Giáo trình bệnh truyền nhiễm - Chương 3

Chương 3
Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm
I. Khái quát về chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm là việc xác định nguyên nhân (và tên gọi) của hiện
tượng bệnh lý đang có thông qua các thủ tục mô tả những hiện tượng bệnh lý đang gặp ở
cá thể (bệnh) và ở quần thể (dịch) hoặc/và mô tả mầm bệnh đã được phân lập để so sánh
những thuộc tính thu được đó với những thuộc tính của các bệnh/dịch hoặc mầm bệnh đã
được mô tả, phân loại và định danh (đặt tên) và quy thuộc hiện tượng bệnh lý đang có vào
một nhóm hiện tượng bệnh lý đã được phân loại và đặt tên. Mô tả có thể dựa vào triệu
chứng lâm sàng (chẩn đoán lâm sàng), bệnh tích (chẩn đoán giải phẫu bệnh lý), đặc điểm
dịch học (chẩn đoán dịch tễ học) và các đặc điểm vi sinh vật học, huyết học, huyết thanh
học, sinh học phân tử (chẩn đoán xét nghiệm). Như vậy, ta gọi được tên bệnh đang có là
nhờ vào việc xác định tính tương đồng của các biểu hiện bệnh và/hoặc căn bệnh với các
biểu hiện bệnh và/hoặc căn bệnh của những bệnh đã đặt tên từ trước. Thủ tục chẩn đoán
(giống như thủ tục nhận dạng) vì vậy được gọi là thủ tục đồng định (identification). Trên
thực tế, quá trình quy thuộc được thực hiện qua hàng loạt bước loại suy, ví dụ "vi khuẩn
phân lập được nhuộm màu Gram âm vậy không thể là Bacillus hay một vi khuẩn Gram
dương nào khác". Do đó, chẩn đoán còn là quá trình giám biệt (differentiation), còn các
tính trạng quan trọng giúp chẩn đoán được gọi là những đặc điểm giám biệt. Tuy nhiên,
nhiều khi thủ tục chẩn đoán chỉ là việc xác nhận sự hiện diện của một mầm bệnh (chẩn
đoán bệnh nguyên học xác nhận kết quả chẩn đoán khác).
Đồng định, như vậy, không chỉ là "xác định", mà là xác định có định hướng trên
cơ sở những kiến thức đã biết trước của nhà chuyên môn về các loại bệnh và/hoặc mầm
bệnh. Hơn nữa đồng định có thể thất bại. Sau mọi nỗ lực đồng định, nếu đồng định vẫn
thất bại, nhà chuyên môn có thể đưa ra giả thuyết về loại bệnh mới, chưa được biết.
Trong điều tra dịch tễ học người ta nghiên cứu tốc độ truyền lây, tỷ lệ mắc bệnh
mới, tỷ lệ lưu hành bệnh, tỷ lệ tử vong, tuổi và giống phát bệnh chủ yếu, vùng phát sinh,
yếu tố thời tiết, sinh sản dị thường hoặc đẻ trứng dị thường, giảm sản lượng sữa hoặc tỷ
lệ đẻ trứng, thay đổi thức ăn, nhập động vật mới, sự truyền lây bệnh sang loại động vật
khác, lịch sử tiêm phòng vacxin,... Đặc biệt, điều tra dịch học là hết sức quan trọng trong
quá trình nhận biết bệnh truyền nhiễm phát sinh ở động vật được chăn nuôi tập trung

dưới cùng điều kiện môi trường.
Tuy ở nhiều bệnh cảm nhiễm những đặc điểm dịch học, biểu hiện bệnh lý và triệu
chứng lâm sàng có thể đặc trưng, và điều này giúp ích cho việc suy định mầm bệnh liên
quan nhưng cần chú ý rằng cũng có thể chúng tạo định kiến ở người xét nghiệm và làm
lệch lạc kết quả do lựa chọn sai phương pháp xét nghiệm, ví dụ, dùng phương pháp vi
khuẩn học để xét nghiệm động vật bệnh do ngộ độc hóa chất (nông dược,...).
Chẩn đoán bệnh nguyên học là những thủ tục vi sinh vật học, huyết thanh học và
sinh học phân tử,... nhằm xác định sự hiện diện của một loại mầm bệnh nào đó trong cơ
thể bị bệnh. Đương nhiên, quy thuộc yếu tố mầm bệnh nghi ngờ (với nhóm mầm bệnh đã
biết) ở cấp độ càng chi tiết càng tốt: loài gì, nhóm huyết thanh học nào, nhóm di truyền
học phân tử nào,... là những câu hỏi thường đặt ra và tìm cách trả lời.
Để thực hiện nhanh chóng và chính xác các xét nghiệm chẩn đoán bệnh nguyên
học cần khảo cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích mổ khám và đặc điểm dịch tễ để suy
định những bệnh nguyên liên quan có thể gây nên bệnh dịch. Dựa vào triệu chứng lâm
sàng và bệnh tích, vị trí bệnh biến chủ yếu,... mà các bệnh truyền nhiễm động vật chia
thành bệnh cơ quan hô hấp, bệnh hệ thần kinh trung ương, bệnh cơ quan tiêu hóa, bệnh
sinh khối u (ung thư), bệnh da, bệnh cơ quan sinh dục tiết niệu và các chứng bệnh trở
ngại sinh sản (vô sinh, đẻ non,...). Chủng loại các mầm bệnh cũng có thể là vi khuẩn,
virut, nấm, nguyên trùng hoặc ký sinh trùng khác. Hơn nữa các loại mầm bệnh không chỉ
gây bệnh đơn thuần mà còn có thể bệnh hỗn hợp hoặc kế phát làm bệnh chứng lâm sàng
càng thêm phức tạp. Do đó, việc chọn lấy loại bệnh phẩm thích hợp với loại bệnh tật này
hay khác và việc thu mẫu ảnh hưởng lớn đến kết quả chẩn đoán. Trong trường hợp nghi
ngờ bệnh do cảm nhiễm vi khuẩn, chẳng hạn, cần chú ý mở rộng giả thuyết về loại mầm
bệnh mà lấy mẫu thích hợp để chẩn đoán cả bệnh cảm nhiễm virut và nấm,...
II. Chẩn đoán bệnh nguyên học
1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh phẩm
Kết quả phân lập bệnh nguyên phụ thuộc việc lấy bệnh phẩm vào thời điểm thích
hợp và từ vị trí thích hợp cũng như những xử lý thích hợp cho đến khi xét nghiệm. Cách
lấy mẫu khác nhau phụ thuộc loại bệnh, mẫu bệnh phẩm,... nhưng về nguyên tắc thì lấy
sớm khi mới phát hiện bệnh trạng lâm sàng, hoặc nếu vật bệnh chết thì ngay sau khi chết

là tốt. Tuy nhiên, trong những bệnh cảm nhiễm mãn tính bệnh nguyên vẫn còn có thể
phân lập được ngay cả khi bệnh đã qua. Vị trí lấy bệnh phẩm thích hợp trong đa số
trường hợp là tổ chức có biến đổi bệnh lý (ổ bệnh) hoặc vị trí liên quan. Ví dụ, trong bệnh
cơ quan hô hấp lấy dịch xoang mũi và khí quản, trong bệnh thần kinh lấy máu hoặc tủy
sống, trong bệnh đường tiêu hóa lấy phân hoặc dịch từ hầu họng, trong bệnh ở da thì lấy
nội dịch bọc nước và bọc mủ, trong bệnh đường sinh dục tiết niệu thì lấy nước tiểu hoặc
dịch thẩm xuất tử cung,... Hơn nữa, trong trường hợp phân lập mầm bệnh từ mẫu bệnh
phẩm mổ khám bệnh tích thì cần lấy một cách vô trùng tránh vi khuẩn đường ruột ô
nhiễm các loại bệnh phẩm (não, gan, lách, hạch lympho,...), thời điểm lấy các mẫu sau
chết càng sớm càng tốt vì sau khi súc vật chết vài giờ các nội quan và máu đã bị tạp
khuẩn xâm nhập và phát triển. Hơn nữa, đối với các bệnh cảm nhiễm virut có chứng
nhiễm virut huyết nặng như bệnh sốt lưu hành bò thì cần lấy máu vào thời điểm sốt. Sau
phát bệnh hai tuần trở đi là thời kỳ lấy máu thu huyết thanh kỳ hồi phục. Trong thời kỳ
này hiệu giá kháng thể tăng so với thời kỳ sốt cấp tính chứng tỏ mầm bệnh chứa kháng
nguyên thuộc loại dùng để phát hiện kháng thể. Ví dụ, nếu một bệnh xuất hiện trong quần
thể thì ở các cá thể bị bệnh cấp tính triệu chứng bệnh kéo dài khoảng 1 tuần, khi đó khả
năng phát hiện được mầm bệnh nhờ lấy mẫu để phân lập trong khoảng 1 tuần đó cho đến
vài ngày sau đó. Trong kỳ cấp tính này kháng thể đặc hiệu chưa được hình thành. Tuy
nhiên, sau thời điểm này kháng thể đặc hiệu bắt đầu tăng dần. Nếu lấy mẫu huyết thanh
kỳ hồi phục (từ 10 ngày cho đến 1 tháng sau khi xuất hiện triệu chứng thì hàm lượng
(hiệu giá) kháng thể cao hơn nhiều so với lần lấy máu kỳ cấp tính. Trong kỳ hồi phục
này, ngược lại khó có thể phân lập được mầm bệnh.
Trong kiểm tra bệnh nguyên, sau khi lấy mẫu nên xét nghiệm mẫu càng sớm càng
tốt. Trong trường hợp không thể thực hiện xét nghiệm ngay được, nếu để phân lập vi
khuẩn thì bảo quản bệnh phẩm ở 4 °C hoặc đôi khi đông lạnh. Nhưng với bệnh phẩm để
kiểm tra virut thì cần bảo quản ở -70 °C hoặc bảo quản trong dung dịch PBS (dung dịch
sinh lý đệm phosphat) pha 50% glycerin.
2. Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên
Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên bao gồm một số phương pháp bên cạnh việc chẩn
đoán lâm sàng: kiểm tra trực tiếp, nuôi cấy phân lập và đồng định mầm bệnh qua các xét

nghiệm, phản ứng dị ứng và các phản ứng huyết thanh học xác định sự tăng hàm lượng
kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh. Hai sơ đồ dưới đây thường được áp dụng cho việc
chẩn đoán bệnh do vi khuẩn và virut gây ra ở động vật.
Kiểm tra trực tiếp bệnh phẩm được thực hiện trong trường hợp phải vận dụng đối
sách cấp bách đối với bệnh cảm nhiễm và nhiều khi đồng thời với xác định mầm bệnh
qua phân lập.

Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm vi khuẩn người ta có thể suy định chủng loại
mầm bệnh trên cơ sở các đặc điểm hình thái, bắt màu của vi khuẩn có trong bệnh phẩm.
Khi xác nhận được mầm bệnh trong các tiêu bản chế tác từ ổ bệnh ở các cơ quan tổ chức
vốn không có vi sinh vật, hoặc là khi thấy các vi khuẩn nghi gây bệnh một cách áp đảo ở
các tổ chức thường có các vi khuẩn "bình thường" thì phương pháp kiểm tra trực tiếp là
rất hữu ích. Hơn nữa, kết quả này còn có tác dụng tham khảo đối với việc tuyển chọn
những khuẩn lạc đặc hiệu phát triển trên môi trường phân lập vi khuẩn. Trong trường hợp
bệnh cảm nhiễm nguyên trùng hoặc Leptospira và Spirochaeta người ta còn có thể sử
dụng những tiêu bản tươi mới không nhuộm.
Ngoài ra, có thể sử dụng các phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phản ứng
ngưng kết để kiểm tra kháng nguyên đặc hiệu, hoặc phương pháp PCR để kiểm xuất
ADN đặc hiệu của mầm bệnh như những phương pháp kiểm tra trực tiếp.
Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm virut các phương pháp trực tiếp kiểm tra thể
bệnh nguyên có thể là phương pháp hiển vi điện tử để phát hiện các virion virut, phương
pháp phát hiện thể vùi (thể ấn nhập) trong tiêu bản tổ chức nhuộm, phương pháp kháng
thể huỳnh quang phát hiện kháng nguyên đặc hiệu, phương pháp PCR để phát hiện ADN
đặc hiệu của mầm bệnh.
Phươ
ng pháp hiển
vi điện tử áp
dụng để
kiểm tra trực
tiếp hoặc

kiểm tra sau
khi làm sạch
và tăng nồng
độ các bệnh
phẩm (dịch ổ
viêm, niêm
dịch mũi,
phân,...)
hoặc các tiêu
bản lá siêu
mỏng làm từ
tổ chức bệnh
biến đã
nhuộm âm
bản. Các
phương pháp
kháng thể
huỳnh quang
và nhuộm tổ
chức sử dụng các tiêu bản làn mỏng tế bào tách biệt hoặc từ lát cắt tổ chức.

Các phương pháp kiểm tra trực tiếp rất hữu ích trong các trường hợp phải chẩn
đoán nhanh một cách chính xác để có đối sách dự phòng sớm đối với các virut khó hoặc
không thể nuôi cấy.
2.1. Phương pháp kiểm tra phát hiện kiểu hình
Các phương pháp kiểm tra phát hiện kiểu hình bao gồm hiển vi trực tiếp tiêu bản
nhuộm (nhuộm Gram, Giemsa,...) hoặc tiêu bản tươi, hoặc sau khi nuôi cấy khởi đầu
phân lập vi sinh vật gây bệnh thì nghiên cứu các đặc điểm sinh lý (khả năng phát triển
trong các môi trường và đặc điểm lứa cấy,...), đặc điểm sinh hóa (phân giải hay tổng hợp
các chất, sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa,...), khả năng đề kháng (hay mẫn

cảm) với các thuốc kháng sinh,... Trên cơ sở mô tả các tính trạng của vi sinh vật có thể so
sánh với những mô tả trước đó để có thể quy thuộc vi sinh vật ta đang có vào một nhóm
vi sinh vật nhất định.
2.2. Phương pháp phát hiện axit nucleic đặc hiệu
Trình tự nucleotid của ADN nhiễm sắc thể các sinh vật, của axit nucleic trong
nucleocapsid của virut cũng như của ty thể sinh vật nhân thực có tính bảo toàn cao, bảo
đảm tính cá thể của chúng trong quá trình phát triển. Trình tự này có thể khác nhau ở các
cá thể khác nhau nhưng ở những miền nhất định trong trình tự axit nucleic này là ổn định
ở các cá thể cùng loài, ở miền khác lại giống nhau ở những cá thể trong cùng nhóm phân
loại lớn hơn. Nhìn chung những miền axit nucleic genom có tính bảo toàn cao là những
gen có tính chức năng cao. Các phương pháp phát hiện gen đặc hiệu hoặc ADN và ARN
đặc hiệu được áp dụng khá rộng rãi trong phân loại và đồng định vi sinh vật thời gian gần
đây nhờ những thành tựu to lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử. Các phương pháp
phát hiện gen đặc hiệu thường được sử dụng là PCR (polymerase chain reaction - phản
ứng chuỗi enzym trùng hợp) với những biến thể của nó (RAPD,...), hoặc RT-PCR với
ARN virut hoặc sinh vật khác, các phương pháp lai phân tử (hybridization, gồm nhiều
biến thể khác nhau như Southern hybridization, Northern hybridization, Western
hybridization), tính đa dạng ngẫu nhiên, giải đọc và so sánh trình tự nucleotid,... Mục
đích của các phương pháp này là so sánh phân loại vi sinh vật trên cơ sở tính đồng dạng
và dị biệt (tính đồng - dị) của các gen có chức năng cao nào đó, trên cơ sở đó có thể đồng
định các vi sinh vật bệnh nguyên mới phát hiện được với các mầm bệnh đã được mô tả và
phân loại trước đó, tức xác nhận rằng ở trong bệnh phẩm có vi sinh vật thuộc loại mầm
bệnh trong số các mầm bệnh đã biết hay không thông qua xác nhận sự hiện diện của gen
đặc hiệu loại mầm bệnh này mầm bệnh khác đã được biết đó.
2.3. Phương pháp huyết thanh học
Các phương pháp huyết thanh học dùng để phân biệt các sinh vật hoặc đồng định
chúng thông qua việc đánh giá tính dị biệt hoặc tính đồng dạng của các phân tử tham gia
phản ứng với các kháng huyết thanh hay kháng thể. Bản chất của phương pháp này là lợi
dụng tính đặc hiệu của phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể: "kháng nguyên nào thì
kết hợp với kháng thể nấy". Trong thực tế các phản ứng huyết thanh học có thể giúp phát

hiện kháng nguyên (nếu có sẵn kháng thể đặc hiệu) hoặc phát hiện kháng thể (nếu có sẵn
kháng nguyên).
Việc phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm thường có thể khẳng định sự hiện
diện của mầm bệnh. Tuy nhiên, phản ứng này thường khó khăn hơn so với các phản ứng
phát hiện kháng thể. Phát hiện ra kháng thể cho phép kết luận rằng trong quá khứ động
vật đã bị kháng nguyên xâm nhập (có thể là bị cảm nhiễm hoặc đã được tiêm vacxin).
Như vậy, phát hiện kháng thể trong máu động vật có thể không có ý nghĩa chẩn đoán.
Tuy vậy, nếu thực hiện hai lần xét nghiệm kháng thể (cách nhau một số ngày) trong quá
trình bệnh lâm sàng mà thấy có sự tăng cao hàm lượng (hiệu giá) kháng thể chứng tỏ
bệnh do mầm bệnh (mang kháng nguyên) tương ứng gây ra.
3. Phân lập và đồng định bệnh nguyên
Đồng định mầm bệnh nhằm trả lời câu hỏi có phải bệnh (với những triệu chứng
lâm sàng và đặc điểm bệnh tích đã mô tả) gây ra bởi vi sinh vật nào đó (thuộc loại đã
được biết là gây bệnh) hay không. Hay nói cách khác, đồng định mầm bệnh là xác định
mầm bệnh nghi ngờ có mặt trong bệnh phẩm có thực sự có mặt trong đó hay không. Việc
nghiên cứu là khá đơn giản nếu chỉ có một tác nhân gây bệnh nghi ngờ. Khi đó chỉ cần
trả lời kết quả dương tính hay âm tính. Tuy nhiên, nhiều khi số chủng loại mầm bệnh
thuộc đối tượng nghi ngờ không ít. Khi đó, rất có thể phải áp dụng đồng thời nhiều hướng
nghiên cứu phân lập và các kỹ thuật kiểm định khác nhau (vi sinh vật học, huyết thanh
học, phân tích phát hiện gen đặc hiệu mầm bệnh,...).
3.1. Vi khuẩn
Phân lập và đồng định vi khuẩn mầm bệnh phải dựa trên những hiểu biết trước về
đặc tính của loại mầm bệnh đó bởi vì chỉ có như vậy mới có thể nuôi cấy khởi đầu thành
công cũng như phân lập được vi khuẩn mầm bệnh dưới dạng lứa cấy thuần khiết để có
nguyên liệu cho các xét nghiệm sau đó. Nhiều vi khuẩn phát triển mạnh, có thể hình
thành khuẩn lạc (từ một tế bào ban đầu) sau một ngày đêm (ví dụ, E. coli) nhưng nhiều vi
khuẩn khác lại cần nuôi cấy trong thời gian kéo dài (2 tuần đến 2 tháng đối với trực
khuẩn lao,...) và cũng có vi khuẩn không nuôi cấy được trên môi trường dinh dưỡng nhân
tạo (vi khuẩn bệnh Tyzzer, bệnh phong). Những vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện là
khá thuận lợi cho việc nuôi cấy phân lập nhưng các vi khuẩn yếm khí thường đòi hỏi

những điều kiện không tiếp xúc với khí quyển (Bacteroides, Fusobacterium, Veillonella)
hoặc điều kiện yếm khí của môi trường dinh dưỡng (Clostridium). Cũng có những vi
khuẩn mầm bệnh thường cần phải bồi dưỡng tăng sinh trước khi nuôi cấy phân lập do
mật độ của chúng trong bệnh phẩm thường không cao (Salmonella). Trong nhiều trường
hợp khả năng phân lập trực tiếp mầm bệnh thường thấp do vi sinh vật tạp nhiễm, khi đó
cần sử dụng cơ thể động vật thí nghiệm mẫn cảm làm môi trường tuyển lựa đối với mầm
bệnh. Biện pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm này đòi hỏi phải nắm được tính gây
bệnh của các loại mầm bệnh trong điều kiện thí nghiệm.
Để nuôi cấy khởi đầu thường sử dụng các môi trường đặc thích hợp. Các môi
trường thạch thường, thạch máu thường được sử dụng cho nhiều loại vi khuẩn. Tuy vậy,
đối với nhiều vi khuẩn mầm bệnh có thể sử dụng trực tiếp môi trường phân biệt (như các
môi trường Endo, Istrati, EMB,... cho một số trực khuẩn đường ruột, môi trường muối -
kiềm cho các Vibrio, môi trường Lowenstein với trực khuẩn lao,...). Với vi khuẩn hiếu
khí, bằng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ bệnh phẩm phết lên một vị trí trên bề mặt
môi trường nuôi cấy khởi đầu rồi cũng bằng que cấy đó, hoặc một que cấy vô trùng khác,
từ vị trí vết bôi vạch lên bề mặt môi trường đó đường gấp khúc không chồng lên nhau và
càng dài càng tốt. Sau khi ủ ở điều kiện thích hợp từ môi trường đó, đặc biệt ở những
vùng cuối cùng của đường vạch có mật độ vi khuẩn thấp, ta có thể thu được những khuẩn
lạc riêng rẽ có những dấu hiệu đặc trưng đối với vi khuẩn mầm bệnh cần đồng định.
Chọn một số khuẩn lạc đại diện để nuôi cấy tiếp trên môi trường đặc mới để có lứa cấy
thuần khiết dưới dạng những khuẩn lạc riêng rẽ hoặc canh khuẩn lỏng. Chú ý rằng trên
môi trường tuyển lựa có thể có những tế bào vi khuẩn khác loại không thể hình thành
khuẩn lạc nhưng vẫn sống và có thể phát triển trên môi trường khác và, vì vậy, cần tránh
để que cấy chạm vào bề mặt môi trường một cách không cần thiết.
Để đồng định cần vận dụng các thử nghiệm thích hợp như nghiên cứu hình thái,
tính chất bắt màu Gram,... các tính trạng sinh lý (phát triển trên môi trường nghèo hoặc
có chứa một số chất nhất định ở một nồng độ nhất định như muối mật, mật, NaCl,
KCN,...), các tính trạng sinh hóa (chuyển hóa các chất như lên men đường có sinh hơi
hoặc không sinh hơi, hình thành axit hữu cơ, acetoin,... sản sinh ureaza, sinh indol,...),
tính gây bệnh đối với động vật, với phôi gà và lứa cấy tế bào (vero,...), thành phần protein

tế bào, cấu trúc kháng nguyên,...
3.2. Virut
Việc nuôi cấy phân lập virut đòi hỏi phải có môi trường tế bào sống như động vật
thí nghiệm, lứa cấy tế bào tổ chức, trứng gà đang phát dục (phôi gà) với một số xử lý đối
với bệnh phẩm. Bệnh phẩm được nghiền nhỏ, pha với nước sinh lý cho có đủ độ loãng
nhất định, thêm chất kháng sinh (thường là penicillin và streptomycin) để diệt vi khuẩn.
Để loại bỏ vi khuẩn, có thể lọc bệnh phẩm đã nghiền (thường với cát vô trùng để tăng khả
năng giải phóng virion) qua lọc vi khuẩn (đường kính lỗ khổng <0,22 μm) rồi cấy vào
môi trường lứa cấy tế bào một lớp, phôi gà hoặc động vật thí nghiệm. Với động vật thí
nghiệm cần theo dõi thường xuyên các triệu chứng lâm sàng, sau đó mổ kiểm tra bệnh
tích, dựa trên các triệu chứng và bệnh tích điển hình mà khẳng định sự phát triển của
virut. Nếu không có biểu hiện lâm sàng và bệnh tích, cần thực hiện phản ứng huyết thanh
học để phát hiện và trắc định kháng thể, so sánh hai kết quả hàm lượng (hiệu giá) kháng
thể trước và sau quá trình theo dõi vật sau tiêm truyền có thể khẳng định về sự phát triển
của virut trong cơ thể động vật.
Ở lứa cấy tế bào, nhiều loại virut gây hiệu quả bệnh lý tế bào (CPE) hay bệnh tích
tế bào. Dựa vào CPE đặc trưng ta có thể xác nhận được sự phát triển của virut phát triển
trong lứa cấy tế bào tổ chức. Nếu không biểu hiện CPE có thể kiểm tra sự hiện diện của
kháng nguyên bằng phản ứng huyết thanh học.
III. Chẩn đoán huyết thanh - miễn dịch học
1. Phương pháp huyết thanh học
Phương pháp huyết thanh học giúp ta phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trên
cơ sở phát hiện sự hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể khi trộn một thành phần
đã biết (kháng nguyên hoặc kháng thể) với một dịch nghi có chứa yếu tố kia (kháng thể
hoặc kháng nguyên). Phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm chứng tỏ con vật bị cảm
nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng. Tuy nhiên, phản ứng phát hiện kháng
nguyên thường có độ nhạy thấp và khó có được bệnh phẩm thích hợp đặc biệt khi động
vật còn sống. Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát hiện kháng thể. Phản ứng
này có nhược điểm là khó giải thích kết quả phản ứng. Kết quả dương tính thường nói
rằng trong quá khứ cơ thể động vật đã tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa có thể

do cảm nhiễm tự nhiên, vừa có thể do đã được tiêm phòng. Bên cạnh đó, cảm nhiễm tự
nhiên cũng có thể là thui, mầm bệnh chỉ kích thích miễn dịch nhưng sau đó không tồn tại
trong cơ thể. Như vậy, ngay cả khi đã loại trừ trường hợp đáp ứng miễn dịch do vacxin
thì nếu giết hủy loại thải những con vật kháng thể dương tính thì vẫn có thể là lạm sát.
Tuy nhiên, trong trường hợp bệnh tiến triển nếu lấy máu kiểm tra kháng thể hai lần mà
thấy có sự gia tăng lượng kháng thể chứng tỏ bệnh do mầm bệnh tương ứng đang tiến
triển.
Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là
đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành thường khó phát hiện
nếu không có những thủ thuật thích hợp. Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp
phân tích khác nhau. Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp
kháng nguyên - kháng thể. Ngoài ra, các phản ứng định lượng (thường bán định lượng)
như xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá đáp ứng miễn dịch
tập đoàn.
1.1. Phản ứng kết tủa
Phản ứng kết tủa là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có
kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua
việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là
chất tan.
Do kháng nguyên là chất tan nên phản ứng dù xảy ra cũng có thể không được
nhận biết bởi vì tổ hợp kháng nguyên kháng thể sau khi hình thành có thể hòa lẫn (xáo
trộn) cùng với dung dịch do tác động của dòng đối lưu. Để khắc phục, phản ứng này
được thực hiện trong điều kiện giảm thiểu dòng đối lưu của dung dịch. Có thể thực hiện
phản ứng kết tủa trong ống nghiệm nhỏ và trong keo (gel) agar (hoặc agarose).
Với ống nghiệm nhỏ người ta cho kháng nguyên (dịch chiết từ bệnh phẩm, phải
trong suốt) vào ống sau đó bằng ống hút (pipet) có đầu nhỏ lấy một lượng tương đương
kháng huyết thanh (kháng thể), đưa đầu ống pipet vào sâu tận đáy ống nghiệm rồi nhả từ
từ cho kháng huyết thanh đội dần lớp kháng nguyên lên. Kết quả ta có hai lớp dịch trong
ống. Để yên ở nhiệt độ phòng, sau một thời gian (vài chục phút) nếu có phản ứng xảy ra
ta sẽ thấy một vòng kết tủa màu trắng gần giữa hai lớp dịch (thường thấp hơn ranh giới

giữa hai lớp dịch một chút). Kỹ thuật này thường dùng phát hiện kháng nguyên giáp mô
vi khuẩn nhiệt thán (phản ứng Ascoli).
Phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch có một số biến thể: khuyếch tán một
chiều, khuyếch tán hai chiều. Kỹ thuật khuyếch tán một chiều ít được sử dụng do phải
tiêu tốn lượng lớn yếu tố phản ứng (kháng huyết thanh hoặc kháng nguyên). Người ta pha
thạch (agar hoặc agarose) vào dung dịch sinh lý NaCl 0,8 - 0,85% (pH 7,2) ở nồng độ
thạch khoảng 1% (0,8 - 2,0% agar, phụ thuộc vào chất lượng thạch, có thể kiểm tra bằng
thực nghiệm), đun tan chảy đều rồi ủ duy trì ở 50 °C. Ở nhiệt độ này thạch ở trạng thái
lỏng, có thể cho vào đó một lượng kháng nguyên (hoặc kháng thể), trộn đều rồi đổ thành
bản thạch trên phiến kính (hoặc trong đĩa Petri), đục lỗ, mỗi lỗ cho một loại mẫu cần xét
nghiệm. Nhỏ vào đó một lượng kháng thể (hoặc kháng nguyên). Ủ vào buồng ẩm ở nhiệt
độ phòng hoặc 4 °C. Sau một thời gian nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy vòng kết tủa
trắng xuất hiện quanh lỗ tương ứng.
Phản ứng kết tủa khuyếch tán hai chiều được thực hiện một cách đơn giản nhất
với hai lỗ nhỏ được đục trong khối thạch agarose, một lỗ chứa kháng nguyên còn lỗ kia
chứa kháng thể. Ủ trong buồng giữ ẩm một số ngày và theo dõi hàng ngày, nếu phản ứng
xảy ra ta sẽ thấy đường kết tủa trắng xuất hiện giữa hai lỗ (ở vùng có tỷ lệ hóa trị kháng
thể và hóa trị kháng nguyên xấp xỉ 1). Tuy nhiên, phản ứng này thường có độ nhạy rất
thấp do đó cần vận dụng phương pháp cải tiến như dưới đây.