chuyển hoá artemisinin từ thanh hao hoa vàng (artemisia annua l ) bằng phương pháp sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------

PHẠM QUANG DƯƠNG

CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ TỪ THANH HAO HOA VÀNG
(ARTEMISIA ANNUA L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
ĐỂ TẠO THÀNH CÁC DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
KỸ THUẬT HOÁ HỌC
HÀ NỘI – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------

PHẠM QUANG DƯƠNG

CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ TỪ THANH HAO HOA VÀNG
(ARTEMISIA ANNUA L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
ĐỂ TẠO THÀNH CÁC DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KỸ THUẬT HOÁ HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
KỸ THUẬT HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. PGS. TS VŨ ĐÌNH HOÀNG

2. PGS. TS PHẠM GIA ĐIỀN
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG :
PGS.TS HOÀNG XUÂN TIẾN
HÀ NỘI – 2014


LỜI CAM ĐOAN

Luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học với đề tài “Chuyển
hóa artemisinin từ thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) bằng phương pháp
sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học’’ đƣợc hoàn thành dƣới
sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS Vũ Đình Hoàng – Bộ môn CN Hóa dƣợc và
BVTV – Viện Kỹ thuật Hóa học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội và PGS.TS
Phạm Gia Điền - Phòng CN Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Hoá học – Viện
Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin cam đoan các số liệu, những
kết luận nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận văn này là trung thực và không sao
chép nội dung từ bất kỳ một luận văn thạc sĩ hay tiến sĩ nào khác.


MỤC LỤC
Trang
PHẦN I: TỔNG QUAN ..............................................................................................9
I.1.TÌNH HÌNH SỐT RÉT Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI ...........................9
I.1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới......................................................................9
I.1.2. Tình hình sốt rét ở Việt Nam ....................................................................10
I.1.3. Các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong điều trị sốt rét..........................10
I.2. CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC CỦA ARTEMISININ ........................................11
I.2.1. Artemisinin................................................................................................11
I.2.2. Tính chất hoá học của artemisinin ...........................................................12
I.2.2.1. Phản ứng nhiệt phân ...........................................................................12

I.2.2.2. Phản ứng với kiềm ..............................................................................13
I.2.2.3. Phản ứng với amoniac và amin ..........................................................13
I.2.2.4. Phản ứng với acid ...............................................................................14
I.2.2.5. Phản ứng khử hoá ...............................................................................14
I.2.3. Phản ứng tạo các dẫn xuất từ artemisinin .................................................15
I.2.3.1. Bán tổng hợp các dẫn xuất ete của dihydroartemisinin (DHA) .........15
I.2.3.2. Bán tổng hợp các dẫn xuất este của dihydroartemisinin (DHA) ........16
I.2.3.3. Bán tổng hợp các dẫn xuất carbohydrat của DHA .............................16
I.2.3.4. Bán tổng hợp các dẫn xuất fluoralkyl ete của DHA ...........................16
I.2.4. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin ....................................................17
I.2.4.1. Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự hoạt hoá bởi Fe2+ của haem .....17
I.2.4.2. Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự kìm hãm enzyme PfATP6 .......20
I.2.5. Hoạt tính chống ung thƣ của artemisinin và các dẫn xuất ........................21
I.2.5.1. Artemisinin monomer .........................................................................21
I.2.5.2. Những monomer khác ........................................................................22
I.2.5.3. Artemisinin dimer ...............................................................................23
I.2.5.4. Artemisinin liên hợp ...........................................................................24
I.3. CHUYỂN HOÁ SINH HỌC CỦA ARTEMISININ VÀ CÁC DẪN XUẤT ..26

1


I.3.1. Chuyển hoá sinh học của artemisinin .......................................................27
I.3.2. Chuyển hoá sinh học của dẫn xuất artemisinin.........................................31
I.4. ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI SINH VẬT PENICILLIUM CITRINUM ................34
I.4.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................34
I.4.2. Chuyển hoá của chủng Penicillium citrinum ...........................................35
PHẦN II: VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............38
II.1. VẬT LIỆU, THIẾT BỊ....................................................................................38
II.1.1. Hoá chất, Chủng và môi trƣờng vi sinh vật .............................................38

II.1.2. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................39
II.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................39
II.2.1. Phƣơng pháp lên men. .............................................................................39
II.2.2. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng. ................................................................40
II.2.3. Phƣơng pháp sắc kí cột ............................................................................41
II.2.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ....................................................................43
II.2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học ........................................................45
PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...........................................................46
III.1. THỰC NGHIỆM ...........................................................................................46
III.1.1. Chuẩn bị dịch lên men ............................................................................46
III.1.2. Lên men thực hiện chuyển hoá: .............................................................46
III.1.3. Tách sản phẩm ........................................................................................47
III.2. KẾT QUẢ .....................................................................................................49
III.2.1. Xác định cấu trúc hoá học sản phẩm M1 ...............................................49
III.2.2. Số liệu phổ 1H, 13C NMR của 4α-hydroxydeoxyartemisinin .................50
III.2.3. Thử hoạt tính sinh học. ...........................................................................53
III.2.3.1. Pha loãng mẫu thử: ..........................................................................53
III.2.3.2. Thử hoạt tính ....................................................................................53
III.2.3.3. Chất tham khảo ................................................................................53
III.3. THẢO LUẬN................................................................................................55
PHẦN IV: KẾT LUẬN .............................................................................................56

2


PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................57
PHỤ LỤC ..................................................................................................................63

3

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Đình Hoàng - Bộ môn CN
Hóa dƣợc và BVTV – Viện Kỹ thuật Hóa học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội
đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cƣơng và hoàn thành luận
văn. ThS. Bá Thị Châm Phòng Hoá sinh ứng dụng – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã cung cấp chủng vi sinh vật, các trang thiết bị
cũng nhƣ những hƣớng dẫn trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Gia Điền cùng các các anh, chị trong Phòng CN Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt nhất cho tôi
trong thời gian thực hiện luận văn.
Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo đặc biệt là các thầy cô
thuộc Viện Kỹ thuật Hóa Học trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã chỉ dạy cho tôi
trong suốt quá trình học tập.
Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, và ngƣời thân đã giúp
đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thời gian làm luận văn.
Hà nội, ngày

tháng

năm 2014

Học viên

Phạm Quang Dƣơng

4


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

IR: Infrared Spectroscopy
EI – MS: Electron Impact Mass Spectroscopy
1

H NMR: 1H -Nuclear Magnetic Resonance

13

C NMR: 13C - Nuclear Magnetic Resonance

HMQC: Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence
HMBC: Heteronuclear multiple - Bond Correlation
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
TLC: Thin layer chromatography
EtOAc: Ethyl acetate
UV: ultraviolet
δ(ppm): Độ dịch chuyển hóa học (parts per million)
J(Hz): Hằng số tƣơng tác (Hertz)
br: broad singlet
s: singlet
d: doublet
dd: double doublet
t: triplet
MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu.
IC50 (The half maximal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% .
MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu.

5

DANH MỤC CÁC HÌNH , SƠ ĐỒ VÀ BẢNG
Trang
Hình 1.1. Đƣờng hƣớng tác động của artemisinin gây ra bởi ferrous haem (Fe(II)
protoporphyrin IX)…………………………………………………………………

20

Hình 1.2. Vị trí liên kiết của chất kìm hãm thapsigargin và artemisone đối với
enzyme SERCA……………………………………………………………………

20

Sơ đồ 1.1. Chuyển hoá artemisinin của chủng Penicillium chrysogenum ATCC
9480………………………………………………………………………………...

28

Sơ đồ 1.2. Chuyển hoá artemisinin của chủng Nocardia corallina ATCC 19070
và chủng Aspergillus flavus……………………………………………………….

28

Sơ đồ 1.3. Chuyển hoá artemisinin của chủng Cunninghamella elegans ATCC
9245………………………………………………………………………………...

29

Sơ đồ 1.4. Chuyển hoá artemisinin của chủng Cunninghamella echinulata AS
3.3400 và chủng Aspergillus niger AS 3.795………………………………………

30

Sơ đồ 1.5. Chuyển hoá artemisinin của chủng Penicillium simplicissimum………

31

Hình 1.3. Đăc điểm hình thái chủng Penicillium citrinum…………………..…….

34

Hình 1.4. Các dạng khuẩn lạc Penicillium citrinum nuôi cấy trên môi trƣờng
agar…………………………………………………………………………………

34

Sơ đồ 1.6. Chuyển hoá caffein của chủng Penicillium citrinum…………………...

36

Sơ đồ 1.7. Chuyển hoá 3β-acetoxypregna-5,16 diene-20-one của chủng
Penicillium citrinum……………………………………………………………………….

37

Hình 2.1. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng………………………………………………..

40

Hình 2.2. Phƣơng pháp sắc kí cột………………………………………………….

43

Hình 3.1. Kết quả theo dõi dịch lên men bằng bản sắc ký lớp mỏng……………..

47

BẢNG 3.1: Hệ dung môi dùng để phân lập chất……………………………...........

48

BẢNG 3.2:

Độ dịch chuyển hoá học của proton trên phổ 1H NMR của

artemisinin và 4α-hydroxydeoxyartemisinin ………………………………………

6

51


BẢNG 3.3:

Độ dịch chuyển hoá học của cacbon trên phổ

13

C NMR của

artemisinin và 4α-hydroxydeoxyartemisinin ………………………………………

52

BẢNG 3.4: Kết quả thử hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định của
artemisinin và 4α-hydroxydeoxyartemisinin……………………………………….

7

54


ĐẶT VẤN ĐỀ
Artemisinin là một sesquiterpene có cầu endoperoxide đƣợc phân lập từ cây
Thanh hoa hoa vàng (Artemisia annua L.) đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam và một
số nƣớc khác trên thế giới nhƣ: Trung Quốc, Ấn Độ. Artemisinin là một chất có phổ
hoạt tính sinh học rộng, nhƣ hoạt tính: chống ung thƣ, hoạt tính chống khuẩn, hoạt
tính chống sốt rét. Trong đó, artemisinin đƣợc sử dụng phổ biến điều trị bệnh sốt rét
gây ra bởi loài Plasmodium falciparum kháng cloroquine, ở dạng kết hợp (ACT)
với một số loại thuốc chống sốt rét khác. Tuy nhiên, do đặc điểm thể hiện độc tính
cao, hấp thu kém do tính tan trong dầu và tan trong nƣớc kém, cũng nhƣ dễ bị tái
phát vì kém bền trong cơ thể ngƣời.
Để khắc phục các nhƣợc điểm trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu tổng hợp
các dẫn xuất của artemisinin với các tính chất sinh học tốt hơn bằng các phƣơng
pháp hóa học cũng nhƣ sinh học. Chuyển hóa sinh học (Biotransformation) sử dụng
vi sinh vật và các enzyme rất hiệu quả đối với sesquiterpene. Trên thế giới đã có
nhiều nghiên cứu tổng hợp sinh học các dẫn xuất của artemisinin sử dụng nhiều
chủng vi sinh vật khác nhau. Một số phƣơng pháp hiệu quả hơn hẳn so với phƣơng
pháp chuyển hóa hóa học. Tại Việt Nam, những chuyển hóa sinh học artemisinin sử
dụng các chủng vi sinh vật khác nhau, còn ít đƣợc quan tâm. Nhằm tìm kiếm các

chủng vi sinh mới có hiệu suất chuyển hóa cao, hoặc các dẫn xuất mới. Chúng tôi
thực hiện đề tài: “Chuyển hóa artemisinin từ thanh hao hoa vàng (Artemisia
annua L) bằng phương pháp sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính
sinh học”.
Nội dung của đề tài bao gồm:
(1) Nuôi cấy các chủng vi sinh vật.
(2) Thực hiện chuyển hóa sinh học artemisinin sử dụng các chủng này.
(3) Phân lập các chất tinh khiết từ hỗn hợp sản phẩm
(4) Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp
phổ.
(5) Thử hoạt tính sinh học các chất này.

8


PHẦN I: TỔNG QUAN
I.1.TÌNH HÌNH SỐT RÉT Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI
I.1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới
Sốt rét còn gọi là ngã nước là một chứng bệnh gây ra bởi ký sinh trùng tên
Plasmodium, lây truyền từ ngƣời này sang ngƣời khác khi những ngƣời này bị muỗi
Anophen đốt, và loài muỗi này đƣợc chuyên gia ngƣời Anh là Ronald Ross xác
định nhƣ là một vật trung gian truyền ký sinh trùng sốt rét.
Bệnh phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Á và
châu Phi. Mỗi năm có khoảng 515 triệu nguời mắc bệnh, từ 1 đến 3 triệu ngƣời tử
vong - đa số là trẻ em ở khu vực phía nam sa mạc Sahara, châu Phi. Trong đó 90%
số ca tử vong xảy ra tại đây. Sốt rét thƣờng đi kèm với đói nghèo, lạc hậu, và là một
cản trở lớn đối với phát triển kinh tế. Sốt rét là một trong những bệnh truyền nhiễm
phổ biến nhất và là vấn đề rất nghiêm trọng đối với sức khoẻ cộng đồng. Bệnh gây
ra bởi ký sinh trùng protozoa thuộc chi Plasmodium. Chi này có bốn loài làm con
ngƣời nhiễm bệnh. Nguy hiểm hơn cả là Plasmodium falciparum và Plasmodium

vivax. Hai loài còn lại (Plasmodium ovale, Plasmodium malariae) cũng gây bệnh
nhƣng ít tử vong hơn. Nhóm các loài Plasmodium gây bệnh ở ngƣời thƣờng đƣợc
gọi chung là ký sinh trùng sốt rét. Riêng loài P. knowlesi, phổ biến ở Đông Nam Á,
gây bệnh sốt rét ở khỉ nhƣng cũng có thể gây nhiễm trùng nặng ở ngƣời
Những biểu hiện sau khi nhiễm bệnh bắt đầu thể hiện từ ngày thứ 8 đến 25; tuy
nhiên, các triệu chứng có thể thể hiện muộn hơn đối với những ngƣời đã sử dụng
thuốc chống sốt rét. Biểu hiện ban đầu của bệnh là các triệu chứng giống cảm cúm,
và có thể tƣơng tự nhƣ các trƣờng hợp khác nhƣ nhiễm trùng, viêm ruột và bệnh do
virus. Biểu hiện của bệnh có thể gồm đau đầu, sốt, run, đau khớp, nôn, thiếu máu
tán huyết, vàng da, tiểu ra máu, tổn thƣơng võng mạc, và co giật.
Sốt rét nghiêm trọng thƣờng gây ra bởi loài P. falciparum. Các triệu chứng của
sốt rét do P. falciparium phát triển 9–30 ngày sau khi nhiễm.Những ngƣời bị sốt rét
thể não thƣờng thể hiện các triệu chứng thần kinh nhƣ hành vi bất thƣờng, run giật
nhãn cầu, co giật, hoặc hôn mê [1].

9


I.1.2. Tình hình sốt rét ở Việt Nam
Tại Việt Nam, báo cáo của TS. Nguyễn Thanh Dƣơng – Viện trƣởng Viện Sốt
rét – Ký sinh trùng – Côn trùng TW cho biết: 11 tháng đầu năm 2013 cả nƣớc ghi
nhận 32.498 bệnh nhân mắc sốt rét; 80 trƣờng hợp bệnh nhân sốt rét ác tính và 5
trƣờng hợp tử vong do sốt rét. So với cùng kỳ năm 2012 số bệnh nhân sốt rét giảm
18,5%, số bệnh nhân sốt rét ác tính giảm 41,6% và số tử vong do sốt rét giảm
16,7%. Tuy nhiên nguy cơ sốt rét quay trở lại và bùng phát dịch sốt rét vẫn còn rất
cao ở nhiều địa phƣơng do số ngƣời sống trong vùng sốt rét còn cao, ký sinh trùng
sốt rét kháng thuốc đã xuất hiện ở một số tỉnh và có nguy cơ lan rộng ra nhiều địa
phƣơng khác, muỗi truyền bệnh kháng với hóa chất, di biến động dân cƣ giữa vùng
có sốt rét và vùng không có sốt rét lƣu hành [2].
I.1.3. Các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong điều trị sốt rét

Đã có rất nhiều loại chất có hoạt tính sinh học đã đƣợc sử dụng nhƣ là thuốc để
dùng điều trị bệnh sốt rét. Những loại thuốc này tác động lên các giai đoạn trong
chu trình phát triển của ký sinh trùng số rét. Tiêu biểu là nhóm thuốc họ quinolin.
Trong họ quinolin, quinin là loại thuốc chống sốt rét đƣợc tìm ra đầu tiên vào năm
1820, tiếp đó, tới năm 1945 chloroquine ra đời. Cơ chế tác động của dòng quinolin
đƣợc cho là tác động ức chế lên quá trình polyme hoá haem của ký sinh trùng sốt rét
(haem là phần đƣợc giải phóng ra từ hemoglobin, haem thể hiện độc tính với ký
sinh trùng sốt rét. Để giải độc tính này, các ký sinh trùng gây bệnh đã chuyển hoá
haem thành dạng polyme β-haematin). Tiếp đến năm 1970, pyrimethamin đƣợc tìm
thấy. Cơ chế tác động của pyrimethamin là ức chế enzyme trong quá trình khử
dihydrofolat, một chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp pyrimidin.
Tuy nhiên hiện tƣợng kháng thuốc trong các ký sinh trùng sốt rét đã đặt ra yêu
cầu đối với những nhà khoa học là phải tìm ra loại thuốc mới trong điều trị sốt rét..
Năm 1972, trong một nghiên cứu của nhà khoa học ngƣời Trung Quốc Tu Youyou
đã tìm ra hoạt chất artemisinin trong lá khô của cây Artemisia annua. Artemisinin
đƣợc ghi nhận là hoạt chất có hiệu quả trong điều trị sốt rét và thuộc trong danh
sách gần 200 bài thuốc cổ truyền Trung Quốc đã đƣợc sử dụng [4].

10


I.2. CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC CỦA ARTEMISININ
I.2.1. Artemisinin
Artemisinin có tên khoa học (IUPAC) là: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)octahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin10(3H)-one, đƣợc chiết tách từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L. thuộc
họ cúc Asteraceae [23].
Phƣơng pháp phân lập artemisinin lần đầu tiên đƣợc công bố bởi Klayman và
các cộng sự, trong phƣơng pháp này lá thanh hao khô đƣợc chiết bằng ete dầu hoả,
dịch chiết đƣợc cô đặc rồi hoà tan trong chloroform, bổ xung thêm acetonitril để kết
tủa các chất trơ của cây nhƣ đƣờng và sáp. Sắc ký cặn cô trong silicagel với hệ dung
môi rửa giải cloroform/ethyl acetate, kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng với hơi iode,

artemisinin đƣợc xác định bởi tín hiệu singlet đặc trƣng ở δ 5,80 ppm trên phổ
NMR. Phần dịch chiết có hàn lƣợng artemisinin cao có thể kết tinh trong
cyclohexan hoặc ethanol 50% [22]. Elsohly và các cộng sự sau này đã phát triển và
xây dựng công nghệ chiết artemisinin hiệu suất cao [10].
Ở Việt Nam, từ thế kỷ 14, Tuệ Tĩnh đã dùng thanh hao hoa vàng để chữa sốt rét.
Năm 1989, nhà nghiên cứu Đinh Huỳnh Kiệt cùng cộng sự đã công bố kết quả phân
tích thành phần hóa học của Thanh hao hoa vàng mọc hoang và chiết suất
artemisinin để chữa sốt rét cho bộ đội. Theo phƣơng pháp này, dung môi dùng dể
chiết là ether dầu hoả, xăng công nghiệp, n-hexane, dịch chiết đƣợc cô loại dung
môi, artemisinin sẽ tự kết tinh trong cặn cô thu đƣợc sản phẩm thô. Sản phẩm thô
đƣợc tẩy mầu bằng than hoạt tính và kết tinh lại trong cồn [3].
Từ đó, phong trào nghiên cứu trồng và chiết xuất artemisinin từ loại cây này
bùng phát. Chất artemisinin trong thanh hao có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét
thể vô tính trong hồng cầu. Chất này cũng có khả năng chữa ung thƣ vú và bệnh
bạch cầu, với điểm đặc biệt là rất ít ảnh hƣởng lên trên tế bào lành xung quanh. Ở
liều điều trị, artemisinin và các dẫn chất của nó không độc hại, kể cả với phụ nữ có
thai và ngƣời suy gan, thận. Những năm 1990, các nhà khoa học Việt Nam và Công
ty Dƣợc liệu TWI đã trồng hàng trăm hécta cây Thanh cao hoa vàng, chiết suất

11


hàng tấn artemisinin với hiệu suất cao và bán tổng hợp các loại thuốc chống sốt rét
từ artemisinin nhƣ artesunate, artemether, arteether, đã sản xuất hàng triệu liều
thuốc chống sốt rét cung cấp cho nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu, thu về hàng triệu
đô la Mỹ mỗi năm.

Artemisinin

Artemether

Arteether

Artesunate

I.2.2. Tính chất hoá học của artemisinin [3]
Do trong phân tử artemisinin có cầu endoperoxide (-O-O-) là mối liên kết nhạy
cảm, dễ bị phân huỷ, với các điều kiện hoá học khác nhau artemisinin bị biến đổi
thành những hợp chất mà đa số không còn khung cơ bản ban đầu nữa. Ngoài ra
artemisinin và một số dẫn xuất còn có thể bị biến đổi dƣới ánh sảng tử ngoại: mất
cầu endoperoxide và thay đổi khung cơ bản ban đầu.
I.2.2.1. Phản ứng nhiệt phân
Artemisinin là sesquiterpene lactone có cầu endoperoxide rất bền với nhiệt độ
trong môi trƣờng trung tính cho tới 150oC. Tuy nhiên nhiệt phân ở nhiệt độ cao, cầu
endoperoxide bị phá huỷ tạo ra các sản phẩm khác 2,3,4.

1

3

2

12

4


I.2.2.2. Phản ứng với kiềm
Trong môi trƣờng kiềm, vòng lactone của artemisinin bị mở thành nhóm phản
ứng tự do của aldehyt, xeton, và các hydroperoxit, những nhóm này tiếp tục bị

ngƣng tụ nội phân tử tạo ra hỗn hợp sản phẩm khác nhau. Khi phản ứng với kali
cacbonate trong metanol thu đƣợc este 5, peroxylacton 6, và xeto acid chƣa bão hoà
7.

5

6

7

Tuy nhiên trong môi trƣờng NaOH, sản phẩm tạo ra là pyran 8, với hàm lƣợng 15%

8
I.2.2.3. Phản ứng với amoniac và amin
Torok và Ziffer đã nghiên cứu phản ứng của artemisinin với metanol amoniac.
Sản phẩm trung gian đầu tiên là một hemiaceta-amide 9, hàm lƣợng tƣơng đƣơng
với hai hydroxy methyl xeton 10,11. Hỗn hợp này đƣợc xử lý bằng acid sunfuric
loãng

tạo

thành

hỗn

hợp

sản

phẩm

deoxyazaartemisinin 13 [50].

13

gồm

11-azaartemisinin

12

và


I.2.2.4. Phản ứng với acid
Artemisinin đƣợc xử lý với acid trong methanol hoặc methanol thu đƣợc hỗn
hợp chất, mà cấu trúc của nó đƣợc xác định bằng phổ khối và phổ NMR, thử
nghiệm in vitro về hoạt tính chống ký sinh trùng kháng cloroquine P. falciparum
cho thấy 1,2,4-trioxane (16a và 16b) có hoạt tính nhƣ artemisinin

14a R=CH3

15

b R=C2H5

16a R=CH3
b R=C2H5

I.2.2.5. Phản ứng khử hoá

Với việc thay đổi các điều kiện khử, phân tử artemisinin bị khử ở các nhóm khác
nhau.

14


17

18

19

20
I.2.3. Phản ứng tạo các dẫn xuất từ artemisinin
I.2.3.1. Bán tổng hợp các dẫn xuất ete của dihydroartemisinin (DHA)
Phƣơng pháp thông dụng nhất đƣợc sử dụng để tổng hợp các dẫn xuất ete của
DHA là cho DHA tác dụng với ancol tƣơng ứng với sự có mặt của xúc tác. Xúc tác
đặc hiệu thƣờng dùng trong phản ứng này là trifloroboro eteate (BF3.)(OC2H5)2

20

21

15


I.2.3.2. Bán tổng hợp các dẫn xuất este của dihydroartemisinin (DHA)
Các ester của DHA thu đƣợc bằng cách cho DHA với acid cloride hoặc
anhydride acid trong pyridine hoặc với các acid trong sự có mặt của
dicyclohexylcarbodiimide hoặc dimethylaminopyridin.

22
I.2.3.3. Bán tổng hợp các dẫn xuất carbohydrat của DHA
Các dẫn xuất carbohydrat củ DHA đƣợc tạo thành bằng các xử lý DHA với
alkyl chloroformate trong sự có mặt của triethylamine trong ethylen chloride hoặc
xúc tác bởi 4-dimethylaminpyridin, sản phẩm thƣờng là các α-epime. Các hợp chất
này có hoạt tính lớn hơn artemether.

23
I.2.3.4. Bán tổng hợp các dẫn xuất fluoralkyl ete của DHA
Tổng hợp các dẫn xuất fluoralkyl ether của DHA cũng theo nguyên tắc chung
nhƣ tổng hợp các dẫn xuất ether thông thƣờng là cho DHA tác dụng với các ancol
tƣơng ứng trong dung môi và xúc tác thích hợp

16


24
Hiện có các phƣơng pháp tổng hợp sau:
Phƣơng pháp xúc tác trifluoroboro etheate, phƣơng pháp sử dụng xúc tác
trimethylsilyl chlorid, phƣơng pháp sử dụng phản ứng Mitsunobu. Trong đó phƣơng
pháp sử dụng phản ứng Mitsunobu đƣợc cho là ƣu việt hơn cả, cho hiệu suất cao và
khả năng tổng hợp lựa chọn lập thể tốt.
I.2.4. Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin
I.2.4.1. Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự hoạt hoá bởi Fe2+ của haem
Theo Richard K Hayness và các cộng sự, „sự hoạt hoá‟ của artemisinin bởi haem
đã thể hiện ngay từ giai đoạn trƣởng thành của bào tử động, ở giai đoạn này ký sinh
trùng sốt rét chuyển hoá haemoglobin nhƣ một nguồn amino acids trong môi trƣờng
acid. Quá trình chuyển hoá giải phóng ra ferriprotoporphyrin IX (haem), những
haem này sẽ trải qua quá trình dime hoá không có xúc tác của enzyme hình thành

nên dạng haemozoin, một dạng không hoà tan, là chất sắc tố sốt rét ở dạng tinh thể.
Trên thực tế, tất cả các haem hầu nhƣ chuyển hoá thành hết haemozoin, và có rất ít
sự phân giải theo những đƣờng hƣớng khác. Tổng lƣợng sắt có trong giai đoạn
trƣởng thành của bào tử động của Plasmodium falciparum, xấp xỉ 92% là nằm trong
không bào thực, và cũng, khoảng 88% thì tham gia vào sự hình thành haemozoin.
Và haemozoin là loại sắt đặc biệt chỉ đƣợc xác định trong giai đoạn trƣởng thành
của bào tử động, haemozoin cũng đƣợc luân chuyển trong không bào thực rất lớn.
Dựa theo nguồn gốc hình thành của haemozoin, haem đã đƣợc nghiên cứu nhƣ chất
hoạt hoá của artemisinin. [C14]-artemisinin tìm thấy ở dạng liên kết với haem, hoặc
ở trong ký sinh trùng hoặc ở in vitro trong môi trƣờng có chứa ferriprotoporphyrin
IX chloride ở pH 7,5-7,8. Đó là bằng chứng về sự hình thành một phức hợp haem-

17


artemisinin đã đƣợc tạo ra. Điều này cũng xác nhận rằng haem phải ở trạng thái
Fe2+ để phản ứng với artemisinin, mặc dù có quan điểm cho rằng Fe2+ của haem có
thể gây nên xúc tác quá trình phá huỷ artemisinin, dù cho ý này đã không đƣợc
kiểm chứng. Phức hợp haem-artemisinin tạo thành đƣợc tìm thấy không thể hiên
độc tính với ký sinh trùng sốt rét. Cũng theo một nghiên cứu khác tìm thấy rằng một
lƣợng đáng kể [C14]-artemisinin khi đƣợc ủ với ký sinh trùng sốt rét trở thành dạng
kết hợp với những dimer, và bản chất của quá trình liên kết này trong haemozoin
cũng không đƣợc xem xét thêm.
Về mặt nghiên cứu hoá học, Bernad Meunier và các cộng sự đã xác định đƣợc
một phức hợp liên kết hoá trị giữa haem-artemisinin tách ra với hàm lƣợng tƣơng
đối cao khoảng 80-85% từ quá trình khử ferriprotoporphyrin IX dimethyl ester dƣới
điều kiện nghiêm ngặt [47]. Tuy nhiên, liên quan đến quá trình hình thành của phức
hợp haem-artemisinin trong in vivo vẫn cần đƣợc xác định thêm. Phổ khối nghiên
cứu của phức hợp tách ra từ quá trình ủ của artemisinin với hồng cầu bị nhiễn
Plasmodium xấp xỉ tổng khối lƣợng phân tử của các chất phản ứng (haem và

artemisinin) xong có rất ít sự hiểu biết về cấu trúc của chúng. Một vài đƣờng hƣớng
liên quan đến sự phá huỷ cấu trúc phân tử artemisinin thông qua Fe2+ đƣa đến sự
alkyl hoá của haem đã đƣợc đƣa ra bởi Bernard Meunier và các cộng sự [46]. Sự
alkyl hoá haem đƣợc đề xuất để thể hiện tầm quan trọng đối với hoạt tính chống sốt
rét của artemisinin nói chung. Điều này đã đƣợc sử dụng để làm cơ sở đánh giá mối
quan hệ giữa hoạt tính chống sốt rét của các trioxanes tổng hợp và dạng cấu hình
không gian của những nhóm thế bên ngoài trioxanes, và dùng để chế tạo ra một
nhóm thuốc chống sốt rét đƣợc biết đến nhƣ trioxaquines.
Richard Hayness và các cộng sự dựa trên ý tƣởng về sự hoạt hoá của haem đối
với của artemisinin nhƣ một chất chống sốt rét đã dƣa ra các bƣớc chuyển hoá diễn
ra nhƣ sau:
i-sự tƣơng tác của artemisinin với haem ở dạng khử trong không bào thực, nơi
xảy ra quá trình phá vỡ haemoglobin và sự hình thành của haemozin đã chƣa bao
giờ đƣợc thể hiện.

18


ii-sự liên kết của peroxide đối với nguyên tử iron của haem-ở trạng thái Fe2+-để
gây ra quá trình vận chuyển điện tử bên trong phân tử.
iii-sự tạo thành của gốc tự do seco C-4 (25).
iv-sự phân cắt của ligand oxygen của gốc tự do seco C-4 đối với Fe3+ trong
haem.
v-sự giải phóng của gốc tự do seco C-4 (26) từ môi trƣờng của Fe2+ haem.
vi-sự di chuyển và va chạm của gốc tự do seco C-4 với những protein của ký
sinh trùng.
Theo quan điểm đó, quá trình vận chuyển điện tử trong nguyên tử sắt đƣợc sắp
xếp xung quanh bởi các nguyên tử oxy thông qua quá trình phân cắt. Dẫn đến, sự
trao đổi ligand với giả thiết ligand bên ngoài (nƣớc) cần cho sự giải phóng những
gốc tự do từ haem (theo đƣờng hƣớng b) thì nhanh hơn phản ứng nội phân tử giữa

các gốc tự do và haem. Điều này không chứng minh đƣợc khả năng tóm bắt các gốc
tự do seco C4 với cysteine, khi tại đây điễn ra quá trình khử Fe3+ haem thành Fe2+
haem cần cho sự tạo thành của gốc tự do.
Đƣờng hƣớng khác cũng đƣợc đƣa ra giải thích là do chính sự hình thành phức
hợp haem-artemisinin sẽ kìm hãm sự hình thành của hemozoin hay những gốc tự do
C-4 alkyl hoá những protein giàu histidine mà đƣợc giả định là xúc tác sự hình
thành của hemozoin. Các quá trình này sẽ tạo ra những monomer haem, mà thể hiện
độc tính đối với ký sinh trùng bởi hoạt tính oxy hoá mạnh gây ra hay/hoặc sự liên
kết với những protein cần thiết trong không bào thực [24].

19


Hình 1.1. Đƣờng hƣớng tác động của artemisinin gây ra bởi ferrous haem (Fe(II)
protoporphyrin IX) dẫn đến sự tạo thành gốc tự do seco C-4 (25) và sản phẩm alkyl
hoá (27) (theo con đƣờng a) hoặc giả thiết mất gốc tự do seco C-4 (26) từ haem
(theo con đƣờng b) để alkyl hoá protein thiết yếu của ký sinh trùng sốt rét.
I.2.4.2. Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự kìm hãm enzyme PfATP6
Artemisinin thể hiện cấu trúc tƣơng tự đối với thapsigargin, mà là chất kìm hãm
đặc hiệu enzyme sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA). Sanjeev
Krishna và các cộng sự vì thế đã đƣa ra giả thiết rằng khi mà hoạt động, artemisinin
tác dụng có tính đặc hiệu và chọn lọc sự kìm hãm enzyme SERCA of P. falciparum.
PfATP6 chí là một enzyme SERCA dạng Ca+2-ATPase có trong hệ gene của ký
sinh trùng [12,52].

Hình 1.2. Vị trí liên kiết của chất kìm hãm với enzyme SERCA:
(a) So sánh chuỗi M3, M5, M7 của SERCA. (b) Vị trí liên kiết của thapsigargin và
artemisone trong miền SERCA.
20

I.2.5. Hoạt tính chống ung thƣ của artemisinin và các dẫn xuất
Hiện nay, artemisinin đang đƣợc nghiên cứu phát triển nhƣ chất dùng trong điều
trị ung thƣ. Một trong những ƣu điểm của artemisinin trong việc đƣợc lựa chọn là
một chất dùng trong điều trị không những bởi độc tính đối với dòng tế bào ung thƣ,
mà còn thể hiện ở tính chọn lọc của nó trong việc tiêu điệt các tế bào ung thƣ, đồng
thời nó cũng thể hiện độc tính thấp với những tế bào thƣờng. Trong một bài viết
đƣợc công bố năm 1995 [27], Narendra P. Singh và các cộng sự đã phát hiện rằng
dihydroartemisinin có độc tính đối với những tế bào bạch cầu ở ngƣời, gấp hơn 100
lần so với độc tính đối với những tế bào lymphocytes thƣờng. Kết quả này cũng
đƣợc lặp lại đối trong những tế bào ung thƣ vú và những tế bào vú bình thƣờng. Tuy
nhiên, artemisinin và những monomer tƣơng tự của nó thƣờng thể hiện độc tính
thấp đối với những tế bào ung thƣ và thời gian bán huỷ ngắn do đó không có hiệu
quả trong điều trị. Điều này đã thúc đẩy việc nghiên cứu ra những hợp chất mới từ
artemisinin nhằm làm tăng khả năng gây độc đối với những tế bào ung thƣ. Nhiều
dạng phân tử có chứa artemisinin/ phần endoperoxide nhƣ artemisinin ở dạng
dimer, artemisinin ở dạng lai hợp artemisinin-transferrin (Art-Tf) đã đƣợc phát triển
với những hiệu quả trong điều trị ung thƣ.
I.2.5.1. Artemisinin monomer
Tác dụng chống ung thƣ của artemisinin đã đƣợc đƣa ra từ sớm bởi Herman J.
Woerdenbag và các cộng sự từ năm 1990 [54]. Những nghiên cứu ban đần này tập
trung chủ yếu vào dạng monomer tƣơng tự artemisinin. Những monomer
artemisinin phổ biến (artemisinin, dihydroartemisinin, artesunate, và artemeter) đã
đƣợc thử nghiệm đối với nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau. Kết quả chỉ ra chúng
thể hiện độc tính với những tế bào ung thƣ với IC50s thay đổi từ trong khoảng 10-20
µM. Nhìn chung, những hợp chất artemisinin này đã thể hiện độc tính đối với
những tế bào ung thƣ nhiều hơn là thể hiện độc tính với những tế bào thƣờng liên
quan. Nhiều cơ chế phân tử đã đƣợc nghiên cứu, theo đó artemisinin tác động lên
nhiều đƣờng hƣớng khác nhau mà tham gia vào quá trình phát triền trong tế bào, sự
nhân rộng tế bào, và quá trình chết của tế bào theo một chƣơng trình đã định. Tuy

21


nhiên, sự chết của tế bào theo chƣơng trình-apoptosis do artemisinin gây ra là ảnh
hƣởng đƣa ra phổ biến, cũng nhƣ sự phong toả trong chu trình tế bào, đặc biệt ở giai
đoạn Go/G1. Bởi vậy, xuất hiện cả tế bào bị tiêu diệt và tế bào bị kìm hãm phát triển.
Nhƣng những vị trí tác động chƣa đƣợc đƣa ra rõ ràng. Đã có những báo cáo về
màng ti thể và con đƣờng apoptotic. Cũng có những báo cáo đƣa ra phƣơng pháp
tác động bên ngoài màng ti thể. Sự tham gia của Fe/heme và những dạng oxy hoá
hoạt động (ROS) đã đƣợc đƣa ra nhƣ giả thuyết trƣớc đó của nhóm Narendra P.
Singh. Những nghiên cứu cũng tập trung vào đƣờng hƣớng phân tử trong sự phát
triển của tế bào và quá trình phát triển của tế bào ung thƣ. Hai quá trình đã nhiều lần
xuất hiện trên những báo cáo về tác động của artemisinin đó là do sự kìm hãm yếu
tố nhân NF-κB và làm giảm sự hoạt động của nhân tố phát triển VEGF. Những tác
động khác nhau lên những con đƣờng khác cũng đƣợc đƣa ra bao gồm: NOXA ,
mitogen-activated protein kinase (MAPK), hypoxia inducible factor 1α (HIFα),
Wnt/β − catenin, survivin, COX, c-MYC oncoprotein, epidermal growth factor
(EGF), and tumor necrosis factor α (TNFα). Từ những tác động ở cấp độ phân tử có
thể giải thích hiện tƣợng tự huỷ-apoptotic, chống tạo mạch, chống viêm, chống di
căn, ảnh hƣởng kìm hãm trong chu trình tế bào của những hợp chất artemisinin. Tuy
nhiên, hầu hết những thay đổi của hoạt động phân tử tế bào có thể là kết quả của sự
tăng lên hoạt động gốc tự do trong tế bào ung thƣ do phản ứng giữa artemisinin với
Fe.
I.2.5.2. Những monomer khác
Tiếp đến, những hợp chất monomer cơ bản, những hợp chất tƣơng tự artemisinin
cũng đã đƣợc nghiên cứu. Hợp chất deoxoartemisinin đã đƣợc nghiên cứu ở Đại
học Yansei- Hàn Quốc. Một nhóm deoxoartemisinin đã đƣợc tổng hợp và tìm thấy
khả năng chống sốt rét mạnh hơn artemisinin. Nhóm nghiên cứu Weontae Lee và
các cộng sự [28] đã thử hoạt tính tế bào ung thƣ của deoxoartemisinin và

carboxypropyldeoxoartemisinin trên các dòng tế bào ung thƣ. Kết quả, những hợp
chất này thể hiện độc tính khác nhau lên những dòng tế bào khác nhau. Chúng thể
hiện rằng hoạt tính chống các khối u của những hợp chất artemisinin không phụ

22