Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Ngô Thị Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMIC MÔ GAN CỦA NGƢỜI
BỊ UNG THƢ GAN NGUYÊN PHÁT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

-1-


MỞ ĐẦU
Ung thƣ gan là một trong năm dạng ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới, đứng
hàng thứ ba về nguyên nhân gây chết do ung thƣ trên toàn cầu. Cơ hội sống sót của
bệnh nhân mắc ung thƣ gan là rất thấp, tỷ lệ sống sót khoảng 36%, đặc biệt ở một số
nơi tỷ lệ này chỉ là 17% sau 1 đến 3 năm đƣợc chẩn đoán mắc bệnh [31]. Hàng năm
có khoảng 600.000 ngƣời đƣợc chẩn đoán mắc ung thƣ gan và gần bằng con số đó
là số lƣợng ngƣời đã chết vì nó mỗi năm [36]. Từ những con số trên cho thấy một
thực tế rằng việc chẩn đoán và điều trị ung thƣ gan trên thế giới hiện nay gặp rất
nhiều khó khăn.
Proteomics là công cụ số một trong phân tích hệ protein của cơ thể sinh vật.
Kỹ thuật proteomics đã đƣợc áp dụng cho các nghiên cứu chỉ thị sinh học của các
bệnh ung thƣ nhƣ: ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ phổi, ung thƣ thanh
quản, ung thƣ vòm họng, ung thƣ gan, ung thƣ máu... Việc nghiên cứu bằng kỹ
thuật proteomics đang ngày càng đƣợc mở rộng, đem lại kết quả ngày càng lớn ứng
dụng trong sinh học, y học, dƣợc học và nghiên cứu cơ chế của các quá trình sinh

học [39].
Ung thƣ gan nguyên phát là dạng ung thƣ xuất phát từ các tế bào gan và nó
chiếm đến hơn 90% các trƣờng hợp ung thƣ gan. Nhiễm virus viêm gan B (HBV),
viêm gan C (HCV) mạn tính và xơ gan đƣợc cho là các nguyên nhân chính dẫn đến
ung thƣ gan [35]. Việt Nam là nƣớc có tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát cao do
nhiễm HBV và HCV. Do đó, việc phát hiện sớm ung thƣ gan rất quan trọng đối với
việc điều trị loại ung thƣ này.
Thực hiện luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích
proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát” với mục đích:


Phân tích protein ty thể, microsome và phần còn lại của tế bào tách từ

mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng của bệnh nhân ung thƣ gan.
-2-




Phân tích và so sánh sự biểu hiện của các protein ty thể, microsome và

phần còn lại trong mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng của bệnh nhân ung
thƣ gan nhằm tìm ra các protein đặc trƣng có liên quan đến bệnh.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

-3-

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ GAN
Ung thƣ gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới.

Bệnh này khó chẩn đoán, tiên lƣợng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao và tử vong trong thời
gian ngắn kể từ khi phát hiện. Trong năm 2008 ƣớc tính có 12 triệu trƣờng hợp
đƣợc chẩn đoán mắc ung thƣ, 7 triệu ngƣời chết và khoảng 25 triệu ngƣời đang
sống chung với ung thƣ trên thế giới. Tại Mỹ, năm 2009 ƣớc tính có 22.620 trƣờng
hợp đƣợc chuẩn đoán mắc ung thƣ, 18.160 ngƣời chết. Ung thƣ gan (UTG) gồm hai
loại là nguyên phát và thứ phát. Dạng nguyên phát hình thành từ các mô của gan,
trong khi dạng thứ phát tạo nên bởi các tế bào từ những cơ quan khác trong cơ thể
di căn thông qua máu, hạch bạch huyết tới gan và tạo khối u (nên còn gọi là ung thƣ
gan do di căn). Dƣới kính hiển vi, các tế bào ung thƣ di căn gan nhìn giống nhƣ các
tế bào ung thƣ mà chúng xuất phát. Do đó, trong phạm vi khoá luận này, chúng tôi
chỉ xin đề cập đến ung thƣ gan nguyên phát với dạng ung thƣ phổ biến nhất của nó
là ung thƣ biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [52].
1.1.1 Phân loại ung thƣ gan nguyên phát
Các khối u ác tính nguyên phát của gan có thể phát sinh từ thành phần biểu
mô hoặc không phải biểu mô, trong đó ung thƣ biểu mô là loại hay gặp nhất, chiếm
vị trí quan trọng nhất trong bệnh học UTG. Dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh
hoá tế bào, UTG nguyên phát đƣợc phân loại thành các dạng sau [3]:
- Ung thƣ biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma – HCC) là dạng ung
thƣ ác tính xuất phát từ các tế bào gan, chiếm khoảng 90% các dạng UTG
nguyên phát. Bệnh nhân mắc HCC có nguy cơ tử vong rất cao.
- Ung thƣ biểu mô đƣờng mật (Cholangio carcinoma) là dạng có những khối u
ác tính trong gan bao gồm các tế bào giống tế bào biểu mô đƣờng mật. Bệnh
thƣờng gặp ở lứa tuổi cao hơn so với ung thƣ tế bào gan, trung bình khoảng
-4-

65 tuổi. Dạng này có thể chia thành 2 thể cơ bản là thể ngoại vi và thể trung
tâm.
- Ung thƣ hỗn hợp tế bào gan – đƣờng mật (hepatocholangiocarcinoma) là
dạng mang đặc điểm mô bệnh học của cả hai loại nói trên, nói chung ít gặp.
- Ung thƣ nguyên bào gan (hepatoblastoma) là dạng thƣờng gặp ở trẻ em, rất
hiếm ở ngƣời trƣởng thành.
- Ung thƣ nội mạch máu dạng biểu bì (Epithelioid hemangioendothelioma) là
loại mới đƣợc mô tả, thƣờng gặp ở tuổi 50, 2/3 số trƣờng hợp phát hiện là ở
phụ nữ.
1.1.2. Các giai đoạn của ung thƣ gan
Ung thƣ gan đƣợc chia làm 4 giai đoạn:
 Trong giai đoạn I, có một khối u và không lây lan sang các mạch máu
gần đó.
 Trong giai đoạn II, có một khối u đã lan ra các mạch máu gần đó;
hoặc nhiều hơn một khối u, không cái nào trong số đó lớn hơn 5 cm.
 Giai đoạn III đƣợc chia thành các giai đoạn IIIA, IIIB, và IIIC; Trong
giai đoạn IIIA, một trong những điều sau đây đƣợc tìm thấy: nhiều
hơn một khối u lớn hơn 5 cm hoặc một khối u đã lan rộng đến một chi
nhánh chính của các mạch máu gần gan. Trong giai đoạn IIIB, có một
hay nhiều khối u của bất kỳ kích thƣớc mà có một trong hai: lây lan
đến các cơ quan lân cận khác với các túi mật, hoặc bị hỏng thông qua
các màng của khoang phúc mạc. Trong giai đoạn IIIC, ung thƣ đã lan
đến hạch bạch huyết gần đó.
 Trong giai đoạn IV, ung thƣ đã lan tràn vƣợt ra ngoài gan đến những
nơi khác trong cơ thể, chẳng hạn nhƣ xƣơng hay phổi. Các khối u có
thể có kích thƣớc bất kỳ và cũng có thể đã lan ra các mạch máu gần
đó và các hạch bạch huyết [53].

-5-


1.1.3. Nguyên nhân ung thƣ gan
Mỗi một tác động xấu đều làm tăng nguy cơ mắc một căn bệnh bất kì và có
thể là ung thƣ. Các bệnh ung thƣ khác nhau có các tác nhân gây bệnh khác nhau. Ví
dụ, để làn da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời mạnh là tác nhân dẫn đến ung
thƣ da. Hút thuốc là một tác nhân dẫn đến ung thƣ phổi, miệng, thanh quản, bàng
quang, thận, và nhiều cơ quan khác. Nhƣng việc có một, hay có vài tác nhân không
có nghĩa rằng một ngƣời sẽ mắc bệnh. Các nhà khoa học đã tìm thấy một số tác
nhân làm tăng khả năng dẫn đến ung thƣ biểu mô tế bào gan.
UTG đƣợc xem là biến chứng phổ biến nhất của các bệnh mãn tính thƣờng
gặp ở gan. Chúng thƣờng đƣợc gặp ở nhiều độ tuổi khác nhau, hàng năm có khoảng
5,5–14,9/100.000 ngƣời mắc bệnh và ƣớc tính khoảng 600.000 – 1.000.000 ca tử
vong [31]. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh khác nhau nhiều tuỳ theo khu vực địa lý trên
thế giới, nhất là giữa phƣơng Đông và phƣơng Tây. Khu vực có tỷ lệ phát bệnh cao
nhất là Đông Á, Đông Nam Á và khu vực Nam sa mạc Sahara. Nghiên cứu dịch tễ
học đã xác định đƣợc các yếu tố nguy cơ chính của UTG bao gồm: nhiễm virus
viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV), viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) dẫn
đến viêm gan mãn tính; xơ gan; nhiễm độc aflatoxin (AF); các loại hoá chất gây ung
thƣ nhƣ rƣợu, asen, dioxin (hình 1),… và các rối loạn chuyển hoá apocphirin, thiếu
hụt α–1 antitrypsin, bệnh Wilson, chứng nhiễm sắc tố sắt di truyền. Ngoài ra những
yếu tố nhƣ độ tuổi, giới tính, yếu tố di truyền,… cũng ảnh hƣởng đến nguy cơ mắc
bệnh. Mặc dù các yếu tố nguy cơ gây UTG tác động đến tế bào gan theo các con
đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng đều dẫn đến biến đổi di truyền và hình thành tế
bào ung thƣ.

-6-

Hình 1: Các nguyên nhân chính gây ung thƣ gan [57]

Nhiễm virus HBV là yếu tố nguy cơ hàng đầu của UTG trên toàn thế giới, sự
phân bố địa lý giữa tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính và tỷ lệ mắc bệnh có mối tƣơng quan
chặt chẽ. Ví dụ nhƣ Trung Quốc, các nƣớc thuộc khu vực Đông Nam Á, Nam sa
mạc Sahara có những tỉ lệ này đều ở mức cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World
Health Organization - WHO), tiêm vaccine dự phòng HBV có thể ngăn ngừa đƣợc
khoảng 70% UTG ở các vùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao. HBV là một retrovirus có
vật chất di truyền dạng ADN sợi đơn. Những báo cáo từ đầu thập niên 80 cho thấy
sự hiện diện của ADN của HBV trong hệ gen các tế bào gan của khoảng 90%
trƣờng hợp bệnh nhân ung thƣ gan [3]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi
ADN của HBV chèn vào hệ gen của ngƣời làm biến đổi ADN nhiễm sắc thể, hoạt
hoá các gen ung thƣ nhƣ c–Myc, c–Fos,… và bất hoạt một số gen ức chế khối u nhƣ
TP53. Ngoài ra, các sản phẩm protein của hệ gen HBV nhƣ HBx, protein của gen
pre S/S cũng hoạt hoá các gen ung thƣ dẫn tới thúc đẩy nhanh chu trình tế bào và ức
chế quá trình chết theo chƣơng trình (apoptosis).
Nhiễm virus HCV là yếu tố nguy cơ thứ 2 của UTG. Có khoảng 2–4% số
trƣờng hợp nhiễm HCV mạn tính phát triển thành UTG. Ở những quốc gia, vùng
lãnh thổ tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính thấp thƣờng cũng có tần suất UTG thấp hoặc
-7-


trung bình, trừ Nhật Bản (nơi mà virus HCV là yếu tố nguy cơ số 1). Số ca tử vong
do UTG ở Nhật tăng mạnh từ năm 1975 trở đi, cùng thời gian đó tỷ lệ nhiễm HBV
là không đổi, chỉ có viêm gan HCV là tăng lên tƣơng ứng với tỷ lệ tử vong. Những
nghiên cứu gần đây cho thấy sản phẩm protein của HCVcó thể tƣơng tác với các
protein vật chủ tham gia vào quá trình phát triển, tăng sinh và điều hòa hoạt động tế
bào dẫn đến hình thành tế bào ác tính. Có ba protein đƣợc xem là bằng chứng tham
gia vào quá trình này đó là protein lõi (core protein), NS3 và NS5A.
Aflatoxin (AF) là một mycotoxin đƣợc tiết ra từ các chủng nấm mốc

Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, thƣờng mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc
ẩm ƣớt, đã đƣợc chứng minh là có thể gây UTG thực nghiệm trên súc vật (hình 2).
AF là chất tƣơng tác với virus HBV tăng đáng kể nguy cơ mắc UTG. AF gây ra các
đột biến gen, trong đó đột biến gen p53 đƣợc quan sát thấy nhiều nhất. Hàng loạt
nghiên cứu đã chỉ ra đột biến gen này, đặc biệt là đột biến G/T ở codon 249 luôn
đƣợc tìm thấy ở bệnh nhân UTG tại những khu vực có sự phơi nhiễm AF cao [31].

Hình 2: Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan [13]

-8-


Ngoài các nguyên nhân trên thì các yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính, chủng tộc
hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid, hoặc các rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm
sắt ở mô, thiếu hụt α1-antitrypsin cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thƣ
gan [35].
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị ung thƣ gan
1.1.4.1.Chẩn đoán
Gan đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả
năng tái sinh mạnh, do đó ung thƣ gan phát triển rất nhanh. Đồng thời, các triệu
chứng của ung thƣ gan thƣờng biểu lộ khi bệnh đã nghiêm trọng, do đó, việc điều trị
ung thƣ gan gặp rất nhiều khó khăn. Đây chính là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ
tử vong do ung thƣ gan rất cao.
Việc chẩn đoán ung thƣ gan ở giai đoạn sớm là vô cùng cần thiết. Có hai
phƣơng pháp thông dụng nhất hiện nay để chẩn đoán ung thƣ gan là các x t nghiệm
chẩn đoán vật lý và xét nghiệm máu tìm alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh
bệnh nhân bị ung thƣ.
Để chẩn đoán khi có các triệu chứng của ung thƣ gan, một số phƣơng pháp
chẩn đoán vật lý đƣợc áp dụng nhƣ: siêu âm, chụp cắt lớp (CT), chụp cộng hƣởng
từ (MRI - Magnetic Resonance Imaging), chụp X- quang. Tuy nhiên, những phƣơng

pháp này tốn kém, phụ thuộc nhiều vào máy móc và không hiệu quả để phát hiện
khối u ở giai đoạn sớm.
Cách chẩn đoán thứ hai rất thông dụng đó là việc xét nghiệm chỉ thị AFP
trong huyết thanh. AFP là một glycoprotein có khối lƣợng 70kDa, đƣợc tổng hợp ở
gan và túi noãn hoàng trong giai đoạn thai nhi, và sau đó nó đƣợc tiết vào huyết
thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ. Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh giảm
và hầu nhƣ không phát hiện đƣợc ở ngƣời trƣởng thành khỏe mạnh. AFP có thể
-9-


đƣợc dùng để sàng lọc ngƣời có nguy cơ bị ung thƣ gan cao. AFP mất đi ngay sau
khi trẻ sinh ra, nếu hiện diện ở máu ngƣời lớn có nghĩa là có biến đổi về tế bào gan
và có khả năng mắc ung thƣ gan cao [10].
Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan vì có thể nó cũng
tăng ở những ngƣời bị viêm gan. Hơn nữa, độ nhạy của phƣơng pháp AFP cũng
không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP trong máu
vẫn bình thƣờng (đặc biệt ở những bệnh nhân có khối u nhỏ hơn 3cm) [11].
Hàm lƣợng AFP cao có thể cho chúng ta nghi ngờ chứ không thể chắc chắn
bệnh nhân đã mắc ung thƣ gan. Các x t nghiệm có thể giúp chẩn đoán ung thƣ gan,
nhƣng trong đa số trƣờng hợp cách duy nhất để chắc chắn là lấy một mảnh của khối
u và xem x t nó dƣới kính hiển vi. Điều này đƣợc gọi là sinh thiết. Có nhiều cách
khác nhau để có đƣợc những mẫu khối u. Trong một số trƣờng hợp, một mẫu sinh
thiết có thể đƣợc thực hiện trong khi phẫu thuật. Nếu khối u đã lớn hoặc đã lan rộng
khắp gan, một kim rỗng có thể đƣợc đặt qua da trong bụng và vào trong gan. Sinh
thiết mẫu cũng có thể đƣợc thực hiện trong thời gian phẫu thuật nội soi.
1.1.4.2 Điều trị
Có 2 nhóm điều trị chính: phẫu thuật và không phẫu thuật. Nhóm phẫu thuật
là phƣơng thức điều trị triệt căn, có dự hậu tốt hơn hẳn, và trong đó cắt gan là điều
trị chọn lựa, tuy nhiên chỉ có khoảng 10-20% bệnh nhân có khả năng cắt bỏ UTG.
Ghép gan nhằm loại bỏ gan bị xơ hóa và UTG, tuy nhiên, vấn đề là thiếu gan cho để

ghép.
 Điều trị không phẫu thuật có thể dùng: Thuyên tắc mạch hóa trị, chích cồn
qua da, phá hủy u bằng nhiệt, phá hủy u bằng sóng tần số radio, hóa trị toàn
thân với Doxorubicin, xạ trị qui ƣớc, điều trị nhắm đích.
 Điều trị phẫu thuât: Phẫu thuật cắt gan, ghép gan, ngoài ra có thể hủy u
bằng laser hay đông lạnh cho các u bề mặt.
-10-


1.2 CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC
1.2.1 Khái quát
Nhƣ chúng ta biết, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thƣ gặp rất nhiều khó
khăn. Những phƣơng pháp áp dụng hiện thời hầu nhƣ không đủ khả năng để có thể
tạo những bƣớc đột phá trong việc chẩn đoán sớm ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ gan.
Trong những năm gần đây có một hƣớng nghiên cứu trọng yếu đó là việc nghiên
cứu tìm kiếm các chỉ thị sinh học.
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học.
Chỉ thị sinh học có thể đơn thuần là một chất, nhƣ glucose là chỉ thị của bệnh tiểu
đƣờng, hoặc phân tử protein, nhƣ các kháng thể là chỉ thị của bệnh nhiễm trùng, hay
các dấu ấn ADN là chỉ thị cho các bệnh liên quan đến di truyền. Với phát triển của
những kỹ thuật sinh học hiện đại, ngƣời ta có thể nghiên cứu nhiều phân tử trên
cùng một mẫu bệnh phẩm nhƣ microarray, proteonomics [16].
Trong nghiên cứu bệnh học, chỉ thị sinh học có thể là những phân tử gây bệnh
hay những phân tử đƣợc tạo ra sau khi bệnh phát triển. Biomarker còn đƣợc gọi là
“chỉ thị” của một hiện tƣợng sinh học, những nghiên cứu gần đây đã chứng minh
tính hữu dụng của chỉ thị sinh học cho nhiều bộ môn sinh học từ nghiên cứu đến
ứng dụng. Các nhà nghiên cứu chỉ thị sinh học tin tƣởng rằng chỉ thị sinh học chứa
đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy tìm chỉ thị sinh học sẽ giúp đạt đƣợc
những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học. Những ứng dụng
này gồm các phƣơng pháp chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến

nhiều gene (ung thƣ, tiểu đƣờng, tim mạch, thần kinh...), hoặc các bệnh miễn
nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trƣờng. Chỉ thị sinh học
cũng có nhiều kỳ vọng trong ứng dụng đo lƣờng hiệu ứng của thuốc [5].
1.2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ

-11-


Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở bệnh nhân ung thƣ, có nồng
độ thay đổi liên quan đến sự phát sinh và tăng trƣởng của những khối u ác tính. Chỉ
thị ung thƣ là những chất do các tế bào hoặc mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối
u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai
dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị ung thƣ dạng tế bào bao gồm các
kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormon và những biến đổi di truyền
của tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm các chất hóa sinh phát hiện ở
những nồng độ không bình thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu, và các loại
dịch của cơ thể.
Hiện nay, có ba phƣơng pháp chính đang đƣợc tiến hành để nghiên cứu các chỉ
thị phân tử phục vụ cho việc chẩn đoán sớm ung thƣ:
-

Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gen lạ thƣờng có
liên quan đến các loại ung thƣ riêng biệt. Tuy nhiên, các kết quả của
những nghiên cứu này mới chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh
chứ chƣa tìm đƣợc cơ chế thực sự của bệnh. Có hai lý do chính về giới
hạn phƣơng pháp genomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thƣ. Thứ nhất,
phần lớn các gene liên hệ đến di truyền có tần số rất thấp trong quần thể
đa dạng sinh học; thứ hai, các bệnh đều có sự tham gia của một phức hệ
gene, mà phần lớn chƣa biết tới, chứ không phải từ một gene.

-

Phƣơng pháp proteomics xác định đƣợc hầu hết các protein có triển vọng
trở thành các protein chỉ thị ung thƣ. Các kỹ thuật proteomics có thể xác
định chính xác các đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lƣợng
bệnh, dự đoán đƣợc các ảnh hƣởng của việc điều trị và giúp phát triển y
học cho từng cá nhân. Hạn chế của phƣơng pháp này là nhiều protein chỉ
thị ung thƣ chỉ đƣợc tìm thấy ở mô ung thƣ mà không có mặt trong máu.

-

Phƣơng pháp sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận
dạng các kháng nguyên ung thƣ. Tuy nhiên, do có hiện tƣợng phản ứng
-12-


chéo trong phản ứng miễn dịch, do đó kết quả của phƣơng pháp này
không đảm bảo tính đặc hiệu [18].
Proteomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư
Proteomics ung thƣ là từ đƣợc dùng để chỉ các ứng dụng của kỹ thuật
proteomic trong nghiên cứu ung thƣ. Nhƣ chúng ta đều biết ung thƣ là một bệnh kì
lạ bởi các đột biến diễn ra ở tế bào ung thƣ. Những thay đổi ADN ở các tế bào này
đƣợc dùng trong chẩn đoán nguy cơ bệnh, chẩn đoán sớm và đƣa ra hƣớng điều trị.
Việc sử dụng kỹ thuật proteomic để xác định các tế bào ngƣời bệnh sẽ mang lại một
cuộc cách mạng trong y học.
Việc tìm các chỉ thị sinh học hiệu quả nhất là việc tìm các chỉ thị protein, vì
protein là sản phẩm cuối cùng của gene và tác động trực tiếp đến các hiện tƣợng
sinh học. Lý do quan trọng hơn nữa là protein là thành phần sinh học phong phú
nhất của tế bào so với mRNA hay xa hơn nữa là gene. Một gene có thể có nhiều bản
sao mRNA, biến đổi dịch mã và sau dịch mã thƣờng tạo ra nhiều protein hơn số bản

sao mRNA. Theo ƣớc lƣợng hiện nay, có khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein từ
số lƣợng khoảng 30.000 gene của bộ gene ngƣời [2].
Trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các chỉ thị ung thƣ đã trở thành
mục đích chính của các nghiên cứu ung thƣ. Thành công trong ứng dụng của kháng
nguyên tuyến tiền liệt (PSA) trong điều trị ung thƣ tuyến tiền liệt đã thúc đẩy các
nghiên cứu để tìm ra những chỉ thị thích hợp cho các loại ung thƣ khác. Các chỉ thị
sinh học cũng đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi ung thƣ, chẩn đoán sự tái
phát bệnh, và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh. Với các đích đã đƣợc xác định, các
thuốc điều trị nhƣ imatinib (Novartis Gleevec), trastuzumab (Roche s Herceptin),
và rituximab (Roche s Mabthera) đã đƣợc tạo ra để tác động đặc hiệu nhằm điều trị
có hiệu quả bệnh ung thƣ. Hiện nay, xu hƣớng lựa chọn các chỉ thị và bệnh nhân để
tiến hành điều trị sẽ tốt cho việc dự đoán tình trạng kháng thuốc. Các chỉ thị sinh
học thực sự rất cần cho việc phát triển điều trị cho từng cá nhân. Các protein có thể
-13-


đƣợc tiết ra một cách tích cực hoặc đƣợc giải phóng ra bởi các tế bào khối u nhƣ là
kết quả của sự hoại tử hay quá trình apoptosis và sau đó chúng đƣợc lƣu thông trong
máu. Điều này dẫn đến sự thay đổi hệ thống protein. Sự khác biệt về cƣờng độ tín
hiệu có thể đƣợc tìm ra bằng cách so sánh với huyết tƣơng của những ngƣời bình
thƣờng. Các kỹ thuật nhƣ Antibody Microarray, điện di hai chiều và khối phổ là
những kỹ thuật chính đƣợc sử dụng để tìm các chỉ thị cho bệnh ung thƣ [43].
Kết quả từ Viện nghiên cứu Y học Hoa Kỳ (NIH) đã cho biết có 14 protein
có khả năng dùng làm chỉ thị cho bệnh ung thƣ vú từ các phân tích khối phổ với
mẫu sữa lấy từ vú bệnh nhân[9]. Trong các nhóm đƣợc thử nghiệm, độ chính xác
của các chỉ thị này rất cao so với việc dùng các gene BRCA (BRCA là gene của
bệnh ung thƣ vú di truyền, tuy nhiên gen này chỉ có tỉ lệ thấp từ 2-5% của bệnh này
khi dùng để chẩn đoán chung). Một số chỉ thị protein khác cũng đã đƣợc phát hiện
từ nghiên cứu các bệnh ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ phổi, ung thƣ bàng quang,
và ung thƣ buồng trứng; về các bệnh tim mạch đã có một số chỉ thị protein đƣợc

cho là có liên quan đến bệnh nghẽn động mạch.
1.2.3 Nghiên cứu chỉ thị sinh học với ung thƣ gan
Với ung thƣ gan, việc nghiên cứu các chỉ thị sinh học đã và đang đƣợc tiến
hành với cả ba hƣớng, bao gồm việc dò tìm các chỉ thị ADN, protein và các kháng
thể đặc hiệu. Trong đó, một trong những hƣớng nghiên cứu quan trọng nhất là phân
tích tìm ra các chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của các tế bào ung thƣ
gan. Các phân tử chỉ thị này bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh
tế bào, gây biến đổi ADN (protein PCNA, Ki-67, Mcm2, MIB1, MIA, và
CSE1L/CAS); gen TP53 và phân tử liên quan đến MDM2; các protein khác tham
gia điều khiển chu trình tế bào (cyclin A, cyclin E, cdc2, p27, p73); các gen gây ung
thƣ và các thụ thể của chúng (ras, c-myc, c-fms, HGF, c-met, và erb-B); các yếu tố
liên quan đến sự chết theo chƣơng trình của tế bào (Fas và FasL) và sự hoạt động
của các telomerase. Một hƣớng nghiên cứu khác là tìm ra các chỉ thị phân tử liên
-14-


quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thƣ, các chỉ thị phân tử loại này gồm
các phân tử bám dính (E-cadherin, catenins, các dạng CD44 khác nhau), các
enzyme thủy phân protein làm giảm chất gian bào (MMP-2, MMP-9, Upa, Upar,
PAI), các yếu tố sinh trƣởng tham gia vào sự hình thành mạch giúp khối u phá vỡ
vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể [40]…
1.3.

PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ THỊ UNG THƢ
GAN

1.3.1. Proteomics
Thuật ngữ “proteomics” lần đầu tiên đƣợc Marc Wilkins và cộng sự đƣa ra
năm 1994 đã mở ra một thời kỳ phát triển mạnh mẽ các nghiên cứu về protein.
Proteomics là ngành khoa học nghiên cứu hệ protein, tập hợp tất cả các protein

đƣợc mã hóa và biểu hiện bởi hệ gen của cơ thể sinh vật [26].
Proteomics là một nhánh của nghiên cứu chức năng hệ gen, nó đƣợc sinh ra
khi các nhà nghiên cứu về gen đối mặt với câu hỏi “chức năng của tất cả các protein
là gì ?”. Proteomics có thể đƣợc định nghĩa là những nghiên cứu rộng rãi mọi mặt
protein nhƣ là sự biểu hiện, những tƣơng tác của protein trong tế bào cũng nhƣ việc
mô hình hóa protein. Protein là sản phẩm của ARN thông tin, nó thực hiện phần lớn
các phản ứng của tế bào và nó không có một mối quan hệ tuyến tính nào giữa mức
độ cấu trúc ARN thông tin và protein hay “proteome”trong tế bào. Ngoài ra, hầu hết
các đích tác dụng của thuốc là protein; do đó, các phƣơng pháp để nghiên cứu có
hiệu quả phức hợp protein trong tế bào có thể đóng vai trò trực tiếp cho việc phát
triển thuốc.
Ngày nay, các nghiên cứu proteomics tập trung vào ba mặt chính là: nhận
dạng protein, mô tả sự biểu hiện protein, mô hình hóa hệ thống và sự cải biến
protein.

-15-


- Nhận dạng protein là nhiệm vụ cơ bản của proteomics nhằm xác
định tất cả các protein có trong mẫu nghiên cứu. Mục đích của việc này là
đƣa ra một danh sách các protein hoàn chỉnh đã đƣợc biểu hiện trong thực tế
chứ không phải là suy ra từ dữ liệu về biểu hiện gen.
- Mô tả sự biểu hiện protein là việc xác định sự biểu hiện của các
protein trong một thời điểm nhất định của tế bào, mô. Mô tả protein thực chất
là một trƣờng hợp đặc biệt của việc nhận dạng. Ứng dụng phổ biến nhất là
các phân tích sự khác biệt, trong đó có hai trạng thái riêng biệt của hệ đƣợc
so sánh với nhau. Ví dụ nhƣ việc nghiên cứu so sánh các mô bình thƣờng và
mô bệnh để xác định xem protein nào biểu hiện khác nhau trong các trạng
thái đó. Các protein biểu hiện khác nhau đó có thể trở thành chỉ thị sinh học
của bệnh.

- Mô hình hóa hệ protein là xác định xem các protein liên hệ nhƣ thế
nào với các thành phần khác trong hệ thống sống. Hầu hết các protein thực
hiện chức năng của nó trong việc kết hợp chặt chẽ với các protein khác.
Nghiên cứu các tƣơng tác này giúp xác định đƣợc chức năng của protein. Mô
hình hóa sự cải biến protein là nhiệm vụ xác định xem các protein biến đổi
nhƣ thế nào. Nói chung, nhiều cải biến sau dịch mã đã chi phối cấu trúc,
chức năng và hoạt động của các protein.
1.3.2. Hệ protein gan ngƣời
Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể ngƣời. Gan có vai trò quan trọng trong
các quá trình tiêu hóa, trao đổi chất và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein sinh
chất, là vị trí có hiệu quả nhất để phân giải các chất ngoại sinh, cho quá trình thực
bào đối với các chất rắn, tham gia bảo vệ bộ máy tiêu hóa và các bộ phận khác của
cơ thể. Gan có vai trò chính trong việc xác định động dƣợc học của thuốc, vì đây là
cơ quan chính để đào thải nhờ khả năng chuyển hóa và bài tiết của mật, và cũng là

-16-


vị trí chính có ảnh hƣởng đến sự phân bố do có quá trình tổng hợp các protein gắn
với thuốc.
Tại hội thảo khoa học của Tổ chức Proteome ngƣời (Human Proteome
Organisation_HUPO) diễn ra ngày 28-29/04/2002 ở Bethesda (Hoa Kỳ), đã đánh
dấu cho sự ra đời của dự án Proteome gan ngƣời (Human Liver Proteome Project,
HLPP) với sự tham gia của đông đảo của các viện, trƣờng đại học và các công ty
trên thế giới. Tại hội thảo này đã có sự thống nhất về phƣơng hƣớng, mục đích,
tƣơng lai khoa học của dự án HLPP và đặc biệt nhấn mạnh các mục tiêu khoa học
của dự án, bao gồm: tạo đƣợc bức tranh tổng thể của proteomics gan; xác định sự
phân bố và bức tranh tổng thể của các protein ở mức độ dƣới tế bào; lập bản đồ liên
kết của các protein gan; làm sáng tỏ các biến đổi tổng thể của proteome gan; liên kết
giữa các dự án proteome gan và dự án proteome huyết tƣơng để phát hiện các chỉ

thị sinh học của các bệnh về gan [43].
1.3.3. Proteomics trong nghiên cứu ung thƣ gan
Tác hại của ung thƣ gan đối với sức khỏe con ngƣời và xã hội là vô cùng lớn.
Việc phân tích proteomics ung thƣ gan hứa hẹn sẽ cung cấp cho chúng ta sự hiểu
biết đầy đủ hơn về các tác nhân gây ung thƣ gan, quá trình tiến triển bệnh và hơn
nữa là đƣa ra các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị mới cho bệnh nhân HCC. Việc
phân tích proteomics không chỉ dừng lại ở việc xác định các chỉ thị trong mô, hay
chỉ với nghiên cứu proteomics huyết tƣơng. Việc tìm kiếm các chỉ thị trong huyết
tƣơng kết hợp với nghiên cứu trên mô sẽ giúp chúng ta tiến gần hơn đến việc chẩn
đoán ung thƣ một cách đơn giản và chính xác hơn chỉ với một xét nghiệm máu đơn
giản. Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics trên các dòng tế bào ung thƣ, phân tích
trực tiếp trên huyết tƣơng và mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan đã và đang đƣợc
tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu đƣợc một số kết quả khả quan [14].
Vì nguyên nhân chính của ung thƣ gan là viêm gan B, C nên rất nhiều nghiên
cứu đã tập trung vào đối tƣợng là bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan. Để
-17-


tìm hiểu khác biệt trong biểu hiện protein trong mô ung thƣ gan có tiền sử viêm gan
B nhằm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thƣ, các nhà khoa học Trung
Quốc đã tiến hành phân tích hệ protein các tế bào gan ung thƣ bằng kĩ thuật điện di
2 chiều DIGE (điện di 2 chiều các mẫu khác nhau trên cùng một bản gel). Mẫu lấy
từ 12 bệnh nhân HCC có tiền sử viêm gan B đƣợc phân tích. Hàm lƣợng protein
tƣơng đƣơng từ 12 cặp mẫu (bệnh và bình thƣờng) đƣợc trộn lại với nhau làm thành
nội chuẩn và đƣợc đánh dấu bằng Cy2 trong khi đó mẫu ung thƣ và không ung thƣ
đƣợc đánh dấu ngẫu nhiên bằng Cy3 hoặc Cy5. Tổng số 61 spot đƣợc xác định là
biểu hiện tăng lên trong các mẫu ung thƣ trong khi đó 158 spot có biểu hiện giảm.
Có 71 sản phẩm của gen đã đƣợc xác định từ những spot này. Các thành viên của họ
protein sốc nhiệt 70 và 90 có biểu hiện tăng, trong khi các protein chuyển hóa lại
giảm ở bệnh nhân HCC. Sự giảm các protein ti thể và protein peroxisom trong

nghiên cứu này đƣa ra cho chúng ta một gợi ý rằng có sự mất đi những chức năng
chuyên biệt của cơ quan tử trong tế bào gan ung thƣ. 4 enzyme chuyển hóa trong
chu trình methyl hóa ở gan biểu hiện giảm ở các mô gan ung thƣ, biểu thị bằng sự
thiếu hụt S-adenomethionine trong ung thƣ gan. Hai sản phẩm của gen là
glycerandehyde-3-phosphate

dehydrogenase

và

formimidoyltransferase-

cycledeaminase đƣợc xác định từ các spot biến đổi nghịch, từ đó chỉ ra rằng các
đồng phân hoặc các dạng cải biến sau dịch mã của hai protein này có thể đóng vai
trò khác nhau trong ung thƣ gan. Nghiên cứu này lần đầu tiên chỉ ra rằng sự biểu
hiện tăng của protein Hsp70/Hsp90 và các thể dị hợp ribonulceoprotein nhân C1/C2
trong các mô HCC là các chỉ thị ung thƣ, đƣợc khẳng định bằng Western blot và kĩ
thuật nhuộm hóa miễn dịch tế bào ở 70 mẫu HCC [41].
Ung thƣ gan là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới, nó
tác động đến nhiều nƣớc trong những năm gần đây. Theo thống kê có khoảng 53%
các trƣờng hợp HCC trên thế giới có liên quan đến HBV. Nguy cơ tiến triển thành
HCC từ những ngƣời mang HBsAg cao gấp 25 37 lần so với những ngƣời không bị
nhiễm [27]. Khi các virus viêm gan xâm nhập vào cơ thể sẽ làm cho cơ thể sinh ra
các kháng thể chống lại chúng. Bằng việc nghiên cứu sự biểu hiện các protein huyết
-18-


thanh của ngƣời bình thƣờng, ngƣời nhiễm virus và ngƣời bị ung thƣ gan đã chỉ ra
rằng sự tồn tại của từng kháng thể tự miễn này có liên quan với HCC và là yếu tố
chẩn đoán sớm hiệu quả đối với các trƣờng hợp viêm gan nguy cơ cao [25]. Nghiên

cứu đƣợc thực hiện trên huyết thanh của 37 bệnh nhân HCC và 31 trƣờng hợp viêm
gan B/C không bị HCC. Huyết thanh lấy từ các bệnh nhân bị ung thƣ không phải
HCC và 24 trƣờng hợp khỏe mạnh đƣợc dùng làm đối chứng. Có 8 loại protein tạo
ra đáp ứng thể dịch trong huyết thanh từ 70% trong tổng số 37 bệnh nhân trong
nghiên cứu, với tỉ lệ biểu hiện của từng protein riêng biệt từ 11 27%. Các kháng thể
tự miễn kháng β-tobulin, creatine kinase B, hsp60 và cytokeratin18 đƣợc phát hiện
trong huyết thanh của các bệnh nhân viêm gan B/C, trong khi đó, kháng thể kháng
calreticulin, cytokeratin8, F1-ATP synthase β-subunit và NDPKA chỉ thấy xuất hiện
nhiều ở bệnh nhân HCC. Calretibulin và một dạng bị cắt của nó (Crt32) đã đƣợc xác
định là phổ biến nhất ở các bệnh nhân HCC với tần suất biểu hiện là 27%[25] .
Việc lựa chọn nguồn bệnh nhân để lấy mẫu và cách lấy mẫu sinh phẩm là
rất quan trọng, có vai trò quyết định đến kết quả của một nghiên cứu. Năm 2003,
Các nhà khoa học tại Seoul, Hàn Quốc tiến hành một phƣơng pháp lấy mẫu độc
đáo với 21 cặp mẫu (các mô ung thƣ và các mô không ung thƣ xung quanh gan)
đƣợc lấy từ 21 bệnh nhân ung thƣ gan. Các bệnh nhân này đƣợc chia ra làm 3
dạng HCC bởi các chỉ thị virus: 7 HBsAg dƣơng tính (HCC dạng B), 7 anti-HCV
dƣơng tính (HCC dạng C) và 7 HBsAg và anti-HCV âm tính. Protein tổng số đƣợc
phân tích bằng điện di 2 chiều và khổi phổ MALDI-TOF-MS và những thay đổi
trong hệ protein đã đƣợc chỉ ra. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 60 protein có mức
độ biểu hiện khác nhau giữa các mẫu ung thƣ và không ung thƣ, trong số đó 14
protein bị thay đổi trong cả 3 dạng HCC, trong khi đó, 46 protein lại là chỉ thị đặc
hiệu về virus. Tóm lại, các protein đã xác định đƣợc phân loại theo tác nhân virus
có liên quan đến HCC dạng B và C. Các kết quả này chỉ ra một cách rõ ràng rằng
sự biểu hiện của hệ protein của các mô trong HCC liên quan mật thiết với các yếu
tố gây bệnh và cơ chế ung thƣ gan có thể diễn ra khác nhau do các yếu tố HBV và
HCV [21].
-19-


Cũng trên đối tƣợng các bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan B, tháng

4 năm 2008, Min He và cộng sự [16] đã công bố kết quả nghiên cứu phát hiện và
xác định NAP-2 nhƣ là một chỉ thị sinh học của ung thƣ gan liên quan đến viêm gan
B bằng kĩ thuật proteomic. Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên 81 bệnh nhân HCC có
tiền sử HBV và 33 ngƣời khỏe mạnh với kĩ thuật SELDI-TOF-MS đã mô tả hệ
protein của các mẫu huyết thanh.
Năm 2006, nhóm các nhà khoa học Mỹ đứng đầu là Mary Ann Comunale đã
tiến hành phân tích proteomic các glycoprotein huyết thanh bị fuco hóa trong giai
đoạn đầu ung thƣ gan. Các tác giả đã chỉ ra rằng với sự gia tăng các mức độ fuco
hóa có thể đƣợc quan sát qua phân tích polysaccharide với huyết thanh tổng số và
có liên quan đến sự tiến triển HCC. Nhƣ đã biết AFP là một chỉ thị sinh học trong
ung thƣ gan (trên 50ng/mL gặp ở 30 60% trƣờng hợp HCC tại thời điểm chẩn
đoán), tuy vậy, AFP thƣờng biểu thị không đầy đủ ở những mô nhỏ. Trong nghiên
cứu này, các nhà khoa học đã tiếp cận phƣơng pháp glycoproteomics để xác định
các glycoprotein huyết thanh liên quan tới tiến triển ung thƣ và GP73 đã đƣợc phát
hiện với mức độ gia tăng trong các đối tƣợng HCC. Protein này đã đƣợc phân tích
kĩ và đƣợc chỉ ra nhƣ là một chỉ thị HCC tốt hơn AFP ở ngƣời . Ngoài ra, ngƣời ta
còn phát hiện ra một dạng đồng phân khác của AFP khi bị fuco hóa là DCP
(Desgamma carboxyprothrombin) cũng liên quan đến HCC [30].
Nhằm làm rõ hơn bằng chứng về sự biểu hiện của đáp ứng miễn dịch cơ thể,
bằng việc chỉ ra sự xuất hiện các kháng thể tự miễn tƣơng tác với các kháng nguyên
mô ở ngƣời bị ung thƣ. Nghiên cứu của Paradis và cộng sự (2007) với mục đích
đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên liên quan đến khối u trong huyết thanh
(tumor-associated antigens-TAAs) trong chẩn đoán ung thƣ gan. Các tác giả đã sàng
lọc huyết thanh của 142 bệnh nhân HCC bằng việc sử dụng 8 TAAs chọn trƣớc
(Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, Cyclin B1, surviving và p16) không liên quan đến các
mô gan. Các TAAs đƣợc định lƣợng bằng ELISA trên mẫu huyết thanh và đƣợc so
sánh giữa một nhóm HCC và một nhóm huyết thanh bình thƣờng. Nghiên cứu này
-20-

đã giải quyết vấn đề miễn dịch ung thƣ từ đó cho ph p phân tích toàn diện các
kháng thể tƣơng tác với các kháng nguyên trong một khối u và đánh dấu cho sự
phát triển trong nghiên cứu chỉ thị sinh học bệnh đặc biệt là ung thƣ [37].
Năm 2010, Pleguezuelo và các cộng sự tại đại học Reina Sofia Cordoba Tây
Ban Nha đã tiến hành nghiên cứu nhận dạng chỉ thị mới của ung thƣ gan bằng
phƣơng pháp proteomics. Các bệnh nhân HCC với 3 nguyên nhân chính là nhiễm
virus viêm gan B, viêm gan C và do rƣợu. Mẫu đƣợc phân tích bằng điện di hai
chiều để xác định các protein có biểu hiện khác biệt. Các protein đƣợc phân tách
trên một thanh trip có gradient pH từ 3 đến 10 và điện di biến tính với SDS. Phân
cắt protein bằng trypsin và phân tích nhận dạng peptide. Kết quả là 3 apolipoprotein
biểu hiện khác biệt đã đƣợc nhận dạng: Apo-A1, Apo-A4 và Apo-E. Apo-A4 có
biểu hiện thấp hơn ở bệnh nhân HCC so với mẫu không có HCC. Nhiều ý kiến cho
rằng Apo-A4 và Apo-A1 là các nhân tố độc lập liên quan đến chẩn đoán HCC.
Nghiên cứu đƣa ra kết luận rằng Apo-A4 và Apo-A1 có thể đƣợc sử dụng nhƣ một
chỉ thị có độ nhạy và đặc hiệu cao với HCC [29].
Ung thƣ biểu mô tế bào gan (HCC) là một trong những nguyên nhân phổ
biến gây khối u ác tính gây tử vong cao. Tỷ lệ mắc HCC ở Hoa Kỳ đang gia tăng.
Matos và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu proteomics ung thƣ gan của ngƣời Mỹ.
Khối u và mô từ ba bệnh nhân HCC ngƣời Mỹ bị viêm gan và không liên quan đến
viêm gan đã đƣợc phân tích để tìm sự khác biệt phổ biến trong biểu hiện protein.
Protein đã đƣợc phân tách bởi điện di 2D (gel 10% SDS-PAGE). Gel đã đƣợc cố
định và sau đó nhuộm màu với xanh Coomassie. Số hóa và xử lý đƣợc thực hiện
bằng cách sử dụng phần mềm PDQuest. Sử dụng kiểm định t-student để phát hiện
sự thay đổi protein giữa khối u mà mô lành của tất cả các cặp mẫu với xác suất P <
0,01. Kết quả thu đƣợc với 19 spots biểu hiện khác biệt có ý nghĩa ( 2 lần). Trong
số 19 spots, 9 spots biểu hiện tăng và 10 biểu hiện giảm ở u. Các protein biểu hiện
tăng bao gồm: beta-5-tubulin, beta-actin, vimentin, carbamoyl-phosphate,
synthetase-1, methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, serum albumin, catalase,
-21-

autoimmune regulator, and transcription factor, ets. Các protein biểu hiện giảm bao
gồm:

BiP

protein,

A-kinase

anchoring

protein

18

gamma,

inorganic

pyrophosphatase, keratin 8, repulsive guidance molecule, butyrophilin, superoxide
dismutase, TSA, heat-shock 70-kDa protein 9B, and hemoglobin alpha-2. Đặc biệt,
các protein tự miễn dịch đƣợc biểu hiện cao 14 lần trong mô khối u, cho thấy nó có
thể có một vai trò trong HCC. Xác nhận và tiếp tục điều tra về những thay đổi
protein này có thể dẫn đến việc phát hiện ra phân tử chỉ thị mới [19].
Trong dự án tin sinh học proteomic, Kondo đã chỉ ra rằng 23 protein xuất
hiện trở lại khi tái phát ung thƣ gan sau phẫu thuật. Hơn nữa, khi tập trung vào
những khác nhau về tế bào học, tác giả đã chỉ ra rằng APC gắn protein EB1 là một
chỉ thị sinh học mới cho tiên lƣợng HCC. Protein EB1 liên quan đến con đƣờng dẫn
truyền tín hiệu có biểu hiện khác thƣờng ở bệnh nhân HCC và ung thƣ thực quản.

Kiểm tra hóa miễn dịch tế bào sự biểu hiện EB1 sẽ giúp xác định các trƣờng hợp có
nguy cơ tái phát cao và tác động điều trị có thể đƣợc cải thiện thông qua theo dõi và
điều trị bệnh [23].
1.3.4. Nghiên cứu hệ protein ty thể
Ty thể đƣợc xem nhƣ là cái đích lý tƣởng cho việc phân tích hệ protein vì
chúng có độ phức tạp không cao và có nguồn gốc từ các tế bào prokaryote. Ngoài
ra, ngƣời ta còn thấy vai trò của chúng trong rất nhiều các rối loạn, gây lên nhiều
các bệnh tật khác nhau. Ngoài chức năng tạo nguồn năng lƣợng sinh học, ty thể
tham gia điều hòa quá trình gây chết của tế bào, điều chỉnh ổn định nội môi ion, oxy
hóa các hydrate cacbon và axit béo, tham gia trong nhiều quá trình đồng hóa và dị
hóa khác nhau. Vì vậy, rối loạn chức năng của ty thể có thể gây những hậu quả nặng
nề, từ những khuyết tật trong chuyển hóa năng lƣợng đến các bệnh lý có nguyên
nhân phức tạp, bao gồm cả bệnh Alzheimer, Parkinson, ung thƣ, đái tháo đƣờng typ
2, tim mạch và viêm khớp xƣơng mạn tính. Sự liên quan của ty thể với các bệnh
phát sinh kể trên đã và đang hƣớng những nghiên cứu thực nghiệm vào xác định hệ
-22-


protein ty thể, khám phá những chỉ thị phân tử cho sự phát triển thuốc và can thiệp
vào việc chữa bệnh.
Theo Taylor (2003), Cotter (2004), Prokisch (2004), ngƣời ta dự đoán sẽ có
khoảng 1500 loại protein sẽ đƣợc xác định trong ty thể. Việc áp dụng các kỹ thuật
điện di hai chiều và khối phổ trong những nghiên cứu hiện tại đang mở ra những
hứa hẹn mới trong sự nhận diện hệ protein của ty thể [1].
Ty thể là bào quan phổ biến trong gan. Mỗi tế bào gan có hàng nghìn ty thể.
Trong ung thƣ gan, sự rối loạn chức năng ty thể có thể có những mối liên quan trực
tiếp đến bệnh. Đặc biệt ty thể có một vai trò quan trọng trong con đƣờng hoạt hóa
apoptosis nội bào. Những sai hỏng trong con đƣờng apoptosis có khả năng cho tế
bào đƣợc sống sót, góp phần gây nên tình trạng ác tính của u. Quan trọng hơn nữa là
sự thay đổi biểu hiện và những đột biến trong quá trình apoptosis liên quan tới các

protein có trong các cơ chế quan trọng làm cho các u trở lên kháng thuốc. Vì vậy,
vai trò chủ chốt của con đƣờng apoptosis trong sự phát triển ung thƣ và đáp ứng
điều trị cho thấy rằng các protein ty thể có liên quan đến quá trình này có khả năng
nhƣ là các chỉ thị sinh học chẩn đoán ung thƣ.
Các protein có liên quan đến quá trình apoptosis thông qua ti thể thƣờng
xuyên đƣợc nghiên cứu để đƣợc đánh giá là các chỉ thị sinh học trong ung thƣ. Cụ
thể, là những chất điều hòa chủ chốt của con đƣờng này, các phân tử họ Bcl-2 đƣợc
nghiên cứu thƣờng xuyên nhƣ các chỉ thị sinh học apoptosis trong nhiều loại ung
thƣ, bao gồm cả ung thƣ gan.
Những sai hỏng chức năng của ty thể đƣợc cho là có vai trò quan trọng trong
sự phát triển của ung thƣ. Hơn 70 năm trƣớc, Warburg [44] đã mở đƣờng cho việc
nghiên cứu những biến đổi trong vai trò hô hấp nội bào của ty thể đối với ung thƣ
và đã đề xuất ra một cơ chế để giải thích quá trình phát sinh ung thƣ. Trong một loạt
các bài báo, ông đã đƣa ra giả thiết rằng sự kiện chìa khóa trong việc phát sinh ung
thƣ là sự phát triển của một “tổn thƣơng” trong bộ máy hô hấp nội bào, dẫn đến sự
-23-


tăng sinh bù lƣợng ATP glycolytic. Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu
cầu năng lƣợng của mình bằng cách sản xuất một phần lớn ATP của mình thông
qua cơ chế glycolytic hơn là thông qua phosphoryl hóa oxy hóa. Do sự sản sinh
ATP glycolytic kém hiệu quả, điều này phần nào phản ánh cơ chế trao đổi chất duy
nhất của các tế bào ác tính và điều đó sẽ yêu cầu tiêu thụ một lƣợng lớn glucose để
đáp ứng nhu cầu năng lƣợng của tế bào. Điều này xảy ra trái ngƣợc ở nhiều tế bào
bình thƣờng, các tế bào sử dụng phosphoryl hóa oxy hóa nhƣ là cách chủ yếu để
tổng hợp ATP với hiệu suất cao. Sự khác biệt trong chuyển hóa năng lƣợng giữa các
tế bào ung thƣ và các tế bào bình thƣờng tạo thành một cơ sở hóa sinh để suy đoán
rằng các hƣớng điều trị có thể đƣợc phát triển để chọn lọc tiêu diệt các tế bào ung
thƣ trong trạng thái tổn thƣơng hô hấp tế bào.
Kể từ khi ấn phẩm phẩm đầu tiên của Warburg đƣợc xuất bản hơn nửa thế kỷ

trƣớc, một số bệnh ung thƣ liên quan đến khuyết tật ti thể đã đƣợc xác định và đƣợc
mô tả trong các tài liệu. Những khiếm khuyết bao gồm thay đổi biểu hiện và hoạt
động của các tiểu đơn vị chuỗi hô hấp và các enzym glycolytic, giảm quá trình oxy
hóa các chất NADH đƣợc liên kết, cũng nhƣ đột biến ADN ti thể (mtDNA). Trong
khi có nhiều báo cáo về các hiện tƣợng, các cơ chế chịu trách nhiệm về việc bắt đầu
và tiến triển của đột biến mtDNA, vai trò của nó trong sự phát triển của bệnh ung
thƣ, và tiến triển bệnh vẫn còn chƣa đƣợc làm sáng tỏ [20].
Hơn 300 triệu ngƣời đang bị nhiễm mạn tính với virus viêm gan B, và nhiều
ngƣời trong số này có khả năng phát triển thành ung thƣ gan. HBV mang 7 protein
virus, trong đó có protein không có cấu trúc X (nonstructural X) (HBx). Các kết quả
nghiên cứu với các tế bào bất tử hay các tế bào chuyển gen và với HBx của chuột
biến đổi gen đã chứng minh rằng HBx có thể tƣơng tác với các ty thể. Tuy nhiên,
không có những nghiên cứu mô tả chính xác vị trí HBx trên ty thể hay ảnh hƣởng
của nó đến các trạng thái sinh lý của ty thể. Clippingen và cộng sự [6] đã tiến hành
nuôi cấy tế bào gan chuột mô hình đặc trƣng để mô tả trí của HBx ti thể và ảnh
hƣởng của nó về mặt sinh lý học. Kết quả, đã cho thấy sự định vị của HBx với mật
-24-


độ cao và liên kết với màng ngoài ty thể. Họ đã chứng minh rằng HBx có khả năng
điều hòa màng ti thể trong các tế bào gan và chức năng này của HBx thay đổi tùy
theo tình trạng hoạt động của NF-αB. Trong các tế bào gan chuột sơ cấp, sự hoạt
hóa HBx của NF-αB ngăn cản sự khử cực màng ti thể, tuy nhiên, khi hoạt động của
NF-αB bị ức chế, HBx gây sự khử cực màng thông qua sự điều khiển tính thấm lỗ
ti thể. Tóm lại, các kết quả này xác định con đƣờng tiềm năng mà qua đó có thể
kích hoạt HBx để điều chỉnh quá trình sinh lý của ti thể, do đó làm thay đổi nhiều
hoạt động tế bào và cuối cùng góp phần vào sự phát triển các nghiên cứu ung thƣ
gan liên quan đến HBV.
1.3.5. Nghiên cứu hệ protein microsome
Microsome là những túi tiết đƣợc hình thành từ mạng lƣới nội chất khi các tế

bào eukaryote bị phá vỡ. Ở điều kiện bình thƣờng microsome không tồn tại trong
các tế bào sống. Microsome có thể đƣợc tách và thu lấy từ những mảnh vỡ tế bào
bằng cách ly tâm. Các tế bào không vỡ, nhân, và ty thể sẽ bị lắng xuống ở khoảng
11.000g, trong khi các enzyme hòa tan và lƣới nội chất chứa cytochrome P450 vẫn
còn trong dung dịch. Khi sử dụng máy siêu ly tâm tốc độ lên tới 100.000g các
microsome bị lắng xuống thành cặn còn các enzyme hòa tan thì vẫn nổi trên mặt.
Bằng cách này microsome đƣợc tách ra. Microsome thu đƣợc có màu nâu đỏ do sự
có mặt của các cofactor có chứa sắt, nhân heme trong enzyme P450 có rất nhiều
trong gan của ngƣời và động vật.
Microsome là một công cụ có giá trị lớn trong việc điều tra sự trao đổi chất
của các hợp chất và kiểm tra các tƣơng tác thuốc. Các nhà nghiên cứu thƣờng chọn
microsome dựa trên mức độ hoạt động đặc trƣng của các enzyme CYP.
Năm 2008 Nakamura và cộng sự [22] đã tiến hành nghiên cứu proteomic
microsome trên mô gan chuột thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng sự kết hợp các kỹ
thuật điện di biến tính 1 chiều và sắc ký lỏng nano kết hợp với khối phổ (nano-LCMS/MS) để nghiên cứu hệ protein màng. Hơn 100 protein đã đƣợc nhận dạng bằng
-25-