Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƢỜI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƢƠNG

Hà Nội - 2013


ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á
trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của
vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) nhƣ một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho
ngƣời và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch.
Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở ngƣời do S. suis đã và đang đƣợc coi là
một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao. Rất
nhiều trƣờng hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng nhƣ: nhiễm khuẩn
huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng
nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn nhƣ

Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện
Trung ƣơng Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây
bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở ngƣời lớn tại Việt Nam.
Ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S. suis bởi các kỹ thuật
nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ
thuật miễn dịch học, thậm chí các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến.
Ở Việt Nam, vì sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng nhƣ sự
không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thí ngiệm, những phƣơng
pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp dụng rộng
rãi. Tuy nhiên trong các phƣơng pháp hiện đại, nhanh và chính xác, phƣơng pháp
PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phƣơng pháp có tính khả thi hơn cả về mặt kinh tế
và kỹ năng thực hiện so với phƣơng pháp PCR định lƣợng (Real time PCR). Với
phƣơng pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện đƣợc sự có mặt của
vi khuẩn S. suis, xác định đƣợc typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen
độc lực của vi khuẩn. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công
sức và có độ đặc hiệu cao.
Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn
thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch
não tủy của ngƣời” với 2 mục tiêu chính sau đây:
- Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm
ngƣời;
- Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA
của S. suis.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ S.suis
1.1.1. Giới thiệu chung

Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dƣơng, kỵ khí tùy tiện, kích thƣớc
khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào. Trong bệnh phẩm, chúng thƣờng
xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hình 1.1). S.suis có yếu tố quyết định kháng
nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di
truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này.
Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc nhóm R,
S và T tƣơng ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [Error! Reference source
not found.]. Nhƣng đến năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên
cứu đƣợc S.suis có tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 )
[Error! Reference source not found.] nhƣng typ 32 và 34 vừa đƣợc chứng minh là
Streptococcus orisratti. Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho ngƣời đáng chú ý là
typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [Error! Reference
source not found.]. Nhƣng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là
kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hƣởng đến con ngƣời rộng rãi trên toàn thế giới,
có rất ít trƣờng hợp gây bệnh ở ngƣời do typ 1 và typ 14.
Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trƣờng có 5- 10% CO2, mọc trên các
môi trƣờng nuôi cấy giàu chất dinh dƣỡng nhƣ môi trƣờng thạch máu, thạch
Chocolate, nhƣng mọc tốt nhất trên môi trƣờng Columbia, nhiệt độ thích hợp 370C,
nhƣng có thể phát triển đƣợc ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH thích
hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ
đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.
S. suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trƣờng thạch máu cừu và tan huyết
dạng beta trên môi trƣờng thạch máu ngựa

Mặc dù chức năng của 20-30% bộ gen chƣa đƣợc biết nhƣng nhiều gen
đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã đƣợc nghiên cứu. Đó là
những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu
tố hạn chế sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các
enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. Có 17 chủng
S. suis đã đƣợc giải trình tự gen. Tùy từng chủng, bộ ben có kích thƣớc

từ 2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17
chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại
protein1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn
đoán

*Vỏ polysacarit của vi khuẩn
S. suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide - cps). Việc
định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này.

2


Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 đƣợc cho là có liên quan nhiều
hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ
cũng có thể xảy ra. Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đƣờng: Galactose, glucose, Nacetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine và sialic acid. Ở typ 2, N-acetyl
glucosamine đƣợc thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ
khác chƣa đƣợc nghiên cứu sâu.
*Suilysin
Suilysin là một yếu tố gây tan huyết đƣợc mã hóa bởi gen sly của S. suis.
Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tƣơng đồng
cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae).
Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho
rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn thƣơng tế
bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thí nghiệm đƣợc tiến hành in
vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch). Ngoài ra, suilysin còn có
thể "khởi động" cho quá trình sản xuất và tác động của các cytokine. Thí nghiệm sử
dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hƣởng khác nhau của suilysin
tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến.
Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm
gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải

là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn.
*Hệ thống Arginine deminase
Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định đƣợc 2 protein bề mặt vi
khuẩn có kích thƣớc 47 kDa và 53 kDa. Hai protein này có mức độ tƣơng đồng cao
với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. pyogenes. Protein 47 kDa tƣơng
đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tƣơng đồng với streptococcal
acid glycoprotein (SAGP).
ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trình biến đổi arginine thành
ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp. Hệ thống ADS có mặt
trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis
*Protein được giải phóng do muramidase (muramidase-released protein; mrp) và
yếu tố ngoại bào (extracellular factor- ef)
Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động
vật bị bệnh nhƣng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền
bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên ngƣời, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số
chủng phân lập đƣợc mang gen mrp.
Mrp và ef cũng đƣợc coi là các yếu tố chỉ thị cho S. suis typ 2. Các chủng vi
khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là
ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã đƣợc xác định. Biến
thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có
mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef. Đã có nghiên cứu gây nhiễm

3


trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực
chẳng khác gì vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng
miễn dịch vẫn cần đƣợc làm sáng tỏ bằng các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm.
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis






Quá trình xâm nhập
Sự tồn tại của vi khuẩn trong máu và sự lây nhiễm
Hiện tƣợng viêm và sốc nhiễm trùng
Sự xâm nhập hệ thần kinh trung ƣơng và viêm màng não

1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƢỜI CỦA S.suis
S. suis lần đầu tiên đƣợc báo cáo bởi các bác sĩ thú y năm 1954, sau khi bùng
phát dịch viêm màng não, viêm khớp nhiễm khuẩn huyết, và có mủ xảy ra ở lợn con
[Error! Reference source not found.]. Sau đó, vào năm 1968, bệnh do S. suis
đƣợc ghi nhận ở ngƣời qua mô tả lần đầu tiên về 2 trƣờng hợp viêm màng não mủ
và một trƣờng hợp nhiễm trùng huyết nặng tại Đan Mạch. Từ đó, bệnh đƣợc ghi
nhận ở các nƣớc khác thuộc Châu Âu (Anh, Hà lan,…) và Hồng kông [Error!
Reference source not found.].
Tại Anh, trong khoảng từ năm 1975 đến năm 1990, có tất cả 35 trƣờng hợp
nhiễm Streptococcus suis đƣợc báo cáo, trong số đó, 34 trƣờng hợp bệnh nhân nam.
25 bệnh nhân đã đƣợc xác nhận bị nhiễm Streptococcus suis từ năm 1984 và
1993 ở Hồng Kông. Trong số đó, 15 trƣờng hợp (60%) đã có một tiếp xúc với lợn
hoặc thịt lợn. Xét nghiệm dịch não tủy của 21 bệnh nhân đã xác nhận sự hiện diện
của viêm màng não, 4 bệnh nhân còn lại bị viêm khớp, viêm phế quản phổi, viêm
nội tâm mạc và sốt [Error! Reference source not found.].
Có 7 trƣờng hợp nhiễm S. suis ở Nhật Bản từ năm 1994 đến 2006. Tất cả các
trƣờng hợp có tiếp xúc với lợn và 5 ngƣời trong số họ đã có tổn thƣơng da tay trong
quá trình tiếp xúc. 5 trƣờng hợp trên có các triệu chứng của viêm màng não, nhiễm
trùng huyết, và có 1 trƣờng hợp đã tử vong. Tất cả S. suis đƣợc phân lập thuộc
nhóm D theo phân loại của Lancefield và týp huyết thanh 2. Chúng nhạy cảm với
penicillin G, ampicillin, cefotaxim, và ciprofloxacin. Tuy nhiên, sáu trong số chúng

có khả năng kháng cả erythromycin và clindamycin, và cũng đề kháng với
minocycline [Error! Reference source not found.].
Từ ngày 1/1/2003-31/7/2005, có 21 trƣờng hợp đƣợc xác định là nhiễm S. suis
, trong đó có 1 trƣờng hợp (5%) tử vong, 18 trƣờng hợp (86%) là nam giới và 3
trƣờng hợp (14%) là nữ . Độ tuổi trung bình là 62 tuổi (từ 26-89 tuổi), 12 trƣờng
hợp (57%) khởi phát bệnh trong tháng 5, tháng 6, tháng 7 hoặc tháng 8. Họ sống ở
các huyện khác nhau ở Hồng Kông và không có phân nhóm địa lý [Error!
Reference source not found.].

4


Gần đây, trong tháng 7-8/2005, tại tỉnh Sichuan, Trung Quốc đã xảy ra một
vụ dịch lớn do S. suis lây truyền từ lợn sang ngƣời. Tổng số 215 ngƣời mắc,
trong đó, 61 (ngƣời) 28% trƣờng hợp nhiễm khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng
nhiễm độc, 38 ngƣời chết (62%), 48% viêm màng não mủ ...Tỷ lệ tử vong trung
bình của tất cả các trƣờng hợp > 20%. Một số trƣờng hợp sau khi khỏi bệnh
nhiễm khuẩn S. suis cấp tính bị những di chứng nhƣ điếc không hồi phục, mất
thăng bằng...[Error! Reference source not found.].
Tổng số ngƣời nhiễm S. suis báo cáo cho đến khi tháng 8 năm 2006 ≈ 400, và
gần 90% các trƣờng hợp này xảy ra ở Trung Quốc, Thái Lan, Hồng Kông, Đài
Loan, và Hà Lan. Tất cả các trƣờng hợp ngƣời nhiễm S. suis đã báo cáo hầu hết là
typ 2, ngoại trừ 1 trƣờng hợp typ huyết thanh 1, 1 trƣờng hợp typs huyết thanh 4, và
1 trƣờng hợp typ kiểu huyết thanh 14 [Error! Reference source not found.].
Số lƣợng trƣờng hợp lây nhiễm S. suis ở ngƣời báo cáo đã tăng đáng kể.
Trong một bài báo xuất bản năm 2007, 409 trƣờng hợp nhiễm S. suis ở ngƣời đƣợc
báo cáo, hầu hết trong số đó xảy ra ở Trung Quốc, Thái Lan và Hà Lan, 73 trƣờng
hợp bị tử vong [Error! Reference source not found.].
Từ 2000-2011, 8 bệnh nhân bị nhiễm S. suis đã đƣợc xác định ở Đài Loan. Sáu
trƣờng hợp ban đầu đƣợc xác định nhầm là Streptococcus acidominimus, nhƣng sau

khi giải trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập đƣợc thì chúng đƣợc xác định là
S. suis. Đa số các trƣờng hợp trên đƣợc xác định là S.suis typ 2 [Error! Reference
source not found.].
Trong số 116 trƣờng hợp viêm màng não do S. suis ở Bệnh viện Bệnh nhiệt
đới Thành phố Hồ Chí Minh từ năm 1997 đến năm 2005, 115 trƣờng hợp dotyp
huyết thanh 2 và 1 trƣờng hợp do typ huyết thanh 14 [Error! Reference source not
found.].
Trong hai năm 2005 - 2006, có 72 trƣờng hợp nhiễm S.suis nhập Bệnh viện
Bệnh nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, 58 bệnh nhân (81%) là nam giới. Phần
lớn bệnh nhân là nông dân, 38% bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với lợn hay thịt lợn,
tuy nhiên chỉ có 6 bệnh nhân (8%) có tổn thƣơng da nghi ngờ. 69 bệnh nhân
(96%) biểu hiện bệnh cảnh viêm màng não nhƣ: sốt, nhức đầu, ói, cổ cứng, rối
loạn tri giác là những triệu chứng thƣờng gặp. 68% trƣờng hợp viêm màng não mủ
có triệu chứng ù tai, điếc. Một bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết bị sốc do nhiễm độc
tố liên cầu. Sau 10 đến 14 ngày dùng kháng sinh Ceftriaxone, hầu hết bệnh nhân
đều hồi phục. Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc còn nhạy cảm với
penicillin và ceftriaxone [1, Error! Reference source not found.]
Từ tháng 1/2007 đến tháng 09/2008 : 68 trƣờng hợp tại Bệnh viện Nhiệt đới
trung ƣơng.
Từ tháng 1/2006 đến tháng 12/2010 có hơn 140 trƣờng hợp viêm màng não và
nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Trung ƣơng Huế.
1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG

5


1.3.1. Đƣờng lây truyền
Streptococcus suis có thể lây truyền qua ngƣời khi tiếp xúc với lợn bệnh hay
lợn mang vi khuẩn qua các tổn thƣơng nhỏ, trầy xƣớc trên da của những ngƣời giết
mổ, chế biến và ăn thịt lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn nấu không chín. Hiện nay,

chƣa có bằng chứng bệnh liên cầu khuẩn có thể lây trực tiếp từ ngƣời sang ngƣời.
Lợn mang vi khuẩn là nguồn lây nhiễm chính. Bệnh có thể truyền qua đƣờng
hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc
lây qua kim tiêm nhiễm khuẩn.Vi khuẩn có thể vẫn có mặt ở hạch hạnh nhân của
lợn sau khi đã đƣợc điều trị bằng kháng sinh penicillin. Lợn nái có thể mang vi
khuẩn trong tử cung và âm đạo. Lợn có thể bị nhiễm vi khuẩn ở bất kỳ tuổi nào.
Khả năng nhiễm và gây bệnh của vi khuẩn ở lợn con cao hơn ở lợn trƣởng thành.
Các đàn lợn non trong trạng thái chịu stress và tiếp xúc với nguồn bệnh sẽ có khả
năng phát bệnh cao.
1.3.2. Triệu chứng
Thể lâm sàng thƣờng gặp nhất ở ngƣời mắc bệnh nhiễm trùng S. suis là viêm
màng não mủ (72,5%), nhƣng một tỷ lệ đáng kể (24,2%) thƣờng gặp là thể nhiễm
khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng nhiễm độc, có biểu hiện suy đa phủ tạng, viêm nội
tâm mạc (1,1%), viêm khớp (1,1%), viêm phổi (0,8%) và viêm phúc mạc (0,3%).
Ở thể viêm màng não mủ, bệnh nhân bị sốt cao, đau đầu, ớn lạnh, buồn nôn,
nôn và chóng mặt. Tiếp theo có thể có một hay nhiều triệu chứng sau: điếc, mất
thăng bằng, hôn mê, cứng gáy, xuất huyết, đau khớp, liệt ngoại vi hoặc liệt mặt, đau
cơ nghiêm trọng, bầm tím ban đỏ.
Ở thể sốc nhiễm trùng nhiễm độc, bên cạnh sốt cao, ớn lạnh, đau đầu, nôn,
chóng mặt, đau bụng còn thêm các dấu hiệu khác nhƣ hạ huyết áp, tim đập nhanh,
suy gan, chảy máu dƣới da, đông máu nội mạch rải rác, suy thận cấp, hội chứng suy
hô hấp cấp. Tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc thể này rất cao (>60%).
1.3.3. Biện pháp phòng bệnh
Tuyên truyền trên các phƣơng tiện thông tin truyền thông để ngƣời dân biết và
chủ động phòng tránh bệnh liên cầu khuẩn lợn [1]:
- Nên chọn mua thịt lợn đã qua kiểm định của cơ quan thú y.
- Tránh mua thịt lợn có màu đỏ khác thƣờng, xuất huyết hoặc phù nề.
- Nấu chín thịt lợn là điều rất quan trọng (Tổ chức Y tế Thế giới - WHO
khuyến cáo trên 700C). Không ăn lợn chết, không ăn các món ăn tái, đặc biệt là tiết
canh lợn trong thời gian có dịch.

- Những ngƣời có vết thƣơng hở phải đeo găng tay khi tiếp xúc với thịt lợn
tái hoặc sống.
- Phải giữ các dụng cụ chế biến ở nơi sạch sẽ, rửa sạch tay và các dụng cụ
chế biến sau khi tiếp xúc,chế biến thịt lợn. Dùng riêng các dụng cụ chế biến thịt
sống và thịt chín.

6


1.3.4. Biện pháp chống dịch
Khi nhận thấy có dịch liên cầu khuẩn, xảy ra thì phải xử lý đúng nhƣ xử lý
một ổ dịch truyền nhiễm [1]:
- Tăng cƣờng giám sát phát hiện các trƣờng hợp bị bệnh nghi nhiễm liên cầu
khuẩn lợn ở ngƣời, nên đƣa ngay đến bệnh viện để tổ chức cứu chữa kịp thời. Đặc
biệt chú ý giám sát những đối tƣợng có tiếp xúc gần với lợn bị bệnh nhƣ ngƣời chăn
nuôi, giết mổ và buôn bán lợn.
- Nghiêm cấm hoàn toàn việc di chuyển và giết mổ lợn. Không giết mổ,vận
chuyển lợn bệnh, lợn chết phải tiêu huỷ đúng cách.
1.3.5. Nguyên tắc điều trị
- Lƣu ý phát hiện sớm các trƣờng hợp có biểu hiện viêm màng não và có tiếp
xúc với lợn bị bệnh, chẩn đoán và điều trị kịp thời nhằm giảm tỷ lệ tử vong do biến
chứng gây ra.
- Điều trị kháng sinh đặc hiệu Penicilline liều cao: uống, tiêm bắp
hoặc truyền tĩnh mạch, thƣờng phải điều trị trên 10 ngày. Có thể dùng các kháng
sinh khác cũng hiệu quả nhƣ: Ampicilline, Erythromycine hoặc nhóm
Cephalosporine.
- Điều trị triệu chứng và áp dụng các biện pháp hồi sức tích cực.
- Lọc máu nếu có điều kiện.
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM
 Nuôi cấy phân lập

 Nhuộm Gram
 Phản ứng catalase
 Xét nghiệm định danh, định typ:
 Phát hiện vi khuẩn S. suis bằng phản ứng Realtime PCR
1.5. PHƢƠNG PHÁP PCR
1.5.1. Giới thiệu về phƣơng pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction –
PCR)
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại một hoặc một vài bản sao
của một đoạn DNA, tạo ra hàng ngàn, hàng triệu bản sao của một đoạn DNA có
trình tự cụ thể. Kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển vào năm 1984 bởi một nhà hóa
sinh ngƣời Mỹ tên là Kary Mullis. Mullis nhận đƣợc giải Nobel và giải thƣởng của
Nhật Bản phát triển PCR 1993. Tuy nhiên nguyên lý cơ bản của việc sao chép một
phần của DNA bằng cách sử dụng hai mồi đã đƣợc Gobind Khorana mô tả vào năm
1971. Hiện nay, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng rất phổ biến trong y tế, phòng thí
nghiệm sinh học và nhiều ứng dụng khác. Kỹ thuật PCR có tiềm năng trở thành một
trong những kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng rộng rãi nhất vì nó cho kết quả

7


nhanh, chi phí rẻ và đơn giản. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ
thể ngay cả khi số lƣợng DNA đích rất thấp. Phát triển kỹ thuật PCR đƣợc coi là
một trong những bƣớc đột phá trong sự phát triển của nền khoa học thế giới [Error!
Reference source not found.].
1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR
PCR là một phản ứng dây chuyền: Phân tử DNA đƣợc sử dụng để tạo ra 2, 4,
8… bản sao. Sự nhân lên liên tục của DNA đƣợc thực hiện bởi các protein cụ thể là
polymerase, enzyme này có khả năng tổng hợp các chuỗi DNA từ các nucleotit. Để
thực hiện tổng hợp DNA cần có 4 loại nucleotit là adenine (A), thymine (T),
cytosine (C) và guanine (G). PCR là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tạo ra nhiều

bản sao của bất kỳ sợi axit nucleic nào. Đây là một phƣơng pháp khuếch đại một
cách chọn lọc một đoạn DNA của hệ gen. Trong quy trình PCR gốc của Mullis,
DNA sợi kép đƣợc tách thành hai sợi đơn của DNA bằng cách nung nóng nó đến 96
° C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase của E.Coli bị phá hủy, cần phải bổ
sung các enzyme mới sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR này
không hiệu quả vì nó đòi hỏi nhiều thời gian, số lƣợng DNA polymerase lớn, và sự
theo dõi liên tục trong suốt quá trình PCR [Error! Reference source not found.].
1.5.3. Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi
1.5.3.1. Giới thiệu chung
PCR đa mồi là một loại phản ứng khuếch đại gen nhƣng không phải chỉ
khuếch đại một trình tự gen đích mà có thể cùng một lúc khuếch đại hai hay nhiều
hơn hai trình tự gen đích khác nhau khi sử dụng hai hay nhiều loại mồi khác nhau
(primers) với cùng một quy trình khuếch đại trong cùng một ống phản ứng. Do đó,
sử dụng PCR đa mồi có thể tiết kiệm đƣợc thời gian, công sức xét nghiệm và có khả
năng phát hiện đƣợc hai hay nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một lúc.
Phân tích đƣợc các sản phẩm khuếch đại (sản phẩm PCR) của mỗi một cá thể
(hay một tác nhân gây bệnh) từ hỗn hợp các sản phẩm PCR đã làm cho phƣơng
pháp PCR đa mồi trở thành một phƣơng pháp sàng lọc nhanh chóng, tiện lợi cho cả
lâm sàng và nghiên cứu.
Trong lĩnh vực các bệnh nhiễm trùng, PCR đa mồi là công cụ có giá trị trong
việc định danh vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng.
1.5.3.2. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi
Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi
Để có đƣợc hiệu quả cao nhất khi sử dụng PCR đa mồi trong phát hiện gen
đích ngƣời ta phải chú ý nhiều hơn tới mọi khía cạnh của kỹ thuật PCR nhƣ mồi (vị
trí, trình tự, hàm lƣợng, nhiệt độ bắt cặp); hàm lƣợng Taq polymerase; nồng độ
MgCl2; sự tƣơng quan giữa các thành phần phản ứng và gen đích… thêm nữa là các
loại thạch điện di và nồng độ thạch phối hợp.

8

Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ƣu của
tỷ lệ mồi (primer) và „khuôn‟ (DNA của tế bào đích hay „template‟). Nếu tỷ lệ này
quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi đƣợc hình thành, nhƣ vẫn xảy ra khi ta pha rất
loãng „khuôn‟ hoặc cho dƣ thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dƣ thừa 107 phân
tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn,
nồng độ mồi không đƣợc tăng vƣợt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ đƣợc
tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không đƣợc tăng lên theo số mũ
bởi vì các chuỗi đích mới đƣợc tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá
trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lƣợng một cách đáng kể) hoặc ức chế
sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lƣợng và
phức hợp của khuôn đƣợc đƣa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản
phẩm không đặc hiệu (các dimer).
Lựa chọn mồi:
Chiều dài của mỗi mồi ở khoảng 18-24 bp, nếu mồi có độ dài lớn hơn (3035bp) thì dƣờng nhƣ cũng hoạt động trong điều kiện chu kỳ tƣơng tự nhƣ mồi có độ
dài ngắn, tuy vậy mồi ở độ dài lớn có khả năng tạo các sản phẩm chính, ngăn các
sản phẩm phụ trong phản ứng đa mồi.
Nếu có thể, trình tự của mỗi mồi nên đƣợc „bắt đầu‟ và „kết thúc‟ bởi 1-2 cặp
GC.
Hai mồi trong cặp cần phải có nhiệt độ tan chảy Tm gần nhau.
Điều kiện chu kỳ và nồng độ đệm phải điều chỉnh cân xứng với mỗi cặp
primer để việc khuếch đại các vùng đích đƣợc đặc hiệu.
Nồng độ mồi
Thông thƣờng, trong mỗi phản ứng PCR đơn (khuếch đại một vùng), nồng độ
phân tử dùng cho mỗi mồi từ 100 – 500 nM. Trong phản ứng PCR đa mồi, lƣợng
mồi có thể thay đổi từ 500nM đến 15nM (trong nghiên cứu, kết quả cho thấy nếu
nồng độ mồi ở 15nM sẽ không nhìn thấy sản phẩm, ở 30 nM cho sản phẩm ít…và
sản phẩm PCR xuất hiện rõ nhất ở nồng độ 200nM). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng
nên tránh sử dụng lƣợng mồi quá cao hoặc quá thấp. Lƣợng mồi quá cao có thể gây

ức chế phản ứng PCR đa mồi, nhƣng ngƣợc lại lƣợng mồi quá ít thì không đủ để có
sản phẩm khuếch đại. Khi phản ứng khuếch đại diễn ra không đạt yêu cầu, sản
phẩm ít nên khó nhận thấy mặc dù đã tối ƣu các điều kiện của chu kỳ phản ứng thì
việc thay đổi tỷ lệ các mồi khác nhau trong phản ứng là cần thiết, bằng cách tăng
lƣợng mồi cho sản phẩm yếu hơn (vùng yếu) và giảm lƣợng mồi cho sản phẩm
mạnh hơn (vùng mạnh). Nồng độ cuối cùng của các mồi (từ 40 -500nM) có thể thay
đổi đáng kể trong vòng vùng này và thƣờng đƣợc thiết lập theo kinh nghiệm
[Error! Reference source not found.]. Với DNA có số copy thấp hoặc có tính
phức tạp cao thì nồng độ mồi nên dùng từ 300nM - 500nM (0,3 – 0,5µM). Đối với
DNA có số copy cao hoặc tính phức tạp thấp nồng độ mồi đƣợc khuyên là từ 40nM
– 400nM (0,04-0,4µM) [Error! Reference source not found.].
Sự cân xứng giữa lượng mồi và lượng DNA khuôn (DNA đích)

9


Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ƣu
của tỷ lệ mồi (primer) và „khuôn‟ (DNA của tế bào đích hay „template‟). Nếu tỷ lệ
này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi đƣợc hình thành, nhƣ vẫn xảy ra khi ta pha rất
loãng „khuôn‟ hoặc cho dƣ thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dƣ thừa 107 phân
tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn,
nồng độ mồi không đƣợc tăng vƣợt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ đƣợc
tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không đƣợc tăng lên theo số mũ
bởi vì các chuỗi đích mới đƣợc tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá
trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lƣợng một cách đáng kể) hoặc ức chế
sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lƣợng và
phức hợp của khuôn đƣợc đƣa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản
phẩm không đặc hiệu (các dimer).
Nồng độ mồi và nồng độ DNA đích:
Trong giới hạn, khi tăng nồng độ mồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đích

của phản ứng PCR. Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng đƣợc coi nhƣ một cách tối ƣu
phản ứng PCR.

10


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Streptococcus suis
Để hoàn thiện và chuẩn hoá các điều kiện của phản ứng PCR, trong đề tài đã
sử dụng chủng vi khuẩn Streptococcus suis typ 2 phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng
của ngƣời (từ máu và dịch não tủy) đƣợc lƣu giữ tại Phòng thí nghiệm “ Vi khuẩn
Hô hấp” khoa Vi khuẩn, Viện VSDTTW để tạo bệnh phẩm mô phỏng phục vụ thực
nghiệm.
Vi khuẩn S. suis gây bệnh đƣợc kiểm tra dựa trên:
- Tính chất bắt màu trong nhuộm Gram;
- Thử nghiệm Catalaze;
- Phân nhóm huyết thanh Lancefield: S. suis phải thuộc liên cầu nhóm D;
- Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng bộ sinh phẩm „API 20 Strep‟ (Bio
Mérieux);
- Xác định typ huyết thanh phổ biến gây bệnh cho ngƣời: ngƣng kết với
kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2.

Một số chủng vi khuẩn khác để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp
phát hiện
Một số chủng vi khuẩn gây viêm màng não mủ điển hình nhƣ Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae typ b và một số vi
khuẩn khác cùng nhóm liên cầu nhƣng không phải S. suis (Streptococcus pyogenes,
Streptococcus agalactiae) và tế bào bạch cầu ngƣời.

2.1.2. Dịch não tủy nền
Là loại dịch não tủy đƣợc thu thập từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp
hoặc viêm não vô khuẩn: 100 mẫu dịch não tủy thu đƣợc từ bệnh nhân có hội chứng
não cấp (HCNC) hoặc viêm não vi rút, đã đƣợc khẳng định âm tính với vi khuẩn để
tạo bệnh phẩm nền và sử dụng nhƣ mẫu chứng âm tính thật với S. suis.
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng viêm màng não
cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi đƣợc xây
dựng trong đề tài):
- 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng viêm màng
não mủ do S. suis.
+ 44 mẫu đã đƣợc khẳng định chắc chắn là vi khuẩn S. suis bằng nuôi cấy phân
lập.

11


+ 09 mẫu âm tính trong NCPL nhƣng dƣơng tính với S. suis trong PCR đơn
mồi
- 100 mẫu bệnh phẩm âm tính thực sự với vi khuẩn S. suis (cả bằng phƣơng
pháp nuôi cấy và phƣơng pháp PCR), gồm:
+ 29 mẫu từ bệnh nhân ngƣời lớn có các dấu hiệu thần kinh – liệt chi không
rõ nguyên nhân/ hội chứng não cấp).
+ 71 mẫu DNT của TE ≤ 24 tháng tuổi không có tiền sử dịch tễ liên quan
đến lợn/có chẩn đoán xác định VN vi rút hoặc vi khuẩn khác không phải
S. suis nhƣ Hib, phế cầu và não mô cầu (đƣợc lấy trong CT giám sát VMN
mủ ở TE của PTN VKHH).
2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu:
Môi trường và sinh phẩm nuôi cấy định danh vi khuẩn S. suis:
- Môi trƣờng thạch máu cừu 5% (Columbia sheep blood agar plate, BD [Cat.
251165]).

- Dung dịch H2O2 3%
- Bộ API Rapid ID 20 Strep (BioMérieux).
- Bộ kháng huyết thanh Lancefield (BioMérieux)/Streptex (Remel Cat:
30950501])
- Kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2 (serology, Đan Mạch)
- Bộ nhuộm Gram (DIFCO- Becton Dickinson, USA)
- Lam kính và lá kính phủ
Sinh phẩm tách chiết DNA của vi khuẩn:
- High pure PCR Purification Kit (Roche Co.,)
- Lysozyme (MP Biomedicals, Inc. Cat 100834).
- Mutanolysin (Sigma Co.,).
- Triton X 100
Sinh phẩm PCR:
- Ready-To-Go PCR Mastermix Kit (Amersham Co.,) hoặc Hotstartaq
Master Mix Kit (QIAgen), mỗi phản ứng bao gồm: Taq poly 2,5 units; 200µM mỗi
loại dNTP; 1,5mM MgCl2; 10mM Tris-HCl [pH9,0]; 50mM KCl; BSA [Bovine
Serum Albumine].
- 25 mM MgCl2 (Invitrogen/Fermentas)
- Nƣớc tinh sạch (Sartorius).
- Thạch Seakem GTG Agarose và Nusieve GTG Agarose (Cambrex Bio
Science Rockland, Inc. USA).
- Đệm điện di: TAE 10x (Promega Corporation USA)
- Chất nhuộm sản phẩm điện di: ethidiumbromide
- Loading buffer (Novagen Co.)
- 100bp ladder (Markers) Novagen Co..
Các cặp mồi:

12

Đề tài sử dụng các cặp mồi từ tài liệu tham khảo, đánh giá lại từng cặp, tạo tổ
hợp các cặp mồi thoả mãn các yêu cầu nghiên cứu. Bảng 1 trình bày tên và trình tự
các cặp mồi đƣợc sử dụng.

Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
[Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference
source not found.,Error! Reference source not found.]

Loại gen

Ký hiệu

Trình tự

Vị trí

Sản
phẩm
PCR
(bp)

16S-rDNA

195s &
489as2

5′- CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT -3′

172-195

294

5′- GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3′

469-490

5‟-AAG TTC CTC GGT TTT GAG CA-3‟

631-650

5‟-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3‟

1196-1177

Str2-F

5‟-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3‟

1177-1196

Str2-R

5‟-CCA TGG ACA GAT AAA GAT GG-3‟

508-527

688

epf-F

5‟-CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA-3‟

2401-2419

744

epf –R

5‟- AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG-3‟

3143-3124

Sly-F

5‟-GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA-3‟

115-134

Sly-R

5‟-CCG CGC AAT ACT GAT AAG C-3‟

344-362

arcA-F

5‟-TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC-3‟

1225-1244

arcA-R

5‟-GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG-3‟

1342-1324

Protein được
giải phóng bởi
muramidase –
MRP

mrp-F1

5‟-GAC AGA TGG TGA GGA AAA TGG-3‟

mrp-F2

5‟-ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG-3‟

3636-3655

mrp-R

5‟-TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT-3‟

3823- 3804

Cấu trúc vỏ
polysaccharide

cps2J-F

5‟-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3‟

13918-13937

cps2J-R

5‟-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC-3‟

14415-14396

cps2JJ-F

5‟- GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3‟

cps2JJ-R

5‟- CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3‟

Gdh

Gdh

Epf

Suilysin

Arginine
deminase

gdh1 &gdh2

566

248

118

188

498

(typ HT)

13

498


2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ
-

Tủ ấm CO2;
Máy đo DNA (nanodrop);
Máy ủ nhiệt (Wise Therm)
PCR Mastercycler epgradient S (Eppendorf)
Máy điện di (Weal Tec)
Máy chụp ảnh điện di (UVP)
Các loại máy ly tâm: Máy ly tâm lạnh 14000 vòng (BioFuge)…

Spin down (của Eppendorf và Nhật Bản)
Lam kính và lá kính phủ
Ống nghiệm 1.5 ml Eppendorf; ống chạy PCR 0,2ml
Các loại đâu tip có màng lọc chuyên dụng cho SHPT
Micropipet, Pipet Pasteur
Que cấy

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng
Tạo huyền dịch vi khuẩn thuần nhất, chuẩn bị DNA của vi khuẩn S. suis làm
chứng dƣơng và tạo mô hình thử nghiệm.
2.2.1.1. Khẳng định các đặc tính của vi khuẩn tạo mẫu:





Cấy mới
Tính chất bắt màu Gram
Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield
Xác định tính chất sinh học

2.2.1.2. Nghiên cứu tạo mô hình bệnh phẩm với vi khuẩn S. suis:
- Chọn 10 mẫu DNT của những bệnh nhân viêm não vi rút hoặc hội chứng
não cấp (đƣợc khẳng định không phải viêm màng não do vi khuẩn), hỗn hợp lại
(đây là dịch não tủy nền)
- Gặt vi khuẩn S. suis (đã đƣợc cấy mới và kiểm tra ở trên) từ môi trƣờng
thạch máu 5% pha vào 1ml hỗn hợp dịch não tủy đã chuẩn bị ở trên.
- Điều chỉnh độ đục ngang với thang chuẩn 0,5 Mc Farland.Tính lại số vi
khuẩn/ml (vì theo quy định của bộ so độ đục Mc Farland thì 1,5 x 108 tƣơng đƣơng

độ đục 0,5 Mc Farland, thực tế đối với vi khuẩn S. suis sẽ là bao nhiêu ở độ đục 0,5
Mc Farland?) bằng cách pha loãng tiếp bậc 10, lấy 1ml ở nồng độ pha loãng thấp
nhất (thƣờng tƣơng đƣơng 102/ml) láng đều lên đĩa thạch máu 5%, Ủ qua đêm và
đếm số khuẩn lạc. Kết quả cho thấy số lƣợng vi khuẩn S. suis tƣơng đƣơng là 1,21 x
107 vk/ µl
- Từ canh khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland, sẽ thực hiện 2 việc:

14


+ Chia nhỏ thể tích huyền dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf
(0,1ml/1ống): để thực hiện mục đích“Xây dựng phƣơng pháp xử lý dịch
não tủy đơn giản không dùng kit và đảm bảo hiệu quả”. Pha các nồng độ
vi khuẩn hơn kém nhau 10 lần nhƣ sau
+ Sử dụng 0,5ml hỗn dịch để tách DNA bằng bộ sinh phẩm „High Pure PCR
product purification‟ và enzyme mutanolysin. Sau đó đo lƣợng DNA thu
đƣợc bằng máy đo “DNA Nano drop” và pha thành các nồng độ nhỏ hơn
nhau 10 lần (pha loãng bậc 10) với dịch não tủy nền: loạt nồng độ này sử
dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trình PCR đa mồi.
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ
yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn
Yêu cầu về tổ hợp mồi:
- Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ít nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau
luôn phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis
- Kích thƣớc sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt đƣợc
- Có cùng nhiệt độ bắt cặp
- Khả năng cạnh tranh thấp
- Đạt độ nhạy và đặc hiệu
Thực hiện theo yêu cầu trên, cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi tổ hợp mồi
bao gồm 1 cặp đặc hiệu cho S. suis + 1 cặp đặc hiệu cho typ huyết thanh 2 + 1 cặp

đặc hiệu cho Suilysin/ hoặc 1,2 yếu tố độc lực phổ biến khác.
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi đƣợc sử dụng trong thử nghiệm
Tổ hợp

Các loại mồi
Đặc hiệu cho
S. suis

Typ huyết
thanh 2

Enzym ly giải
tế bào

Enzym khác

Protein ngoại bào

Tổ hợp 1

16S rDNA

Cps2J

Sly

-

-

Tổ hợp 2

16S rDNA

Cps2J

Sly

arcA

-

Tổ hợp 3

16S rDNA

Cps2J

Sly

-

Mrp

Tổ hợp 4

16SrDNA

Cps2J

Sly

arcA

Mrp

Tổ hợp 5

Gdh

Cps2J

Sly

-

-

Tổ hợp 6

Gdh

Cps2J

Sly

arcA

-

Tổ hợp 7

Gdh

Cps2J

Sly

-

Mrp

Tổ hợp 8

Gdh

Cps2J

Sly

arcA

Mrp

Tổ hợp 9

Strep2

Cps2J

Sly

-

-

Tổ hợp 10

Strep2

Cps2J

Sly

arcA

-

Tổ hợp 11

Strep2

Cps2J

Sly

-

Mrp

Tổ hợp 12

Strep2

Cps2J

Sly

arcA

mrp

Tổ hợp 13

16S rDNA

Cps2JJ

Sly

-

-

Tổ hợp 14

16S rDNA

Cps2JJ

Sly

arcA

-

15


Tổ hợp 15

16S rDNA

Cps2JJ

Sly

-

Mrp

Tổ hợp 16

16SrDNA

Cps2JJ

Sly

arcA

Mrp

Tổ hợp 17

Gdh

Cps2JJ

Sly

-

-

Tổ hợp 18

Gdh

Cps2JJ

Sly

arcA

-

Tổ hợp 19

Gdh

Cps2JJ

Sly

-

Mrp

Tổ hợp 20

Gdh

Cps2JJ

Sly

arcA

Mrp

Tổ hợp 21

Strep2

Cps2JJ

Sly

-

-

Tổ hợp 22

Strep2

Cps2JJ

Sly

arcA

-

Tổ hợp 23

Strep2

Cps2JJ

Sly

-

Mrp

Tổ hợp 24

Strep2

Cps2JJ

Sly

arcA

Mrp

Kỹ thuật sử dụng để đánh giá:
- Kỹ thuật PCR thông thƣờng (đơn mồi và đa mồi đƣợc xây dựng trong
đề tài)
- Kỹ thuật điện di
2.2.3. Nghiên cứu tối ƣu chu trình nhiệt
Thực nghiệm thay đổi các điều kiện về nhiệt độ biến tính, thời gian biến tính,
nhiệt độ bắt cặp, thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài, số chu kỳ, bổ sung thêm chu
trình nhiệt phụ... để chọn ra chƣơng trình PCR đa mồi thích hợp với mục tiêu “phát
hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến”
Kỹ thuật sử dụng trong suốt nghiên cứu là PCR với các chƣơng trình nhiệt
thay đổi để lựa chọn những điều kiện cho hiệu quả cao nhất.
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi đƣợc thử nghiệm
TT

Giai đoạn đầu

Giai đoạn chính

Giai đoạn
sau cùng

Ghi chú

1

960C (3‟)

940C (30”); 550C (30”);
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (5‟)

Thêm giai đoạn nhiệt độ
cao lúc khởi đầu

2

960C (3‟)

940C (30”);550C (30”);
720C (1‟)40 chu kỳ

720C (5‟)

CT1+Tăng số chu kỳ
chính

3

960C (3‟)

940C (30”);550C (30”);
720C (1‟); 35 chu kỳ

720C (5‟)

CT1+Tăng thời gian bắt
cặp

4

960C (3‟)

940C (30”);550C (60”);
720C (1‟); 40 chu kỳ

720C (5‟)

CT1+Tăng số chu kỳ
chính + Tăng thời gian
bắt cặp

5

960C (3‟)

940C (30”); 550C (30”);
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (10’)

CT1 + Tăng thời gian kéo
dài cuối cùng

6

960C (3‟)

940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (5‟)

CT1 + tăng nhiệt độ bắt
cặp

16


7

960C (3‟)

940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟)40 chu kỳ

720C (5‟)

CT2 + tăng nhiệt độ bắt
cặp

8

960C (3‟)

940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟); 35 chu kỳ

720C (5‟)

CT3 + tăng nhiệt độ bắt
cặp

9

960C (3‟)

940C (30”); 600C (60”);
720C (1‟); 40 chu kỳ

720C (5‟)

CT4 + tăng nhiệt độ bắt
cặp

10

960C (3‟)

940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (10’)

CT5 + tăng nhiệt độ bắt
cặp

11

950C (3‟); 600C (30”); 940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (5‟)

CT phụ + CK8

12

950C (3‟); 600C (60”); 940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (5‟)

CT11+Tăng thời gian bắt
cặp của chu trình phụ

13

950C (3‟); 600C (60”); 940C (30”); 600C (60”);

720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);35 chu kỳ

720C (5‟)

CT12+ Tăng thời gian bắt
cặp của chu trình chính

14

950C (3‟); 600C (60”); 940C (30”); 600C (60”);
720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);40 chu kỳ

720C (5‟)

CT 13 + Tăng thêm chu
kỳ chính

15

950C (3‟); 600C (60”); 940C (30”); 600C (60”);
720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);40 chu kỳ

720C (7’)

CT14 + Tăng thời gian
kéo dài cuối cùng

16

960C (3‟); 600C (60”); 940C (30”); 600C (60”);
720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);40 chu kỳ

720C (7’)

CT15 + Tăng nhiệt độ chu
trình phụ

17

960C (3‟); 600C (30”); 940C (30”); 600C (30”);
720C (1‟), 3 chu kỳ
720C (1‟);40 chu kỳ

720C (7’)

CT16 + Giảm thời gian
bắt cặp

2.2.4. Nghiên cứu tối ƣu các thành phần tham gia phản ứng
Thực nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng các chất tham gia phản ứng
và một số chất có thể gây ức chế phản ứng PCR có mặt trong mẫu bệnh phẩm dịch
não tủy (các dNTP, Taq polymerase, muối MgCl2, NaCl, chất xử lý nhày...): thay
đổi hàm lƣợng, đánh giá bằng PCR đa mồi đã đƣợc tối ƣu điều kiện ở trên.
Lựa chọn thạch điện di và nồng độ thạch điện di để đảm bảo phát hiện sản
phẩm PCR đa mồi.
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực

của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng trong nghiên cứu. Tính
ổn định của PCR đa mồi.
- Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một
dải nồng độ từ 106 đến 1 copy/µl (là sản phẩm của 2. 2. 1)
- Sử dụng tổ hợp mồi (là sản phẩm của 2.2. 2)
- Sử dụng chƣơng trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng (là sản phẩm của 2. 2. 3)
- Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ƣu ((là sản
phẩm của 2. 2. 4)

17


- Phát hiện sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di.
- Phản ứng đƣợc lặp lại 10 lần để đánh giá khả năng bền vững và ổn định của
phƣơng pháp phát hiện bằng PCR đa mồi.
2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với
những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis
- Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một
nồng độ, chọn nồng độ 106 vk/µl.
- Sử dụng tổ hợp mồi đƣợc lựa chọn
- Sử dụng chƣơng trình PCR đa mồi tối ƣu đƣợc xây dựng
- Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ƣu
- Phát hiện sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên thạch agarose.
- Phản ứng đƣợc thực hiện với mẫu tế bào đích của từng loại vi khuẩn khác
nhau nhƣng gây bệnh cảnh lâm sàng viêm màng não mủ giống S. suis hoặc có đặc
điểm cấu tạo giống S. suis và của bạch cầu ngƣời để kiểm tra sự không bắt cặp chéo
(đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng phát hiện vi khuẩn và đặc tính vi
khuẩn S. suis).
2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis
Từ huyền dịch vi khuẩn S. suis thuần khiết đã đƣợc chuẩn độ ở trên, chúng tôi

nghiên cứu các phƣơng pháp tách chiết đơn giản DNA của vi khuẩn trực tiếp trong
bệnh phẩm và đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của S. suis bằng thực nghiệm phát
hiện bởi PCR đa mồi đƣợc xây dựng dành cho vi khuẩn S. suis nhƣ sau:
2.2.7.1. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt độ có kết hợp enzyme (hỗ trợ phá vỡ tế bào):
Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hình là „DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ‟):
- Lấy 100µl vào ống Eppendorf + lysozym (nồng độ cuối 2mg/ml), ủ ở các
thời gian nhƣ sau: ủ 370C/15‟; ủ 370C/30‟. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây:
560C/30‟; 1000C/10‟.
- Lấy 100µl vào ống Eppendorf + Mutanolysin (nồng độ cuối 1mg/ml), ủ ở
các thời gian sau: ủ 370C/15‟; ủ 370C/30‟. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây:
560C/30‟; 1000C/10‟.
2.2.7.2. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt đơn thuần (đơn giản hơn): chọn nhiệt độ,
chọn thời gian xử lý nhiệt.
- Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hình là „DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ‟), lấy
500µl vào ống Eppendorf → ly tâm 15.000 vòng/10 phút, giữ lại 100 µl cặn +5µl
Triton x 100.
- Xử lý nhiệt ở các loại nhiệt độ nhƣ sau: 1000C/10phút; 1000C/15 phút;
1000C/20 phút; 1000C/35 phút; 900C/30‟; 900C/60‟; 850C/35 phút; 850C/60 phút;
800C/35phút; 800C/60phút; 800C/75phút; 800C/90phút.
2.2.8. Áp dụng toàn bộ các quy trình đã xây dựng (xử lý bệnh phẩm, PCR đa
mồi) để phát hiện vi khuẩn S. suis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng.

18


- Sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng
nghi viêm màng não mủ do vi khuẩn S. suis để đánh giá tính hiệu quả của kỹ thuật
xử lý đơn giản và quy trình PCR đa mồi. Số lƣợng mẫu bệnh phẩm tùy thuộc điều
kiện thực tế thu đƣợc trong thời gian nghiên cứu, cụ thể ở nghiên cứu (NC) này là
53 mẫu bệnh phẩm thu đƣợc từ ngƣời mắc bệnh nghi do S. suis

- So sánh kết quả phát hiện bằng PCR đa mồi với kết quả phát hiện bằng nuôi
cấy phân lập và bằng PCR đơn mồi.
- Phân tích các giá trị dƣơng tính thực và âm tính thực của phƣơng pháp PCR đa
mồi.
2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƢƠNG PHÁP
2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dƣơng tính và âm tính
Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm màng não nghi do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S.
suis):
- Lâm sàng: có các dấu hiệu nhiễm trùng hệ thần kinh trung ƣơng – viêm
màng não (sốt, đau đầu, buồn nôn, nôn, cứng gáy, lơ mơ, hôn mê, bầm tím, ban
đỏ…).
- Có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/sản phẩm sống của lợn (giết mổ, bán,
ăn tiết canh..)
Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định viêm màng não do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn
(S. suis) nhằm mục đích phân tích so sánh kết quả của phương pháp nuôi cấy
phân lập và phương pháp PCR đa mồi như sau:
- Lâm sàng: có dấu hiệu viêm màng não nói chung
- Có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn ốm/sản phẩm sống của lợn hoặc nghề
nghiệp liên quan đến lợn/sản phẩm sống của lợn.
- Xác định đƣợc tác nhân gây bệnh bởi một trong hai phƣơng pháp hoặc bằng
nuôi cấy phân lập hoặc bằng việc phát hiện đƣợc gen đặc hiệu của vi khuẩn bởi kỹ
thuật PCR (đơn mồi hay đa mồi)
Viêm màng não không do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis):
Mẫu âm tính do không phải vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn khi cấy bệnh phẩm
không có S. suis và/hoặc không phát hiện đƣợc vật liệu di truyền của vi khuẩn bởi
PCR.
Chú ý:
Tiêu chuẩn trên được sử dụng trong trường hợp phân tích, so sánh kết quả của
phương pháp nuôi cấy và PCR đa mồi (phương pháp thử nghiệm).
Kết quả của PCR đa mồi cũng đƣợc so sánh với kết quả phát hiện của PCR

đơn mồi (đƣợc tiến hành trên cùng 1 mẫu bệnh phẩm).

19


2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phƣơng pháp [Error!
Reference source not found., Error! Reference source not found.]
Các chỉ số gồm: độ nhậy (Se), độ đặc hiệu (Sp), tỷ lệ dƣơng tính giả, tỷ lệ âm
tính giả, giá trị tiên đoán dƣơng tính (PPV), giá trị tiên đoán âm tính (NPV), tỷ
+

số dự báo khả năng mắc bệnh khi xét nghiệm dƣơng tính (LR ), tỷ số dự báo khả
–

năng không mắc bệnh khi xét nghiệm âm tính (LR ).
Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số

Phƣơng pháp đã công bố

Phƣơng pháp
thử nghiệm

Tổng

Dƣơng tính

Âm tính

Dƣơng tính

a

b

a+b

Âm tính

c

d

c+d

a+c

b+d

a+b+c+d

Tổng
Độ nhạy hay tỷ lệ dƣơng tính thật =
Độ đặc hiệu hay tỷ lệ âm tính thật =
Tỷ lệ dƣơng tính giả
=
Tỷ lệ âm tính giả
=

a/(a+c)
d/(b+d)

b/(b+d)
c/(a+c)
+

Tỷ số dƣơng khả dĩ - Tỷ số dự báo khả năng bệnh khi xét nghiệm dƣơng tính (LR )
+

LR

= Độ nhạy/ (1- độ đặc hiệu)

Tỷ số âm khả dĩ - Tỷ số dự báo không mắc bệnh khi xét nghiệm âm tính (LR)
-

LR = (1- độ nhạy)/ độ đặc hiệu
Giá trị dự đoán dƣơng tính (PPV) = a/ (a+b)
Giá trị dự đoán âm tính (NPV)
= d/ (c+d)
Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR - liên quan đến khả năng mắc bệnh và không mắc bệnh

Mức độ

Khả năng mắc bệnh

+

LR
 10
5-10
2-5

2
1

. Mức độ LR 0.1
0.1-0.2
0.2-0.5
 0.5
1

Cao
Trung bình
Thấp
Rất thấp
Vô dụng

20

Khả năng không mắc
bệnh
Cao
Trung bình
Thấp
Rất thấp
Vô dụng


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN
3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng

Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm mẫu

Phƣơng pháp thử nghiệm

TT

Kết quả thử nghiệm

1

Tính chất bắt màu Gram

Gram (+)

2

Phản ứng catalase

Âm tính

3

Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield

Nhóm D

4

Xác định tính chất sinh học

Typ huyết thanh 2

3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp:

bp

M

TH1

TH2

TH3

TH4

TH5

TH6

TH7

TH8

500
200
100

Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; TH: Tổ hợp mồi

Ở tất cả các tổ hợp mồi, các băng DNA đều hiện rõ ở vị trí 498 bp (tƣơng
ứng với sản phẩm của cặp mồi Cps2J, đặc hiệu cho týp huyết thanh 2), và vị trí 248
bp (tƣơng ứng với sản phẩm của cặp mồi đặc hiệu cho enzym ly giải tế bào sly. Nhƣ

21


vậy hai cặp mồi Cps2J và Sly đều hoạt động rất tốt trong cả 8 tổ hợp. Đối với các tổ
hợp mồi từ 1 đến 4, các vạch DNA là sản phẩm của mồi đặc hiệu cho S.suis 16S
rDNA đều biểu hiện tốt.Tuy nhiên ở TH3 và TH4, cả 2 sản phẩm của cặp mồi Mrp
có kích thƣớc 188 bp đều không biểu hiện. Tất cả các tổ hợp từ 5 đến 8, sản phẩm
của 2 cặp mồi Gdh và Cps2J biểu hiện không rõ ràng. Chỉ có TH1 và TH2, sản
phẩm của tất cả các cặp mồi đều đƣợc biểu hiện, các vạch DNA phân tách rõ ràng,
dễ quan sát.
bp

M

TH9 TH10

TH11 TH12 TH13

TH14 TH15 TH16

500
300
200
100

Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; TH: Tổ hợp mồi

Hình 3.2 cho thấy sản phẩm của các tổ hợp mồi từ 9 đến 12 đều đƣợc biểu hiện
trên bản gel nhƣng những vạch này rất mờ; ở tổ hợp 15 và 16, các sản phẩm hiện rõ nét
hơn. Tuy nhiên, kết quả điện di sản phẩm của các cặp mồi trên đều xuất hiện những
vạch DNA không đặc hiệu. Ở tổ hợp 13 và 14, sản phẩm của các cặp mồi đều biểu hiện
đầy đủ và rõ nét, hơn nữa không xuất hiện sản phẩm phụ trong kết quả điện di.
Nhƣ vậy, từ các thử nghiệm trên cho thấy trong 24 tổ hợp mồi, chỉ có tổ hợp
mồi 1, 2, 13 và 14 là phù hợp và cho kết quả rõ ràng khi sử dụng để phát hiện S.suis
bằng phƣơng pháp PCR đa mồi
Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp đƣợc lựa chọn trong thí nghiệm

Tổ hợp

Tổ hợp 1

Loại mồi
Đặc hiệu cho
Typ huyết
Enzym ly giải
thanh 2
S. suis
tế bào
(KTSP : 294 bp) (KTSP: 498bp) (KTSP: 248 bp)
16S rDNA

Cps2J

22

Sly

Enzym khác
(KTSP: 118 bp)

-


Tổ hợp 2

16S rDNA

Cps2J

Sly

arcA

Tổ hợp 13

16S rDNA

Cps2JJ

Sly

-

Tổ hợp 14

16S rDNA

Cps2JJ

Sly

arcA

3.1.3. Xác định điều kiện tối ƣu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S. suis và
một số yếu tố độc lực phổ biến
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện S.suis
Các điều kiện phản ứng đƣợc
thử nghiệm

Ảnh hƣởng tốt đến khả
năng phát hiện của
PCR

Không tác động đến
khả năng phát hiện của
phản ứng PCR

Thêm 1 bƣớc gia nhiệt phụ lúc
khởi đầu

X

Tăng thời gian bắt cặp

X

Tăng số chu kỳ chính

X

Tăng cả thời gian bắt cặp và số
chu kỳ chính

X

Tăng thời gian kéo dài cuối cùng

X

Thay đổi nhiệt độ bắt cặp + lần
lƣợt những thay đổi trên

X

Thêm chu trình nhiệt phụ (gồm
đủ 3 bƣớc gia nhiệt) trƣớc khi
vào chu trình nhiệt chính

X

Thêm chu trình nhiệt phụ, thay
đổi thời gian kéo dài

X

Thêm chu trình nhiệt phụ, thay
đổi thời gian bắt cặp, tăng dần
số chu kỳ chính

X

Thêm chu trình nhiệt phụ, thay
đổi nhiệt độ biến tính, tăng số
chu kỳ chính

X

Cụ thể:
- Thêm chu trình nhiệt phụ: có 3 chu kỳ của: 960C x 3 phút; 600C x 30 giây;
720C x 1 phút.
- Nhiệt độ bắt cặp thích hợp, thời gian và số chu kỳ hợp lý trong chu trình chính:
là chu trình nhiệt thứ hai với 40 chu kỳ của: 940C x 30 giây; 600C x 30 giây; 720C x 1
phút.
- Thời gian kéo dài sản phẩm ở giai đoạn nhiệt cuối cùng: 720C x 7 phút.

23


Sản phẩm đích rõ nét, không có hiện tƣợng cạnh tranh. Kết quả đƣợc minh
họa ở hình 3.3

Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ƣu phát hiện trực tiếp S. suis
trong bệnh phẩm
M: thang DNA chuẩn 100bp

Sp1: chủng vi khuẩn S. suis chuẩn (S. suis + TE)
Sp2: Bệnh phẩm mô phỏng (DNT chứa S. suis đã
chuẩn độ)

1: Sản phẩm PCR đại diện cho typ HT 2
2: Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu S. suis
3: Sản phẩm PCR đại diện enzym ly giải của
S.suis

3.1.4. Tối ƣu hóa các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát hiện vi
khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi đƣợc khảo sát
Thành phần đƣợc thử nghiệm

Tăng hàm lƣợng Taq
polymerase > 1,5u/pƣ

Ảnh hƣởng tốt
đến khả năng phát
hiện của PCR

Không tác động đến khả
năng phát hiện của phản ứng
PCR/ảnh hƣởng xấu

X

Giảm hàm lƣợng Taq
polymerase < 1,5u/pƣ

X

Tăng hàm lƣợng dNTPs
> 200µM

X

Giảm hàm lƣợng dNTPs
< 200µM

X

24