Nghiên cứu nhân giống cây Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐỨC QUANG

Tên đề tài
NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƢƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa

: 2012 – 2016

Thái Nguyên, 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐỨC QUANG

Tên đề tài
NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƢƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa

: 2012 – 2016

Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình
2. Th.S. Nguyễn Thị Tình
Thái Nguyên, 2016


i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tại viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp
phía bắc, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ từ ban lãnh đạo, thầy cô hướng dẫn, bạn bè, gia đình.
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS. Ngô Xuân Bình và cô
Th.S. Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo trong suốt thời gian thực tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn chị Phạm Thị Thảo, cán bộ kỹ thuật phòng thí
nghiệm cùng các bạn cùng thực tập đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô trong khoa CNSH & CNTP, Trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ trong suôt quá trình học tập
và hoàn thành khoá luận này.
Và cuối cùng tôi chân thành cảm ơn đến sự quan tâm sâu sắc từ gia đình, bạn
bè, đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận.
Thái Nguyên, ngày 27 tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đức Quang


ii

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
BAP

: 6-Benzylaminopurine

Cs

: Cộng sự

CT

: Công thức

CT NCKH

: Công trình Nghiên cứu khoa học

Đc

: Đối chứng

IBA

: Indole-3-butyric acid

Kinetin

: 6-Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference

MS

: Murashige and Skoog’s

MT

: Môi trường

NAA

: α-Naphlene axetic acid

TB

: Trung Bình

TCDL

: Tổ chức dược liệu

TN

: Thí nghiệm


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Tỷ lệ emodin và physcion ...........................................................................6
Bảng 2.2. Một số công trình NCKH về cây Hà thủ ô đỏ ..........................................18
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch
HgCl2 0,1% đến khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn (sau 7 ngày cấy) ....................29
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng
tạo chồi cây Hà thủ ô đỏ (sau 20 ngày nuôi cấy) ......................................................31
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA đến khả năng
nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ (sau 30 ngày nuôi cấy) .....................................32

Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả năng
nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ. (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................34
Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra
rễ cây Hà thủ ô đỏ (sau 25 ngày nuôi cấy) ................................................................36
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
cây Hà thủ ô đỏ (sau 25 ngày nuôi cấy). ...................................................................37


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây Hà thủ ô đỏ............................................................................................3
Hình 2.2. Hình ảnh của một số sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ .........................................20
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng
dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn...............................30
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của một số môi trường đến
khả năng tạo chồi cây Hà thủ ô đỏ. ...........................................................................31
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA + NAA đến
khả năng nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ. ...............................................................33
Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA + Kin đến
khả năng nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ. ...............................................................34
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng
ra rễ cây Hà thủ ô đỏ. ................................................................................................36
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ. .....38


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu..........................................................................2
1.2.1. Mục đích nghiên cứu .........................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ...........................................................................................2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
2.1. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ....................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố.......................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................3
2.1.3 Tác dụng dược lý................................................................................................4
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .........................................................6
2.2.1. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào ........................................................7
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ............................................................7
2.2.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................7
2.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật ...........................................................7
2.2.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................9
2.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào ......................................................................13
2.3.1. Giai đoạn chuẩn bị .........................................................................................13
2.3.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy ...................................................................................13


vi

2.3.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi ............................................................................14
2.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh ........................................................................................14
2.3.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên ..........................................15
2.4. Những vấn đề trong nuôi cấy mô .......................................................................15
2.4.1. Sự tạp nhiễm....................................................................................................15
2.4.2. Tính bất định về mặt di truyền ........................................................................16
2.4.3. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy.....................................................17
2.4.4. Hiện tượng thuỷ tinh thể .................................................................................17
2.5. Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam và trên thế giới .......18
2.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam .........................18
2.5.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ trên thế giới ........................20
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...22
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .........................................................................22
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................22
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................................................22
3.3.1. Hóa chất ..........................................................................................................22
3.3.2. Thiết bị sử dụng ..............................................................................................22
3.4. Điều kiện nghiên cứu .........................................................................................23
3.5. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................23
3.6. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................23
3.6.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................23
3.6.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................23
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.....................................29
4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%
đến khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn. ...................................................................29
4.2. Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tạo chồi
của cây Hà thủ ô đỏ. ..................................................................................................31
4.3. Kết quả ảnh hưởng của BA, Kin, NAA đến khả nhân nhanh chồi
cây Hà thủ ô. .............................................................................................................32

vii

4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA đến khả năng
nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ. ...........................................................................32
4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả năng
nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ. ..............................................................................34
4.4. Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng
ra rễ cây Hà thủ ô đỏ. ................................................................................................35
4.4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ. ..36
4.4.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ.....37
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................39
5.1. Kết luận ..............................................................................................................39
5.2. Đề nghị.................................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................40
PHỤ LỤC 1 ...............................................................................................................43
PHỤ LUC 2 ..............................................................................................................46


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thảo dược là một nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để
sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh và phục hồi
sức khỏe cho con người. Hà thủ ô đỏ được tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713 và
được sử dụng như một loại thảo dược trường sinh của con người. Trên thế giới Hà
thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan và Ấn Độ. Ở Việt Nam Hà
thủ ô đỏ mọc hoang từ các tỉnh miền núi từ Nghệ An trở ra, có nhiều ở Lai Châu,

Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, một số tỉnh khác như Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình
có số lượng ít hơn [6]. Hà thủ ô đỏ chủ yếu được biết đến như vị thuốc bổ, trị suy
nhược thần kinh, ích huyết, khoẻ gân cốt, đen râu tóc. Theo y học cổ truyền, Hà thủ
ô có vị đắng chát, hơi ngọt, tính ấm, có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, mạnh
gân xương, nhuận tràng. Được dùng để bổ máu, chữa thận suy, gan yếu, thần kinh
suy nhược, thiểu năng tuần hoàn, ngủ kém, đau lưng mỏi gối, khô khát táo bón.
Trong củ Hà thủ ô đỏ có chứa nhiều chất quan trọng như emodin,
chrysophanol, rhein, physcion, tinh bột, lipit…Trong tự nhiên Hà thủ ô đỏ có thể
gây trồng bằng hạt hay bằng dây, sau 3-4 năm thì thu hoạch, lấy củ rửa sạch, bổ
thành miếng phơi khô để làm thuốc. Lá có thể dùng làm rau, dây lá cũng có thể
dùng làm thuốc [2]. Theo Chang Lin (2003) cây Hà thủ ô đỏ được nuôi trồng trong
nhà kính sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn cây ở ngoài tự nhiên
[15]. Trước đây nguồn Hà thủ ô đỏ ở nước ta khá dồi dào nhưng gần đây do khai
thác quá mức và nạn phá rừng nên lượng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút nghiêm trọng,
không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc chế biến và sản xuất thuốc chữa bệnh
cho người dân. Do đó, việc nhân nhanh số lượng cây Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp
nuôi cây mô tế bào thực vật để đáp ứng cung cấp nguồn dược liệu là hết sức cần
thiết. Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần vào công tác nhân giống cũng như việc
nhân nhanh cây Hà thủ ô đỏ nhằm nâng cao năng suất, chất lượng, và hiệu quả sản xuất,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống cây Hà thủ ô đỏ
(Polygonum multiflorum Thunb) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ”


2

1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu nhân giống cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb)
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu

- Xác định được ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2
0,1% đến khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
- Xác định được ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tạo chồi của
cây Hà thủ ô đỏ.
- Xác định được ảnh hưởng của BA, Kin, NAA đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Hà thủ ô đỏ.
- Xác định được ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ
cây Hà thủ ô đỏ.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh
hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống Hà
thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) tại phòng thí nghiệm.
- Là tài liệu tham khảo thêm cho việc nghiên cứu và sản xuất tại các cơ sở.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Nhân nhanh giống Hà thủ ô đỏ trong phòng thí nghiệm, từ đó tăng nguồn cây
giống phục vụ sản xuất.
- Bảo tồn được loại dược liệu quý.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, đồng nghĩa: Polygonum multiflorum Thunb).
Theo hệ thống học thực vật mới nhất, cây Hà thủ ô đỏ được phân loại như sau:
-

Nghành (Division): Magnoliophita

-

Lớp (Class): Eudicots

-

Bộ (Ordo): Caryophyllales

-

Họ (Familia): Polygonaceae

-

Chi (Genus): Fallopia

-

Loài (Species): Fallopia multiflora

Tên gọi khác cây Hà thủ ô đỏ: Dạ giao đằng, Mã ôn, Khua lình (Thái ), Mán
năng ón (Tày thổ) [7].
Trên thế giới Hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan…Ở
Việt Nam, chúng thường mọc hoang ở rừng núi, nhiều đất ở Tây Bắc, Lai Châu,
Lào Cai hay ở vùng thấp như Sài Sơn (Sơn Tây) hoặc ở Thanh Hoá, Nghệ - Tĩnh
đều có [7].

Hình 2.1 Cây Hà thủ ô đỏ.

2.1.2. Đặc điểm hình thái
Hà thủ ô đỏ là loài dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ, thân
quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so
le, có cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4 – 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm, đầu nhọn, mép


4

nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhăn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm
lấy thân. Hoa tự chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau,
ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhuỵ (trong số đó có 3 nhuỵ
hơi dài hơn). Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhuỵ hình mào gà rủ
xuống. Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao
hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên [2].
2.1.3 Tác dụng dược lý
Theo Đông y hà thủ ô vị đắng ngọt chát, tính hơi ôn; vào các kinh can và thận.
Có tác dụng bổ can thận, dưỡng huyết, bổ âm, giải độc, nhuận tràng thông tiện.
Dùng cho các trường hợp can thận âm hư, huyết hư, đau đầu hoa mắt chóng mặt,
đau lưng mỏi gối ù tai điếc tai, râu tóc bạc sớm, di tinh, huyết trắng, táo bón, hội
chứng lỵ mạn tính, trĩ xuất huyết, sốt rét, lao hạch, bệnh mạch vành, tăng huyết áp,
tăng mỡ huyết, xơ vữa động mạch. Râu tóc có mối quan hệ mật thiết với tạng thận.
Thận tàng tinh, tinh sinh huyết. Tóc, râu là phần thừa của huyết cho nên nếu thận
hư, yếu thì râu, tóc không được nuôi dưỡng đầy đủ sẽ sớm bạc trắng và rụng. Hà thủ
ô có công dụng bồi bổ can thận, dưỡng huyết tư tâm, bởi vậy khả năng làm đen râu,
tóc. Ngoài ra, thận tinh sung túc thì sự phát triển của cơ thể diễn ra thuận lợi, năng
lực tính dục được khôi phục và nâng cao nên dễ sinh con. Sự già yếu của con người
cũng do quá trình suy giảm của thận tinh quyết định, bởi vậy việc sử dụng Hà thủ ô
lâu dài để bổ ích thận tinh cũng có tác dụng kéo dài tuổi thọ [1].
Theo các kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, Hà thủ ô có tác dụng dược lý
khá phong phú như giúp đẩy lui tuổi già, tăng trí nhớ, ngừa bệnh Alhzeimer, bệnh

Parkinson, trị mất ngủ, mệt mỏi, giúp tóc lâu bạc, kháng khuẩn, trị bệnh ngoài da,
giảm cholesterol LDL, tăng cholesterol HDL, giảm triglyxerit, hạ đường huyết, giúp
ngăn ngừa tình trạng vữa xơ động mạch, bảo vệ tế bào gan, thúc đẩy quá trình sản
sinh hồng cầu, nâng cao khả năng miễn dịch, cải thiện hoạt động của hệ thống các
tuyến nội tiết, đặc biệt là tuyến thượng thận và giáp trạng. Ngoài ra, hà thủ ô còn có
tác dụng kháng khuẩn, nâng cao khả năng chống rét của cơ thể, nhuận tràng và giải
độc [10].


5

Lexitin là một photphatit được tạo thành từ sự kết hợp giữa axit
glyxerophotphorit với một phân tử cholin và hai axit béo. Trong Hà thủ ô đỏ lexitin
chiếm một lượng nhỏ nhưng nó là thành phần quan trọng tham gia tích cực tới quá
trình quan trọng trong hoạt động sống. Theo một công trình nghiên cứu ở đại học
Hamburg, Cộng hòa liên bang Đức, lượng chất béo trong mỡ giảm thiểu rõ rệt ở
người được điều trị hỗ trợ với lexitin trong 4 tuần liên tục. Nó giúp việc chuyển hóa
mỡ và phân hủy chất béo, chất xơ cứng động mạch trong cơ thể cũng như trong
mạch máu (cholesteron). Lexitin rất quan trọng để giữ cho lượng Cholesteron ở
dạng hòa tan trong mật và giúp ngăn ngừa hiện tượng sỏi mật. Lexitin rất quan
trọng trong việc giữ cho hệ thần kinh luôn khỏe mạnh, nó luôn có ở vỏ bọc dây thần
kinh. Các thành phần cơ bản của lexitin, cholin rất cần thiết gây tác động từ tế bào
thần kinh này sang tế bào thần kinh khác cải thiện hệ thần kinh. Trong thí nghiệm
tiến hành trên cơ thể thỏ người ta ghi nhận: Lecitin làm tăng huyết dịch và trợ tim
rất đặc hiệu, giảm cholesteron trong máu, ngăn ngừa các bệnh lý về tim mạch giúp
hạn chế rụng tóc. Theo một số nhà nghiên cứu trong thành phần của lexitin có nhóm
chức inositol là nhân tố kích thích sinh trưởng và giải độc tố. Dựa vào tác dụng giải
độc của lexitin, nhiều nhà điều trị đã từ lâu áp dụng chất này trong phác đồ điều trị
cho những người bị gan nhiễm mỡ. Hơn nữa lexitin có tác dụng tăng cường quá
trình hấp thụ các chất béo, cân bằng omega. Nó có khả năng chống oxi hóa giúp

ngăn chặn quá trình phân hủy chất béo [5].
Thành phần hoá học: Thân rễ Hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin,
chrysophanol, rhein, physcion; protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin,
ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside. Tanin… Trong tự nhiên,
Hà thủ ô đỏ được trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt. Vấn đề gặp phải
với phương pháp nhân giống truyền thống đối với cây Hà thủ ô đỏ là khả năng nảy
mầm hạt lâu, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm cành tạo ra cây con có tuổi thọ
ngắn. Và Chang Lin (2003) đã xác định các cây Hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro
sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên [15].


6

Bảng 2.1: Tỷ lệ emodin và physcion
Hàm lượng Emodin

Hàm lượng Physcion

(mg/g sấy khô)

(mg/g sấy khô)

Phần thân ngoài tự nhiên

0. 075±0. 000

0. 078±0. 00

Phần rễ ngoài tự nhiên

0. 077±0. 002

0. 084±0. 001

Phần chồi nhân giống in vitro

0. 381±0. 060

0. 277±0. 044

Cây trong nhà kính sau in vitro

0. 392±0. 060

0. 413±0. 064

Sản phẩm Hà thủ ô đỏ

Theo như bảng số liệu trên, nhân giống cây Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật rất hiệu quả và phù hợp.
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm
80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô
tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh,
bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…[7].
Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng
khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh,
cây dược liệu…
Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do

nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng
phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt
quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra
lượng lớn cây giống có chất lượng tốt.
Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất
cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên
môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [8]. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế
bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học
nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban


7

đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể
tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học
giống hệt nhau.
2.2.1. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu
tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm
của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân
hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi
gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [9].
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên
hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh
để thực hiện chức năng phân chia.

Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
2.2.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a) Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo
điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm.
Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in
vitro [11].


8

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết
định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng
thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường
hay sử dụng một số hoá chất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để
khử trùng.
b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH
- Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [11].
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng

của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra
chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật
in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có
ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux
người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm.
- Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt
độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±2 0C [9].


9

- pH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi trường
là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường được điều
chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang
trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [12],13.
2.2.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi
cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật,
loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và
nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các
thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn
cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ

sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một
số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…
a) Nước
Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường
dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu. Nếu
môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào hay meristem thì nên dùng nước
cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô. Trong
trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này
vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn [9].
b) Dinh dưỡng vô cơ
Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa
lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. Theo thống nhất của Hội sinh lí học
thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn
0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng
độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố khoáng là nhu
cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật. Giống như cây trồng ngoài tự


10

nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường
nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự
phát triển. Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần
phải lấy từ đất các nguyên tố sau [9]:
- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi
(Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S).
- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm
(Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo).
Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các
nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật.

Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng
khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng. Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ
đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng
khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính. Theo nguyên
tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các
nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô. Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến
nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS
(Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này [9].
c) Đường
Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng
nuôi cấy mô thực vật. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá
trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của
chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí
hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối). Các mô có màu xanh
cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro. Mặt khác, quá trình quang hợp
cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy. Trên thực tế việc bổ sung CO2 là
rất khó khăn và tốn kém.
Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường
saccharose ở nồng độ 1-5%. Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp và


11

vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy. Cũng có
thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật. Nồng độ
đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy [9].
d) Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại
đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số
lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các vitamin thường

được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic
acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy
sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như
nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.
e) Agar
Agar là một loại polysacharit của tảo. Agar là chất keo đông thường được
sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất
polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành. Nồng độ của thạch dùng
trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi
cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh
dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy. Ở
800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái
gel. Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít nước. Thạch ở dạng
gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng [9].
f) Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát
sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào:
nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó [9].
Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra
còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng
phát triển và phân hóa cơ quan.


12

Auxin: Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp.
Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và auxin
tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4D), 1-napthalene acetic acid (NAA). Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng
này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D.
IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó

không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô. NAA và 2,4-D không bị biến tính
trong quá trình hấp tiệt trùng. Tuy nhiên chất 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có
tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus.
Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy
nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình
sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng
phát sinh phôi vô tính. Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy
mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình
thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus). Nồng độ auxin thường được sử dụng
trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy.
Cytokinin: Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết
định sự phân hóa chồi. Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo
hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo. Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l. Ở nồng độ cao,
cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng
thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.
Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl
amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin tự
nhiên). Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì
có hoạt tính cao và giá không đắt. Zeatin làmột loại cytokinin tự nhiên có hoạt
tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất đắt. Trong nhiều
trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea,
Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng
trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ.


13

g) Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Than
hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol…

trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu.
Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi
có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Than hoạt tính
còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt. Nhìn chung nó có ảnh hưởng
trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong
môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường.
2.3. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn [16], [18].
2.3.1. Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in
vitro. Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Có
thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2,
NaOCl, HgCl2,….
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao;
tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy
mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa
vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân…
Sharma G.J. (2005) [22] đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây
địa liền và cây ngải máu. Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15
phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu. Dương Tấn Nhựt và cs (2011) [19]
tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng Cồn 70% trong 30 giây và
HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao.
2.3.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô


14

nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh
trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. Behera K.K. và cs
(2010) [14] sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ
vàng. Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi
cấy. Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô
đã chuyển hoá.
2.3.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng
thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai đoạn
này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để tăng hệ số người
ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin,
cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết
hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy thường là 2527ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuỳ thuộc
vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình
thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi
nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính. Jala A. và cs (2012) [17]
nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BA 1 mg/l và NAA 0,1
mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy.
2.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường
ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn
chỉnh. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều
hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức
năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi. Nguyễn Thị Liễu
và cs (2011) [8] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo
rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất cho sự hình thành rễ bất


15

định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/l trong môi trường MS bổ sung sucrose 50
mg/l.
2.3.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai đoạn
chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất. Sen A. và cs (2010) [20] khi
chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây
vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên.
Shahinozzaman M. (2013) [21] chuyển cây con tái sinh in vitro sang chậu nhựa
có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi. Kết
quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao.
Theo Goer (1993) để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống
cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng
như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
2.4. Những vấn đề trong nuôi cấy mô
2.4.1. Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,
gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm
như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình nuôi cấy, từ môi trường, dụng cụ và các
máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống không khí trong phòng cấy [4].
Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được
xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh
trưởng, mẫu lá hay rễ non. Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô

16

trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên
bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vầy... của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững
chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt, vi khuẩn thường
nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau một tuần nuôi cấy.
Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô
cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường
gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium,
Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas....
Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập
quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng
ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác
Môi trường không khí, trong phòng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu
không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong
trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng
nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích luỹ vi sinh vật càng nhiều.
Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt trong quá trình
cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa
được sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 – 3 tháng. Các loài nấm thường gặp:
Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra .
2.4.2. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng
nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua nuôi
cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện
giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Nuôi cấy mô sẹo
cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Đến nay việc đưa ra biến dị chưa được
làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây

ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyển. Số lần cấy chuyển càng nhiều càng cho độ
biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy
chuyển ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyển ngắn làm giảm sự biến dị.