút
Nhuộm bản gel với Ethidium Bromide trong 15 phút
Quan sát và chụp ảnh bản gel với tia UV

Điện di dùng để kiểm tra ADN trước và sau khi chạy PCR. Nồng độ gel là 1% dùng để
kiểm tra ADN sau khi tách chiết. Trường hợp kiểm tra sản phẩm PCR hay sản phẩm
enzym cắt giới hạn thì nồng độ agarose có thể cao hơn.
3.2.4 Xác định kiểu gen
Sử dụng phương pháp PCR-RFLP trên 34 mẫu heo rừng đã tách chiết DNA. Các chỉ
tiêu quan sát gồm: đa hình gen và tần suất kiểu gen.
Các bước PCR-RFLP
Nhân đoạn gen cần thiết bằng PCR: sau khi tách chiết DNA tiến hành phản ứng PCR bằng
máy PCR với cặp mồi chuyên biệt
Trình tự primer để nhân đoạn gen CAST (Ernst et al., 1998)
F:GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC


R:TGCAGATACACCAGTAACAG
Thành phần mix cho một phản ứng PCR: Nước khử ion, dream taq ,mồi xuôi,mồi ngược,
DNA
- Điện di agarose sản phẩm PCR: các sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel
agarose 1% bằng bộ điện di một chiều,sau đó nhuộm với Ethidium Bromide.
- Chụp hình gel sản phẩm PCR: sau khi điện di gel sản phẩm PCR, chụp hình
gel, điều chỉnh ánh sáng và quan sát các băng AND xuất hiện tren gel.
 Sản phẩm PCR sẽ được ủ với các enzym giới hạn thích hợp để cắt đoạn gen và
quan sát trên gel agarose (PCR-RFLP).
Kỹ thuật RFLP được tiến hành theo các bước sau:
- Sử dụng sản phẩm PCR đạt chất lượng tốt (thông qua kiểm tra trên gel agarose
1 %)
- Sử dụng các enzym cắt hạn chế để cắt ADN thành các đoạn có kích thước khác
nhau.
-

Tiến hành hút 0,9 μl buffer cho vào effendoft chứa 7,6 μl sản phẩm PCR và thêm 0,5μl

enzyme cắt ủ ở nhiệt độ 37 trong 1 giờ PCR được cắt bởi enzyme cắt giới hạn sẽ được
kiểm tra trên gel agarose 2,5% để đọc kết quả. Kết quả được đọc dựa vào kích thước các
đoạn DNA được cắt từ sản phẩm PCR.
3.2.5 Tính tần số kiểu gen và tần số alen
Tần số kiểu gen: kiểu gen xác định từ kết quả điện di PCR-RFLP và tần số
kiểu gen là tỷ lệ số cá thể có cùng kiểu gen trong quần thể khảo sát.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của lợn rừng (Sus scrofa) Tây Nguyên. Tạp chí Sinh
học, 2014, 36: 36SE-TN161.
Hội Đồng Hạt Cốc Chăn Nuôi Mỹ (1996). Cẩm nang chăn nuôi lợn công nghiệp. NXB
Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 913-931.
Lê Thị Mến (2010). Kỹ thuật chăn nuôi heo. NXB Nông nghiệp, TPHCM.
Nguyễn Thiện Và Võ Trọng Hốt (2007). Kỹ thuật chăn nuôi và chuồng trại nuôi heo.
NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Ngọc Tuân Và Trần Thị Dân (2000). Kỹ thuật chăn nuôi heo. NXB Nông Nghiệp,
TPHCM.
Nguyễn Thiện (2009). Giống lợn năng suất cao kỹ thuật chăn nuôi hiệu quả. NXB Nông
Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng Và Trần Quốc Dũng. 2007. Giáo trình công nghệ tái tổ
hợpDNA. NXB Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr 65.
Phạm Hồng Sơn (2006). Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử. NXB Đại Học
Huế, tr.9.
Tài liệu tiếng anh
Wang. Q. S et al. (2007). Polymorphisms of the CAST gene in the Meishan and five other
pig populations in China. South African Journal of Animal Science 2007, 37 (1), 2730.
Takano. G. J et al. (2004). The relationship between slow and fast myosin heavy chain
content, calpastatin and meat tenderness in different ovine skeletal muscles. Meat

Science 69 (2005) 17–25.
Goll. M. L. A. Zybert , E. Krzecio , K. Antosik et al. (2004). New alleles in calpastatin
gene are associated with meat quality traits in pigs. American Society of Animal
Science. 82:2829–2839.
Krzecioa. B et al. (2008). The influence of CAST genes polymorphism and their
interactions on selected meat quality parametres. Animal Science Papers and Reports
vol. 12 (2008) no. 4, 389-398.
Ernst. C. W , Zlender. K, A Robic, M Yerle, L Wang, M. F Rothschild (1998). Mapping of
calpastatin and three microsatellites to porcine chromosome 2q2.1 ± q2.4. Animal
Genetics, 1998, 29, 212-215.
Rybarczyk. A and M. Bonneau. (2008). The effect of calpastatin polymorphism
(CAST/HinfI and CAST/Hpy188I) and its interaction with RYR1 genotypes on
carcass and pork quality of crossbred pigs. Animal Science Papers and Reports vol. 28
(2010), no. 3, 253-260.
M.Kocwin-Podsiadla, J.Kuryl, E. Krzecio, A. Zybert, W. Przybylski.The interaction
between calpastatin and RYR1 genes for some pork quality traits. Meat Science 65
(2003) 731–735.