Xét nghiệm định lượng hscTnT (troponin T độ nhạy cao)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y-DƯỢC ĐÀ NẴNG
KHOA XÉT NGHIỆM Y HỌC
--------

BÀI TIỂU LUẬN

XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG hsTROPONIN T
HIGH SENSITIVE TROPONIN T – TROPONIN T
ĐỘ NHẠY CAO

Người thực hiện: Lê Thị Phương Thúy
Lớp: Đại học Xét nghiệm Y học 02


Tháng 11/2016


Chương I
Tổng quan về Troponin T
Troponin có bản chất hóa học là polypeptide, là những protein cấu trúc được tìm thấy
trong cơ tim và cơ xương, liên quan đến sự điều hòa hiện tượng co bóp của cơ tim và cơ
xương.

Cấu trúc sợi cơ tim
Troponin là một phức hợp gồm 3 tiểu đơn vị: troponin C, troponin I, troponin T.
- Troponin C gắn calci trong phân tử troponin.
- Troponin I làm nhiệm vụ tương tác giữa actin và myosin bằng cách ức chế
actomyosinadenosintriphotphatase hoạt động.
- Troponin T gắn kết troponin với myosin tạo thành tropomyosin.
Các tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử khác nhau: troponin C là 18 kilodalton (KD),
troponin I là 26 KD, troponin T là 39 KD.

Những gen mã hóa cho các đồng phân TnC của xương và tim thì giống nhau nên
không có sự khác biệt cấu trúc. Tuy nhiên, đồng phân TnI và TnT của xương và tim thì
khác nhau và các thử nghiệm miễn dịch nhận biết được sự khác biệt này. Điều này giải
thích tính đặc hiệu cho tim của các troponin tim. Không xảy ra phản ứng chéo giữa TnT
của xương và tim với các thử nghiệm miễn dịch hiện tại.

3


Phần lớn TnI, TnT gắn với myofibrin và có 6 – 8% cTnT, 3 – 4% cTnI có trong bào
tương vì vậy khi cơ tim bị tổn thương, chúng sẽ được giải phóng sớm nhất vào máu gây
tăng nồng độ các chất này trong huyết tương. Sau đó sự thoái hoá của phức hợp troponin
gắn với myofibrin tiếp tục diễn ra, khiến cho nồng độ troponin trong máu tăng kéo dài
trong hội chứng mạch vành cấp. Trong tổn thương cơ tim nồng độ của troponin I,
troponin T rất nhạy và đặc hiệu. Thông qua một số nghiên cứu so sánh và các đánh giá
meta riêng biệt của các thử nghiệm được công bố sử dụng bệnh nhân hội chứng mạch
vành cấp (acute coronary syndrome – ACS), các nhà điều tra kết luận rằng TnT và TnI
cung cấp các thông tin tương tự về giá trị chẩn đoán và tiên lượng. Chính vì vậy, ở đây tôi
lựa chọn xét nghiệm định lượng hs-cTnT.
hs-cTnT không phải là một loại TnT khác mà là Troponin độ nhay cao đang được sử
dụng phổ biến trên lâm sàng. Xét nghiệm đinh lượng Troponin T độ nhạy cao (hs-cTnT)
được triển khai trên hệ thống Elecsys của hãng Roche Diagnostic vào năm 2010 đánh dấu
sự ra đời của phương pháp định lượng cTnT thế hệ thứ 5. Đây là phương pháp có độ
chính các đặc biệt với biên độ đo lường từ 3ng/L tới 10000 ng/L. Phương pháp này xác
định nồng độ cTnT ở người bình thường (99th percentile) là dưới 14 ng/L và hệ số biến
thiên CV ≤ 10% ở nồng độ 13 ng/L.

4

Chương II
Ý nghĩa lâm sàng của Troponin T
Với tính đặc hiệu tổ chức cao nên cTnT được xem là một dấu ấn sinh học
(biomarker) đặc hiệu của tim với độ nhạy cao cho tổn thương cơ tim.
Trong nhồi máu cơ tim, sự thiếu oxy gây nên tổn thương màng tế bào. Kết quả là các
protein trong tế bào khuếch tán vào mô rồi tràn vào máu. Mức độ tăng của TnT phụ thuộc
vào độ lớn của mô bị tổn thương. Trong nhồi máu cơ tim cấp (acute myocardial
infarction – AMI), hàm lượng cTnT trong huyết thanh tặng khoảng 3 – 4 giờ sau khi xảy
ra các triệu chứng về tim, đạt đỉnh cao nhất sau 12 – 24 giờ và có thể duy trì mức tăng
này đến 14 ngày (điều này còn phụ thuộc vào sự tưới máu lại của động mạch vành).
Nồng độ cao của cTnT có thể kéo dài trên 10 ngày chứng tỏ sự giải phóng một cách chậm
chạp của phân tử này ra khỏi vùng bị tổn thương.

Biến đổi nồng độ các chỉ điểm theo thời gian/ NMCT cấp
Trong khi các xét nghiệm định lượng cTnT trước đây chỉ phát hiện được những
lượng tương đối lớn cTnT (với giá trị cắt là 0,1 μg/L) được giải phóng trong quá trình
thiếu máu cục bộ cơ tim (ischaemia) trong hội chứng mạch vành cấp (ACS) thì xét
nghiệm TnT hs với giá trị cắt 14 ng/L còn có thể phát hiện được tất cả các dạng tổn
thương cơ tim nhẹ hơn xảy ra trong các điều kiện mạn tính như suy tim do tắc nghẽn
5


(congestive cardiac failure), loạn nhịp tim (cardiac arrhythmias) và nghẽn tắc phổi
(pulmonary embolus).
Ở các khoa Hồi sức cấp cứu, hs-cTnT cần được chỉ định ngay khi bệnh nhân vừa
được tiếp nhận. Hs-cTnT có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn các xét nghiệm định lượng
cTnT khác nên có thể giúp phát hiện tổn thương cơ tim sớm và loại trừ nhồi máu cơ tim
chỉ khoảng 3 giờ (thậm chí chỉ 2 giờ) sau khi được tiếp nhận cấp cứu.
Hs-cTnT cũng tăng ở các bệnh nhân mắc bệnh thận mạn tính tiền thẩm phân phúc
mạc, giai đoạn cấp của bệnh phổi mạn tính, tăng cao trước khi xảy ra biến cố tim mạch.

Các mức này không phải là dương tính giả, chúng báo hiệu nguy cơ tử vong cao mà
không tìm thấy trong các xét nghiệm Troponin khác.
cTnT có thể tiên lượng bệnh cảnh ngắn, trung và dài hạn cho những bệnh nhân
mắc ACS. Đây là dấu ấn tổn thương cơ tim được ưu tiên lựa chọn trong hướng dẫn mới
về chẩn đoán và điều trị ACS không tăng đoan ST (NSTEMI).
Ngoài ra, TnT còn hữu dụng trong việc xác định những bệnh nhân nào có lợi ích
với liệu pháp chống huyết khối.
Nồng độ cTnT thấp có thể gặp ở những bệnh nhân ổn định trên lâm sàng như bệnh
suy tim thiếu máu cục bộ hoặc không thiếu máu cục bộ, suy thận, nhiễm trùng huyết và
đái tháo đường, viêm cơ tim, giập cơ tim, thuyên tắc phổi, nhiễm độc tim do thuốc; là
một tiên lượng độc lập của các biến cố tim mạch bao gồm rung nhĩ mới hay rung nhĩ
tái phát.
Các xét nghiệm chẩn đoán khác như Myoglobin, CK-MB, Nt-proBNP, PIGF và
CRP cung cấp thông tin bổ sung để chẩn đoán hay tiên lượng bên cạnh dấu ấn cTnT ở
những chỉ định khác nhau.

6


Chương III
Kỹ thuật đinh lượng Troponin T độ nhạy cao
1. Nguyên tắc:
Hs-cTnT được định lượng bằng phương pháp miễn dịch sandwich sử dụng công
nghệ hóa phát quang hay miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA). TnT có trong mẫu thử
đóng vai trò kháng nguyên được kẹp giữa hai kháng thể, kháng thể thứ nhất là kháng thể
đơn dòng đặc hiệu kháng cTnT đánh dấu biotin, kháng thể thứ hai là kháng thể đơn dòng
đặc hiệu kháng cTnT đánh dấu ruthenium (chất có khả năng phát quang), các kháng thể
này nhận diện hai epitope (đoạn acid amin có vị trí từ 125-131 và 136-147) ở vùng trung
tâm của cTnT, bao gồm 288 acid amin, từ đó tạo thành phức hợp miễn dịch kiểu
sandwich. Cường độ phát quang tỷ lệ thuận với nồng độ cTnT có trong mẫu thử.

Các mẫu chuẩn Troponin T hs (Troponin T hs CalSet) chứa troponin T tim người tái

tổ hợp (rec. hcTnT). Rec. hcTnT được phân lập từ canh cấy tế bào E. coli BL21 chứa một
vector pET với gen đồng phân 3 cTnT. Sau khi lên men, các tế bào bị phá vỡ bằng sóng
siêu âm và rec. hcTnT được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Rec. hcTnT
tinh khiết tiếp tục được đặc trưng hóa qua xét nghiệm SDS PAGE, Western blotting, hoạt
tính miễn dịch và thành phần protein.
2. Nguyên lý xét nghiệm:
7


Xét nghiệm dựa trên nguyên lý bắt cặp:
Thời kỳ ủ đầu tiên: 50 µL mẫu thử, kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng cTnT đánh
dấu biotin, và kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng cTnT đánh dấu phức hợp ruthenium
phản ứng với nhau tạo thành phức hợp bắt cặp.
Thời kỳ ủ thứ hai: Sau khi thêm các vi hạt phủ streptavidin, phức hợp miễn dịch trên
trở nên gắn kết với pha rắn thông qua sự tương tác giữa biotin và streptavidin.
Hỗn hợp phản ứng được chuyển tới buồng đo, ở đó các vi hạt đối từ được bắt giữ
trên bề mặt của điện cực. Những thành phần không gắn kết sẽ bị thải ra ngoài buồng đo
bởi dung dịch ProCell/ProCell M. Cho điện áp vào điện cực sẽ tạo nên sự phát quang hóa
học được đo bằng bộ khuếch đại quang tử.
Các kết quả được xác định thông qua một đường chuẩn xét nghiệm trên máy được
tạo nên bởi xét nghiệm 2-điểm chuẩn và thông tin đường chuẩn chính qua mã vạch trên
hộp thuốc thử.
3. Chuẩn bị:
3.1. Người thực hiện:
- 01 cán bộ đại học, 01 kỹ thuật viên xét nghiệm chuyên ngành hóa sinh.
3.2. Bệnh phẩm:
- Lấy 3 ml máu tĩnh mạch vào ống không có chất chống đông hay ống có chất
chống đông là K2-EDTA, K3-EDTA, Li-heparin hoặc Na-heparin. Không sử dụng chất

chống đông Oxalat và Fluorid cho xét nghiệm này. Máu không vỡ hồng cầu.
- Mẫu huyết tương (chống đông EDTA, heparin) và huyết thanh không nên được
sử dụng xen lẫn nhau. Không sử dụng mẫu thử và mẫu chứng được ổn định bằng azide.
- Sau khi lấy máu, đem ly tâm tách lấy huyết thanh hoặc huyết tương.
- Ly tâm các mẫu có kết tủa trước khi thực hiện xét nghiệm.
- Bệnh phẩm ổn định 24 giờ ở 2-8°C, 12 tháng ở -20°C.
- Bệnh phẩm chỉ rã đông 1 lần và phải để bệnh phẩm đạt nhiệt độ phòng trước khi
phân tích. Để tránh hiện tượng bay hơi, bệnh phẩm, chất chuẩn, chất kiểm tra chất lượng
nên phân tích trong vòng 2 giờ.
3.3. Thuốc thử:
8


Bộ thuốc thử được dán nhãn hs-cTnT:
- M Vi hạt phủ Streptavidin (nắp trong), 1 chai, 12 mL: Vi hạt phủ Streptavidin
0.72 mg/mL; chất bảo quản.
- R1 Anti-troponin T-Ab~biotin (nắp xám), 1 chai, 14 mL: Kháng thể đơn dòng
kháng cTnT đánh dấu biotin (chuột) 2.5 mg/L; đệm phosphate 100 mmol/L, pH 6.0; chất
bảo quản; chất ức chế.
- R2 Anti-troponin (nắp đen), 1 chai, 14 mL: Kháng thể đơn dòng kháng cTnT
(chuột) đánh dấu phức hợp ruthenium 2.5 mg/L; đệm phosphate 100 mmol/L, pH 6.0;
chất bảo quản.
Sử dụng thuốc thử
- Các thuốc thử trong hộp được đựng trong một bộ các chai sẵn sàng để sử dụng
và không thể tách riêng.
- Máy phân tích tự động đọc mã vạch trên nhãn thuốc thử và ghi nhận tất cả thông
tin cần thiết cho việc chạy thuốc thử.
- Tránh để các dung dịch thuốc thử và các mẫu (mẫu xét nghiệm, mẫu chuẩn và
mẫu chứng) bị tạo bọt.
Bảo quản và độ ổn định :

- Bảo quản ở 2-8°C. Không trữ đông.
- Đặt hộp thuốc thử Elecsys theo hướng thẳng đứng nhằm đảm bảo tính hữu
dụng của toàn bộ các vi hạt trong khi trộn tự động trước khi sử dụng.

Độ ổn định
chưa mở nắp ở 2-8 °C

đến ngày hết hạn sử dụng

sau khi mở và để ở 2-8 °C

12 tuần

trên máy phân tích

4 tuần

9


3.4. Dụng cụ, máy móc:
- Máy xét nghiệm như: Elecsys 2010, Modular analytics E170, cobas e 411, cobas
e 601, cobas e 170, rchitect,…
- Các dụng cụ khác: micro pipet, đầu col, cốc đựng đầu col bẩn, …
4. Kỹ thuật tiến hành:
- Máy phân tích cần chuẩn bị sẵn sàng để thực hiện phân tích mẫu: Máy đã được
cài đặt chương trình xét nghiệm hsTnT. Máy đã được chuẩn với xét nghiệm hsTnT. Kết
quả kiểm tra chất lượng với xét nghiệm hsTnT đạt yêu cầu không nằm ngoài dải cho
phép và không vi phạm luật kiểm tra chất lượng.
- Người thực hiện phân tích mẫu nhập dữ liệu về thông tin người bệnh và chỉ định

xét nghiệm vào máy phân tích hoặc hệ thống mạng (nếu có).
- Nạp mẫu bệnh phẩm vào máy phân tích.
- Ra lệnh cho máy thực hiện phân tích mẫu bệnh phẩm.
- Đợi máy phân tích mẫu theo protocol của máy.
- Khi có kết quả cần xem xét đánh giá kết quả sau đó in báo cáo hoặc ghi kết quả
vào phiếu xét nghiệm để trả cho người bệnh.
5. Nhận định kết quả:
Các lý do để cTnT trở thành hs-cTnT:
- Tăng thể tích bệnh phẩm từ 15 µl đến 50 µl.
- Sử dụng chất liên kết (kháng thể gắn Ru) được tối ưu hóa cao nhằm khuếch đại
tín hiệu.
- Giảm tín hiệu nền để tăng tỉ lệ tín hiệu/nhiễu.
- Giảm nhiễu gây nên bởi kháng thể dị nguyên (heterophic antibodies) bằng cách
sử dụng kháng thể chuột-người (chimeric antibodies) thay vì kháng thể chuột đơn thuần
(được sử dụng ở Troponin T Gen 4).
Ở người bình thường:
- <50 tuổi, nồng độ hs-cTnT trong huyết tương <14 ng/L.
- Giá trị hs-cTnT tăng theo tuổi, ở người từ 50-75 tuổi là < 16 ng/L và ở người >
75 tuổi là < 70,6 ng/L.

10


Các trường hợp có thể xảy ra khi xét nghiệm hs-cTnT ở bệnh nhân nghi ngờ tổn
thương cơ tim:
- Nếu mức độ hs-cTnT là bình thường (< 14 ng/L), cần phải thử lại sau đó 3-6 giờ.
Nếu kết quả vẫn < 14ng/L xác định không có nhồi máu cơ tim; nếu mức độ hs-cTnT tăng
trên 50% giá trị ban đầu là nhồi máu cơ tim cấp.
- Nếu mức độ hs-cTnT ban đầu tăng vừa phải (14 – 53 ng/L), cần phải thử lại sau
đó 3-6 giờ, nếu mức độ hs-cTnT tăng trên 50% giá trị ban đầu là nhồi máu cơ tim cấp.

- Nếu mức độ hs-cTnT ban đầu tăng > 53 ng/L, rất có khả năng có sự tổn thương
cơ tim, tuy nhiên, vẫn cần thử lại sau đó 3-6 giờ, nếu mức độ hs-cTnT tăng trên 30% giá
trị ban đầu, có thể khẳng định là nhồi máu cơ tim cấp. Mức độ hs-cTnT 86,8 ng/L là giá
trị cắt hiệu quả nhất để chẩn đoán AMI ở người già.
6. Sai sót và xử trí:
Xét nghiệm không bị ảnh hưởng bởi:
- Vàng da bilirubin < 428 µmol/L hoặc < 25 mg/dL.
- Tán huyết : Hb < 0.062 mmol/L hoặc < 0.1 g/dL; mẫu có dấu hiệu tán huyết quan
sát được có thể gây nhiễu.
- Lipid huyết: Intralipid < 1500 mg/dL.
- Biotin < 82 nmol/L hoặc < 20 ng/mL.
Các kết quả giảm giả tạo thu được khi sử dụng mẫu có nồng độ hemoglobin > 0.1
g/dL.
Tiêu chuẩn: Độ phục hồi nằm trong khoảng ± 20 % giá trị ban đầu ở nồng độ TnT <
100 ng/L hoặc pg/mL (± 10 % ở nồng độ troponin T ≥ 100 ng/L hoặc pg/mL).
Ở bệnh nhân dùng liều cao biotin (nghĩa là > 5 mg/ngày), không nên lấy mẫu cho
đến ít nhất 8 giờ sau khi dùng liều biotin cuối.
Kết quả xét nghiệm không bị nhiễu bởi các yếu tố thấp khớp với nồng độ lên đến
1500 IU/mL.
Hiệu ứng mẫu phẩm “high-dose hook” có nồng độ cao không ảnh hưởng đến kết quả
xét nghiệm với nồng độ troponin T lên đến 100000 ng/L (pg/mL).
Thử nghiệm in vitro được tiến hành trên 52 loại dược phẩm thường sử dụng. Không
có hiện tượng nhiễu tới xét nghiệm.
11


Trong một số hiếm trường hợp, nhiễu có thể xảy ra do nồng độ kháng thể kháng
kháng thể đặc hiệu kháng chất phân tích, kháng streptavidin hay ruthenium quá cao của
mẫu phẩm phân tích. Xét nghiệm đã được thiết kế phù hợp để giảm thiểu các hiệu ứng
này.

Với mục tiêu chẩn đoán, kết quả xét nghiệm cần được đánh giá kèm theo bệnh sử,
thăm khám lâm sàng và các phát hiện khác.

12


Tài liệu tham khảo
1. Quyết định số 320 / QĐ – BYT ngày 23 tháng 01 năm 2014.
2. GS.TS Tạ Thành Văn, “Hóa sinh lâm sàng”, Nhà xuất bản y học, 2013.
3. PGS.TS Nguyễn Nghiêm Luật, “Troponin T tim độ nhạy cao hs-cTnT (high sensitive
cardiac TnT): một xét nghiệm đánh giá tổn thương cơ tim mới”
4. A. G. Olatidoye, A. H. Wu, Y. J. Feng, D. Waters, "Prognostic role of troponin T versus
troponin I in unstable angina pectoris for cardiac events with meta-analysis comparing
published studies", Am J Cardiol, 1998.
5. Alpert JS, Thygesen K, Jaffe A, White HD. The universal definition of myocardial
infarction: a consensus document: ischaemic heart disease. Heart 2008.
6. French J and White H Heart 2004
7. Giannitsis E, Becker M, Kurz K, Hess G, Zdunek D, Katus HA. High-sensitivity
cardiac troponin T for early prediction of evolving non-ST-segment elevation myocardial
infarction in patients with suspected acute coronary syndrome and negative troponin
results on admission. Clin Chem, 2010.
8. L. Babuin, A. S. Jaffe, "Troponin: the biomarker of choice for the detection of cardiac
injury", CMAJ, 2005.
9. Olivieri F, Galeazzi R, Giavarina D, Testa R, Abbatecola AM, Ceka A, Tamburrini
P, Busco F, Lazzarini R, Monti D, Franceschi C, Procopio AD, Antonicelli R. Agedrelated increase of high sensitive Troponin T and its implication in acute myocardial
infarction diagnosis of elderly patients. Mech Ageing Dev 2012 Mar.
10. Roche, Troponin T hs, 2010.
11. R. Y. Xu, X. F. Zhu, Y. Yang, P. Ye (2013), "High-sensitive cardiac troponin T", J
Geriatr Cardiol.
12. S. M. Fleming, K. M. Daly, "Cardiac troponins in suspected acute coronary

syndrome: a meta-analysis of published trials", Cardiology, 2001.
13. T. Reichlin, W. Hochholzer, S. Bassetti, S. Steuer, C. Stelzig, S. Hartwiger, S. Biedert,
N. Schaub, C. Buerge, M. Potocki, M. Noveanu, T. Breidthardt, R. Twerenbold, K.
Winkler, R. Bingisser, C. Mueller (2009), "Early diagnosis of myocardial infarction with
sensitive cardiac troponin assays", N Engl J Med.
13