phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp whartsons jelly dây rốn người

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN THỊ DUNG
Tên đề tài:

“PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỪ LỚP
WHARTSON'S JELLY DÂY RỐN NGƢỜI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2011-2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN THỊ DUNG
Tên đề tài:

“PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỪ LỚP

WHARTSON'S JELLY DÂY RỐN NGƢỜI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2011-2015
Giản viên hƣớng dẫn : 1. Th.S Vi Đại Lâm
Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm
2. TS. Nguyễn Văn Hạnh
Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học

Thái Nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận, tôi đã
luôn nhận được sự giúp đỡ và đóng góp ý kiến hết sức quý báu của các thầy
cô giáo và các bạn.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. NGUYỄN VĂN
HẠNH nguyên Phó Trưởng phòng - Phòng Công nghệ Phôi – Viện CNSH.
Người đã định hướng nghiên cứu, tạo điều kiện, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình làm khóa luận.

Ngoài ra tôi xin gửi lời cảm ơn, biết ơn sâu sắc tới Ths. Vi Đại Lâm –
Khoa Công nghệ sinh học – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Thầy đã ủng
hộ, giúp đỡ và tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh
nghiệm làm việc cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn qúy thầy cô trong Hội đồng giám khảo, các thầy cô đã
nghiệm thu để em có thể tiến hành thực hiện khóa luận này!
Tôi gửi lời cảm ơn đến Ths. Lê Bắc Việt, cử nhân Nguyễn Thanh Ngà
là những người anh, người chị tại cơ sở thực tập đã ân cần bảo ban và động viên
tôi những lúc khó khăn trong khi nghiên cứu. Tôi sẽ luôn ghi nhớ và trân trọng.

Sinh viên

Trần Thị Dung


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Dữ liệu về sự biểu hiện chỉ thị bề mặt của MSCs ............................ 13
Bảng 3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy cho 1000ml môi trường .............. 23
Bảng 3.2 Trình tự của mồi chạy RT - PCR ...................................................... 29
Bảng 3.3 Thành phần cho 1 phản ứng RT - PCR ............................................ 30
Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT - PCR .............................................. 30
Bảng 4.1 Kết quả tách RNA ............................................................................. 35
Bảng 4.2 Kết quả biểu hiện của các marker chỉ thị ......................................... 37


iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Khả năng tự đổi mới của MSCs .......................................................... 5
Hình 2.2 Tiềm năng biệt hóa của MSCs ............................................................ 7
Hình 2.3 Những giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc ................. 9
Hình 2.4 Cấu tạo của dây rốn ........................................................................... 11
Hình 3.1 Mẫu dây rốn trước khi xử lý ............................................................. 22
Hình 3.2 Phân lập mảnh mô dây rốn trên đĩa nuôi .......................................... 22
Hình 3.3 Mảnh mô được để khô trong đĩa nuôi 4 giếng ................................. 24
Hình 3.4 Xử lý MSCs bằng enzyme, tế bào bong nhiều, tách khỏi mặt đĩa .... 25
Hình 4.1 Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô ............................................. 32
Hình 4.2 Tế bào 80% dạng hợp lưu ................................................................. 34
Hình 4.3 Tế bào cấy chuyển ............................................................................. 35
Hình 4.4 Kết quả điện di với các marker chỉ thị .............................................. 36
Hình 4.5 Tế bào giải đông ................................................................................ 38


iv

DANH MỤC VIẾT TẮT
CD

Cluster of differentiation (Cụm biệt hóa)

CHT

Enzyme collagenase / hyaluronidase/trypsin

CT

Collagenase/ trypsin

DMEM/F12

Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium/ Ham 12

DNA

A xít Deoxyribonucleic

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA

A xít Ethylene diamine tetra acetic

EGF

Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng lớp biểu bì)

FBS

Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bò)

FGF

Fibroblast growth factor
(Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi)

HLA

Human leukocyte antigen
(Kháng nguyên bạch cầu ở người)

HNF4α

Hepatocyte nuclear factor 4 (Yếu tố nhân 4 ở tế bào gan)

hWJSCs

Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Stem Cells
(Tế bào gốc từ lớp WJ dây rốn người)

ITS

Insulin – transferin - selenium

MSC

Mesenchymal stem cell (Tế bào gốc trung mô)

PBS

Phosphate buffer saline (Dung dịch đệm phosphate)

RNA

Ribonucleic Acid

RT – PCR

Reverse transcription Polymerase chain reaction (Phản ứng
chuỗi tổng hợp phiên mã ngược hay PCR phiên mã ngược)

Trp

tripsin / EDTA

WJ

Wharton’s jelly (Thạch Wharton’s)

TBG

Tế bào gốc


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... 0
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... iii
DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................. iv
MỤC LỤC .......................................................................................................... v
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài ................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu của đề tài .................................................................................... 2

1.3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................ 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn của đề tài ............................................................ 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
2.1. Cơ sở khoa học ............................................................................................ 4
2.1.1. Tế bào gốc ................................................................................................ 4
2.1.2. Tế bào gốc trung mô ................................................................................ 5
2.1.3. Tế bào gốc trung mô ở dây rốn .............................................................. 10
2.2. Nghiên cứu trong nước và nước ngoài ...................................................... 19
2.2.1. Trong nước ............................................................................................. 19
2.2.2. Nước ngoài ............................................................................................. 20
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 21
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................. 21
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 21
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................ 21
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ................................................................ 21


vi

3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 21
3.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 21
3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................... 21
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 32
4.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào ....................................................................... 32
4.2. Kĩ thuật cấy chuyển ................................................................................... 34
4.3. Kết quả tách RNA ..................................................................................... 35
4.4. Biểu hiện các marker của MSCs ở tế bào nuôi cấy .................................. 35
4.5. Phương pháp lạnh đông............................................................................. 37
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 39

5.1. Kết luận ..................................................................................................... 39
5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 40
I, Tài liệu tiếng việt .......................................................................................... 41
II, Tài liệu tiếng anh ......................................................................................... 42
III, Tài liệu internet .......................................................................................... 43
PHỤ LỤC
A, Nguyên vật liệu, vật tư, trang thiết bị
A.1. Dụng cụ vật tư tiêu hao
A.2. Thiết bị nghiên cứu
A.3. Hóa chất


1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Khoa học đã phát hiện rằng một số loài vật như thằn lằn, sao biển có
thể tái tạo các bộ phận đã mất trên cơ thể chúng. Con người chúng ta cũng có
chung những đặc điểm này. Mặc dù cơ thể chúng ta không thể tái tạo cả một
bộ phận trên cơ thể nhưng tế bào máu, tế bào da vẫn thường xuyên được tái
sinh trong mỗi chúng ta nhờ những tế bào “toàn năng”, lần đầu tiên được phát
hiện trong quá trình tiến hành thí nghiệm với tủy xương vào những năm 1950
đã dẫn đến phát hiện về sự tồn tại của tế bào gốc trong cơ thể (TS. Phạm
Mạnh Hùng, 2008) [7].
Nguồn tế bào gốc sử dụng cho các nghiên cứu được thu nhận từ nhiều
nguồn khác nhau như tế bào gốc lấy từ phôi, dịch ối. Tuy nhiên, những nguồn
tế bào này được cho là có liên quan đến việc phá hủy phôi, tổn hại thai nhi,
can thiệp thô bạo làm ảnh hưởng bất lợi cho thai nhi, phần lớn các giáo hội
công giáo và chính trị gia đã phản đối gay gắt vì cho rằng đây là vấn đề xâm

phạm đến đạo đức, niềm tin tôn giáo.
Tế bào gốc cũng có thể được thu nhận từ các mô ở người trưởng thành
như tủy xương, máu ngoại vi, nang lông…Tuy nhiên vấn đề này gặp phải khó
khăn về kỹ thuật (Logeart-Avramoglou D và cs, 2005) [18], hạn chế về số
lượng, tế bào thu được rất ít, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe, già và khó biệt
hóa (Bobis S và cs, 2006) [14], có nguy cơ tiềm năng của nhiễm virus trong
quá trình phân lập của MSCs từ tủy xương (Romanov Y. A và cs, 2003) [23].
Hiện nay, các nhà khoa học đang cố gắng tìm kiếm những nguồn tế bào
gốc mới để phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu thực tiễn. Những báo cáo gần
đây đã chỉ ra rằng, trong nguồn rác thải y tế, dây rốn của trẻ sơ sinh có chứa
các tế bào gốc có khả năng biệt hóa cao, gọi là tế bào gốc trung mô. Đây được
cho là một phát hiện quan trọng vì có thể thu thập các tế bào gốc mà không


2

gây bất kỳ tổn thương nào tới cơ thể con người nên ít bị cản trở bởi các vấn
đề về luật pháp và đạo đức trong nghiên cứu. Tế bào gốc dây rốn là tế bào gốc
nhũ nhi, còn rất trẻ nên khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được
trực tiếp hoặc sau tăng sinh in vitro là rất lớn. Nó có những đặc điểm giống
như các tế bào gốc trưởng thành (có tiềm năng biệt hóa đa năng) (Trương
Định và cs, 2009) [4].
Các nghiên cứu đã công bố trước đây cho biết, có thể thu được tế bào
gốc máu và tế bào gốc trung mô (MSCs) từ các nguồn khác nhau trong dây
rốn như máu dây rốn, lớp Wharton’s jelly (WJ là lớp mô đệm của dây rốn),
màng lót và lớp nội mô tĩnh mạch dây rốn (Nguyễn Hồng Trường, 2011)
[11]. Trong số đó, phân lập MSCs từ lớp Wharton’s jelly dây rốn là hướng đi
mới nhất và đang được nghiên cứu rộng rãi.
MSCs từ lớp Wharton’s jelly được đánh giá rất cao về tiềm năng ứng
dụng, vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và nuôi cấy tế

bào gốc từ lớp Whartson's jelly dây rốn ngƣời” để hoàn thiện quy trình phân
lập và tìm các chỉ thị bề mặt có vai trò trong việc nhận biết các MSCs từ lớp
Wharton’s jelly dây rốn, chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ cho các
nghiên cứu sau này.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người.
- Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người.
- Tạo ngân hàng tế bào gốc dây rốn phục vụ các mục đích nghiên cứu
trong tương lai.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
- Phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn
người.


3

- Nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn
người.
- Tạo ra ngân hàng tế bào gốc dây rốn phục vụ các mục đích nghiên cứu trong
tương lai.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Nghiên cứu được điều kiện nuôi cấy in vitro của tế bào gốc trung mô,
từ đó mở rộng các ứng dụng của loại tế bào gốc này.
- Xây dựng được các mô hình thực hành, thí nghiệm trên tế bào gốc
trung mô.
- Xây dựng được ngân hàng tế bào gốc trung mô phục vụ cho các
hướng nghiên cứu trong y sinh học như: Kỹ nghệ mô, liệu pháp tế bào, liệu
pháp gen, thử nghiệm độc tố...

1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn của đề tài
Biệt hóa thành nhiều loại “tế bào giống tế bào gan”. Góp phần phát triển
hướng nghiên cứu phục hồi, thay thế các cơ quan nội tạng có nguồn gốc từ trung
bì ở hàng trăm triệu bệnh nhân trên toàn thế giới.
Nghiên cứu về quá trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô góp
phần hỗ trợ, thúc đẩy những hiểu biết về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của tế
bào gốc trung mô nói riêng và tế bào gốc nói chung. Gợi mở các hướng
nghiên cứu để điều trị bệnh bằng tế bào gốc như: Điều trị bệnh suy tủy, ung
thư máu bằng ghép tế bào gốc tạo máu, điều trị bệnh ly thượng bì bọng nước
(epidermolysis bullosa), thoái hóa khớp, liệt tủy sống, các bệnh về thoái hóa
cơ tim, bỏng da hay nám da, bệnh Alzheimer, Parkinson... (Hà Loan, 2015)
[27], (Hoàng Hiền, 2015) [28].


4

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1. Tế bào gốc
Tế bào gốc (stem cell) là những tế bào chưa có chức năng, có thể biệt
hóa thành các loại tế bào khác nhau về cấu trúc và chức năng tạo nên quá
trình hình thành mô, cơ quan và hệ cơ quan trong các cơ thể (Phan Kim Ngọc,
2009) [8].
Tế bào đầu tiên ở cơ thể người và nhiều loài động vật là hợp tử, hợp tử
nguyên phân tạo thành phôi nang (đặc hoặc rỗng), các tế bào phôi nang trải
qua quá trình di chuyển để xác lập vị trí các mô, cơ quan trong cơ thể. Vậy
hợp tử chính là tế bào gốc đầu tiên của cơ thể.
Các tính chất cơ bản của tế bào gốc bao gồm tính tự làm mới (self
renew), khả năng phân chia (self generate) và tự khuếch đại (self propagate),
khả năng biệt hóa. Trong đó, khả năng biệt hóa và tính tự làm mới là đặc

trưng cơ bản được nhắc tới nhiều nhất của các loại tế bào gốc nói chung.
Tính tự làm mới giúp duy trì sự có mặt ổn định của tế bào gốc trong cơ
thể. Một tế bào gốc khi phân chia sẽ tạo nên một tế bào gốc khác giống hệt
nó. Vì vậy, tuy liên tục biệt hóa tạo nên các tế bào có chức năng cho cơ thể
nhưng lượng tế bào gốc trong cơ thể không bị mất đi. Mặt khác, tế bào gốc,
nếu giữ nguyên trạng thái không biệt hóa, dường như có khả năng phân chia
vô hạn. Một trong hai tế bào con được sinh ra trong nguyên phân của tế bào
gốc luôn là bản sao của tế bào mẹ, tế bào con còn lại sẽ biệt hóa theo nhiều
giai đoạn để tạo nên tế bào chuyên hóa (Phan Kim Ngọc, 2009) [8].
Khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác được gọi là tiềm năng.
Tiềm năng càng cao thì khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau
càng lớn. Tiềm năng của các loại tế bào gốc khác nhau là khác nhau (tùy
thuộc cách phân loại). Các tế bào gốc toàn năng có thể biệt hóa thành hầu hết các


5

loại tế bào trong cơ thể trong khi các tế bào gốc đơn năng lại chỉ biệt hóa thành
một loại tế bào với chức năng nhất định. Ví dụ: Tế bào gốc máu là tế bào gốc
đơn năng, có thể biệt hóa thành tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu...).
Các tế bào gốc hiện nay trở thành đối tượng nghiên cứu rất đáng quan
tâm bởi những tiềm năng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Các lĩnh vực
chủ yếu hiện nay như trong cấy ghép (tế bào, mô, cơ quan), liệu pháp gen,
kiểm nghiệm hóa chất và trong nghiên cứu khoa học (Phạm Văn Phúc, 2006)
[9].
2.1.2. Tế bào gốc trung mô
Tế bào gốc trung mô (MSC) thuộc nhóm tế bào multipotent hay tế bào
gốc đa năng và được thu nhận từ những mô có nguồn gốc từ lớp trung bì,
chúng có tính mềm dẻo cao. Các tế bào này có thể tự đổi mới và biệt hóa
thành nhiều dòng tế bào chuyên biệt khác nhau như xương, mỡ, sụn, thần

kinh, gan, khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp.
2.1.2.1. Tính tự làm mới của MSCs

Hình 2.1: Khả năng tự đổi mới của MSCs


6

Tế bào gốc trung mô có khả năng phân chia, tạo thành một tế bào gốc
con giống hệt tế bào gốc ban đầu và một tế bào không mang tính chất của một
tế bào gốc gọi là TAC (transit amplifying cell). Nhìn chung, tế bào MSCs và
các tế bào được biệt hóa từ MSCs thuộc nhóm tế bào cần bám dính. Tức là trong
điều kiện nuôi cấy invitro, MSCs cần bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy nếu không tế
bào sẽ nổi lơ lửng, có thể đi vào trạng thái ngừng hoạt động hoặc chết.
Các tế bào MSCs có hình dạng thon dài, giống nguyên bào sợi. Sau 5-7
ngày nuôi cấy thì phát triển thành những quần lạc. Khi tế bào tăng sinh ở mật độ
thấp chúng phần lớn có dạng sợi nhưng khi đạt mật độ bao phủ khoảng 80% và
bắt đầu tạo thành những “dòng chảy tế bào” song song thì các tế bào trở nên dẹt
hơn. Hình dạng này còn được gọi là “confluence” hay “hợp lưu tế bào”.
2.1.2.2. Tiềm năng biệt hóa của MSCs
MSCs có khả năng biệt hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt
(Hình 2.2). Tiềm năng biệt hóa của MSCs phụ thuộc nhiều vào các môi
trường nuôi cấy. Trong các môi trường nuôi cấy của MSCs, thường có thêm
các thành phần bổ sung, có vai trò định hướng biệt hóa. Các yếu tố này có thể
là các chất hóa học hoặc hormone thường có vai trò nhất định trong cơ thể
(Jinlian Hua1, và cs, 2011) [17]. Một vài ví dụ tiêu biểu như:
Khi nghiên cứu khả năng tạo tế bào xương, các tế bào MSCs của người
đã được cảm ứng biệt hóa bằng muối strontium ranelate của acid renalic với
nguyên tố Strontium (ký hiệu Sr). Lượng muối strontium ranelate được sử
dụng tương đương với nồng độ được phát hiện trong xương, thực phẩm và

nước uống của người trong tự nhiên. Phương pháp RT - PCR được dùng để
phân tích mô hình biểu hiện gene của các tế bào MSC trong thí nghiệm cho
thấy gene Cbfa1, một gene có vai trò “công tắc” trong quá trình tạo xương đã
được biểu hiện trong thời gian ngắn, 4 ngày sau khi được cảm ứng (tế bào đối
chứng biểu hiện gene Cbfa1 sau 14 ngày). Việc biểu hiện gene Cbfa1 cho


7

thấy MSCs có thể được biệt hóa tạo xương bằng chất cảm ứng một cách chủ
động trong phòng thí nghiệm. Một loại protein có tên osteonectin, có vai trò
trong tái cơ cấu mô hình, cấu trúc xương, sắp xếp các sợi collagen fibril và
phân tử hydroxyapatite liên quan tới độ bền của xương cũng được phát hiện
sớm hơn bình thường 10 ngày trong thí nghiệm này (Monnipha Sila-ASNA
và cs, 2007) [19].
Các thí nghiệm tương tự cũng được tiến hành với các hướng biệt hóa
thành các dòng tế bào khác nhau. Gần đây nhất, viện Công nghệ sinh học Việt
Nam đã công bố kết quả nghiên cứu biệt hóa tế bào MSCs thành tế bào gan
bằng chất cảm ứng DMSO (Dimethyl sulfoxide) và chuyển gene để cảm ứng
biệt hóa. Kết quả phân tích biểu hiện gene bằng RT-PCR cho thấy, sau 30
ngày nuôi cấy, các tế bào MSCs tiếp xúc với DMSO có kết quả dương tính
với gene HNF4α. HNF4α là một gene chỉ thị đặc trưng cho dòng tế bào gan,
đây là một gene điều hòa, có thể có tác động tới hàng loạt các gene liên quan
chức năng gan trong cơ thể. Những nghiên cứu về chất cảm ứng DMSO và
chuyển gene biệt hóa hiện vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu (Nguyễn
Văn Hạnh và cs, 2015) [6].

Hình 2.2: Tiềm năng biệt hóa của MSCs
(Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

8

2.1.2.3. Tính mềm dẻo của MSCs
Khi tế bào MSCs đã biệt hóa thành một tế bào có chức năng, chúng có thể
thay đổi chiều hướng biệt hóa thành một loại tế bào khác, có chức năng khác
khi thay đổi môi trường nuôi cấy và hiện tượng này được gọi là “Tính mềm
dẻo của tế bào gốc” hay “chuyển biệt hóa”.
 Đầu tiên, ở cùng một mô nhất định có thể tồn tại những loại tế bào gốc không
liên quan gì đến mô đó, ví dụ như tế bào gốc tạo máu tồn tại ở cơ. Chính
những tế bào này đã tang sinh cùng với tế bào được phân lập có chủ đích.
 Thứ hai, có thể các tế bào cấy ghép đã dung hợp với một tế bào khác dẫn đến
sự chuyển thông tin di truyền của tế bào cấy ghép vào trong tế bào vật chủ, từ
đó dẫn đến sự biểu hiện của một số đặc tính gốc trong các tế bào quan sát
được như trong quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi và tế bào soma.
 Thứ ba, khi thí nghiệm trên cừu Dolly người ta đã quan sát thấy quá trình tái
lập trình ở nhân để đạt trạng thái đa tiềm năng khi tiêm nhân của tế bào soma
vào trong tế bào chất của một trứng không được thụ tinh đã loại nhân.
 Giả thiết thứ tư cho rằng các tế bào với tính nhiều tiềm năng vẫn còn tồn tại
ngay cả sau quá trình phát triển phôi. Ví dụ, tế bào MAPC (Multipotent Adult
Progenitor Cells) (Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11].


9

Hình 2.3: Những giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc
(Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]
2.1.2.4 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô
Nhiều báo cáo khoa học đã cho thấy tế bào gốc trung mô có thể thu
nhận từ nhiều nguồn tế bào khác nhau (Barry F.P, 2004) [13], (jarocha D và

cs, 2006) [12], (Payushina O và cs, 2006) [21]. Ví dụ như:
-

Nguồn tủy xương tự thân: Tủy xương có chứa tế bào gốc MSCs

tương đối ít hơn so với máu dây rốn, tuy nhiên, một lợi thế là các tế bào gốc
tự thân là những tế bào an toàn và có tính hoạt động cao (Phạm Văn Phúc,
2006 ) [9].
-

Nguồn từ mô mỡ là một trong những nguồn giàu MSCs. Tế bào gốc

mô mỡ cũng được phát hiện có những tiềm năng giống với tế bào gốc từ tủy
xương.


10

- Nguồn cuống rốn trẻ sơ sinh: Được biết là nơi tập trung MSCs nhiều
hơn cả vì nhiều cấu trúc trong cuống rốn đã được phát hiện là vùng có chứa
MSCs ví dụ như máu cuống rốn và lớp nội mô hay trong lớp nhầy Wharton’s
jelly (y khoa y dược, 2013 ) [29], (báo cáo kết quả khao học công nghệ, 2011)
[30].
Hiện nay, dây rốn trong phòng hộ sinh vẫn được coi là một loại rác thải
y tế. Vì vậy, việc phân lập và nuôi cấy thành công các loại tế bào gốc từ
cuống rốn trẻ sơ sinh là một bước tiến đáng kể, vì đã tìm ra được một nguồn
cung cấp tế bào gốc sạch, dồi dào mà không vấp phải các vấn đề về đạo đức
hay gây đau đớn khi lấy tế bào, đồng thời cũng góp phần tái chế rác thải. Các
tế bào gốc thu được từ cuống rốn có thể được sử dụng trong nghiên cứu và
trong bệnh viện để điều trị các bệnh về máu và hệ miễn dịch.

Trong các nguồn trên thì cuống rốn trẻ sơ sinh là một nơi thu nhận
được nhiều MSCs nhất. MSCs có tồn tại trong nhiều cơ quan bào thai và tuần
hoàn trong máu của thai tiền sinh đồng thời với các tế bào gốc tạo máu. Chính
vì vậy mà chất nền cuống rốn WJ rất có thể là một nơi tích tụ MSCs dư thừa
sau khi chúng rời hệ tuần hoàn.
2.1.3. Tế bào gốc trung mô ở dây rốn
2.1.3.1. Dây rốn
Dây rốn là đoạn kết nối giữa rốn của thai nhi và nhau thai bám ở thành
tử cung của người mẹ, có vai trò là cầu nối giữa người mẹ và em bé để vận
chuyển chất dinh dưỡng từ người mẹ chuyển qua đứa trẻ.
Dây rốn thường có chiều dài 50 cm và dày 2 cm, có một tĩnh mạch và
hai động mạch bao quanh bởi các mô nhầy hay gelatin, còn gọi là lớp
Wharton’s Jelly hay WJ và được bọc bởi màng ối. Có thể xác định ba vùng
khác nhau của lớp WJ: Vùng dưới màng ối, chất nền WJ, và lớp mô bao
quanh các mạch máu. Vùng chất nền WJ gồm các phân tử collagen loại I, III,


11

VI nằm ở trong những khoảng không gian có hình dạng giống như rãnh. Xung
quanh rãnh này là các phân tử collagen loại VI, laminin và heparin sulfate
proteoglycan. Các khoảng không gian chứa đầy chất nền WJ có dạng rãnh
được bao quanh bởi các tế bào chất nền là các nguyên bào sợi cơ mảnh có
dạng ống biểu hiện vimentin, desmin và actin cơ trơn. Dây rốn giai đoạn sớm
chỉ có vimentin và desmin. Cấu trúc và thành phần của dây rốn giúp bảo vệ
các mạch máu khỏi bị nén và cũng có thể hỗ trợ quá trình trao đổi giữa máu
dây rốn và dịch ối (Hình 2.4) (Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11].

Hình 2.4: Cấu tạo của dây rốn
(Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

Các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng dây rốn là một nguồn giàu TBG.
Có hai loại TBG đã được xác định trong dây rốn: Loại 1 là MSCs từ lớp WJ,
tĩnh mạch, các vùng xung quanh và giữa các động mạch, vùng dưới màng ối
và máu của dây rốn. Loại 2 là TBG tạo máu từ máu dây rốn (Nguyễn Hồng


12

Trường, 2010) [11]. Loại MSCs từ WJ hiện nay đang được quan tâm và đẩy
mạnh nghiên cứu.
2.1.3.2. Các chỉ thị phân tử của tế bào gốc trung mô từ chất nền dây rốn
Tế bào gốc trung mô từ chất nền dây rốn (gọi là hWJSCs hay human
Wharton’s Jelly Stem cell) biểu hiện các marker của TBG, gồm marker của
các loại tế bào ES (embryonic stem cell), EG (embryonic germ cell), các tế
bào tiền chất thần kinh hay TBG thần kinh, biểu hiện actin và vimentin cơ
trơn, các marker cho nguyên bào sợi cơ, nestin, enolase chuyên biệt thần kinh
(NSE) và protein sợi thần kinh đệm (glia Fibrillary xitic protein – IGFAP), ckit, oct-4, Tra-1,60; biểu hiện các mức thấp của telomerase và cũng hình
thành các cấu trúc tương tự các thể phôi khi nuôi cấy (Trương Định và cs,
2009) [4].
Qua phân tích bằng Flow cytometry, người ta thấy chúng có biểu hiện
mức cao các marker chất nền (CD44, CD105), marker integrin (CD29, CD51)
và marker MSC như: CD105 (SH2), CD73 (SH3, SH4), CD90 nhưng không
biểu hiện các marker của dòng tạo máu (CD34, CD45). Chúng có khả năng
tăng sinh invitro mạnh, và có thể cảm ứng biệt hóa thành nhiều loại tế bào
khác: Đó là các tế bào cơ tim (cardiomyocyte) bằng cách xử lý với 5 –
azacytidine hay nuôi các TBG đó trong môi trường cơ tim, kết quả được
chứng nhận là thành công khi chúng biểu biểu hiện các marker tế bào cơ tim
là N – cadtherin và troponi tim I. Các hWJSCs còn có thể biệt hóa thành các
tế bào mỡ, sụn và xương bằng các yếu tố biệt hóa phù hợp (Trương Định và
cs, 2009) [4], (Romanov Y.A và cs, 2003) [23].

Bảng 2.1: Dữ liệu về sự biểu hiện chỉ thị bề mặt của MSCs


13

Tên chỉ thị

Loại chỉ thị

Dƣơng tính

Kháng nguyên
đặc hiệu

Âm tính

CD105 (SH2), CD73 (SH3,
SH4), Stro–1, ACTA1

CD133

CD4,

Chỉ thị tế bào

CD14,

(PTPRC),

tạo máu

CD45,
c–kit/SCFR

(CD117)
IL1R, IL3R, IL4R, IL6R,

Các

thụ

cytokine
nhân

tố

thể IL7R, LIFR, SCFR, G–
và CộNG

SựFR,

IFNγR,

sinh TNFR1, TNFR2, TGFβR1,

trưởng

IL–2R (CD25)

TGFβR2, bFGFR, PDGFR,
EGFR
Các

Integrin

Các phân tử kết α2(CD49b),
dính

aα(CD49c),

α1(CD49a),
α3(CD49c), α4(CD49d),

αL(CD11a),

β1(CD29), Cβ2(CD18)

β3(CD61), β4(CD104)
ICAM–1 (CD54), ICAM–2
(CD102),
Các phân tử và (CD106),

VCAM–1
ALCAM

–1

thụ thể chất nền (CD166), LFA3 (CD58), L–
ngoại bào

selectin (CD62L), endoglin
(CD105),

hyaluronate

ICAM

–3

(CD50),

selectin (CD62E), P–selectin
(CD62P),

PECAM

(CD31), vWF, Cadherin 5

(CD44), CK18, CK19
Các chỉ thị khác

CD9, CD13, Thy–1 (CD90),
HLA–ABC (MHC I) (thấp)

E–

HLA–DR (MHC II)

–1

14

2.1.3.3. Phương pháp RT – PCR kiểm tra biểu hiện các chỉ thị của MSC
RT- PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) là phương
pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ mRNA dựa vào đặc tính phiên
mã ngược. Phương pháp RT – PCR vì vậy có thể được dùng để kiểm tra sự biểu
hiện và mức biểu hiện của gen ở mức độ RNA.
Hoạt động của RT – PCR có sự tham gia của hai loại enzyme tổng hợp
chuỗi oligonucleotide: Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) cần
cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA và DNA polymerase cần cho sự
tổng hợp sợi DNA từ cDNA. Nguyên liệu để chạy RT - PCR gồm mẫu RNA
tách chiết được, các loại hóa chất, vật liệu cần thiết để tiến hành phản ứng
như: enzyme, dNTP, đệm cho hai phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại,
mẫu RNA, nước, và một số cặp mồi,… Ngày nay trên thị trường đã có sẵn các
bộ Kit cho RT – PCR, trong đó từ thành phần phản ứng, quy trình đến tối ưu
hóa đều được chỉ dẫn rất cụ thể (Lê Thị Thúy Dung, 2014) [31].
Một phản ứng RT – PCR thông thường sẽ có 5 bước:
1. Tách chiết RNA (có thể là RNA tổng số hoặc mRNA)
2. Tạo cDNA bằng phản ứng sao chép ngược
3. Tạo DNA từ cDNA bằng phản ứng PCR thông thường
4. Kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp điện di
5. Giải trình tự sản phẩm (với mồi đặc hiệu cao thì không quá cần thiết)
Trong trường hợp các enzyme có nhiệt độ hoạt động gần nhau thì có
thể thực hiện bước 2 và bước 3 trong cùng một phản ứng để tăng độ đặc hiệu
và hạn chế nguy cơ nhiễm, cũng như tiết kiệm thời gian (Lê Thị Thúy Dung,
2014) [31].

15

2.1.3.4. Một số phương pháp phân lập, nuôi cấy và biệt hóa hWJSCs
a) Các phương pháp mới để phân lập và nuôi cấy hWJSCs
Với mục đích nghiên cứu là phát triển các phương pháp thích hợp nhất
để phân lập MSCs có nguồn gốc từ dây rốn người. Parvin Salehinejad và cộng
sự đã thực hiện bốn nhóm phương pháp để phân lập hWJSCs. Bao gồm ba
nhóm enzyme: Collagenase / hyaluronidase / trypsin (CHT), collagenase /
trypsin (CT) và trypsin (Trp) và một nhóm nuôi cấy mảnh mô nhỏ (Exp). Ở cả
bốn nhóm, đều phân lập được các tế bào hUCMs nhưng số lượng tế bào, khả
năng tăng sinh, biểu hiện marker… của các tế bào bị phân lập ở các phương
pháp là khác nhau.
Phân tích Flow cytometry cho thấy các chỉ thị CD44, CD73, CD90 và
CD105 được thể hiện trong tất cả các nhóm, trong khi CD34 và CD45 không
được thể hiện. Các chỉ thị của MSCs như CD73, CD90 được biểu hiện khác
nhau trong các nhóm khác nhau: CD90 biểu hiện cao nhất ở nhóm CT và Exp;
CD73 biểu hiện cao nhất ở nhóm Exp.
Về khả năng tăng sinh, nhóm Exp có khả năng tăng sinh cao nhất.
Với các nhóm enzyme, các tế bào không tiếp tục tăng sinh sau khoảng 30
ngày nuôi cấy, nhưng ở nhóm Exp, tế bào có thể kéo dài thời gian tăng sinh
tới 80 ngày.
Về thời gian phân lập, chỉ sau 2 – 3 tiếng đồng hồ đã có thể phân lập
được TBG ở phương pháp enzyme, trong khi đó phương pháp Exp phải mất
đến 2 – 3 tuần mới quan sát thấy có tế bào mọc ra. Số lượng tế bào ban đầu
thu được nhiều nhất ở nhóm CT (0,5-1 × 104 tế bào / cm lớp WJ), ít hơn ở
CHT (0,25 × 104 tế bào / cm lớp WJ), và ít nhất ở nhóm Trp (1 × 103 tế bào /
cm lớp WJ).
Hình thái tế bào giữa nhóm phân lập bằng enzyme và phân lập bằng
nuôi cấy mảnh mô cũng có sự khác nhau. Quần thể tế bào trong nhóm Exp có

16

tính đồng nhất cao với các tế bào giống nguyện bào sợi chiếm ưu thế. Ở
phương pháp enzyme, quần thể tế bào không đồng nhất, gồm các tế bào giống
nguyên bào sợi với độ dài, ngắn khác nhau và cả các tế bào tròn nhỏ.
Kết quả ở nghiên cứu trên cho thấy, phương pháp Exp tốn nhiều thời
gian nhưng hiệu quả phân lập TBG là cao nhất. Đối với phân lập bằng
enzyme, tùy vào mục đích phân lập để lựa chọn hỗn hợp enzyme thích hợp
(Parvin S., B. A. Noorjahan và cs, 2012) [20].
b) Các nghiên cứu mới về biệt hóa hWJSCs
Như đã nói ở trên, TBG từ dây rốn nói chung và hWJSCs có rất nhiều
ưu điểm, hiệu quả cao trong ứng dụng trong lâm sàng, vì vậy đã có rất nhiều
nghiên cứu về khả năng biệt hóa đa dòng của hWJSCs.
Phân tích Real-time reverse transcription polymerase chain reaction đã
được thực hiện để xác định biểu hiện mRNA của của ba chỉ thị tế bào gan:
ALB, AFP và CK-18. Kết quả cả 3 chỉ thị trên đều biểu hiện. Western blot
cũng được sử dụng để khẳng định cho kết quả này. Phân tích Flow cytometry
cho thấy hWJSCs dương tính với các dấu hiệu MSC (CD105, CD90, CD73,
CD29, CD44 , CD59) và không biểu hiện các marker CD45, CD34. Phương
pháp nhuộm PAS (Periodic acid–Schiff) và khảo nghiệm hấp thu LDL (Lowdensity lipoprotein) cũng được thực hiện để đánh giá khả năng lưu giữ
glycogen và hấp thu lipoprotein của tế bào biệt hóa. Kết quả cho thấy các tế
bào nhuộm màu đỏ tươi với tỷ lệ phần trăm là 82, 9%, tế bào có thể hấp thu
LDL với tỷ lệ cao 85, 8% (Ying N. Z., C. L. Puv, và cs, 2009) [26].
Như vậy, hWJSCs đã được biệt hóa thành công thành tế bào có chức
năng và đặc điểm sinh học giống tế bào gan trong điều kiện in vitro.
Trong nghiên cứu của mình, Ariff Bongso và Chui-Yee Fong đã thiết
lập một số quy trình biệt hóa thành tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào mỡ và
tế bào sụn (Bongso A., Fong C. Y,2012) [15]:

17

 Biệt hóa tế bào xương: Cấy chuyền tế bào đến lần 2 và ủ trong môi
trường tạo xương: DMEM – LG chứa 10% FBS, 50 ug/ml ascorbate -2
phosphate, 10-8 M dexamethasone vào 10mM β – glycerophosphat. Môi
trường biệt hóa được thay ba ngày một lần, các tế bào sau khi biệt hóa hoàn
toàn (dựa vào hình dạng), tiến hành nhuộm hóa mô hay hóa mô miễn dịch.
Biệt hóa tế bào cơ tim: Xử lí với 5 – azacytidine, ủ các MSC 24 giờ
trong môi trường DMEM 3μM 5 – azacytidine. Chuyển sang môi trường
DMEM 10% FBS để ngăn cản sự chết tế bào do sự tiếp xúc quá lâu của 5 –
azacytidine. Duy trì tế bào ở môi trường DMEM 10% FBS từ 3 ngày đến 5
tuần. Để có được môi trường điều kiện tế bào cơ tim, phải chuẩn bị bằng cách
nuôi cấy tế bào cơ tim chuột 7 ngày tuổi trong môi trường DMEM với 4,5 g/l
glucose, và 10% FBS trong khoảng 72 giờ, môi trường được thu nhận và li
tâm khoảng 800 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, cuối cùng dịch nổi
được lọc để sử dụng như môi trường điều kiện cho MSCs. (Qian Qian và cs,
2011) [22].
 Biệt hóa tế bào tạo sụn: Cấy chuyền tế bào 2 lần và ủ trong môi trường
tạo sụn: DMEM-LG không huyết thanh có 1x insulin – transferin – selenium
(IST) + premix (Gibco), 10 ng/ml transforiming growth factor (TGF)
(Peprotech).
 Biệt hóa tạo mỡ: Cấy chuyền tế bào đến lần 2 và ủ ấm trong môi trường
tạo mỡ (DMEM và 1g/l glucose) chứa 10% FBS, 50 μg/ml ascorbate – 1
phosphate, 10 -7 M dexame thasone và 50 μg/ml indo methacin (Trương Định
và cs, 2009) [4], (Trần Văn Bé và cs, 2010) [1].
2.1.3.5. Ưu điểm của các tế bào gốc từ dây rốn
Hiện nay, các nhà khoa học chứng minh rằng dây rốn là nguồn cung
cấp tế bào gốc lý tưởng nhất, sỡ dĩ như vậy vì tế bào gốc được lấy từ nguồn