Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc (luận văn thạc sĩ)

IH
TRƢ

QU

GI H N I

Ọ

Ọ TỰ

-----------------------

UYỄ VĂ DŨ

ỨU
M

E MÃ

ỘT B Ế

U

ÓA PROTEASE HIV
Á

VĂ T

S

ội - 2011

1

T UỐ

Ọ


MỤ

Ụ

MỞ ẦU .................................................................................................................... 1
hƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 8
1.1. Giới thiệu chung về HIV ............................................................................... 8
1.1.1. HIV/AIDS ................................................................................................. 8
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS ................................................................... 10
1.1.3. Phương pháp điều trị HIV/AIDS ............................................................ 11
1.2. Protease của HIV-1 ...................................................................................... 12
1.2.1. Cấu trúc của protease HIV-1 .................................................................. 12
1.2.2. Chức năng của protease HIV-1 .............................................................. 15
1.2.3. Gen mã hóa protease HIV- 1 .................................................................. 12
1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp ................................................................ 17
2.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 20
2.1.1. Các hệ vector và chủng vi sinh vật ......................................................... 20
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................. 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 20
2.2.1. Tách chi t RN hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA ............................... 20
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus .............................................................. 21

2.2.2. Tách chi t và định lượng DNA .............................................................. 21
2.2.3. iện di DNA trên gel agarose ................................................................ 22
2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR ........................................... 23
2.2.5. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1 ........................................ 24
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phương pháp
Sanger ............................................................................................................... 25
2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli ..................................... 26
2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)........... 28
2.2.9. iện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-P GE) theo phương
pháp của Laemmli ............................................................................................ 28
2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western
blotting) ............................................................................................................ 29

2


2.2.11. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phương pháp của Rich rd
và tập thể........................................................................................................... 30
3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 .. 32
3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 ............................... 32
3.1.2. Phát hiện đột bi n kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1
( ột bi n N83T) ............................................................................................... 33
3.2. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến
N83T trong vector pET32a ................................................................................ 35
3.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và bi n nạp vào t bào E.
coli chủng DH5 .............................................................................................. 37
3.2.4. Cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 m ng đột bi n N83T trong vi khuẩn E.
coli BL21 (DE3) RIL ......................................................................................... 44
3.2.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-bind ..................... 46
KẾT LU N .............................................................................................................. 50

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51

3


ẢM Ơ
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, người thầy đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo
thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô
giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến
thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị Hồng Loan đã tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ, nghiên cứu sinh, học
viên, sinh viên thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein,
đặc biệt là Phòng Protein tái tổ hợp, những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có
thể hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp,
những người đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi để hoàn thành luận văn này.
Luận văn được thực hiện với kinh phí của đề tài mã số KLEPT.09.01.
Hà Nội, ngày 17 tháng 12 năm 2011
ọc viên

guyễn Văn Dũng

4

BẢ
APS

Ữ V ẾT TẮT

Ammonium Persulphate

bp

ặp b zo (b se p ir)

BSA

lbumin huy t th nh bò (Bovine Serum lbumin)

CBB

Coomassie Blue Brillant

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

ddNTP

Dideoxyribonucleoside triphosphate

dd H2O

Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O)

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EtBr

Ethidium Bromide

IPTG

Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

kb

Kilobase

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

MCS

Multiple Cloning Sequence

OD

Mật độ qu ng học (Optic l Density)

PAGE

iện di gel poly cryl mide (Poly ryl mide Gel Electrophoresis)

PBS

Muối chứ đệm phosph te (Phosph te Buffered Saline)

PCR

Phản ứng chuỗi polymer se (Polmer se h in Re ction)

PMSF

Phenyl Methylsulphonyl Fluoride

PVDF

Polyvinylidene fluoride

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

Tris base-Acetic-EDTA

TEMED

N, N, N’, N’-Tetramethyl-Ethylenediamine

5


MỞ ẦU
Virus suy giảm miễn dịch ở người (Hum n immunodeficiency virus - HIV)
là nguyên nhân chính gây r hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ( cquired
Immunodeficiency Syndrome -

IDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy

hiểm nhất hiện n y. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất h i type HIV gây nên
IDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên
nhân chính gây r

IDS trên toàn th giới.

Theo số liệu củ Tổ chức Y t Th giới, tính đ n cuối năm 2009 có khoảng 33,3
triệu người đ ng sống chung với HIV/ IDS, khoảng 1,8 triệu người đã ch t vì

IDS

và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt N m, theo báo cáo ục
phòng chống HIV/ IDS - Bộ Y t tính đ n 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người
nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố.
Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân IDS là 94.613 người,
số trường hợp tử vong đ n cuối kỳ báo cáo là 49.912 người.
Trong chu trình sống củ HIV-1, protease là enzyme không thể thi u.
Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (g g, g g-pol) tại những vị trí nhất định để
tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thi t cho virus hoàn chỉnh. Vì th
prote se được xem là một trong các đích tác động qu n trọng nhất cho liệu pháp tìm
r thuốc điều trị HIV/ IDS. Tuy nhiên, do HIV s o chép nh nh, enzyme phiên mã
ngược có tỷ lệ s i sót c o tạo r sự bi n đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen củ các
nhóm HIV dẫn đ n tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức ch
prote se chống HIV được sản xuất và thương mại hó nhưng việc tìm các chất ức
ch mới củ prote se vẫn luôn được qu n tâm.
Bên cạnh đó, các đột bi n kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc
riêng biệt, do đó th y th một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột bi n thì
các phác đồ s u vẫn thành công (Hoffm nn và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm
kháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột bi n trong gen mã hó prote se HIV
có v i trò rất qu n trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/ IDS.

6


Ở Việt N m, gen mã hó prote se HIV m ng đột bi n kháng thuốc là vấn đề
còn ít được nghiên cứu. ác nghiên cứu chủ y u tập trung vào xác định nhóm virus
gây bệnh chủ y u ở người Việt N m và tìm r một số đột bi n liên qu n kháng
thuốc.

ặc biệt, chư có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hó prote se HIV

mang đột bi n kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người Việt N m.
ề tài nghiên cứu củ chúng tôi được đặt r là nhằm phát hiện một số đột
bi n kháng thuốc trong gen mã hó củ prote se củ HIV, đồng thời bước đầu biểu
hiện gen này trong vi khuẩn E. coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu ti p theo.
ác nghiên cứu củ luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng
điểm

ông nghệ Enzym và Protein, Trường

Quốc gi Hà Nội.

7

ại học Kho học Tự nhiên,

ại học


hƣơng 1: TỔ
1.1.

iới thiệu chung về

QU

TÀ

ỆU

V

1.1.1. HIV/AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là IDS, do virus HIV
gây r sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đ n n y đã
trở thành “căn bệnh th kỷ” trên toàn th giới.
Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ
Retroviridae với h i type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2),
trong đó HIV-1 gây r 98% sự l n truyền còn HIV-2 chỉ chi m ưu th ở vùng tây
châu Phi, ít l n truyền trên th giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên
nhân chính gây nên AIDS.
HIV-1 được chi thành 3 nhóm là M (m in), O (outlier), nhóm N (new) trong
đó hơn 90% sự lây nhiễm củ HIV thuộc nhóm M. Trong nhóm M gồm các phân
nhóm

, B,

, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circul ting

recombinant form- RF).

ác phân nhóm khác nh u chủ y u ở cấu trúc củ các

protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực đị lý.

ây là một đặc

điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm r thuốc điều trị cho các bệnh nhân
HIV/ IDS theo từng khu vực [14].
Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô
tả ở hình 1. Lớp vỏ ngoài cùng củ virus HIV b o gồm một lớp màng lipid kép có

nguồn gốc từ t bào chủ, trên lớp vỏ này có chứ khoảng 72 bản s o protein env củ
virus, mỗi protein env lại chứ một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân
được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ b o ngoài.
Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản s o củ protein p24. Trong lõi
b o gồm hệ gen củ HIV là h i sợi RN

(+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10

kb gồm 9 gen mã hó cho 15 protein khác nh u. uối mỗi chuỗi RN

là các trình

tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng v i trò trong việc kiểm soát
sự nhân lên cũng như điều hò quá trình tổng hợp protein củ virus. Giống như các
retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham

8


gi vào quá trình s o chép và trưởng thành củ virus. Sản phẩm b n đầu củ gen
gag là một protein 56 kD , s u đó được ch bi n thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24
và p15 là các protein cấu trúc củ virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse
tr nscript se (RT), intergr se và prote se trong đó enzyme RT có chức năng phiên
mã ngược RN

củ virus thành cDN ; enzyme intergr se chèn cDNA vào nhiễm

sắc thể củ t bào chủ còn prote se th m gi vào quá trình cắt các phân tử protein
tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự
hình thành củ thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid củ virus; sản

phẩm củ gen env (gp160) được cắt bởi prote se củ t bào chủ thành gp120 và
gp41 s u đó lắp ráp lại thành cấu trúc t m phân trong lớp vỏ virus. Ngoài 3 gen
chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứ thông tin mã hó
cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nh u
hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nh u [5, 17, 22].

ình 1: ấu tạo của

V [40]

HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, b o gồm con đường tiêm truyền do
dùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm củ máu, từ mẹ bị
nhiễm bệnh s ng th i nhi và qu qu n hệ tình dục không an toàn [1, 15].
Quá trình ti n triển củ bệnh được chi thành 3 thời kì. Sự lây nhiễm HIV
b n đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, s u đó virus đi
khắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp

9


nào được phát hiện [1, 7, 15]. Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng như cảm cúm,
hạch lympho sưng to, cũng có khi không thấy triệu chứng gì. Ti p theo là gi i đoạn
tiềm ẩn kéo dài từ 1 đ n 12 năm (tùy theo từng người nhiễm). Trong gi i đoạn này,
quá trình s o chép củ virus giảm và số lượng t bào lympho T D4+ tăng lên, virus
HIV có thể được phát hiện bằng P R hoặc RT-P R trong các lympho củ máu và
trong các mô bạch huy t [1]. Khoảng vài năm s u, mật độ các virus trong máu tăng
nh nh và giữ ở mức đó cho tới lúc ch t, các kháng thể kháng virus giảm dần. Gi i đoạn
này gọi là gi i đoạn toàn phát h y gi i đoạn cuối. Lúc này hội chứng lâm sàng củ bệnh
suy giảm miễn dịch xuất hiện, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công, người bệnh
ch t dần [7, 16, 28].

Chính những đặc trưng phân tử trong cách tấn công hệ thống miễn dịch
của HIV mà AIDS trở thành một trong những bệnh nguy hiểm nhất trong lịch
sử loài người.
1.1.2. Tình hình nhiễm

V/

DS

ại dịch HIV/ IDS đã và đ ng là một thách thức to lớn đối với ti n trình
phát triển xã hội. S u gần 3 thập kỷ phát hiện, bắt đầu ở các nước phát triển, HIV/
IDS đã l n rộng trên toàn th giới, đặc biệt phát triển ở khu vực châu Phi và các nước
châu Á.

n n y vẫn chư có v ccine phòng ngừ HIV và thuốc chữ trị đặc hiệu.

Theo thông báo củ Tổ chức y t th giới (WHO) và hương trình phối hợp
phòng chống

IDS củ Liên hiệp quốc (UN IDS) đ n cuối năm 2009 ước tính

khoảng 33,3 triệu người đ ng m ng căn bệnh HIV/ IDS, trong đó số đối tượng mới
là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã ch t vì

IDS. Tại khu vực

châu Á, có khoảng 4,87 triệu người đ ng sống cùng với HIV/ IDS ở các khu vực
ông N m và N m Á; tình hình phát triển củ bệnh này ngày càng tăng với những
diễn bi n phức tạp. Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm củ đại dịch
HIV/ IDS trong vài thập kỉ tới [37].

Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đ n ngày 30/9/2010 trên cả nước có
180.631 trường hợp nhiễm HIV/ IDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng
số người ch t vì AIDS được báo cáo là 48.368.

10

ho đ n n y, đã có trên 74% xã,


phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS.
Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là đị phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất
với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước. Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy,
trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có
49% bị nhiễm qu đường máu, 38% qu đường tình dục, 3% qu đường mẹ - con và
10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chi m 70,8% và nữ giới chi m
29,2%. Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9 tháng qua ở tuổi từ 20-39
(chi m 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chi m gần 3%. Theo đánh giá chung, tình hình
nhiễm HIV/ IDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong gi i đoạn
tập trung – xảy ra chủ y u trong các nhóm có hành vi nguy cơ c o, đặc biệt trong
nhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm.
Do những hậu quả to lớn củ đại dịch HIV/ IDS đối với sự phát triển xã hội
trên phạm vi toàn cầu, việc tìm r v ccine phòng ngừ hiệu quả và thuốc đặc trị cho
căn bệnh này là vấn đề cấp thi t đối với các nhà kho học y học và sinh học phân tử.
1.1.3. Phƣơng pháp điều trị

V/

DS

ách điều trị HIV/ IDS phổ bi n nhất là dùng thuốc chống virus, đây là

thuốc có tác dụng ức ch sự phát triển và nhân lên củ HIV ở những gi i đoạn khác
nh u trong vòng đời củ virus. Hiện tại có một số nhóm chất chống HIV đ ng được
sử dụng dự trên cơ ch tương đồng về cấu trúc dẫn đ n cạnh tr nh hoạt động.
húng được chi thành 5 nhóm chính gồm: các chất có bản chất nucleoside (NRTI)
ức ch enzyme phiên mã ngược RT, các chất ức ch prote se (PI), các chất ức ch
enzyme phiên mã ngược không phải loại nucleoside (NNRTI), các chất ức ch
enzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) và các chất ức ch hò nhập
không cho virus nhân bản. HIV/ IDS còn có thể được điều trị bằng các thuốc điều
hò miễn dịch như lph -interferon, interleukin 2, loprin sine với tác dụng tăng
cường khả năng bảo vệ hệ miễn dịch. Ngoài r , bệnh nhân HIV/ IDS còn có thể
được điều trị với một số thuốc phòng ngừ các bệnh cơ hội [15].

11


Tuy nhiên, do HIV có tỷ lệ đột bi n c o dẫn đ n tình trạng kháng thuốc và
việc sử dụng thuốc điều trị trong thời gi n dài dẫn đ n các tác dụng phụ. hính vì
vậy, hướng nghiên cứu tìm r các loại thuốc chống HIV/ IDS mới cũng như liệu
pháp điều trị bằng cách k t hợp các loại thuốc khác nh u đã và đ ng là vấn đề cấp
bách hiện n y.
1.2. Protease của

V-1 (gọi tắt l protease

V-1)

Protease HIV-1 là một enzyme không thể thi u trong chu trình sống củ
virus. Prote se cần thi t để phân cắt các tiền chất polyprotein virus g g và g g-pol
thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành củ virus
[39]. ác nghiên cứu cho thấy, khi ức ch hoạt tính củ prote se hoặc gây đột bi n

trên gen mã hó cho prote se, các hạt virus được hình thành nhưng không có khả
năng xâm nhiễm vào t bào vật chủ [19]. Với v i trò đặc biệt qu n trọng như trên,
protease HIV-1 là một trong các đích nghiên cứu nhằm tìm r loại thuốc ngăn chặn
sự nhân lên củ HIV.
1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1
Hệ gen củ HIV-1 nằm trong phần lõi củ virus và b o gồm h i sợi RN

(+)

đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hó cho 15 protein khác nh u.
Trên mỗi sợi RN có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩ “groupantigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymer se” và env là “envelope” (vỏ).

ác

gen gag và env mã hó cho nucleoc psid và glycoprotein củ màng virus; gen pol mã
hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có
6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RN 9 kb (Hoffm nn và tập thể, 2007).
Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được
tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000
base) dẫn đ n tình trạng kháng thuốc phổ bi n ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm
chí khi chư dùng thuốc. Nghiên cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng RF01_ E
thất bại trong điều trị H

RT ở Nonth buri, Th il nd được đăng ký trên GenB nk

với số hiệu từ FJ463512- FJ463596, phát hiện các đột bi n phụ (minor) kháng thuốc

12

PI là M36I và H69K ở hầu h t các bệnh nhân, I13V, E35D và L89M ở hơn 84% các
bệnh nhân được điều trị TV, TV/r, IDV/r, NFV, TPV/r.
ác nghiên cứu về gen mã hó prote se HIV-1 ở Việt N m chủ y u tập trung
vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ y u ở người Việt N m và tìm r một số đột bi n
liên qu n đ n tính kháng thuốc. Năm 2003, Nguyễn Hoàng L n và tập thể [21] đã ti n
hành đọc trình tự các gen mã hó RT, prote se và env trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1
ở miền N m, chủ y u là ở thành phố Hồ hí Minh. 198 trong số 200 bệnh nhân nghiên
cứu thuộc phân nhóm

RF01_ E. Nghiên cứu cũng xác định được 6,5% đột bi n

kháng thuốc chính khi sử dụng H

RT đối với 200 bệnh nhân này. Ishiz ki và tập thể

[15] cũng ti n hành đọc trình tự gen mã hó prote se và RT trên đối tượng các bệnh
nhân nhiễm HIV-1 ở Hải Phòng. Phân tích hình thái di truyền củ hơn 1.000 bệnh nhân
cũng cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh củ y u là

RF01_ E (chi m 98,3%).

Phân tích đột bi n kháng thuốc trên 294 bệnh nhân đã chỉ r có 0,3% đột bi n liên qu n
đ n kháng thuốc ức ch prote se tại vị trí M46I.
Trong các đột bi n kháng thuốc thì phổ các đột bi n kháng PI rất rộng có thể
do sự đ hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease.
Mặc dù có sự kháng chéo từ mức độ vừ đ n mức độ cao giữ các PI, các đột bi n
chính là tương đối đặc hiệu cho từng thuốc riêng biệt. Phần lớn các dữ liệu về đột
bi n chính phát sinh từ các bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI th hệ thứ
nhất).

ột bi n chính rất hi m gặp ở các phác đồ điều trị bằng PI tăng cường

(Hoffmann và tập thể, 2007). Khi điều trị s quin vir không tăng cường chủ y u xảy
r đột bi n G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; n u kèm thêm đột
bi n L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100 lần (Jacobsen
và tập thể, 1995). Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột bi n L10I/R/V,
G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm hiệu
lực củ s quin vir tăng cường (Valer và tập thể, 2002).
1.2.2. ấu trúc của protease

V-1

ó nhiều cách phân loại prote se, dự vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide,
prote se được chi

thành h i nhóm chính: exopeptid se và endopeptid se.

Exopeptid se cắt liên k t peptide ở gần đầu N hoặc đầu

13

củ cơ chất, trong khi đó


endopeptid se cắt liên k t peptide nội chuỗi. Dự vào cấu trúc củ “nhóm chức” có
mặt trong trung tâm hoạt động, prote se lại được chi thành bốn nhóm chính:
prote se serine, prote se sp rtyl, prote se cysteine/thiol và prote se chứ kim loại
(metallo protease), ti p đó prote se lại ti p tục được phân chi thành nhiều họ khác
nh u dự vào trình tự xit amin [34]. Theo cách phân loại này, protease HIV-1 là
một protease aspartyl hay protease axit.

N vi và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo được
cấu trúc tinh thể củ prote se HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc củ prote se
đã được nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liên
k t với các chất ức ch . Prote se HIV-1 là một dimer, chứ h i tiểu phần giống hệt
nh u được sắp x p gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng
11 kD gồm 99 xit min (Hình 2). Sự tương tác giữ chúng tạo thành cấu trúc
không gi n với 3 miền (dom in) chính quy t định chức năng và các tính chất khác
củ prote se HIV-1 [39].

ầu tiên là miền k t thúc (termin l dom in) gồm phi n

gấp n p β được tạo thành từ 4 đầu cuối củ cả 2 tiểu phần ( xit min 1-4 và 90-95
củ mỗi tiểu phần), vòng qu y tạo thành từ các xit min 4-9 và vòng xoắn α (các
axit amin 86-94 củ mỗi tiểu phần). Miền này khá qu n trọng trong việc hình thành
và ổn định dạng dimer củ một prote se có hoạt tính. Ti p theo là 2 miền lõi (core
dom in) với sự th m gi củ các xit min từ 10-32 và 63-85 củ mỗi tiểu phần.
Trung tâm hoạt động củ enzyme với một trình tự bảo thủ c o Asp25-Thr26-Gly27
được tạo thành ở mặt phân giới củ các miền lõi từ cả 2 tiểu phần. Miền lõi có tính
quy t định đối với sự ổn định củ dimer cũng như hoạt tính xúc tác củ prote se.
Miền cuối cùng còn được gọi là “mũ” (fl p dom in) gồm một vòng được ti p xúc
phần lớn với dung môi (gốc 33-43) trước một cấu trúc cặp tóc có chứ mũ (các xit
amin 44-63). ác chất ức ch hoặc cơ chất liên k t giữ h i tiểu phần bằng liên k t
hydro và tương tác V n der W ls với vị trí hoạt động gồm h i bộ b đặc trưng và
h i mũ linh hoạt.

ác mũ gấp xuống cơ chất hoặc các chất ức ch và hoạt động

trong suốt quá trình xúc tác cùng với việc liên k t cơ chất cũng như loại trừ phân tử

14

nước từ vị trí hoạt động. ó một phân tử nước được giữ lại hình thành nên cầu nối
giữ chất ức ch và nhóm –NH- củ Ile 50/50’ –NH- ở các mũ. Phân tử nước này
rất thi t y u cho sự thủy phân củ prote se và có thể bị th y th bởi một nhóm
c cbonyl có trong một chất ức ch thích hợp nào đó. ác nghiên cứu cũng đã chứng
minh rằng các mũ của protease thực sự mềm dẻo và tính chất mềm dẻo này có thể
qu n trọng đối với hoạt tính củ enzyme. N u đột bi n xuất hiện ở vị trí mũ có thể
làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme [11, 39].

ình 2: ấu trúc không gian của protease HIV-1 [39]

1.2.3. hức năng của protease

V-1

Protease là enzyme không thể thi u có v i trò qu n trọng trong quá trình tái
bản củ HIV-1. Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu
trúc, có chức năng cần thi t cho virus trưởng thành.

ụ thể, protease HIV-1 nhận

bi t 9 trình tự peptide khác nh u trên polypeptide gag để tạo r các protein cấu trúc:
matrix, capsid, nucleocapsid cùng với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1
và p6 có v i trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái củ lớp vỏ trưởng
thành; thủy phân polypeptide g g-pol tạo thành 3 enzyme: protease, RT và

15

intergr se cần thi t cho quá trình s o chép củ virus HIV và thủy phân polypeptide
env thành các protein vỏ gp120 và gp41 củ HIV-1 [4, 39] (Hình 3).
Mặc dù, các t bào ở động vật có vú cũng có protease aspartyl và các
prote se khác nhưng chúng không có khả năng phân cắt các polyprotein g g, g gpol như prote se củ HIV-1. Ngoài ra, protease HIV-1 không những cắt các
polyprotein củ chính nó mà còn thủy phân rất nhiều protein củ vật chủ như ctin,
Bcl2, procaspase 8 [29].

ây chính là cơ sở để tạo r các cơ chất đặc hiệu của

protease HIV-1 [4].

Hình 3: Sơ đồ phân cắt polyprotein gag v gag-pol của

V-1 để hình th nh

các protein chức năng [39]

Hoạt tính của protease HIV-1 bị ức ch bởi pepstatin A [21] giống như các
protease aspartyl khác. Khi ức ch hoạt tính củ prote se hoặc gây đột bi n trên gen
mã hó cho prote se, các hạt virus được hình thành nhưng không đóng gói phù hợp
để tạo thành thể virus trưởng thành, nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào
t bào vật chủ. Ngoài ra, protease HIV-1 còn đóng v i trò trong quá trình phát sinh
bệnh. Khi chuyển vào t bào người hoặc virus, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiều
protein củ vật chủ như ctin, Bcl2 và proc sp se 8.

ác nghiên cứu cũng khẳng

định, sử dụng các chất ức ch prote se có thể ngăn chặn hiện tượng ch t theo
chương trình do protease HIV-1 gây nên [34].

16


1.2.4. Tạo protease

V-1 tái tổ hợp

Do v i trò qu n trọng củ prote se HIV-1, việc sản xuất và tinh sạch với
lượng đủ lớn enzyme này là cần thi t cho các nghiên cứu nhằm phát triển các loại
thuốc ức ch prote se trong điều trị bệnh HIV/ IDS. hính vì vậy từ khi HIV được
phát hiện cho đ n n y đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất prote se HIV1 bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E. coli hoặc trên nấm men Saccharomyces
cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hó học monomer 99 xit min. Tuy nhiên, quá
trình sản xuất prote se HIV-1 gặp nhiều trở ngại trong việc biểu hiện và tinh sạch.
Năm 1989, D rke và tập thể [8] đã sử dụng promoter trp củ vector pPRT để
biểu hiện prote se HIV-1. Prote se s u khi được tinh sạch qu hệ thống cột DE Esephadex A-25 và phosphocellulose có khối lượng khoảng 11 kD , b o gồm 99 xit
min, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng như phân cắt cơ
chất tổng hợp. K t quả nghiên cứu tính chất cũng cho thấy, hoạt tính củ prote se
tinh sạch bị ức ch bởi pepst tin

và khi gây đột bi n th y

sp-25 thành Asn-25,

prote se chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng prote se nguyên bản b n đầu.
Năm 1990, heng và tập thể [6] đã sử dụng t bào E. coli JM105 đồng nhiễm
với ph ge α E6 để biểu hiện và tinh sạch prote se HIV-1 với số lượng lớn. Prote se
HIV-1 thu được chủ y u ở dạng thể vùi, s u đó được hò t n bằng ure 8 M, tinh sạch
qu cột lọc gel

54 rồi được hồi tính để thu được dạng hoạt động và thử hoạt tính

với cơ chất tổng hợp. K t quả, prote se HIV-1 được tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ
1 lít môi trường nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450
nmol/phút/mg protein, một bước tinh sạch qu cột ti p theo làm tăng hoạt độ lên 800
nmol/phút/mg. Khi so sánh với prote se HIV-1 thu được từ các điều kiện không bi n
tính cho thấy prote se ở dạng bi n tính s u đó sẽ được hồi tính hiệu quả.
Năm 1992, R ngw l và tập thể [32] đã biểu hiện prote se HIV-1 ở vi khuẩn
E. coli và thu được prote se tái tổ hợp chi m từ 8 đ n 10% protein tổng số củ t
bào bằng cách th y đổi một số thông số như: promoter; sử dụng các codon ư thích
đối với E. coli; thêm trình tự giàu

+T ở vùng 5’ mã hoá; gen được biểu hiện dưới

dạng protein dung hợp với h i trình tự tự cắt trong t bào.

17


Leuthardt và Roesel [23] đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch prote se HIV1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E. coli. Bằng hệ thống biểu hiện
này, prote se được gắn thêm 3 gốc Histidine (His) ở đầu cùng N và đầu cuối

để

thuận tiện cho quá trình tinh sạch. Nghiên cứu cho thấy 90% prote se HIV-1 sau
biểu hiện thu được ở phân đoạn k t tủ (pellet) củ t bào vi khuẩn và được hò t n
hiệu quả bằng đệm ly giải có gu nidine 6 M. S u khi tinh sạch bằng hệ thống cột
tr o đổi nion và sắc ký ái lực Ni- g rose, prote se tái tổ hợp được hồi tính và có
hoạt tính cắt cơ chất g g p55 củ HIV-1 và cơ chất tổng hợp đặc hiệu giống như
prote se tự nhiên.
Năm 2007, hen và tập thể [5] đã sử dụng hệ thống biểu hiện bên ngoài t

bào (E. coli cell-free system) củ hãng Roche, Grenz cherstr sse (Thụy Sỹ) để biểu
hiện trực ti p prote se HIV-1 trong điều kiện in vitro.

ể nhân bản DN

cho biểu

hiện protein in vitro, h i phản ứng P R đã được ti n hành. Phản ứng P R thứ nhất
nhân bản đoạn gen mã hó prote se HIV-1 đặc hiệu. Trong phản ứng P R thứ h i,
C-terminal His-t g và các nhân tố điều hò cần thi t cho biểu hiện protein ở hệ
thống t bào nhân sơ dự trên T7 polymer se (T7 promoter, vị trí liên k t ribosome
củ vi khuẩn, T7 termin tor, mã mở đầu, mã k t thúc) được bổ sung vào. Sản phẩm
P R cuối cùng có thể biểu hiện trực ti p protein không cần bất kỳ bước tinh sạch
nào. Phân tích phân đoạn hò t n và không t n củ hệ thống biểu hiện bằng điện di
protein cho thấy thu nhận được prote se mong muốn chủ y u ở phân đoạn hò t n.
Khi được biểu hiện ở E. coli, protease HIV-1 có khả năng gây độc gi t ch t t
bào [34].

ể hạn ch tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu

hiện prote se HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện và quy trình biểu hiện
khác nh u như sử dụng các promoter trp, λPL, T7, araBAD và tac [8, 18, 35]. Nghiên
cứu biểu hiện prote se dưới dạng dung hợp với nhiều protein khác nh u để tăng tính
t n củ prote se như -galactosidase, dihydrofolate reductase, -lactamase, maltose
hoặc gắn với phân tử IgG [10, 24, 35]. Prote se được liên k t với IgG bởi liên k t
peptide Asp-Pro, liên k t này không bị cắt bởi prote se củ virus. Protein dung hợp
có khối lượng phân tử 25,4 kD vẫn có hoạt tính xúc tác, cắt cơ chất peptide tại đúng

18

vị trí liên k t Tyr-Pro. Prote se nguyên bản có thể được thu lại bằng cách ủ prote se
dung hợp với xit formic, cắt liên k t Asp-Pro [10]. Kom i và tập thể [18] đã biểu
hiện prote se HIV-1 trên hệ thống vector có sử dụng T7 promoter trong t bào E. coli
chủng BL21 (DE3) với ch phẩm prote se có hoạt tính c o gấp mười lần so với khi
sử dụng các vector tương tự. Nghiên cứu củ nhóm tác giả cho thấy hệ thống biểu
hiện này cũng phù hợp với việc biểu hiện các protein độc khác trong E. coli.
Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện prote se HIV-1 cho thấy quá trình
sản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: prote se gây độc với t bào chủ;
protein đích được biểu hiện chủ y u ở dạng không hò t n (90% ở dạng thể vùi);
hàm lượng thu được rất thấp chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễn
dịch [19, 23]. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy, bằng việc đồng biểu hiện
với pl smid pLysS, pLysE có thể hạn ch được tính độc và prote se HIV-1 khi
được biểu hiện cùng với các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng
tính t n và thuận tiện cho tinh sạch nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính [10, 23-24, 35].
Ở Việt N m, prote se HIV-1 là một trong số những enzyme được nghiên cứu
nhiều nhất trong những thập kỷ qu và các nghiên cứu chủ y u là điều tr , tách chi t
và nghiên cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật. Tuy nhiên, prote se HIV1 từ các bệnh nhân Việt N m là vấn đề chư được nghiên cứu nhiều.
Năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Lo n và tập thể [2] đã thành công trong biểu
hiện và tinh sạch prote se HIV-1 trên hệ thống vector pET32 , ở t bào E. coli.
Protease HIV-1 biểu hiện có hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp giống trong t bào chủ.
Xuất phát từ thực t , ở t bào E. coli, protease HIV-1 thường chỉ có hoạt tính
khi được biểu hiện ở dạng tự cắt tại liên k t Phe (Tyr)-Pro để giải phóng chuỗi
polypeptide với xit min mở đầu chuỗi là Pro [8]. ác nghiên cứu cũng cho thấy,
protease HIV-1 khi được biểu hiện cùng các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất
biểu hiện, tăng độ hò t n và thuận tiện cho quá trình tinh sạch mà vẫn đảm bảo
được hoạt tính tự cắt [25, 32, 35, 37].

19

hƣơng 2:

UY

ỆU VÀ P ƢƠ

P ÁP

ỨU

2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu huyết thanh
Mẫu huy t th nh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đ ng điều trị
kháng virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương.
2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật
oạn gen mã hóa protease củ HIV được đư vào vector nhân dòng
pCR2.1 là k t quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2].
Vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega. Các vector: pET28a,
pET32 và pET43 củ hãng Nov gen (Mỹ).
ác chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3) pLysS; E. coli BL21
(DE3) RIL được mu từ hãng Nov gen.
2.1.3. Hóa chất
Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và
dTTP) của hãng Ferment s.

ác oligonucleotide được thi t k và đặt mua từ hãng

Invitrogen. Kit tinh sạch DN trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas. Các
hoá chất giải trình tự do hãng Beckman Coulter cung cấp. Kháng thể đơn dòng

kháng protease HIV-1 được mua từ hãng Gene-Tex. Gel sắc ký ái lực His-bind của
hãng Novagen. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khi t dùng cho nghiên cứu sinh
học phân tử.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết R
RN

hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA

củ HIV-1 được tách và tinh sạch từ các mẫu huy t th nh bệnh nhân

nhiễm HIV-1 theo kit QI

mp Ultr sen virus củ Qi gen với các dung dịch (đệm) kèm

theo với các ký hiệu là R, B, W1, W2, VE. Quy trình thực hiện như s u:
Huy t th nh (400 µl) đã được tách sẵn từ máu tổng số được chuyển s ng ống
eppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosph te chứ muối (PBS) và 640 µl đệm

,

0,56 µl dung dịch chất m ng RN (RN c rrier) được bổ sung nhằm tăng khả năng
gắn RN

virus, hỗn hợp được trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Mẫu s u đó

20


được ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi.

K t tủ được hoà t n trở lại trong 240 µl đệm R đã được làm nóng tới 60oC, 16 µl
protein se K được bổ sung, hỗn hợp được trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần
5-10 giây. Ti p theo, hỗn hợp được ủ ti p ở 40o trong 10 phút và lắc đều cứ s u 5
phút 1 lần. 240 µl đệm B được bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex.
S u đó, hỗn hợp được đư vào cột QI

mp Spin và được ly tâm ở 7.000 vòng/phút

trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. ó thể lặp lại bước này nhiều hơn 1 lần để RN gắn
với cột được nhiều nhất. ột s u đó được chuyển s ng ống eppendorf mới và được
rử 2 lần bằng đệm

W1 và

W2 k t hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút.

uối cùng, cột được chuyển s ng một ống eppendorf mới. 60 µl đệm VE được bổ
sung, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RN .
Mẫu được bảo quản ở -20o đ n khi sử dụng.
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
RN

củ HIV-1 được chuyển thành cDN

bằng enzyme M-MLV reverse

tr nscript se củ Hãng Enzynomics.
cDN

được tổng hợp theo quy trình: 10 l RNA của HIV-1 và 1 l mồi

ngẫu nhiên (0,2 g) được bi n tính ở 70oC trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp
phản ứng s u đó được bổ sung 2 l đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 l
hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) 2 mM, 3,5 l H2O, 0,5 µl chất ức
ch ribonuclease và 0,5 l M-MLV reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng được ủ
ở 37oC trong 90 phút, phản ứng được k t thúc bằng xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút
và làm lạnh trên đá. Các mẫu cDN s u đó được bảo quản ở -20o để dùng cho các
thí nghiệm ti p theo.
2.2.2. Tách chiết v định lƣợng DNA
DN pl ssmid được tách chi t theo kit của Hãng Fermentas.
Nguyên lý: Màng t bào bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid. Trong
môi trường kiềm, trong khi DNA nhân sẽ bị bi n tính và k t tủa khi hỗn hợp được
trung hòa bằng axit thì plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình bi n tính xảy
ra ở mức độ vừa phải và sẽ nh nh chong được hồi tính khi trung hòa, do vậy,

21


pl smid được tách riêng khỏi DNA nhân. Mặc khác, sự phá vỡ màng t bào được
điều khiển bằng thời gian ti p xúc với SDS sao cho màng nhân không bị phá hủy,
sự giải phóng DNA nhân là tối thiểu.
Quy trình: Một khuẩn lạc trên đĩ thạch được cấy vào 1,5 ml môi trường LB
lỏng có chứa kháng sinh phù hợp, được nuôi cấy lắc ở 370C, 180 vòng/phút trong 1416 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 2 phút ở 250 để thu t
bào. S u đó, tủa t bào được hòa trong 250 l dung dịch I đã được bổ sung RNase và
ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút, ti p tục bổ sung 250 l dung dịch II, lắc đều rồi ủ ở nhiệt
độ phòng trong 5 phút và trung hò bằng 350 l dung dịch III, ủ trên đá từ 3-5 phút.
S u các bước phá màng, giải phóng DNA, hỗn hợp được ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 20 phút, thu dịch trong. Dịch này được nạp lên cột (kèm theo kit) và để tĩnh một
phút ở nhiệt độ phòng. Trong gi i đoạn này, DNA plasmid có ái lực với gel sẽ được
giữ lại trên cột. Cột được rửa với 500 l đệm PE 2 lần, ly tâm 13.000 vòng/phút trong

1 phút để loại dịch rửa. Cột được ly tâm thêm một lần nữa nhằm loại h t EtOH còn
sót lại s u bước rử . DN pl smid được đẩy ra khỏi gel bằng 30-50 l đệm EB.

ộ

tinh sạch củ DN pl smid s u đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.
DN

pl smid s u khi tinh sạch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ánh

sáng tử ngoại củ các xit nucleic ở bước sóng 260 nm (
với hàm lượng DN

260).

A260 = 1 tương đương

là 50 μg/ml và tương đương với hàm lượng RN

DN pl smid được cho là sạch khi giá trị
2.2.3. iện di D

260/A280

là 40 μg/ml.

nằm trong khoảng 1,8-2,0.

trên gel agarose

Nguyên tắc: ác phân tử DN

là các poly nion nên trong môi trường trung

tính và kiềm, dưới tác dụng củ điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức
độ di chuyển củ các phân tử DN

trong điện trường phụ thuộc chủ y u vào kích

thước củ chúng và nồng độ gel.
Quy trình tiến hành: Gel g rose được chuẩn bị trong đệm T E với
nồng độ EDT

1-2 mM để tránh sự phân cắt DN

bởi nucle se. Mẫu DN

được trộn với đệm mẫu có chứ chất chỉ thị màu là bromophenol x nh, xylene
cyanol và Ethidium bromide 50 g/ml s u đó tr vào

22

ường chạy.

iện di được


ti n hành với điện th ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30
phút. S u khi k t thúc điện di bản gel được lấy r soi và chụp ảnh dưới ánh
sáng tử ngoại củ máy soi gel Doc (Bio-Rad).

2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi HIV Fw/Rv được thi t k để nhân bản đặc hiệu đoạn gen
mã hóa cho protease HIV-1 từ nghiên cứu củ Nguyễn Thị Hồng Lo n và tập thể
[2]. ể thuận tiện cho quá trình biểu hiện s u này, có vị trí cắt giới hạn củ enzyme
BamHI trên mồi xuôi và enzyme XhoI trên mồi ngược. Ngoài r , trên mồi xuôi còn
có thêm 21 nucleotide mã cho trình tự tự cắt gồm 7 xit min, Gly-Thr-Val-SerPhe-Asn-Phe, tương ứng với vị trí cắt đặc hiệu giữ p17 và p24 trên gen gag củ
HIV-1. Trình tự cặp mồi như s u (vị trí cắt enzyme giới hạn được thể hiện bằng chữ
có gạch chân; trình tự tự cắt được thể hiện bằng chữ in nghiêng):
 HIV-Fw: 5’-GGGCGGATCCACTAGT
(BamHI)
GGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’
 HIV-Rv: 5’ G GT CTCGAGAAAATTTAAAGTGCAGCCAATCTG-3’
(XhoI)
P R được ti n hành với khuôn là vector p R2.1 m ng đoạn gen mã hoá prote se
HIV-1 (pCR2.1-Prot) [2]. Thành phần củ phản ứng P R được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Th nh phần của phản ứng P R

Thành phần

Thể tích (μl)

dd H2O

17

ệm Taq DNA polymerase 10X

2,5

Taq DNA polymerase (5 đơn vị/l)

0,5

dNTPs 2 mM

2,5

HIV-Fw 10 pmol

1

HIV-Rw 10 pmol

1

pCR2.1-Prot

0,5

23


Tổng thể tích

25

94oC-40 giây
Với chu trình nhiệt như s u: 40 chu kỳ

53oC-30 giây

72oC-30 giây

Sản phẩm củ phản ứng P R được điện di kiểm tr trên gel g rose 2%.
2.2.5. hân dòng đoạn gen mã hóa protease

V-1

Sản phẩm P R được tổng hợp với sự xúc tác củ enzyme T q DN
polymer se sẽ có đầu adenosine monophosphate (A) do hoạt tính gắn thêm đầu
tận cùng không phụ thuộc vào trình tự DN

khuôn củ enzyme T q DN

polymerase. Trong khi đó, vector nhân dòng pGEM-T củ hãng Promeg được
thi t k có chứ một gốc thymidine monophosph te (T) ở đầu 3’.
Thành phần củ phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T được thể
hiện ở bảng 2.
Bảng 2. Th nh phần của phản ứng gắn sản phẩm P R v o vector p EM-T

Thành phần

STT
1
2

Sản phẩm P R

Thể tích (l)
2

ệm T4 DNA ligase 2X

5

3

T4 DNA ligase

1

4

Vector pGEM-T

1

5

ddH2O

1

Tổng thể tích

10

24


Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22o trong 3 ti ng, s u đó sử dụng cho bi n nạp vào

t bào khả bi n E. coli chủng DH5α
T bào khả bi n E. coli DH5 được lấy r từ tủ lạnh sâu -80o để trên đá 10
phút cho t n dần, s u đó được bổ sung hỗn hợp phản ứng gắn ở trên, trộn nhẹ và để
trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành t bào. Hỗn hợp bi n nạp
được làm sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, làm lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 500 l
môi trường LB lỏng vào hỗn hợp bi n nạp. ác t bào s u bi n nạp được giữ trong tủ
ấm 37o trong 10 phút và ti p đ n nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở 37oC trong 60
phút. 50-100 l hỗn hợp bi n nạp được cấy trải trên đĩ LB đặc có chứ

mpicillin g

/ml, cơ chất X-g l 20 mg/ml và chất cảm ứng IPTG 0,1 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC
qu đêm. ác thể bi n nạp được sơ bộ nhân r bằng màu sắc củ khuẩn lạc và được
kiểm tr sự có mặt củ gen đích bằng P R và xác định trình tự gen.
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phƣơng
pháp Sanger
Pl smid từ các thể bi n nạp được tách và tinh sạch bằng kit củ Hãng Ferment s
như được mô tả ở mục 2.2.2 và được sử dụng để xác định trình tự đoạn gen đích.
Nguyên tắc: Xác định trình tự dự trên phương pháp k t thúc kéo dài chuỗi
nhờ dideoxyribonucleotide củ S nger và tập thể [31]. Các ddNTP do không chứ
nhóm –OH tại vị trí 2’ củ gốc đường nên khi được enzyme DN
vào chuỗi DN

polymer se gắn

đ ng tổng hợp thì chúng sẽ không thể tham gia hình thành liên k t

phosphodiester với nucleotide mới và khi n cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng
lại. Như vậy, từ một đoạn DN

b n đầu, nhiều sợi đơn mới được đánh dấu ở một

đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nh u
một nucleotide.

ác sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di

cryl mide dạng m o quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các k t quả để
đư r trình tự đoạn DN gốc.

25