Đánh giá tính đa hình ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản

MỞ ĐẦU

Lúa là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, 90% diện tích trồng lúa
và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á... Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiện sinh
thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất
cả các châu lục [8, 12].
Việt Nam là một nước nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa nước và
được xếp vào hàng những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lượng gạo xuất
khẩu năm 1999 lên tới 4,3 triệu tấn song hiệu quả xuất khẩu và khả năng cạnh tranh
trên thị trường quốc tế còn thấp, một trong những nguyên nhân là do chất lượng gạo
chưa đáp ứng được nhu cầu về phẩm chất của thị hiếu người tiêu dùng. Trong khi đó
nhiều địa phương của nước ta có những giống lúa rất quý như Tám Thơm, Tám Ấp
Bẹ, Dự Thơm,Tẻ Di Hương... hạt trong, cơm dẻo và rất thơm ngon. Đây là những
giống có tiềm năng nâng cao giá trị xuất khẩu nhưng năng suất cịn thấp vì cây cao,
thân mềm chống đổ kém, lá dài, mỏng và rủ, hạt thưa, thời gian sinh trưởng kéo dài,
phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [4, 11, 12].
Bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma Viện Công nghệ sinh
học đã chọn tạo được ba giống lúa DR1, DR2 và DR3 cho năng suất cao, ổn định và có
khả năng chịu hạn, chịu lạnh tốt hơn so với giống gốc X11 và CR203 [14]. Sử dụng
công nghệ tế bào thực vật, công nghệ gen kết hợp với kỹ thuật gây đột biến bằng tia
gamma cho phép cải biến một số đặc điểm nơng học cịn hạn chế của các giống lúa
nêu trên theo hướng hạ thấp chiều cao cây, chống đổ và rút ngắn thời gian sinh
trưởng. Mặt khác để nắm vững đặc điểm của các giống lúa đặc sản trước hết cần sử
dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá sự đa dạng về di truyền của nhóm lúa
Tám thu thập được ở các địa phương khác nhau.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài "Đánh giá tính đa hình
ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản". Nhằm
tìm ra mối quan hệ di truyền và đánh giá khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây lúa từ mô
sẹo xử lý tia gamma để xác định ngưỡng chiếu xạ thích hợp đối với mơ sẹo của một
số giống lúa đặc sản góp phần vào việc chọn tạo giống lúa mới.

1


Chơng 1. Tổng quan tài liệu

1.1. ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu đa hình
ADN
1.1.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Mullis và CS phát minh
năm 1985. Thực chất đây là một phơng pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện
diện của tế bào.
Điều kiện của phản ứng PCR: ADN khuôn, 2 đoạn mồi (mỗi mồi dài từ 18 24 nucleotit), Taq polymeraza (là enzym chịu nhiệt), bốn loại deoxyribonucleotit
triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg++ [21].
Trớc đây phản ứng PCR thờng dùng ADN polymeraza I của E.coli và T4
ADN polymeraza. Các enzym này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao nên qua mỗi chu kỳ
phản ứng phải phổ sung thêm enzym. Việc phát hiện ra các loại ADN polymeraza
bền nhiệt (Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza...)
đà cho phép quá trình nhân bản đợc thực hiện tự động hoá. Ngoài độ bền nhiệt các
enzym này còn khác nhau về khả năng kéo dài chuỗi ADN cần nhân bản. Thông
dụng nhất là Taq ADN polymeraza đợc tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus, sống ở nguồn nớc nóng 940C- 1000C. Enzym này hoạt động tốt nhất ở
700C - 800C. Trọng lợng phân tử của Taq ADN polymeraza là 94 KD, gen tổng hợp
dài 2499 cặp bazơ nitơ, mà hoá cho 832 axit amin [34].
Năm 1988, Saiki đà chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza gi¶m 50% sau
130 phót ë 92,50C; sau 40 phót ở 950C và sau 5-6 phút ở 970C. Mặt khác, nồng độ
ion Mg++ và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hởng rất nhiều đến hoạt tính
của Taq polymeraza [23, 34].
Đoạn mồi là những đoạn oligonucleotit đợc thiết kế bổ sung với mạch ADN
khuôn. Để gắn mồi một cách đặc hiệu, đoạn mồi thờng đợc tổng hợp dài từ 18 - 24
nucleotit. Phản ứng PCR dùng một cặp mồi gồm một mồi xuôi (forward) và một

môi ngợc (reverse), mồi luôn gắn với ADN khuôn theo chiều từ 3 - 5 và ADN
polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp về đầu 5’.

2


Nhìn chung, trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi trong phản ứng
PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng.
Phản ứng PCR lµ mét chi gåm nhiỊu chu kú nèi tiÕp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm ba giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: biến tính ADN (denaturing), ở nhiệt độ khoảng từ 94 0C - 950C,
trong thời gian ngắn từ 30 giây - 1 phút, để tách sợi ADN kép thành 2 sợi ADN đơn.
- Giai đoạn 2: giai đoạn gắn mồi (annealing), ở nhiệt độ 400C - 600C, hai
đoạn mồi sẽ gắn vào ADN khuôn ở vị trí mà tơng đồng theo nguyên tắc bổ sung ở
hai đầu đoạn ADN cần nhân. Nhiệt độ của bớc gắn mồi tuỳ thuộc vào loại từng mồi
cụ thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi. Vì vậy giai
đoạn này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.
Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:
Tm =81.5 + 16.6 (log10{J+}) + 0.41 (%G + C) - (600/I) - 0.63 (%FA) [23].
{J+} : nồng độ của các cation hoá trị I.

Trong đó:

FA : chất dùng để gây biến tính ADN.
I

: chiều dài của mồi.

- Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài (extension) ở nhiệt độ 72 0C, ADN Taq
polymeraza hoạt động tổng hợp, kéo dài các mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai

đầu sợi khuôn ban đầu. Geifand và White (1990) đà thông báo về tốc độ tổng hợp
của Taq là: 150 nucleotit/giây ở 750C - 800C; >60 nucleotit/gi©y ë 700C; 24
nucleotit/gi©y ë 550C; 1,5 nucleotit/gi©y ë 370C; 0,25 nucleotit/gi©y ë 220C [23].
Sau mét chu kú gåm ba giai đoạn nh trên, từ một phân tử ADN khuôn đợc
nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa nhân bản trong mỗi chu kỳ lại làm khuôn
cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó
sau mỗi chu kỳ tổng hợp đựơc lợng ADN gấp đôi và nh vậy sau n chu kỳ nhân bản
sẽ tạo ra 2n bản ADN khuôn ban đầu [13].
Công thức:
Trong đó:

Y = x.2n
Y: là tổng số bản sao ADN

x: là số khuôn ADN ban ®Çu
n: sè chu kú

3


PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích bộ genom của động vật và
thực vật vì nó có khả năng tạo ra một lợng lớn trình tự đặc hiệu. ứng dụng của PCR
vào nhiều mục đích khác nhau, bao gồm xác định trình tự của ADN đợc nhân bản,
nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cADN hay
th viện gen, xác định sinh vật chuyển gen, phân tích tiến hoá, phân tích sự đa dạng
di truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể. Hiện nay PCR đợc xem là một
phơng pháp nhanh và tơng đối đơn giản để đánh giá cây đợc chuyển gen [1, 26].
1.1.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụng
Để thực hiện phản ứng PCR cần phải xác định trình tự nucleotit ở hai đầu của
đoạn gen cần nhân bản, để thiết kế đoạn mồi. Trớc khi xuất hiện máy đọc trình tự

ADN tự động thì vấn đề này gây nhiều khó khăn cho công tác nghiên cứu. Do đó,
các nhà nghiên cứu nhanh chóng ủng hộ kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi có trình tự
ngẫu nhiên. Đợc sử dụng rộng rÃi nhất trong các kỹ thuật đó là kỹ thuật RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA = Tính đa hình các đoạn ADN đợc nhân bản
ngẫu nhiên). Kỹ thuật này đợc hai nhóm nghiên cøu (Williams vµ CS, 1990) [37],
(Welsh vµ CS, 1990) [36] đồng thời xây dựng một cách độc lập. Nó là một kỹ cho
phép phát hiện tính đa hình các đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng
một mồi đơn chứa một trật tự nucleotit ngẫu nhiên. Thờng mồi này chứa từ 9 đến 12
nucleotit tối thiểu là 4 nucleotit. Có hàng ngàn loại mồi chứa khoảng 10 nucleotit
nhng số lợng mồi đợc dùng trong nghiên cứu là một con số hạn chế. Trong phản ứng
RAPD, các mồi đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của đoạn
ADN khuôn. Nếu các điểm bắn mồi nằm trong khoảng cách có thể nhân bản đợc
(thờng từ 200 đến 2000 nucleotit) thì đoạn ADN đó đợc nhân lên. Sự có mặt của sản
phẩm này chứng tỏ đà có sự tơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa ADN genom
với các mồi oligonucleotit. Từ những nghiên cứu này, ngày nay kỹ thuật RAPD đÃ
đợc thống nhất theo phơng pháp của Williams và CS (1990) [37] là sử dụng các
đoạn mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotit với thành phần G + C cao (60%) để
bám chặt vào ADN khuôn.
Điểm khác giữa RAPD so với PCR là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên dài
10 nucleotit, quá trình nhân bản ADN là ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào
bất kỳ vị trí nào trong bộ genom khi tìm đợc vị trí bổ sung. Với chiều dài ngắn nên
khả năng đoạn mồi tìm đợc các đoạn tơng đồng trên các mạch đơn của ADN trong
genom không quá khó khăn. Vì thế RAPD là một phơng pháp có hiệu quả để xác
định tính đa hình về trật tự nucleotit giữa các cá thể. Tùy vào từng nhóm loại thực
vật hay vi sinh vật cụ thể mà các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế đặc dụng. Theo

4


lý thuyết, số lợng các đoạn ADN đợc nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí gắn

của các đoạn mồi, kích thớc và mức độ phức tạp của cấu trúc genom. Kết quả là sau
khi điện di sản phẩm RAPD sẽ xuất hiện nhiều phân đoạn khác nhau. Sự khác nhau
đó gọi là tính đa hình.
Sự đa hình của sản phẩm RAPD là do mức độ tơng đồng của trình tự ADN
trong genom với trình tự mồi và kích thớc của bộ genom. Độ tơng đồng càng cao thì
phân đoạn càng nhiều.
Kỹ thuật RAPD cũng giống PCR gồm ba giai đoạn nhng điểm khác là trong
giai đoạn gắn mồi RAPD có nhiệt độ bắt mồi thấp hơn (từ 350C - 450C). Đây cũng là
một nguyên nhân dẫn đến có nhiều phân đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên [2].
RAPD là một phơng pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích
quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật
RAPD đợc sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây trồng khác nhau, sự đa
dạng di truyền trong các kiểu gen lúa nớc và lúa nơng, sự đa dạng di truyền giữa lúa
Indica và Japonica, xác định sự đa hình của các giống.
Yang và Quiros đà sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự 10 nucleotit để nghiên
cứu sự khác biệt của 23 giống cần tây và đợc chia làm ba nhóm. Kết quả thu đợc
cũng trùng hợp khi sử dụng 6 chỉ thị protein để phân loại các giống cần tây trên
(Yang và Quiros, 1993) [38]. Tơng tự nh vậy nhiều tác giả đà sử dụng RAPD để lập
cây chủng loại phát sinh của các loài cây nh: ngô, lúa gạo, lúa mì,... [24, 29, 32].
Orozco và CS, (1994) [31] đà ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan
hệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc tai tạo từ các loài bố, mẹ ở các
vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có
đặc điểm quý để lai tạo giống cà phê mới. Bùi Mạnh Cờng và CS, (2000) [6] cịng
cho biÕt khi sư dơng kü tht RAPD đà phân biệt đợc hai giống đậu Vetch và lentil,
giống nhau về hình thái (trọng lợng1000 hạt, màu sắc, kích thớc...). Điều này có một
ý nghĩa lớn trong việc xác định độ thuần di truyền cũng nh mức độ lẫn tạp cơ giới
của các loại giống cây trồng.
Trong quá trình thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài (Apostol
và CS, 1993) đà xây dựng kỹ thuật phân nhóm thông qua các biểu đồ RAPD. Thực
chất của kỹ thuật này gồm ba bớc:

Bớc 1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toán
khoảng cách quan hƯ gi÷a chóng.
Bíc 2: LËp ma trËn gåm tÊt cả những giá trị tính đợc trớc đó.

5


Bớc 3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồ đặc trng. Các giá trị biểu
diễn khoảng cách giữa các cá thể đợc thiết lập theo hệ số tơng đồng của Nei và Li
(1985).
2N
S=

AB

NA + NB
Trong đó NAB là số băng có mặt ở cả hai loài A và B; N A là số băng chỉ có ở
loài A; NB là số băng chỉ có ở loài B.
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đà thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự
động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợng
nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các băng nhân bản của các cá thể. NTSYSpc
version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) là tên của một trơng trình thuộc
kiểu trên để tạo các biểu đồ hình cây. Biểu đồ thu đợc sẽ thể hiện mức độ gần nhau
của các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể đợc
nghiên cứu. Chơng trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu và có độ chính
xác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả trong việc phân tích kỹ thuật RAPD.
1.2. Đặc điểm của các giống lúa Đặc sản ở miền Bắc Việt Nam
ở nớc ta cây lúa giữ vị trí trọng yếu trong hệ thống cây lơng thực. Ngày nay
khi năng suất lúa gạo đà đáp ứng đủ nhu cầu trong nớc và có d để xuất khẩu thì ngời
ta quan tâm nhiều đến chất lợng gạo. Các giống lúa đang đợc sản xuất trên diện tích

lớn mặc dù cho năng suất cao nhng chất lợng cha đáp ứng đợc nhu cầu của thị trờng
đòi hỏi. Vì vậy vị trí các giống lúa đặc sản ngày càng quan trọng trong việc nâng
cao chất lợng gạo Việt Nam.
Các giống lúa đặc sản có chất gạo tốt và có mùi thơm ngon thuộc nhóm lúa
mùa chính vụ. Đa số các giống lúa này đợc trồng ở một số tỉnh thuộc khu vực miền
Bắc nớc ta (Thái Bình, Nam Định, Hà Tây, Hải Dơng, Hải Phòng...), nh Tám Xoan
Hải Hậu, Tám ấp Bẹ Xuân Đài, Tám Cổ Ngỗng Nam Định, Dự Thơm, Tẻ Di Hơng... Là những giống lúa có tiềm năng xuất khẩu và đáp ứng nhu cầu thiết thực
trong nớc [12].
Nhng các giống lúa này có diện tích gieo trồng ít, năng suất còn thấp và
không ổn định, do có nhiều đặc điểm yếu nh cây cao (từ 145 -170 cm), thân mềm
yếu, chống đổ kém, lá dài rủ, hạt tha, cổ bông dài, kém chịu phân, phản ứng chặt
chẽ với ánh sáng ngày ngắn và có thời gian sinh trởng khá dài (từ 155-170 ngày) cần

6


khắc phục những nhợc điểm nói trên cho phù hợp với điều kiện canh tác của từng
vùng [11, 12].
Vì vậy việc nghiên cứu tạo các đột biến thực nghiệm kết hợp với chọn dòng
tế bào nhằm chọn tạo các giống lúa chất lợng và năng suất cao từ các giống lúa địa
phơng có một ý nghĩa rất lớn không chỉ đối với cây lúa mà còn đối với các giống
cây trồng khác.
1.3. nuôi cấy mô sẹo và cơ sở chọn dòng biến dị soma
Năm 1898, lần đầu tiên, nhà thực vật học ngời Đức tên là Haberlandt đà nhận
xét: "Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng
để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào" [1]. Bất
kỳ một bộ phận nào của cây (mầm, rễ, thân, lá, nhị...), đều có thể tạo nên cây hoàn
chỉnh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Mô sẹo (callus) là một khối tế bào mô mềm, có mức độ cấu trúc thấp, cha
phân hoá, có khả năng phân bào liên tục và thờng có tính biến động di truyền cao.

Trong nuôi cấy in vitro mô sẹo đợc tạo ra từ nuôi cấy các cơ quan của thực vật (thân,
lá, rễ, hạt, nhị...) ở các môi trờng nuôi cấy thích hợp có chứa các chất điều khiển
sinh trởng cần thiết nh (auxin, cytokinin) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng,
độ ẩm...) tối u. Mô sẹo có thể đợc duy trì trên môi trờng nuôi cấy bằng cách cấy
chuyển định kỳ, tuy nhiên trong thực nghiệm cho thấy rằng: mô sẹo qua cấy chuyển
nhiều lần thì khả năng tái sinh cây giảm rõ rệt và tăng tính biến động di truyền của
mô [1, 9, 15].
Các tế bào mô sẹo có tính ổn định di truyền thấp. Vậy muốn nhân nhanh và
duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua mô sẹo của một số loài thực vật cần sử
dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh. Những cây tái sinh từ mô sẹo thờng
có những biến đổi di truyền phong phú (dị bội, đa bội) và các biến đổi di truyền
khác, điều này có ý nghĩa trong chọn giống (Lê Trần Bình và CS, 1998) [2], (Oono,
1983) [30]. Bằng cách này nhiều tác giả đà thông báo thu đợc những giống cây
trồng mới [3, 15, 20, 33].
Thuật ngữ biến dị soma đợc Larkin và Scowcroft (1982) [27] dùng để chỉ
tất cả các biến dị xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô và tế bào. Biểu hiện của biến dị
soma đợc quan sát thấy ở kiểu hình của những cây tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo.
Nguyên lý chung cđa viƯc chän dßng mang biÕn di soma là ở tế bào nuôi cấy in
vitro tần suất biến ®éng di trun dao ®éng tõ 10-5- 10-8 trong m«i trờng nuôi cấy
bình thờng khi không xử lý đột biến, còn nếu kết hợp với xử lý đột biến bằng chÊt

7


hoá học (EMS, BU...) hoặc các loại bức xạ (tia UV, tia gamma...) thì tần số đột biến
có thể tăng lên gấp 10 - 100 lần, vì vậy có thể chọn ra các cá thể đột biến nhanh hơn
và có hiệu quả hơn so với các biện pháp chọn giống thông thờng khác áp dụng cho
cây nguyên vẹn. ở mức độ tế bào, nhất là tế bào đơn bội hầu nh các đặc điểm đột
biến đợc thể hiện ra ngay. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào còn cho phép giảm bớt đáng
kể thời gian cần thiết để chọn đợc những tính trạng theo ý muốn [22].

Shepart và CS (1980) qua nuôi cấy tế bào trần của khoai tây đà chọn lọc và
đà thu đợc giống khoai tây có thời gian sinh trởng ngắn, củ đều, hình dạng đẹp và
chống chịu đợc một điều kiện bất lợi của môi trờng tốt hơn so với giống gốc [trích
dẫn từ 1].
Larkin và CS (1982) [27], Barwale vµ CS (1987) [19] cịng cho rằng biến dị
soma thờng xuất hiện ở các cây tái sinh đợc sau khi nuôi cấy tế bào qua giai đoạn
mô sẹo. Có nhiều kiểu đột biến nh: đột biến nhân, đột biến tế bào chất, đa bội thể và
các bất thờng khác trong nhiễm sắc thể.
Trong nghiên cứu thực nghiệm Maliga (1984) [28] đà tiến hành xử lý tia cực
tím đối với tế bào trần thuốc lá và xử lý tia gamma Co 60 với tế bào thuốc lá cho thấy
tần số đột biến tăng lên 10 lần so với đối chứng.
Những cây tái sinh từ mô sẹo xử lý đột biến dễ mang những biến động di
truyền về nhiễm sắc thể (di bội, đa bội) và các biến đổi di truyền khác.Vấn đề này
đà mở ra một triển vọng lớn trong việc cải tiến di truyền những giống cây trồng có ý
nghĩa kinh tế, tạo giống mới cho năng suất cao, chống chịu đợc các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi, chất lợng tốt và ổn định. Nhiều công trình nghiên cứu đà thành công
trong việc chọn dòng mang biến di soma trên các đối tợng cây trồng khác nhau đặc
biệt là cây lơng thực.
Theo Lê Trần Bình và CS (1997) [1] bản chất và cơ chế của biến dị soma liên
quan mật thiết đến những thay đổi trong genom của tế bào nuôi cấy. Do nhiều
nguyên nhân nh tác động của hoocmôn sinh trởng trong thời gian dài và các yếu tố
khác làm cho nhiễm sắc thể trong tế bào nuôi cấy tăng lên tạo ra các dạng đa bội
lệch và mức bội thể cao. Nhiều trờng hợp khác, các đoạn nhiễm sắc thể có thể bị
chuyển đổi hoặc đảo ngợc. Cấu trúc của phân tử ADN có thể bị thay đổi dẫn đến
thay đổi kiểu hình thực sự.
Adkins và CS (1995) [18] thông báo đà chọn đợc dòng lúa chịu hạn từ mô
sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 bằng việc bổ sung vào môi trờng nuôi cấy PEG
8000. Các tính trạng nông sinh học quan trọng và khả năng chịu hạn đà duy trì và ổn

8

định ở thế hệ R2. Tơng tự một số tác giả cũng thu đợc các dòng cây chịu mất nớc
nh cây anh đào, cây cao lơng...
Sử dụng công nghệ tế bào thực vật kết hợp với kỹ thuật thổi khô mô sẹo
(Đinh Thi Phòng và CS, 2001) [15] đà chọn tạo thành công ba giống lúa DR1, DR2
và DR3 cả ba giống lúa đều thấp cây, ngắn ngày, chịu nóng hạn, chịu lạnh khá,
chống đổ, đẻ nhánh và sinh trởng khoẻ, cho năng suất vợt giống gốc CR 203. Trong
đó DR2 đà đợc công nhận là giống lúa Quốc gia 1998 và hiện nay DR2 không chỉ
đợc gieo trồng ở 12 tỉnh miền núi phía Bắc mà còn cả ở miền Trung (Kontum).
Giống lúa DR3 đà qua ba vụ khảo nghiệm cơ bản và hiện đang đợc triển khai mở
rộng sản xuất ở các vùng sinh thái khó khăn.
Tơng tự nh vậy Viện lúa đồng Bằng sông Cửu Long cũng đà chọn tạo thành
công dòng lúa Khao 105 có tính ứng dụng và các dòng chịu muối triển vọng từ
giống lúa Một Bụi (Bùi Bá Bổng, 1997) [3] và hiện nay giống Khao 105 đà đợc công
nhận là giống Quốc gia. Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học cũng đà chọn tạo thành công giống lúa BR12 kháng bệnh đạo ôn, có nguồn gốc
từ giống lúa CR203.
Việc chọn đợc những dòng tế bào kháng nấm bệnh, kháng chất diệt cỏ,
kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng, thích nghi tốt với các yếu tố bất lợi của môi
trờng (nóng, lạnh, khô, hạn, chua, mặn...), trên nhiều đối tợng cây trồng khác nhau
có một ý nghĩa to lớn trong nông nghiệp.
1.4. Đột biến thực nghiệm và ứng dụng trong chọn tạo giống
cây trồng
Vật chất di truyền đợc duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác, nhng
không phải là tuyệt đối, có thể bị biến đổi bởi tác nhân tự nhiên hoặc gây tạo nh tác
nhân gây đột biến vật lý và hoá học. Ngời ta gọi những biến đổi dù là nhỏ nhất trong
cấu trúc gen hoặc nhiễm sắc thể là đột biến [16].
Trong chọn giống cổ điển để chọn đợc một giống tốt, ổn định ngời ta phải
cần ít nhất từ 6 đến 10 thế hệ vì những đột biến trong tự nhiên suất hiện với tần số

rất thấp. Trong khi đó bằng phơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm),
chỉ cần từ 3 đến 6 thế hệ, thậm chí cá biệt chỉ có trờng hợp cần 2-3 thế hệ (Nguyễn
Hữu Đống, 2000) [10]. Với phơng pháp đột biến nhân tạo, sử dụng các tác nhân gây
đột biến lý hoá có thể làm tăng nguồn đa dạng di truyền trong quần thể. Trong hàng
loạt các đột biến xuất hiện, những đột biến có lợi có thể nhân trực tiếp thành giống
mới hoặc đợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống. Trong nhiều

9


tác nhân gây đột biến thì các tác nhân vật lý (tia Rơnghen, tia gamma, bức xạ
nơtron...) hiện là những tác nhân gây đột biến có hiệu quả, giúp chọn tạo ra các
giống cây trồng có những tính trạng tốt (chịu hạn, kháng nấm, năng suất cao, chất lợng tốt, thời sinh trởng ngắn...). Nhiều tác giả xử dụng phơng pháp gây đột biến
thực nghiệm bằng tia gamma đà chọn tạo đợc nhiều giống cây trồng mới, đặc biệt là
các cây lơng thực. Đối với chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co 60 hoặc Cs137 có hoạt tính
phóng xạ, tuỳ tõng trêng hỵp cơ thĨ cã thĨ sư dơng hai cách chiếu xạ: chiếu xạ trong
thời gian ngắn với liều lợng cao hoặc chiếu xạ trong thời gian dài với liều lợng thấp
[7].
Bức xạ ion hoá gồm tia Rơnghen (tia X), tia gamma (tia ) và các hạt về bức
xạ do các nguyên tố phóng xạ giải phóng ra (các hạt , , proton, nơtron). Thuật
ngữ ion hoá hàm ý muốn nói rằng năng lợng của chúng lớn tới mức các phân tử nớc
và các phân tử khác khi bi tác dụng sẽ bị phá vỡ thành những phân tử tích điện. Mọi
dạng bức xạ ion hoá đều có hiệu ứng gây chết và đột biến cho mọi tế bào và virut.
Khi có mặt ôxy, bức xạ ion hoá sản sinh ra các gốc hydro peroxit và nhiều các chất
có phản ứng mạnh. Các chất này sẽ tác động trực tiếp đến các phân tử sinh học gây
tổn thơng chúng, đặc biệt là những tác động lên bộ genom làm biến đổi vật chất di
truyền, tạo ra các đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể, có thể đợc di truyền lại
cho các thế hệ sau [17].
Các phân tư sinh häc nh ADN díi t¸c dơng cđa bøc xạ ion hoá có thể bị ba
dạng tổn thơng sau: đứt gÃy một mạch đơn (đứt gÃy khung đờng - photphat), đứt gÃy

mạch kép và thay thế bazơ nucleotit, ảnh hởng đến qua trình sao chép ADN - ARN
và tổng hợp protein. Cần nhấn mạnh rằng chỉ cần một sai lệch nhỏ của phân tử axít
nucleic có thể dẫn đến những thay đổi lớn vì cơ chế hoá sinh của tế bào khuếch đại
nó lên một cách đáng kể. Nhiễm sắc thể cũng có thể bị biến đổi cấu trúc (mất đoạn,
lặp đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn), hoặc thay đổi số lợng nhiễm sắc thể (dị bội, đa
bội).
Khi chiếu xạ bằng tia gamma từ nguồn Co60 lên tế bào hoặc mô thì các phân
tử sinh học chịu tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hoá:
- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp ion hóa và kích thích các phân tử sinh
học làm tổn thơng các phân tử đó.
- Tác dụng gián tiếp: bức xạ ion hoá tác dụng lên các phân tử nớc (chiếm 85 95% trọng lợng tế bào) với ion H+, OH-, tạo ra các gốc tự do OHã , Hã và các sản
phẩm oxy hoá mạnh nh H2O2 chúng có khả năng hoạt động rất mạnh về mặt hoá
học, do đó nó công phá các phân tử sinh học làm thay đổi cấu trúc chức năng của

10


chúng. Nếu những tổn thơng hoá sinh không phục hồi đợc sẽ kéo theo những tổn thơng chuyển hoá dẫn đến những tổn thơng hình thái và chức năng [7].
Công tác chọn giống và tạo giống mới có vai trò hết sức quan trọng trong việc
nâng cao năng suất và chất lợng cây trồng đặc biệt là cây lơng thực. Chính công tác
này đà đóng vai trò quyết định trong cuộc cách mạng xanh trong những năm 1960 ở
ấn Độ và nhiều nớc khác trên thế giới [7]. Một trong những thành tựu nổi bật nhất
của thế kỷ 20 là khám phá ra phơng pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực
nghiệm. Với kết quả của hơn 60 nớc đà thu đợc chứng tỏ đây là một phơng pháp có
hiệu quả để tạo giống mới.
Theo thống kê của tổ chức lơng thực và tổ chức năng lợng nguyên tử thế giới
(FAO/IAEA) năm 1960 chỉ có 7 giống cây trồng đột biến, năm 1975 có 145 giống,
năm 1992 có 1330 giống, năm 1997 có 1870 giống. Trung Quốc, Nhật Bản, ấn Độ,
Liên Xô cũ... là những nớc tạo ra nhiều giống bằng phơng pháp đột biến thực
nghiệm. Trong đó chủ yếu là cây lơng thực nh, lúa mạch không đổ Pallas; lúa

mạch thấp cây, chín sớm Mari (Thuỵ Điển); lúa mạch Vena chống bệnh gỉ sắt
(áo); lúa mì Inta sản lợng cao, chịu rét, rơm ngắn (Đức); lúa cho năng suất cao
(ấn Độ, Nhật Bản); lúa chống sâu bệnh, chịu th©m canh (A20, DT10, xu©n sè 5 ViƯt Nam); gièng Tài nguyên ĐB - 100 không mẫn cảm với quang chu kỳ, thời gian
sinh trởng ngắn , năng suất và chất lợng cao (Việt Nam); giống đậu Hà Lan Strol
năng suất cao (Thuỵ Điển); giống đậu tơng Sanilak, Xiuei, Gretiot chín sớm,
chống nấm, chống bệnh đốm lá, không đổ (Mỹ); giống đậu tơng chín sớm, chống
nấm, hàm lợng protit, lipit cao (Nga, Đức, Mỹ); giống bông đột biến No.108 có bụi
dày, lá xanh đậm, chống đổ, chống bệnh giỏi, năng suất và chất lợng bông cao - nhờ
việc xử lý tia γ tõ ngn Co60 víi liỊu lỵng 2000rad (Nga)...[16, 17].
ở Việt Nam, các nghiên cứu và ứng dụng của phơng pháp gây đột biến thực
nghiệm vào chọn giống thực vật đà đợc bắt đầu khá sớm. Đó là vào năm 1966, tại
Bộ môn Di truyền học, Trờng Đại học Tổng hợp Hà Nội, với các nghiên cứu trên
cây lúa và cây đậu tơng (Vũ Nguyên Hiền, Trịnh Bá Hữu, Phan Phải, Trần Minh
Nam, Lê Duy Thành, Phạm Thành Hổ, Phạm Bá Phong, 1970; 1978; 1986; 1990..).
Sau đó hớng nghiên cứu đà đợc triển khai ở nhiều cơ sở khác nh, Viện KHKTNN
Việt Nam (Trần Đình Long, Nuyễn Hữu Nghĩa..), Viện di truyền nông nghiệp
( Phan Phải, Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Hoàng Tuyết Minh..), Trờng Đại
học S phạm I Hà Nội (Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung..), Trờng Đại học Nông
nghiệp I (Lê Song Dự, Trần Tú Ngà, Đoàn Thị Thanh Nhàn..),... Và nhờ vậy, cho

11


đến nay nớc ta có hàng chục giống mới đợc tạo ra bằng phơng pháp gây đột biến
thực nghiệm ở một số cây chồng, cho năng suất cao, chất lợng tốt và chống chịu đợc
các điều kiện bất lợi của m«i trêng, nh gièng lóa (A- 20, DT10, DT11, DT13, DT33,
Xuân số 5, Xuân số 6, Tép hành đột biến), giống lạc (V79, 4329, A329, DT332..),
giống ngô (DT-6, DT-8..), đậu tơng ( M103, DT83, DT84, DT90, V48..), cà chua
(Hồng Lan..)...[17, 25, 35].
Gần đây Nguyễn Minh Công và CS (1999) [4] đà tạo đợc giống Tám Thơm

đột biến không cảm quan, có thể cấy đợc cả hai vụ. Phạm Văn Chơng, 2001) [5]
cũng thông báo chọn tạo đợc ba giống lúa BM9855, LT2 và Khao 85 đột biến không
cảm quang, gieo cấy đợc cả hai vụ, có chất lợng gạo cao (hạt gạo trong, dài, ngon
cơm...), năng xuất khá. Riêng giống Khao 85 hiƯn nay lµ gièng lóa duy nhÊt ë miền
Bắc Việt Nam đạt tiêu chuẩn quốc tế về gạo xuất khẩu chất lợng cao. Giống LT2 đợc xếp vào loại giống lúa đặc sản của Việt Nam .

Chơng 2. đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1. đối tợng nghiên cứu
1. Đối tợng nghiên cứu tính đa hình ADN là 20 giống lúa Tám có nguồn gốc
khác nhau đợc trình bày ở bảng 2.
2. Đối tợng dùng nghiên cứu chọn dòng đột biến là 4 giống lúa: Tám Xoan,
Tám ấp Bẹ, Dự Thơm và Tẻ Di Hơng.
Tất cả các giống lúa này đợc Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vËt thc
ViƯn Khoa häc Kü Tht N«ng nghiƯp ViƯt Nam cung cÊp.
- Nguån chiÕu x¹ tia gamma tõ nguån Co
chiÕu xạ Quốc gia Từ Liêm, Hà Nội.

60

đợc tiến hành tại Trung tâm

- Thiết bị sử dụng: máy ly tâm lạnh (Sigma), máy PCR (Thermal Cycler PTC
100 hÃng MJ), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Model 8425A (Hewlett

12


Packard), máy chụp ảnh Gel Doc (Pharmacia), máy chụp ảnh (Polaroid), dàn cây,
buồng tối và bình nuôi cấy.

Bảng 1: Đặc điểm nông học của các giống lúa nghiên cứu chọn dòng đột biến

Đặc điểm
Thời gian sinh
trởng (ngày)
Chiều cao cây
(cm)
Tổng số
hạt/bông
P. 1000 hạt (g)
Năng suất
(tạ/ha)
Phẩm chất gạo
và cơm
Đặc tính chống
chịu

Tám Xoan

Tám ấp Bẹ

Dự Thơm

Tẻ Di Hơng

160 - 165

165 - 168

155 158

142 - 145

140 - 145

137 - 140

140 – 145

125 - 130

130 - 135

150

100 – 110

110 - 115

20 - 21

21 - 22

24 25

21,2

30 -32

35 - 41

-

-

Hạt nhỏ, trong
và ngon cơm

Hạt nhỏ, ngon
và rất thơm

Cơm mềm,
dẻo và thơm

Thân mềm,
chống đổ kém

Thân mềm,
chống đổ kém

Chống đổ
trung bình

Cơm mềm,
dẻo và thơm
-

Bảng 2: Nguyên liệu 20 giống lúa dùng để phân tích đa hình ADN

Số thứ tự

Số đăng ký

Tên giống

1

GB0310

Tám Thơm Hà Đông

2

GB0311

Tám Xoan Hải Dơng

3

GB0312

Tám Xoan Hải Dơng

4

GB0313

Tám Xoan Có Râu Hải Dơng

5

GB0314

Tám Xoan Bắc Ninh

6

GB0315

Tám Xoan

7

GB0316

Tám Nghệ Hạt Đỏ

8

GB0317

Tám Xoan Vĩnh Phúc

9

GB0318

Tám Nhỡ Bắc Ninh

10

GB0319

Tám Nhỡ Vĩnh Phúc

13


11

GB1048

Tám Xoan Hải Hậu

12

GB1252

Tám Chiêm Hà Nam

13

GB1253

Tám Thơm

14

GB1254

Tám Ngọc Vạch

15

GB1381

Tám Thơm Hồng Quảng B

16

GB2365

Tám Xoan

17

GB2373

Tám xoan

18

GB2375

Tám Thơm ấp Bẹ

19

GB5117

Tám Xuân Đài

20

GB5118

Tám Tiêu

2.2. phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp nghiên cứu theo sơ đồ thí nghiệm tổng quát sau:

Hạt các giống lúa

Tạo cây và thu lá

Tạo mô sẹo

Tách ADN

Xử lý đột biến

Đánh giá đa hình
ADN bằng kỹ
thuật RAPD

Tái sinh cây và
xác định ng­ìng
xư lý ®ét biÕn

14

Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.2.1. Nghiên cứu tính đa hình ADN của 20 giống lúa Tám
2.2.1.1. Kỹ thuật thu và bảo quản lá
Hạt lúa đợc bóc vỏ trấu, chọn những hạt sạch cho vào lọ thủy tinh có nút
nhám và khử trùng hạt theo trình tự sau: lắc nhẹ trong cồn 70% khoảng 1 phút, 15 20 phót trong níc javen 60%, rưa s¹ch b»ng níc cÊt vô trùng 4 lần. Sau đó chuyển
hạt lên đĩa petri có giấy lọc vô trùng.
Hạt gạo đà khử trùng đợc cấy lên môi trờng MS cơ bản, có bổ sung 1%
saccharoza + 0.8% agaroza, pH = 5,8. MËt ®é cÊy 10-15 hạt/bình. Nuôi ngoài ánh
sáng đèn trong phòng cấy với cờng độ 2000 lux, thời gian chiếu sánh 10/24 giờ,
nhiệt độ nuôi cấy 250C . Sau 2 tuần cắt thu lấy lá dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh
sâu - 200C. Thu lá non vì lá non có ít sản phẩm của trao đổi chất gây trở ngại cho
khả năng hoà tan của ADN thu đợc.
2.2.1.2. Tách ADN tổng số từ lá lúa
Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lá lúa dựa theo phơng pháp tách ADN
của Egnin, 1998.
a) Ho¸ chÊt sư dơng:
1M Tris-HCl, pH = 8.0; 5M NaCl; 0.5 EDTANa2; PVP; 5% SDS (Sodium
dodecyl sulfate); RnazaA 10 mg/ml; 3M CH3C00Na, pH 5,3 or pH 7.0; TE (10 mM
Tris, pH=8.0 + 1mM EDTA, pH=8.0); isopropanol; Phenol: Chlorofom: Isoamyl
(25:24:1) và Cồn 80%.
b) Pha đệm tách ADN:
Bảng 3: Nồng độ của hoá chất tách ADN tổng số

Nồng độ chuẩn

Nồng độ cÇn pha

Trong 50 ml

1M Tris - HCl, pH = 8.0

50mM

2.5ml

5M NaCl

300Mm

3ml

0.5M EDTA

20Mm

2ml

15


Polyvinyl pyrolydine

2%

1g

10% Muèi natri ascobat

0,1%

0,5ml

20% Saccrosin

1,5%

3,75ml

1%

0.5g

Metabisulfit
H2O cÊt

38,5 ml

c) Quy tr×nh t¸ch ADN tỉng sè:
- Thu 1-2 gam l¸ lóa non, nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bớc nghiền phải làm nhanh để thu đợc ADN có phân tử lợng lớn. Nghiền trong nitơ
lỏng đảm bảo mẫu đợc nghiền triệt để, ADN thu đợc có dạng sứa, có phân tử lợng
cao, không đứt đoạn.
- Chuyển nhanh sản phẩm nghiền vào ống eppendorf, giữa trong đá hoặc cho
vào tủ lạnh sâu -20 cho đến khi cần dùng.
- Thêm 9-12 ml dung dịch đệm tách ADN trộn đều bằng cách đảo ngợc nhẹ.
Nếu dùng ống eppendorf 2 ml thì thêm 500 àl - 1ml đệm A trộn đều.
- Giữ trong đá 2-5 phút, Thêm 9 ml dung dịch (Phenol: Chlorofom: Iso amin)
(25: 24: 1) đảo đều cho đến khi có màu trắng sữa, cho vào đá.

- Ly tâm với tốc ®é 10.000 - 12.000 vßng/phót, ë 40C trong 15 phót.
- Chuyển dịch trên sang ống eppendorf mới, có chứa 9ml dung dịch Iso
propanol (nhẹ nhàng không khuấy cặn). Dịch nổi trên cùng có thể lọc qua một màng
lọc vô trùng trớc khi thêm Iso propanol.
- Đảo đều để trong nhiệt độ 40C, 10-30 phút (hoặc cho kết tủa qua đêm ở
nhiệt độ 4 0C).
- Ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút, ở 40C trong 3-5 phút nếu ADN là lớn có
thể thấy lơ lửng, nếu không ly tâm ở số vòng lớn hơn 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ phần dịch nổi ở trên, làm khô phần kết tủa (không làm khô quá lâu)
bằng máy Speed-Vac.
- Hoà tan kết tủa trong 500 àl TE, hoặc ít hơn nếu vật liệu ban đầu dùng ít, để
ở 4 C qua đêm cho cục kết tủa hết và ADN không bị gÃy.
0

- Thêm 3 -7 àl enzym RnazaA, trộn đều và ủ ë 370C trong 30 phót.

16


- Ly tâm 14.000 vòng/phút chuyển dịch trên sang một ống mới 1,5ml cẩn
thận không sẽ bị khuấy cặn.
- Thêm 100àl CH3C00Na, lắc đều và thêm 1ml Isopropanol để kết tủa lại.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và thêm 1ml
cồn 80%.
- Ly tâm14.000 vòng/phút, bỏ dịch cồn trên và làm khô bằng máy Speed-Vac
(ADN phải khô mới có thể hoà tan hoàn toàn trong TE).
- Hoà tan lại trong 50 - 100 àl TE, để qua đêm , bảo quản ADN ở -200C.
2.2.1.3. Phơng pháp xác định hàm lợng và độ sạch của ADN
a) Điện di trên gel agaroza:
- Pha agaroza 0.8% trong TBE 0.5X, đun nóng, để nguội khoảng 600C đổ vào

khuôn gel 30ml có cài lợc.
- Sau 30 phút tháo lợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0.5X ngập bảng gel 1mm.
- Lấy 2àl DNA mẫu + 1àl Thuốc nhuộm 10X + 7àl H2O trộn đều. Dùng
pipet cho vào giếng.
- Chạy điện di: 60V, 70 phút.
- Nhuộm gel: nhuộm gel bằng Ethidium bromid 0.5 àg/ml trong 10 phút, rửa
sạch bằng nớc.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.
b) Đo bằng máy đo quang phổ hấp thụ:
- Đo trên máy đo quang phổ có chơng trình xử lý trên máy vi tính.
- Vùng đo ở bớc sóng 260nm-280nm.
- Chỉnh cân bằng máy: dùng nớc cất vô trùng để làm chuẩn.
- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN chuẩn đà biết trớc nồng độ.
- Đo mẫu: cho 995àl nớc cất vµ 5µl ADN mÉu vµo cuvet (hƯ sè pha lo·ng
200 lần), lắc đều đặt vào máy đo.
- Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvet.
- In kết quả đo đợc.
Tính toán hàm lợng và độ sạch ADN:

17


Hàm lợng ADN (ng/àl) = 50 ì HSPLìOD260
Độ sạch ADN = OD260/OD280
HSPL: hÖ sè pha lo·ng
50: h»ng sè
OD260: chØ sè ®o ®ỵc ë bíc sãng 260nm
OD280: chØ sè ®o ®ỵc ở bớc sóng 280nm
Nếu độ sạch ADN = 1,8 - 2,0 thì mẫu đợc coi là mẫu sạch.

2.2.1.4. So sánh RAPD
a) Đoạn mồi
Đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng cho việc phân tích bộ genom đợc tổng hợp
bằng máy Gene assembler (Pharmacia) tại Viện Công nghệ Sinh học. Trình tự các
đoạn mồi dài 10 nucleotit đợc thiết kế dựa trên tài liệu của Monna và CS (1994).
Các đoạn mồi có ký hiệu và trình tự là:
1. Mồi RA31: 5 AACCGACGGG 3

6. Måi RA46: 5’ CCAGACCCTG 3’

2. Måi RA32: 5’ TGCCCTGCCT 3’

7. Måi RA50: 5’ GCTGTGCAGC 3’

3. Måi RA36: 5’ GGGGGTCGTT3’

8. Måi RA142: 5’ CAATCGCCGT 3’

4. Måi RA40: 5’ GGCGGACTGT 3’

9. Måi RA143: 5’ TCGGCGATAG 3’

5. Måi RA45: 5’ TACCACCCCG 3’

10. Måi RA159: 5 GTCCACACGG 3

b) Phản ứng PCR-RAPD
- Mỗi ống phản ứng PCR có 25 àl dung dịch chứa: 1X đệm PCR; 2.5 mM
MgCl2; 100 àM 4dNTP; 200 nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymeraza và 50 100 ng ADN khuôn.
- Trộn đều hỗn hợp thu đợc (thao tác trong đá để đảm bảo các hoá chất không

mất hoạt tính).
- Tiến hành nhân bản trong máy PCR-Thermal Cycler PTC100 theo chÕ ®é:

18


Bíc 1: 940C 1 phót; bíc 2: 920C 1 phót; bíc 3: 350C 1 phót; bíc 4: 720 1 phót;
bíc 5: 72 0C 10 phót; bíc 6: lu gi÷ ë 40C. Từ bớc 2 đến bớc 4 lặp lại 45 chu kỳ.
b) Điện di sản phẩm RAPD
Pha agaroza 1,5% trong TBE 0,5X đun nóng, để nguội khoảng 600C thì đổ
vào khuôn gel có cài lợc, sau 30 phút tháo lợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0,5X
ngập bản gel 1 mm. LÊy 2,5 µl thuèc nhuém 10X cho vµo mỗi ống sản phẩm, trộn
đều. Dùng pipet cho hỗn hợp vào giếng và chạy điện di: 80V, 150 phút. Nhuộm gel
bằng Ethidium bromid 0,5 àg/ml trong 10 phút, rửa sạch bằng nớc, soi gel trên đèn
UV và chụp ảnh.

c) Phân tích số liệu RAPD
Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn ADN khi điện
di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên của 20 giống lúa Tám để làm cơ sở
cho việc phân tích số liệu.
Tiêu chuẩn hoá sản phẩm RAPD theo qui ớc:
Số 1: xuất hiện phân đoạn ADN
Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN
Các số liệu đợc xử lý trên máy vi tính theo chơng trình NTSYSpc version 2.0
(Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) để lập ra biểu đồ so sánh hệ số tơng đồng di
truyền giữa 20 giống lúa Tám ở mức độ phân tử.
2.2.2. Phơng pháp chọn dòng đột biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2.1. Tạo mô sẹo
a) Các loại môi trờng dùng trong nuôi cấy:
- Môi trêng C1: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 0,1 mg/l NAA + 0,2

mg/l BAP + 2 mg/l 2,4D.
- M«i trêng C2: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 2 mg/l 2,4D.
- M«i trêng R: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 0,2 mg/l NAA + 2
mg/l BAP, pH = 5,8.
b) Kỹ thuật tạo mô sẹo lúa:

19


Hạt lúa chín đợc bóc vỏ trấu, chọn những hạt sạch cho vào lọ thuỷ tinh có nút
nhám và khử trïng theo tr×nh tù sau: khư trïng trong cån 70 0 thêi gian 1 phót, javen
60% thêi gian tõ 15 - 20 phút (lắc đều), sau đó rửa sạch bằng nớc cất vô trùng 4 - 5
lần. Đặt hạt lên đĩa petri, có lót giấy thấm vô trùng, để hạt khô, hạt lúa đà đợc khử
trùng đem cấy vào môi trờng tạo mô sẹo C1 và C2 khoảng 15 - 20 hạt/bình tam giác
250 ml, để trong buồng tối ở nhiệt độ 250C, sau 1 tuần để ra ánh sáng với cờng độ
2000 Lux, thời gian chiếu 10 giờ/ngày, ở 250C. Sau 2 -3 tuần khối mô sẹo sẽ đợc tạo
thành và tiến hành đánh giá khả năng tạo mô sĐo.
2.2.2.2. Xư lý m« sĐo b»ng tia gamma tõ ngn Co60.

Mô sẹo đợc tạo ra sau 3 tuần, chọn lọc những mô đẹp, đợc cắt nhỏ khoảng 2
- 3 mm cấy vào môi trờng nhân mô sẹo và tiến hành xư lý chiÕu x¹ b»ng tia
gamma tõ ngn Co60.
ChiÕu x¹ mô sẹo với liều lợng là: 3Krad, 5Krad, 7Krad, 9Krad, 11Krad và
13Krad. Mô sẹo đà xử lý chiếu xạ đợc nuôi cấy ngay lên môi trờng tái sinh cây (R)
sau 4 tuần đánh giá tỷ lệ sống chết của mô sẹo từng liều chiếu.
2.2.2.3. Tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý đột biến
Mô sẹo sau khi xử lý đột biến đợc cấy lên môi trờng tái sinh, ở nhiệt độ
phòng 250C, dới ánh sáng đèn neon với cờng độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10
giờ/ngày. Sau 4 tuần nuôi cấy đánh giá và chọn lọc mô tái sinh, số cây tái sinh. Các
dòng tái sinh đợc cấy chuyển sang môi trờg MS cơ bản có bổ sung 2% saccharoza +

0,8% agaroza.
Các chồi lúa tái sinh đợc tách thành các dòng cây và cấy lên môi trờng tạo
cây hoàn chỉnh (MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA), nuôi cấy trong điều kiện nh trên.
Trớc khi đa cây ra ruộng, cây phải đợc cấy chuyển một vài lần để cây khoẻ hơn có
khả năng thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên.
2.2.2.4. Phơng pháp tính toán số liệu
Các phép tính toán này đợc sử dụng trên chơng trình phần mềm excel.
a) Xác định tỷ lệ tạo mô sẹo (Ci)
CI =

Ncf
ì100%
Nt

CI:: tỷ lệ mô sẹo tính theo %
Ncf: số hạt tạo mô sẹo
Nt: tổng số hạt nuôi cấy

20


b) Xác định tỷ lệ sống sót của mô sẹo (SV)
SV =

Nsv
ì100%
Nt

SV: tỷ lệ mô sống sót (%)
NSV: số mô sống sót

Nt: tổng số mô xử lý

c) Xác định tỷ lệ tái sinh cây ( RC)
RC =

Nr
ì100%
Nsv

RC: tỉ lệ tái sinh (%)
Nr : số mô tái sinh
NSV: số mô sống sót

Chơng 3. Kết quả và thảo luận

3.1. Phân tích tính đa hình ADN của các giống lúa tám

3.1.1. kết quả tách chiết ADN tổng số
Để thực hiện đợc phản ứng RAPD thì ADN sạch, không bị đứt gÃy là nguyên
liệu đầu tiên quyết định đến sự thành công cho cả quá trình nghiên cứu.
Kết quả kiểm tra chất lợng và xác định nồng độ ADN cho thấy các mẫu ADN
thu đợc đều có chất lợng tốt. Cụ thể là điện di trên gel agaroza cho thấy ADN tập
trung một băng chính, không bị đứt gÃy (hình 1) và khi đo OD ë bíc sãng 260 nm 280 nm th× phỉ hÊp thơ chØ cã mét ®Ønh hÊp phơ duy nhÊt là 260 nm (hình 2).
Các mẫu ADN thu đợc đều có độ tinh sạch cao cụ thể là chỉ số tû lƯ
OD260/OD280 thÊp nhÊt lµ 1,800 ë hai gièng GB0315, GB0319 và cao nhất là 1,913 ở
giống GB2375 (bảng 4).
Nh vậy, kết quả tách chiết ADN từ lá lúa của chúng tôi đà thu đợc các mẫu
ADN sạch và có trọng lợng phân tử lớn, đủ tiêu chuẩn để tiến hành các phản ứng
RAPD.
Bảng 4: hàm lợng và độ tinh sạch của các mẫu ADN

Tên mẫu

Hàm lợng Độ tinh sạch
ADN
AND (ng/àl)

Tên mẫu

Hàm lợng

Độ tinh sạch

ADN (ng/àl)

ADN

21


GB0310
GB0311
GB0312
GB0313
GB0314
GB0315
GB0316
GB0317
GB0318
GB0319

1066,8
2280,7
1135,6
2279,5
1062,9
1935,6
1327,0
618.33
671,5
1209,7

1,882
1,880
1,868
1,882
1,803
1,800
1,856
1,823
1,812
1,800

GB1048
GB1252
GB1253
GB1254
GB1381
GB2365
GB2373

GB2375
GB5117
GB5118

978,63
673,23
825,47
1056,7
315,73
1438,8
373,23
1711,17
494,27
920,6

1,863
1,856
1,828
1,889
1,832
1,902
1,808
1,913
1,812
1,904

ảnh

Hình 2: Kết quả điện di kiểm tra ADN tổng sè t¸ch tõ c¸c gièng lóa

22


Hình 3: Phổ hấp phụ ADN tách từ các giống lúa

3.1.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiªn (ký hiƯu RA31;
RA32; RA36; RA40; RA45; RA46; RA50; RA142; RA143 và RA159) có độ dài 10
nucleotit để phân tích tính mức độ khác nhau về di truyền của 20 giống lúa Tám.
Kết quả nhận đợc cả 10 mồi đều biểu hiện tính đa hình nhng chỉ có 6/10 mồi là cho
thấy tính đa rõ nhất đó là các mồi: RA31, RA36, RA45, RA46, RA142 và RA159.
Điện di sản phẩm RAPD víi 10 måi cđa 20 gièng lóa T¸m thu đợc 889 phân đoạn
ADN. Dới đây là kết quả phân tÝch RAPD víi 3 måi RA36, RA46 vµ RA142:
a) Måi RA36

¶nh

23


: xuất hiện phân đoạn ADN;

không xuất hiện phân đoạn ADN

Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 20 gièng lóa víi måi RA31 (thø tù
c¸c gièng nh trong bảng 5). M: Thang ADN chuẩn (ADN cắt b»ng Hind II + Ecol RI).

Ghi chó: Sè 1: GB0310, 2: GB0311, 3: GB0312, 4: GB0313, 5: GB0314, 6:
GB0315, 7: GB0316, 8: GB0317, 9: GB0318, 10: GB0319, 11: GB1048, 12: GB1252, 13:
GB1253, 14: GB1254, 15: GB1381, 16: GB2365, 17: GB2373, 18: GB2375, 19: GB5117 và

20: GB5118.

Kết quả điện di sản phÈm RAPD cđa c¸c gièng víi måi RA36 cã tõ 4 đến 12
phân đoạn ADN trong genom lúa đợc nhân ngẫu nhiên (bảng 5). Kích thớc các phân
đoạn có chiều dài ớc tình từ 0,46Kb đến 2,5Kb. Đây là loại mồi tạo ra sự đa hình
phong phú nhất (hình 4). Trong đó giống GB0313 (cột 4) và GB0316 (cột 7) là có số
phân ADN đợc nhân ban nhiều nhất là 12 phân đoạn, giống GB1381(cột 15) chỉ có
4 phân đoạn đợc nhân bản.
Bảng 5: Các phân đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD với
mồi RA36.
CDƯT
(Kb)

Đ

Số thứ tự các giống*

ĐN 1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0

2.5

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

0

1

0

1

1

1

2.0

2

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

1

0

1

0

1

1.62

3

1

1

1

1

1

1

1

1

0

1

1

1

0

0

0

1

0

1

1

1

1.5

4

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

1

0

1

0

1

1.4

5

0

0

0

0

1

0

1

1

0

0

1

0

0

0

0

1

0

0

0

0

1.3

6

0

0

0

1

1

1

1

1

0

0

0

0

1

0

0

1

0

0

0

0

1.2

7

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1.0

8

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

24


0.95

9

1

1

1

1

1

1

1

0

1

1

1

0

0

1

0

1

0

1

1

1

0.9

10 0
11 0

0

0

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

0

1

0

1

1

0

1

0

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

12 1
13 0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

0

0

1

0

1

1

1

0

0

1

1

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0

0

0

14 0
15 1

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

1

0

0

0

0

1

1

0

1

1

1

1

0

0

1

0

0

16 1
17 0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

7

7

6 12 11 10 12 10 7

9 11 5

5

5

4 11 6 10 6

9

0.85
0.8
0.75
0.7
0.6
0.55
0,46
TPĐ

Ghi chú: * là số thứ tự các giống nh trong hình 4; CDƯT: chiều dài ớc tính;
ĐĐN: Đoạn đợc nhân; TPĐ: Tổng phân đoạn; Số 1: phân đoạn ADN đợc nhân; số 0 phân
đoạn ADN không đợc nhân .

Tính đa hình đợc thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn
ADN khi so sánh giữa các giống với nhau. Trong 20 giống lúa tám nghiên cứu thì
chỉ có giống GB2373 (cột số 17) xuất hiện phân đoạn ADN tại vị trí 0,46Kb và
1,0Kb (mũi tên) hay tại vị trí 0,7Kb cột số 7 giống GB0316 xuất hiện phân đoạn
ADN. Ngợc lại tại vị trí 2,5Kb ba gièng GB2373 (cét sè 17), GB1381 (cét sè 15) vµ
GB0318 (cột số 9) không có phân đoạn ADN đợc nhân bản và tại vị trí 1,2 Kb cũng
cho thấy giống GB0312 (cột số 3) không xuất hiện phân đoạn AND. Từ kết quả
phân tích cho phép nhận xét các giống lúa Tám nghiên cứu đà có sự sai khác về di
truyền.
b) Mồi RA46
Điện di sản phẩm RAPD với mồi RA46 của các giống lúa chúng tôi cũng
nhận đợc kết quả tơng tự nh mồi RA36. Xuất hiện từ 4 đến 11 phân đoạn AND đợc
nhân bản ngẫu nhiên của các giống có kích thớc ớc lợng khoảng từ 0,5Kb đến 2,5Kb
so với thang ADN chuẩn (bảng 6). Ví dụ: tại vị trí 0,6Kb có hai giống GB0314 (cột
số 5) và giống GB1254 (cột số 14) phân đoạn ADN đà không đợc nhân bản, tơng tự

tại vị trí 1,4Kb hai giống GB0318 (cột số 9) và GB0319 (cột số 10) phân đoạn cũng
không đợc nhân bản (hình 5). Trong 20 giống lúa nghiên cứu thì chỉ có giống
GB5117 (cột số 19) là xuất hiện phân đoạn ADN tại vị trí 0,8Kb. Tại nhiều vị trí
khác cho thấy một số giống có phân đoạn ADN đợc nhân bản, một số giống khác

25