luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc điểm đoạn cDNAEST từ cây chè bản địa thái nguyên

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

NGUYỄN THỊ HẠNH

1


0949.141.000

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến - Giảng
viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người
đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm đề tài.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Dương Trung
Dũng – giảng viên trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời
gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè,
đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt
thời gian qua.
Tác giả
NGUYỄN THỊ HẠNH

2


3


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Viết đầy đủ
bp
Cặp base
Diethylpyrocarbonate
DEPC
Complementary DNA
cDNA
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate
đtg
Đồng tác giả
DTT
EDTA
Ethyen Diamin Tetraacetic Acid
EtBr
Ethidium Bromide
Kb
Kilobase
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RNA
Ribonucleic Acid
SSR
Simple Sequence Repeat (đoạn lặp lại trình tự đơn giản)
TAE
Tris acetat EDTA

4


MỞ ĐẦU
1.

Lí do chọn đề tài
Cây chè là loài cây công nghiệp dài ngày, có nguồn gốc từ vùng khí hậu Nhiệt
đới và Á nhiệt đới. Chè có nhiều vitamin có giá trị dinh dưỡng và bảo vệ sức khoẻ,
có tác dụng giải khát, bổ dưỡng và kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hoá
các chất mỡ, giảm được bệnh béo phì, chống lão hoá … Do đó nước chè đã trở thành
thứ nước uống của nhân loại. Ngày nay, hầu hết dân cư trên thế giới dùng nước chè
làm nước uống hàng ngày. Một số nước uống chè thành tập quán và tạo ra được một
nền văn hoá nguyên sơ là “văn hoá trà”.
Ngoài để uống người ta còn dùng nước chè xanh để rửa các vết thương những
chỗ lở loét, nhiễm trùng trên cơ thể. Vì thế chè không những có tên trong danh mục
giải khát mà còn có tên trong từ điển y học, dược học. Người Nhật Bản khẳng định
chè cứu người khỏi bị nhiễm xạ và gọi đó là thứ nước uống của thời đại nguyên tử.
Ở vùng Tây Nam Trung Quốc thời cổ đại đã dùng lá chè làm vật trao đổi ngang giá
và thứ thuốc tiên. Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như:
giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc
đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn (Đỗ Ngọc Quý, Đỗ Thị
Ngọc Oanh, 2008).

Chè có giá trị sử dụng và là hàng hoá có giá trị kinh tế cao, và là một sản
phẩm xuất khẩu có giá trị trên thị trường thế giới.Thị trường trong nước và thế giới
đòi hỏi về chè ngày càng nhiều với yêu cầu chất lượng ngày càng cao. Tuy vậy,
những hiểu biết về các quá trình sinh học bên trong cây chè vẫn còn rất hạn chế.
Kích thước genome chè là rất lớn (khoảng 4 Gb) (Shi et al., 20110) nên việc
giải mã toàn bộ genome đòi hỏi thời gian nhiều năm và chi phí ước tính hàng chục
triệu đô la. Ngày nay, để làm sáng tỏ các quá trình sinh học ở chè, các nhà khoa học
cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu cây chè ở mức độ phân tử.
5


Để làm sáng tỏ vai trò và ứng dụng của chè cần phải nghiên cứu về gen và
genome nhằm cung cấp các thông tin di truyền về cấu trúc và chức năng của các gen
quan trọng quy định nên sản phẩm chè. Phương pháp phân lập và phân tích các đoạn
trình tự gene biểu hiện (Expressed Sequence Tag, EST/cDNA) là một trong các
phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm tập trung nghiên cứu các gen chức
năng.
Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu cơ bản tiếp theo về cấu trúc genome và
nghiên cứu sự biểu hiện các gen chức năng ở chè, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm đoạn cDNA/EST từ cây chè bản địa Thái
Nguyên”.
2.

Mục tiêu đề tài
Tạo dòng và xác định được đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST từ cây chè bản địa
Thái Nguyên phục vụ cho các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo.

3.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu
sau:

1.

Nghiên cứu tạo dòng tái tổ hợp mang đoạn cDNA/EST ngẫu nhiên được tổng hợp từ

2.

mRNA của cây chè bản địa Thái Nguyên.
Xác định và phân tích đặc điểm trình tự của đoạn cDNA/EST đã được tạo dòng từ
cây chè bản địa Thái Nguyên

6


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1
1.1.1

Giới thiệu chung về cây chè
Phân loại
Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O. Kumtze và thuộc hệ thống
phân loại sau :
Giới thực vật – Plantae
Ngành Ngọc Lan (Angiospermae)
Lớp Ngọc lan ( Dicotyledonea)
Bộ chè (Theales)
Họ chè (Theaceae)
Chi chè (Camellia hoặc Thea)

Loài (Camellia sinensis)
Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới và
cận nhiệt ở cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á. Ở Việt Nam có
khoảng 11 chi với trên 200 loài.
Dựa vào các đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hóa, nguồn gốc phát sinh
cây chè Cohen Stuart chia Camellia Sinensis ra làm bốn loại:
a) Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. Bohea)
Đặc điểm:
- Cây bụi thấp phân cành nhiều.
- Lá nhỏ, dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, lá dài 3,5 - 6,5 cm.
- Có 6 - 7 đôi gân lá không rõ, răng cưa nhỏ, không đều.
- Búp nhỏ, hoa nhiều, năng suất thấp, phẩm chất bình thường.

7


0
0
- Khả năng chịu rét ở độ nhiệt -12 C đến -15 C.
Phân bố chủ yếu ở miền đông, đông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số
vùng khác.
b) Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. macrophylla)
Đặc điểm:
- Thân gỗ nhỡ cao tới 5m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên.
- Lá to trung bình chiều dài 12 - 15 cm, chiều rộng 5 - 7 cm, màu xanh nhạt, bóng,
răng cưa sâu không đều, đầu lá nhọn.
- Có trung bình 8 - 9 đôi, gân lá rõ.
- Năng suất cao, phẩm chất tốt.
Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc).
c) Chè Shan (Camellia sinensis var. Shan)

Đặc điểm:
- Thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m.
- Lá to và dài 15 - 18 cm màu xanh nhạt, đầu lá dài, răng cưa nhỏ và dày.
- Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết, nên còn gọi là chè
tuyết. - Có khoảng 10 đôi gân lá.
- Có khả năng thích ứng trong điều kiện ấm ẩm, ở địa hình cao, năng suất

8


cao, phẩm chất thuộc loại tốt nhất.
Nguyên sản ở Vân Nam - Trung Quốc, miền Bắc của Miến Điện và
Việt Nam.
d) Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var.
assamica) Đặc điểm:
- Thân gỗ cao tới 17 m phân cành thưa.
- Lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh đậm, dạng lá hình bầu
dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài.
- Có trung bình 12 - 15 đôi gân lá.
- Rất ít hoa quả.
- Không chịu được rét hạn.
- Năng suất, phẩm chất tốt.
Trồng nhiều ở Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số
vùng khác.
1.1.2

Nguồn gốc và phân bố
a) Nguồn gốc
Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểm khác
nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sơ về lịch sử, khảo cổ học và thực

vật học. Một số quan điểm được nhiều nhà khoa học công nhận nhất là:
+ Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc:
Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của
cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm. Theo các tài
liệu Trung Quốc thì cách đây trên 4000 năm người Trung Quốc đã biết dùng chè
làm dược liệu và sau đó là để uống. Năm 1753, Carl Van Linnacus, nhà thực vật
học lần đầu tiên trên thế giới đã xác định Trung Quốc là vùng nguyên sản của cây
chè và định tên khoa học của cây chè là Thea sinensis, phân thành 2 loại: Thea
bohea và Thea viridis.


Theo Daraselia Gruzia (1989) thì các nhà khoa học Trung Quốc như:
Schenpen, Jaiding, …đã giải thích cây chè mẹ ở Trung Quốc như sau: Tỉnh Vân
Nam là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ về các con sông ở Việt Nam,
Lào, Campuchia, Mianma. Đầu tiên cây chè mọc ở Vân Nam, sau đó hạt chè di
chuyển theo dòng nước đến các nước nói trên và sau đó lan dần ra các nơi khác,
dọc theo cao nguyên Tây Tạng.
+ Cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam (Ấn Độ):
Năm 1823, R.Bruce đã phát hiện được cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn
Độ), từ đó các học giả người anh cho rằng: Nguyên sản của cây chè là ở vùng
Atxam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc.
+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam:
Những công trình nghiên cứu của Đjemukhatze (1961 – 1976) về phức
catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất
catechin giữa các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận
điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc của
cây chè. Đjemukhatze đã kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa,
tổng hợp chủ yếu là (-) – epicatechin galat, ở chúng có khả năng tổng hợp (-) epigalocatechin và các galat của nó để tạo (+) galocatechin chậm hơn. Nghiên
cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chủ yếu là tổng hợp (-) – epicatechin và
(-) – epicatechin galat (chiếm 70% tổng các loại catechin). Khi di thực các cây

chè dại này lên phía Bắc với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng sẽ
thích hợp dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechin phức
tạp hơn, cùng với tạo thành (-) epigalocatechin và các galat của nó. Điều đó có
nghĩa là trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình hidroxil hóa và
galil hóa. Từ những biến đổi hóa sinh này của các cây chè dại và cây chè được
trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là “ Nguồn gốc cây chè
chính là ở Việt Nam”. Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè thế giới sau đây: Camellia
→ Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to → Chè Trung Quốc → Chè Assam (Ấn
Độ ).
Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm nêu trên đều có sự thống nhất rằng:


cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm.
Hiện nay cây chè phân bố khá rộng rãi trong những điều kiện tự nhiên rất
khác nhau, từ 30 vĩ độ nam (Natan – Nam Phi) đến 45 vĩ độ bắc (Gruzia – Liên
Xô), là những nơi có điều kiện tự nhiên rất khác xa vùng nguyên sản.
b)

Phân bố
Sự phân bố của cây chè phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu. Các kết quả

nghiên cứu đều đưa đến một kết luận chung là: Vùng khí hậu nhiệt đới, á nhiệt
đới thích hợp cho cây chè. Ngày nay, do trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng
phát triển đã lai tạo, chọn lọc ra nhiều giống chè khác nhau và được trồng rộng rãi
ở nhiều nước khác nhau trên thế giới. Theo Đỗ Ngọc Quỹ[10], thì hiện nay chè
được phân bố khá rộng từ 42º vĩ Bắc Pochi (Liên Xô cũ) đến 27º Nam Coriente
(Achentina).
Sự phân bố của cây chè theo điều kiện khí hậu đất đai và địa hình cũng có sự
khác nhau. Đất trồng chè tốt phải nhiều mùn, thoát nước tốt và có độ dốc thoải.
Ảnh hưởng của độ cao đã hình thành nên các vùng chè với nhiều giống chè, chất

lượng khác nhau. Các nhà khoa học cho rằng: Chè trồng ở những vùng có độ cao
lớn hơn so với mặt nước biển thường có chất lượng tốt hơn so với chè trồng ở
vùng thấp.
Về điều kiện khí hậu, chè sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 15ºC đến
20ºC, tổng nhiệt độ hàng năm vào khoảng 8.000ºC; lượng mưa trung bình hàng
năm 1500 – 2000 mm; độ ẩm đất 70 - 80%. Tuy nhiên với khả năng thích nghi
rộng cùng với sự tiến bộ của khoa học hiện nay chè được trồng ở những vùng
khắc nghiệt hơn
1.1.3

Đặc điểm thực vật của cây chè
Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặc thân
bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và mang
một số đặc điểm sinh học sau đây:
Đặc điểm hình thái
Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và chồi.


Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng.
Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành. Trên cành chia ra làm nhiều đốt,
chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 – 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh trưởng.
Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm, xanh nhạt,
màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám.
Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh dưỡng
mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả. Chia theo vị trí trên cành có: chồi
ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành).
Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng cưa,
chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm. Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồi lõm, láng
bóng. Hệ gân lá hình mạng lông chim. Lá chè có thể có hình thuôn, mũi mác, ô
van, trứng gà, gần tròn. Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù. Lá chè thường

thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống, điều kiện tự nhiên
và điều kiện canh tác. Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo ra các các sản phẩm
chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trong các lá này khác nhau.
Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng, có khi
lại hơi phớt hồng. Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhị đực trung
bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt phấn hình tam
giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim). Bầu nhị cái có 3 - 4 ô, chứa 3 - 4
noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba. Ở gốc bầu nhụy có tuyến mật
làm thành một vòng tròn gọi là đĩa.
Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả chè có dạng hình tròn,
tam giác, vuông tùy theo số hạt. Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín
chuyển xang màu xanh thẫm hoặc nâu. Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt
chè. Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác. Hạt chè có khối
lượng từ 0,6 – 2g thường từ 1- 1,6g.
Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu nâu,
cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng.


Hệ rễ: Gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu đỏ và
rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà.
Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè
Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là 22 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng nước cần
thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè. Loại đất thích hợp cho trồng chè
dày 60 – 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn
3 - 4 %.
Sinh trưởng và phát triển của cây chè
Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm
suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển
nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một
năm.

1.1.4

Đặc điểm di truyền của cây chè
Chè là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới nhưng cho đến nay,
vẫn chưa có nhiều thông tin về hệ gen của cây chè. Những nghiên cứu trước đây
đã cho ra những kết quả rất khác nhau. Năm 2001, nghiên cứu của Hanson cho
thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia sinensis vào khoảng 15.298 Mbp.
Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các
giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ gen của cây chè được ước tính
khoảng 4 Gbase. Nghiên cứu tế bào học các giống chè của Kondo (1979) đã xác
định cây chè là loài thực vật lưỡng bội (2n = 30, số nhiễm sắc thể cơ sở là 15)
và kiểu nhân (karotype) biến đổi khác nhau giữa các giống chè.
Nói chung, các nhiễm sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu hướng kết
lại với nhau thành khối. Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh ngắn
của nhiễm sắc thể) của 15 cặp nhiễm sắc thể trong khoảng 1,00 đến 1,9. Sự
đồng nhất của các nhiễm sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc điểm cùng nguồn
(monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia.


1.1.5

Thành phần hóa sinh trong cây chè
Phẩm chất của chè thành phẩm được quyết định do những thành phần hóa
học của nguyên liệu và kỹ thuật chế biến. Thành phần sinh hóa của chè biến
động rất phức tạp nó phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện đất đai, địa hình,
kỹ thuật canh tác, mùa thu hoạch... Trên cơ sở nắm được những đặc điểm chủ
yếu về mặt sinh hóa của nguyên liệu sẽ đặt cơ sở cho một số biện pháp kỹ thuật
để nâng cao sản lượng đồng thời giữ vững và nâng cao chất lượng của chè.
Những thành phần sinh hóa chủ yếu trong búp chè gồm có:
Nước: Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè: nước có quan hệ đến quá

trình biến đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các men, là chất
quan trọng không thể thiếu được để duy trì sự sống của cây. Hàm lượng nước
trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời
gian hái và tiêu chuẩn hái v.v... Trong búp chè (tôm + 3 lá) hàm lượng nước
thường có từ 75 - 82%. Để tránh khỏi sự hao hụt những vật chất trong búp chè
qua quá trình bảo quản và vận chuyển, phải cố gắng tránh sự giảm bớt nước trong
búp chè sau khi hái.
Tanin: Tanin là một trong những thành phần chủ yếu quyết định đến phẩm
chất chè. Tanin còn gọi chung là hợp chất fenol, trong đó 90% là các dạng
catechin. Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của tanin chè không giống
nhau và tùy theo từng giống chè mà thay đổi. Những hợp chất này dựa vào tính
chất của chúng có thể phân thành:
- Dạng tan được trong este: phân tử lượng 320 - 360.
- Dạng tan trong nước hoặc xeton: phân tử lượng 420 - 450.
- Dạng kết hợp với protein (chỉ sau khi dùng dung dịch NaOH 0,5% để xử lý,
mới có thể hòa tan trong dung dịch).
Các dạng catechin như epicatechin galat, epigalocatechin galat tham gia vào
quá trình sinh trưởng của cây.


Về mặt phẩm chất chè, tanin giữ vai trò chủ yếu trong việc tạo thành màu
sắc, hương vị của chè (nhất là đối với việc chế biến chè đen), vì vậy trong quá
trình trồng trọt cần chú ý nâng cao hàm lượng tanin trong nguyên liệu.
Tanin được dùng trong y học để làm thuốc cầm máu, nó có khả năng tăng
cường sức đề kháng của thành huyết quản trong cơ thể động vật, tăng cường sự
tích lũy và đồng hóa sinh tố C.
Ancaloit: Trong chè có nhiều loại ancaloit nhưng nhiều nhất là cafein. Hàm
lượng cafein ở trong chè có từ 3 - 5% thường nhiều hơn cafein ở trong lá cà phê
từ 2 - 3 lần. Nó không có khả năng phân ly ion H+ tức là không có tính axít mà
chỉ là một kiềm yếu. Cafein chỉ hòa tan trong nước với tỷ lệ 1/46, rất dễ hòa tan

trong dung môi clorofoc. Cafein có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương,
kích thích cơ năng hoạt động của tim, có tác dụng lợi tiểu. Cafein rất bền vững
trong chế biến. Nó có khả năng kết hợp cới tanin để tạo thành hợp chất tanat
cafein có hương vị dễ chịu. Theo tài liệu của Roberto, hợp chất tanat cafein được
tạo thành chủ yếu từ cafein, teaflavin, tearubigin, teaflavingalat. Ngoài ra còn có
sự tham gia của ECG và EGCG.
Protein và axít amin: Protein là hợp chất hữu cơ phức tạp chứa N, phân bố
không đều ở các phần của búp chè và thay đổi tùy theo giống, thời vụ, điều kiện
canh tác và các yếu tố khác. Protein có thể trực tiếp kết hợp với tanin, polifenol
tạo ra những hợp chất không tan làm ảnh hưởng xấu đến phẩm chất chè đen. Do
đặc điểm của việc chế biến chè xanh là diệt men ngay từ đầu, nên hàm lượng
tanin trong chè ít bị thay đổi và còn quá cao làm cho chè có vị đắng. Protein kết
hợp với một phần tanin làm cho vị chát và đắng giảm đi. Vì thế trong một chừng
mực nào đó, protein có lợi cho phẩm chất chè xanh.
Ngày nay người ta đã tìm thấy trong chè có 17 axít amin, các axít amin này
kết hợp với đường và tanin tạo thành andehit có mùi thơm của chè đen và làm
cho chè xanh khác


Gluxít và pectin: Trong lá chè chứa rất ít gluxít hòa tan, trong khi đó các
gluxít không hòa tan lại chiếm tỷ lệ lớn. Xenlulo và hemixenlulo cũng tăng lên
theo tuổi của lá, vì vậy nguyên liệu càng già chất lượng càng kém. Hàm lượng
đường hòa tan ở trong chè tuy ít nhưng rất quan trọng đối với hương vị chè.
Đường tác dụng với protein hoặc axít amin tạo nên các chất thơm.
Pectin thuộc về nhóm gluxít và nó là hỗn hợp của các polixacarit khác nhau
và những chất tương tự chúng. ở trong chè, pectin thường ở dạng hòa tan trong
nước, tan trong axít oxalic, tan trong amon oxalat. Pectin tham gia vào việc tạo
thành hương vị chè, làm cho chè có mùi táo chín trong quá trình làm héo. ở mức
độ vừa phải, pectin làm cho chè dễ xoăn lại khi chế biến nhưng nó có ảnh hưởng
xấu đến quá trình bảo quản chè thành phẩm vì pectin dễ hút ẩm.

Diệp lục và các sắc tố khác gần nó: Trong lá chè có chứa diệp lục tố, carotin
và xantofin. Các sắc tố này biến động theo giống, theo mùa và các biện pháp kỹ
thuật canh tác.
Trong chè thành phẩm diệp lục tố có ảnh hưởng xấu tới phẩm chất của chè
bởi vì làm cho sản phẩm có màu xanh, mùi hăng, vị ngái.
Dầu thơm: Dầu thơm ở trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè
tươi: 0,007% - 0,009% và trong chè bán thành phẩm: 0,024 - 0,025%. Hàm
lượng dầu thơm trong lá chè, được tăng dần ở những địa hình cao, tuổi lá quá
non chứa ít hương thơm. Dầu thơm ảnh hưởng trực tiếp đến hương vị của chè do
hương thơm tự nhiên và do quá trình chế biến tạo thành như sự lên men, ôxi
hóa, tác dụng của độ nhiệt cao.
Dầu thơm có tác dụng điều tiết sinh lý của cây để thích hợp với điều kiện bên
ngoài (khi độ nhiệt quá cao hay quá thấp) và ngăn cản những bức xạ có bước
sóng ngắn, tác hại đến cây chè. Đối với cơ thể con người dầu thơm có tác dụng
kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tinh thần minh mẫn, thoải mái dễ
chịu nâng cao hiệu suất làm việc của các cơ năng trong cơ thể.


Vitamin: Các loại vitamin có trong chè rất nhiều. Chính vì vậy giá trị dược
liệu cũng như giá trị dinh dưỡng của chè rất cao. Theo các tài liệu của Trung
Quốc, hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1.000g chất khô như
sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,70; B2: 12,20; PP: 47,0; C: 27,0 v.v...
Đáng chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè, nhiều hơn trong cam
chanh từ 3 đến 4 lần. Quá trình chế biến chè đen làm cho vitamin C giảm đi
nhiều vì nó bị ôxi hóa, còn trong chè xanh thì nó giảm đi không đáng kể.
Men: Men là nhân tố quan trọng của sự sống. Men quyết định chiều
hướng phát triển của mọi phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sinh vật và
chúng là chất kích động tất cả các biến đổi hóa học.
Trong búp chè non có hầu hết các loại men, nhưng chủ yếu gồm hai nhóm
chính:

- Nhóm thủy phân: men amilaza, glucoxidaza, proteaza và một số men khác.
- Nhóm ôxi hóa khử: Chủ yếu là hai loại men: peroxidaza và polifenoloxidaza.
Chất tro: Các nguyên tố tro giữ vai trò quan trọng trong hoạt động của cơ
thể sống, chúng là những nhân tố của sự thay đổi trạng thái các chất keo và ảnh
hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của tế bào. Hàm lượng tro trong chè tươi từ
4-5% và trong chè khô từ 5-6%. Trong chè, tro chia thành hai nhóm: hòa tan
trong nước và không hòa tan trong nước. Chè thành phẩm loại tốt, hàm lượng tro
ít hơn so với loại chè xấu nhưng tỷ lệ chất tro hòa tan lại nhiều hơn.
1.1.6

Giá trị của cây chè
Cây chè là loại cây công nghiệp lâu năm, mau cho sản phẩm, cho hiệu quả
kinh tế cao, có đời sống kinh tế lâu dài. Chè trồng một lần, có thể thu hoạch 30 40 năm hoặc lâu hơn nữa. Chè được dùng làm nước uống từ thời xa xưa, đến nay
đã trở thành một thức uống lý tưởng được nhân trên thế giới ưa dùng. Có giá trị
về nhiều mặt như: thực phẩm, dược liệu, kinh tế xã hội, văn hóa…
Giá trị về mặt thực phẩm: Trong chè có các thành phần hóa học giàu chất dinh
dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người như hỗn hợp tanin chè có khả


năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột (tả, lỵ, thương hàn), các loại protein,
vitamin, muối khoáng… Cafein và một số alcoloit khác là chất có thể kích thích
hệ thần kinh trung ương, vỏ cầu đại não, giúp tăng cường sự hoạt động của cơ thể,
giảm mệt nhọc .
Giá trị y học: Nước chè tươi còn giảm được các quá trình viêm như viêm
khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu. Uống chè
giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhiễm độc. Mới đây nhất, các nhà
khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng gây ung thư của
các chất phóng xạ. Người ta đã trích ly các chất trong chè để điều chế các thuốc
trợ tim, cầm máu, lợi tiểu… Những giá trị tiềm ẩn của cây chè vẫn còn đang được
quan tâm nghiên cứu.

Giá trị về mặt kinh tế xã hội: Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ cấu cây
trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của ngành
nông nghiệp Việt Nam. Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói
giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúc đẩy quá trình
công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du và miền núi.
Ngoài ra, trồng chè còn giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chống sói mòn đất,
bảo vệ môi trường…
Giá trị về mặt văn hóa: Lá chè được sử dụng không chỉ để chế biến thức uống
phục vụ nhu cầu của con người, mà từ lâu chè thành phẩm đã trở thành nét văn
hóa đặc trưng của nhiều quốc gia. Uống chè là nét văn hóa lâu đời của người Việt
Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đời sống tinh thần của con
người. Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạo được cảm hứng trong văn thơ,
hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếu trong lễ nghi giao tiếp, giáo dục, cưới
xin, ma chay, hội hè….
1.2
1.2.1

Thư viện cDNA/EST
Giới thiệu về cDNA/EST
a) Định nghĩa
EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thường dài từ 200 - 500 nucleotide)
được tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5’ hay 3’ của
cDNA). Gồm có 5’EST và 3’EST


Hình 1.1: Sơ đồ hình thành EST
-

5’ EST được tạo ra từ một phần đầu 5’ của cDNA, có khuynh hướng bảo

tồn giữa các loài và không thay đổi nhiều trong một họ gen.
3’ EST được tạo ra từ một phần đầu 3’ của cDNA, dạng này có thể sẽ rơi
vào vùng không mã hoá (non-coding) hay vùng không dịch mã (Untranslated
Regions, UTRs). Do đó khuynh hướng bảo tồn giữa các loài thấp hơn những
trình tự mã hóa.
b)
Nguyên nhân hình thành và ứng dụng của EST
Các nhà nghiên cứu đang lao động một cách cần mẫn để giải trình tự và thu thập
bộ gen của rất nhiều loại sinh vật, bao gồm chuột và người, với một số lượng lớn vì
những lí do quan trọng.
Mặc dù những mục tiêu quan trọng của bất kì dự án giải trình tự nào đều có thể
có được trình tự gen và xác định được một tập hợp hoàn chỉnh của gen, nhưng mục
tiêu cuối cùng là đạt đến tầm hiểu biết về việc khi nào, vị trí nào và bằng cách nào mà
một gen được hoạt hóa, một tiến trình mà thường được xem là sự biểu hiện gen.
Một khi chúng ta bắt đầu tìm hiểu vị trí nào và bằng cách nào một gen được
biểu hiện dưới những điều kiện thông thường, sau đó chúng ta có thể nghiên cứu điều
gì xảy ra trong một trạng thái đã thay đổi, ví dụ như trường hợp bị nhiễm bệnh. Tuy
nhiên, để thực hiện được mục tiêu sau cùng, các nhà nghiên cứu phải xác định và
nghiên cứu về protein, hay những protein mà nó được mã hóa bởi một gen nào đó.
Việc tìm thấy một gen mã hóa cho một protein hoặc nhiều protein là điều
không dễ dàng. Như trước đây các nhà nghiên cứu sẽ bắt đầu cuộc tìm kiếm bằng
cách định rõ một vấn đề sinh học và phát triển thành một chiến lược cho việc nghiên


cứu vấn đề đó. Thông thường, việc tìm tài liệu khoa học thường cung cấp nhiều dẫn
chứng cho việc tiến hành như thế nào. Ví dụ, các phòng thí nghiệm khác có thể công
bố dữ liệu mà đã thiết lập sự liên kết giữa một protein và một căn bệnh được quan
tâm. Các nhà nghiên cứu sau đó sẽ làm việc để phân lập protein, xác định chức năng
của nó, và định vị gen mã hóa cho protein.
Một cách khác, các nhà khoa học sẽ tiến hành những nghiên cứu di

truyền để xác định vị trí nhiễm sắc thể của một gen đặc biệt. Một khi vị trí
nhiễm sắc thể đã được xác định, các nhà khoa học sẽ sử dụng những phương
pháp hóa sinh để phân lập gen và protein tương ứng. Dù bằng cách nào thì
những phương pháp này đều tốn nhiều thời gian, có trường hợp nhiều năm, và
kết quả là chỉ có vị trí và sự miêu tả của một số lượng phần trăm nhỏ của gen
đƣợc tìm thấy.
Tuy nhiên, thời gian đòi hỏi cho việc định vị và mô tả hoàn toàn một gen
đã giảm xuống đáng kể nhờ sự phát triển và hướng tiếp cận của một kĩ thuật
được dùng để tạo ra Expressed Sequence Tag hay EST. EST cung cấp cho nhà
nghiên cứu một phương pháp nhanh chóng và không tốn kém cho việc khám
phá các gen mới, tìm được dữ liệu về sự biểu hiện và điều hòa gen, và cho việc
thành lập bản đồ gen.
Ý tưởng là giải trình tự những mảnh DNA mà chúng đại diện cho những
gen biểu hiện trong tế bào, mô hay cơ quan nào đó từ những sinh vật khác nhau
và sử dụng những sự đánh dấu này để tìm ra được gen bằng sự bắt cặp giữa các
nucleotide. Thách thức kết hợp việc xác định gen từ trình tự bộ gen biến đổi
giữa các sinh vật và độc lập với kích thước bộ gen cũng như sự hiện diện hay
vắng mặt của intron, nó là những trình tự DNA xen vào làm gián đoạn trình tự
mã hóa protein của một gen.
c)

Sự hình thành EST
cDNA đại diện cho 1 gen biểu hiện đã được phân lập, các nhà khoa học sau

đó có thể giải trình tự vài trăm nucleotide từ đầu này hay đầu kia của phân tử để
tạo ra hai loại EST khác nhau.


Sử dụng mRNA để tạo cDNA
cDNA là một dạng của DNA đượcc tạo ra trong các phòng thí nghiệm, sử dụng

một loại enzyme gọi là reverse transcriptase. Tạo cDNA đi ngược với tiến trình bình
thường của sự sao mã trong tế bào. Bởi vì, người sản xuất sử dụng mRNA làm khuôn
(template) chứ không phải DNA. Không giống như DNA của bộ gen, cDNA chỉ chứa
exon hay gen biểu hiện.
mRNA là một chìa khóa để tìm thấy những gen biểu hiện trong bộ gen.
Tuy nhiên, mRNA không bền vững ở bên ngoài tế bào. Do đó, các nhà khoa học
đã sử dụng một loại enzyme đặc biệt để biến đổi nó thành dạng DNA (cDNA) bổ
sung (complementary DNA). cDNA có cấu tạo bền vững hơn rất nhiều so với
mRNA. Vì được tạo ra từ mRNA, các intron đã được loại bỏ nên cDNA chỉ đại
diện cho những trình tự DNA biểu hiện.

Hình 1.2: Sự hình thành EST
- 5’EST


Chỉ giải trình tự phần bắt đầu của cDNA tạo ra 5‟EST. 5‟EST có đƣợc từ
đầu 5‟ của một bản sao (transcript) mà bản sao này thƣờng mã hóa cho một
protein. Những vùng này có khuynh hướng bảo tồn giữa các loài và không thay
đổi nhiều trong một họ gen.
- 3’EST

Giải trình tự phần cuối của phân tử cDNA tạo ra 3‟EST. Bởi vì những
EST này đƣợc tạo ra từ đầu 3‟ của bản sao, chúng thường rơi vào những vùng
không mã hóa cho protein, hay là những vùng không dịch mã (untranslated
region – UTR), và do đó chúng có khả năng biểu lộ sự bảo tồn giữa các loài thấp
hơn so với những trình tự mã hóa.
1.2.2

Phương pháp tạo ra thư viện cDNA/EST
Gần 30 năm qua, thư viện cDNA (cDNA library) đã thể hiện hiệu quả rõ rệt

trong nghiên cứu sinh học phân tử như: xác định thành phần, cấu trúc của protein
được mã hóa bởi đoạn DNA cụ thể, biểu hiện gen của eukaryote trong tế bào
prokaryote, nghiên cứu sự biểu hiện của mRNA, và rất nhiều ứng dụng cụ thể
khác. cDNA (complementary DNA, copy DNA) được tạo từ mRNA trưởng thành
(mature mRNA) sử dụng enzyme Reverse transcriptase. Ở eukaryote, mRNA có
đuôi poly Adenine để phân biệt với các loại RNA khác, đồng thời giữ vai trò tạo
đọan mồi (primer) trong quá trình phiên mã ngược. Để xây dựng thư viện cDNA
nhất thiết phải tạo dòng cDNA tức là tạo số lượng lớn bản sao cDNA dựa vào cấu
trúc của mRNA hoặc lượng nhỏ cDNA ban đầu và sự hỗ trợ của thành tựu công
nghệ sinh học. Có nhiều phương pháp tạo thư viện cDNA/EST, tuy nhiên các
phương pháp này chỉ khác nhau ở phương pháp tổng hợp cDNA. Dưới đây là
phương pháp tạo thư viện cDNA/EST, trong đó cDNA được tổng hợp bằng kỹ
thuật RT-PCR:
- Tách chiết RNA tổng số
Nguyên tắc chung: phân tử RNA không bền dễ bị phân huỷ bởi các enzim
ribonuclease và các enzim này thì có mặt ở khắp nơi, có hoạt tính rất cao và rất
bền vững với các tác nhân thường dung để loại enzim. Do vậy việc tách chiết


RNA đòi hỏi rất thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm từ ribonuclease từ môi
trường, thao tác phải trong điều kiện vô trùng.
Tách RNA toàn phần. Gồm ba bước cơ bản như tách chiết DNA.
+ Bước 1: Tế bào và mô được nghiền trong dung dịch hỗn hợp chất tẩy mạnh và
tách protein lien kết ra khỏi RNA.
+ Bước 2: Loại bỏ protein khỏi mẫu qua xử lí phenol chlorophorm và li tâm. +
Bước 3: Tủa RNA hoà tan trong pha nước bằng etanol và li tâm để thu nhận lại. .
- Tinh sạch RNA: 90 -99% RNA tổng số trong tế bào là tRNA, rRNA các loại
RNA này có kích thước và trình tự xác định nên có thể tách riêng bằng điện di
và li tâm. Riêng mRNA chiếm từ 1- 5% có kích thước và trình tự vô cùng đa
dạng song chúng có một điểm chung là có đuôi poliA nhờ đó có thể tách nó

riêng ra nhờ sắc kí ở trên cột OligodT- cellulose
- Tổng hợp cDNA: Phương pháp tổng hợp cDNA bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse

Transcriptase linked to Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp này cơ bản dựa vào phản ứng khuếch đại phân tử (PCR) nhưng
có sử dụng enzyme phiên mã ngược, với nguyên liệu ban đầu là phân tử mRNA
trưởng thành. Phương pháp này được mô tả qua hình dưới:


Phương pháp này được phát triển để tạo dòng cDNA trong trường hợp lượng
mRNA rất ít hoặc lượng mô ít. Hình dưới mô tả một trong nhiều kỹ thuật sử dụng
sự kết hợp giữa 2 enzyme reverse transcriptase và Taq polymerase được gọi là


RT-PCR. Mục đích của kỹ thuật này là tạo ra đoạn cDNA mang 2 đầu đều có chức
năng làm primer và làm vùng cắt hạn chế để chèn vào genome vật chủ phục vụ
cho mục đích biểu hiện. Trong ứng dụng này đuôi poly A của mRNA được dùng
làm đoạn bổ sung với primer dT được thiết kế mang trình tự của vùng cắt hạn chế
cho RE (restriction enzyme) cụ thể. Tương tự như thế, các primer bổ sung tiếp
theo dA, dG, hoặc dC mang vùng hạn chế cụ thể nào đó
1.3 Tình hình nghiên cứu gen và genome ở chè
1.3.1 Genome chè
1.3.2 Các nhóm gen chức năng ở chè
1.3.3 Thư viện cDNA/EST ở chè
Trong những năm gần đây, những phân tích cDNA/EST của chè đã tạo ra
nguồn thông tin khá lớn.Việc giải mã các đoạn trình tự biểu hiện (EST) là phương
pháp hữu hiệu trong việc xác định các gen quy định những đặc điểm quan trọng
của cây chè . Một số phân tích EST của cây chè đã được công bố: Chen et al.
(2005) xác định được 1.684 ESTs từ chồi non của cây chè. Park et al. (2004) xác
định được 588 ESTs và Sharma và Kumar (2005) công bố ba ESTs liên quan đến

khả năng chịu hạn. Fumiya Taniguchi và cộng sự đã xây dựng thư viện
cDNA/EST từ 7 bộ phận khác nhau của cây chè và tìm ra 17.458 đoạn EST.
Thư viện cDNA/EST cung nguồn thông tin cho các nghiên cứu nhằm tìm
hiểu các quá trình sinh lí quan trọng liên quan đến quá trình sinh trưởng của chè
như: quá trình đồng hóa nitơ, chuyển hóa axit amin. Các gen quy định chất lượng
chè như các gen liên quan đến việc chuyển hóa các hợp chất thứ cấp ( catechin và
cafein)
(Breed Sci. 2012 Jun; 62(2): 186–195.
Published online 2012 Jun 19. doi: 10.1270/jsbbs.62.186
PMCID: PMC3405963

Expressed sequence tags from organ-specific cDNA
libraries of tea (Camellia sinensis) and polymorphisms
and transferability of EST-SSRs across Camelliaspecies
Fumiya Taniguchi,1,2,* Hiroyuki Fukuoka,3 and Junichi Tanaka1,2,4

/>