báo cáo thực hành tách dòng gen

MỞ ĐẦU
Sinh học phân tử hiện đại đang phát triển mạnh và đã trở thành nòng cốt của
công nghệ sinh học. Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử và áp
dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu khoa học sự sống và công nghệ
sinh học đã có nhiều đóng góp trong việc chăm sóc, bảo vệ sức khỏe con nggười;
trong đánh giá tài nguyên sinh vật; trong chọn giống và sản xuất nông lâm ngư
nghiệp.
Thành tựu của sinh học hiện đại và những hiểu biết về di truyền học phân tử
làm cơ sở cho việc nghiên cứu, xây dựng các kỹ thuật sinh học hiện đại. Những kỹ
thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu genome của sinh vật ngày càng
phát triển, đặc biệt là ứng dụng của kỹ thuật chuyển gen đang có ứng dụng rất lớn
trong việc nâng cao phẩm chất giống. Kỹ thuật chuyển gen được bắt đầu từ việc
thu nhận dịch chiết DNA từ tế bào sống sau đó PCR để nhân đoạn gen mong
muốn, gắn vào vector tách dòng để chọn lọc lấy dòng mang gen rồi gắn vào vector
biểu hiện để biến nạp vào cơ thể sinh vật cần chuyển gen, phân tích cơ thể đó xem
có mang đoạn gen mong muốn hay không. Trong bài thực hành này chúng tôi chỉ
thực hiện đến bước tách dòng gen.
Bài thực hành được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, trường Đại
học Khoa học – Đại học Thái Nguyên dưới sự hướng dẫn trực tiếp của tiến sĩ
Hoàng Thị Thu Yến, với những máy móc và thiết bị khá hiện đại như: máy PCR,
máy li tâm, nồi hấp tiệt trùng, hệ thống điện di…

1


Bài 1: TÁCH

CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT

Ngô là cây lương thực và là thức ăn chăn nuôi quan trọng của nhiều nước trên
thế giới. Vì vậy, việc cải thiện chất lượng và năng suất cây ngô hiện nay mang tính

thời sự được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Tạo cây ngô chuyển gen
mang những đặc tính tốt như: chịu hạn, chịu lạnh, chống mọt…là một giải pháp
hiệu quả. Để thực hiện chuyển gen trước hết phải thu nhận DNA tổng số từ cây
ngô. Trong bài thực hành này chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá ngô.
Tế bào lá ngô là tế bào nhân chuẩn vì vậy mà DNA tổng số của nó bao gồm: DNA
trong nhân tế bào (có dạng thẳng, kép) và DNA trong các bào quan là ty thể và lạp
thể (DNA có dạng vòng, kép).
Mục đích
Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao bọc
I.

của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử. Điều
quan tâm là thu nhận được các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹn không bị
phân hủy.
II.
Hóa chất và thiết bị
Tris HCl 1M, PH=8
EDTA 0,5M, PH=8
Sorbitol 2M
NaH2PO4 0,4%
Chloroform
Isoamyl ancohol
NaHCl 5M
CTAB 4%
III.

CH3COONa 3M, PH=5,2
Cồn tuyệt đối, nước khử ion
Pipetman và đầu côn các loại
Cối chày sứ

Máy li tâm
Bể ổn nhiệt
Tủ lạnh sâu
Ống eppendorf 1,5 µl và 2 µl

Tiến hành

Quy trình thu nhận DNA tổng số từ tế bào lá ngô trải qua các bước chính sau:
thu mẫu, nghiền mẫu, phá vỡ tế bào và thu nhận DNA.

2


-

Phá vớ màng tế bào và màng nhân: trong bước này ta nghiền mẫu trong nitơ
lỏng để cho mẫu giòn, dễ nghiền, DNA ít bị đứt gãy và nhiệt độ thấp sẽ làm
cho các enzyme không hoạt động do đó nó sẽ không cắt DNA. Sau khi
nghiền màng tế bào và màng nhân sẽ bị phá vỡ, giải phóng DNA để chúng ta

-

có thể thu nhận ở các bước tiếp theo.
Loại bỏ các thành phần không mong muốn: trong bước này bổ sung các
dung dịch đệm rửa, đệm chiết sau đó li tâm để loại bỏ các thành phần không
mong muốn. Sau khi bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1), li tâm sẽ
thu được dung dịch chia thành 3 lớp rõ ràng. Lớp dưới cùng là các tạp chất
như diệp lục, hydratcacbon…, lớp ở giữa màu trắng là Protein và lớp trên

-

cùng là dịch chúng ta cần thu trong đó chứa DNA chúng ta cần tách chiết.
Tủa DNA bằng cồn tuyệt đối ta sẽ quan sát thấy có vẩn kết tủa DNA màu
trắng đục. Sau khi li tâm thu được tủa DNA, rửa tủa sau đó mang làm khô để
loại hết cồn để không ảnh hưởng đến kết quả của các bước tiếp theo. Hòa tan
tủa trong nước khử ion vô trùng rồi bảo quản trong -20oC cho đến khi sử

IV.

dụng.
Giải thích

Nguyên lí của quá trình tách chiết phá vỡ tế bào lá ngô:
- Phá vỡ tế bào , màng tế bào và mô.
- Loại bỏ tạp chất không phải DNA ( Protein, lipid, đường…)
- CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào.
Màng tế bào là lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị
hòa tan.
Trong dung dịch đệm có các thành phần:
- Tris- HCl: ổn định pH.

3


- EDTA: Có ái lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ
DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca+ , Mg+
canh tranh với enzyme làm enzyme không hoạt động.
- Khi bổ sung CTAB thì ủ ở 65ºC trong 1h và 10 phút đảo trộn 1 lần.
- CTAB hoạt động mạnh hiệu quả ở nhiệt độ khoảng 60- 70ºC, mạnh hơn khi có ái
lực cơ học tác động vào ( CTAB hoạt động trong trường hợp có NaCl).

. - Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả năng tạo bọt, đồng thời giúp tăng cường hỗ
trợ khả năng kết tủa protein, hỗ trợ sự phân pha. Sau khi bổ sung ly tâm thì có hiện
tượng phân pha ( 3 pha).
+ Pha trên : Là DNA.
+ Pha giữa: Chứa protein.
+ Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform.
- CH3 COONa 3M pH 5.5 : ion Na+ vào trung hòa DNA triệt tiêu khả năng hòa
tan DNA, bổ sung isopropanol sẽ kết tủa được DNA, phân tách và thu được DNA (
CH3 COONa, CH3 COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn).
- Rửa tủa bằng cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa tủa vì DNA bị hòa
tan trong nước không hòa tan trong cồn. Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan trong cồn
70%, cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì cậy khi rửa tủa bằng cồn
xong thì hút hết hết cồn và làm bay hơi hết cồn. Nếu còn cồn sẽ làm biến tính
enzyme không thực hiện được các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo.
- Hòa tan DNA bằng nước khử ion, nước khử ion có thể hòa tan tủa DNA để dùng
cho các phản ứng sau.

4


Bài 2: ĐIỆN

DI NUCLEIC ACID

Sau khi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá ngô chúng tôi tiến hành điện di sản
phẩm thu được để kiểm tra xem trong dung dịch có chứa DNA hay không và dự
đoán hàm lượng DNA trong dung dịch tách chiết.
Chúng tôi tiến hành điện đi qua các bước cơ bản sau:
Bước 1: hòa tan 0,8g agarose trong 100 ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt,
đun sôi trong lò vi sóng khoảng 2 phút sau đó bỏ ra, lắc đều cho agarose tan rồi

tuêps tục đun trong lò vi sóng khoảng 30 giây. Lưu ý trong quá trình đun bằng bình
chịu nhiệt có nắp thì không được đậy nắp kín nhắm tránh tràn ra khi sôi.
Bước 2: để agarose nguội đến khoảng 600C thì đổ vào khuôn gel. Đổ khuôn gel cao
khoảng bằng 2/3 răng lược. Khi đổ thì nên đổ nhanh, dứt khoát tránh tạo thành
nhiều lớp gel sẽ ảnh hưởng đến kết quả điện di.
Bước 3: đặt bản gel trong bể điện di, đổ đẹm TEA 1X vào bể điện di cho đến khi
mức đệm cao hơn mặt gel từ 1-2 mm.
Bước 4: trộn 8 µl mẫu với 3 µl dye tra vào một giếng nhỏ trên gel. Ghi lại thứ tự
của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng. Mỗi mẫu được dùng 1 đầu côn hút
riêng. Khi tra mẫu vào giếng, một tay tỳ lên thành giá của điện di làm điểm dựa,
tay kia đưa micropipet sao cho đầu côn vừa sát miệng giếng rồi bơm từ micropipet
ra. Cần lưu ý thao tác này nếu không cẩn thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ
miệng giếng. Chạy điện di ở điện thế 100V trong 30 phút . Lúc này quan sát bằng
mắt thường có thể thấy hỗn hợp mẫu trong giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía
cực âm sang cực dương
Bước 5: Lấy bản gel từ bể điện di ra nhuộm trong ethydium bromid 0,5μl/ml trong
10 phút. Lưu ý khi mang bản gel nhuộm cần cẩn thận vì ethydium bromid rất độc

5


hại với người và môi trường. Do đó, để giảm thiểu việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng
bằng thìa to, dạng bản, có cán dài.. để đưa bản gel vào khay nhuộm, lấy ra khỏi
khay, mang rửa lại bằng nước sạch, đến khi đưa bản gel lên máy soi.
Bước 8: Soi bản gel trên máy tia tử ngoại, khi đó các axít nucleic trong gel agarose
sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ ethydium
bromid. Chất này có khả năng xen gắn vào giữa các bazơ của axít nucleic làm
chúng phát sáng dưới dạng những vạch màu đỏ cam, dễ quan sát và chụp ảnh.
Kết quả thu được là hình ảnh điện di sau:

Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm tách DNA tổng số.

6


Kết quả tách DNA của các mẫu hầu như không tốt vì trên hình ảnh không có băng
rõ ràng.
Các giếng 4, 5 và 8 ta thấy DNA bị đứt gãy nhiều, có các vệt sáng ở đuôi nhưng đó
chỉ là RNA và các đoạn DNA bị đứt gãy. Tuy nhiên dải sáng cách miệng giếng một
đoạn nên ở đó có thể sẽ có DNA mà ta mong muốn tách. Vì bình thường nếu DNA
đứt gãy quá nhiều thì dải sáng sẽ bắt đầu từ miệng giếng.
Giếng 1 và 2 là 2 giếng tra mẫu dung dịch tách chiết từ lá ngô của nhóm 1. Tuy
nhiên nó cũng giống như các giếng còn lại khác, không có hoặc chỉ có dải sáng rất
mờ phần lớn nằm ở đuôi. Đó cũng là các RNA hoặc các đoạn DNA bị đứt gãy.
Nhưng trong các mẫu này vẫn có thể có chứa DNA nhưng với một lượng rất ít mà
ta không thể nhìn thấy được. Các mẫu này làm phản ứng PCR có thể vẫn ra sản
phẩm mà ta mong muốn nhưng khi PCR không nên pha loãng.

7


Bài 3: KỸ THUẬT PCR
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi tiến hành nhân bản một phần vùng
gen rRNA 16s có kích thước 600bp bằng kỹ thuật PCR sử dụng taq polymerase.
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, băng điện di đúng
kích thước sẽ được cắt và tinh sạch.
Các bước thực hiện
Bước 1: Làm tan băng các hóa chất cho phản ứng PCR
- Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được bảo quản ở -20oc, vì vậy trước khi
thực hiện phản ứng cần phải làm tan băng các loại hóa chất này bằng cách đưa các

ống hóa chất ra môi trường ngoài. Để tan từ từ ở nhiệt độ phòng cho đến khi toàn
bộ khối hóa chất ở trạng thái dung dịch.
Bước 2: Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR
- Mỗi mẫu chuẩn bị một eppendorf mới, vô trùng
- Sử dụng bút đánh dấu tên mẫu lên nắp ống và thân ống
- Sử dụng micropipet phù hợp để lấy các hóa chất cho phản ứng PCR với thành
phần như bảng dưới đây.
Thành phần phản ứng
Buffer Dream taq (10X)
dNTPs (10mM)
Primer F (10mM)
Primer R (10mM)
Taq polymerase (5unit/µl)
Template (AND khuôn)
H2O
Tổng

Thể tích (µl)
2,5
2,5
1,0
1,0
0,3
2,0
14,7
25

8

- trong đó PCR M đã được pha trộn 3 thành phần: Buffer Dream taq (10X), dNTPs
(10mM), Taq polymerase (5unit/µl). Ta lấy lần lượt các thành phần như sau: H2O,
PCR M, Primer F, Primer R, Template (AND khuôn).
+ enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi mới có thêm 1 nu A nhô ra ở đầu 3’
+ dNTPs là các nucleotide tự do ở dạng triphotphat.
+ mồi: gồm có mồi xuôi (có chiều cùng với chiều phiên mã) và mồi ngược (có
chiều ngược chiều phiên mã). Mồi thường dài 18-24 nucleotide vì khả năng lặp lại
trong gen thấp do đó mồi mang tính đặc hiệu.
+ nồng độ của các chất trong phản ứng PCR phải vừa đủ.
- Trộn các thành phần đã nêu trên trong ống eppedorp loại 1,5ml và đưa vào ống
PCR với thể tích 25μl đến 50μl, cho vào máy ly tâm ở tốc độ nhẹ (spin) 3000
vòng/phút. Bước này nhằm để các thành phần nêu trên lắng xuống đáy ống PCR.
Bước 3: Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
- Biến tính ban đầu: 94oC trong 3 phút
- Khuếch đại: 32 chu kỳ gồm các bước:
+ Biến tính: 94oC trong 1 phút
+ Gắn mồi: 54oC trong 45 giây
+ Kéo dài: 72oC trong 1 phút
- Kéo dài cuối cùng: 72oC trong 10 phút

9


- Ủ bảo quản: 4oC
Bước 4: Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng phương pháp điện di trên agarose 0,8%
trong 30 phút.
Bước 5: Nhuộm bản gel trong ethydium bromid 5 phút
Bước 6: Soi và chụp ảnh.
Kết quả điện di sản phẩm PCR ta thu được hình ảnh như sau:

Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR
Ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy phản ứng PCR được thực hiện không thành
công lắm do xuất hiện nhiều băng có kích thước khác nhau, hơn nữa không lên
hình ảnh macker.

10


-

Ở giếng 1 và giếng 3 cùng nhân một phần gen rRNA 16s có kích thước
600bp nên đều xuất hiện 2 băng giống nhau. Hai băng này ở rất sát nhau, tuy
nhiên do macker không lên nên ta không thể dự đoán được băng nào là băng

-

600bp. Do đó khi thôi gel ta cắt cả 2 băng mang thôi gel.
Ở giếng 2 và 4 cùng nhân gen rRNA 18s có kích thước 1800bp, ở hai giếng
này xuất hiện 3 băng nhưng dự đoán băng đầu tiên sẽ là đoạn gen ta khuếch
đại vì nó ở trên cùng nên có kích thước lớn nhất. Các băng bên dưới là các
sản phẩm kéo dài không hết hoặc mồi thừa. Như vậy khi thôi gel ta sẽ cắt
băng trên cùng để thôi gel.

11


Thôi gel sản phẩm PCR
Do các thành phần trong sản phẩm PCR ảnh hưởng đến phản ứng gắn sản phẩm
PCR vào vector làm giảm hiệu quả tách dòng. Do đó sản phẩm PCR cần được tinh

sạch, hỗn hợp sản phẩm PCR được đưa vào cột chứa dung dịch có vai trò biến tính
protein và làm cho DAN bám vào màng silica trong cột. Sau đó DNA được thu lại
từ màng.
1.
2.
-

Dụng cụ và hóa chất
Nguyên liệu: sản phẩm PCR điện di trên gel agarose.
Dụng cụ: bể ổn nhiệt, máy li tâm, pipet, đầu côn, dao cắt gel
Hóa chất: kit thôi gel GeneJET gel extraction kit từ hãng Fermentas
Quy trình thực hiện
bước 1: điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống
eppendorf 2ml. nếu điện di sản phẩm PCR cho ra nhiều băng thì ta so với

-

macker và chỉ cắt lấy băng đúng kích thước của đoạn gen ta mong muốn.
Bước 2: bổ sung dung dịch bám (binding solution) theo tỉ lệ 1:1. Tức là cứ 1
đơn vị mẫu ta bổ sung 1 đơn vị dung dịch bám. Ta cân lượng gel ban đầu
cho vào ống là 0,35g tương ứng 350µl do đó ta bổ sung 350µl dung dịch

-

bám.
Bước 3: Ủ ở nhiệt độ khoảng 50-60oC cho đến khi gel tan hoàn toàn.
Bước 4: hút dịch sang cột thôi gel, li tâm 12000v/phút trong 2 phút, bỏ dịch.
Trên cột thôi gel có chứa ion + do đó DNA sẽ bị giữ lại trên màng cột và các

-

hợp chất khác bị rửa trôi qua cột.
Bước 5: bổ sung 700 µl dung dịch rửa vào cột, li tâm 12000v/p, 2 phút.
Trong dung dịch rửa có chứa cồn để rửa trôi các tạp chất. Để ở nhiệt độ

-

phòng 5 phút.
Bước 6: li tâm cột tiếp 12000v/ph, 2 phút. Sau đó đặt cột sang ống mới để 5
phút ở nhiệt độ phòng để mẫu bay hết cồn để không ảnh hưởng đến các thí

-

nghiệm tiếp theo.
Bước 7: cho 15 µl H2O vào cột, để một lúc cho ngấm rồi mới li tâm.

12


-

Bước 8: li tâm 12000v/p, 3 phút. Thu dịch, loại bỏ cột. Vì DNA tan trong
nước nên sau khi li tâm ta thu được dung dịch chứa DNA tinh sạch được giữ
ở 4oC hoặc -20 oC.

13


Bài 4: TẠO

1.

DÒNG GEN rRNA 16s

Gắn sản phẩm PCR vào vector.

Với nguyên liệu là một phần trình tự vùng gen rRNA 16s có kích thước 600bp
đã được tinh sạch, chúng tôi tiến hành gắn trình tự gen này vào vector pTZ57RT.
pTZ57RT là vector tồn tại dưới dạng mạch thẳng, có kích thước 2886bp với điểm
khởi đầu sao chép F1 ori, dấu chuẩn chọn lọc là gen lac Z (gen mã hóa cho betagalactosidase, một enzim phân hủy cơ chất X-gal từ màu trắng thành màu xanh) và
gen kháng kháng sinh ampicillin, điểm nhận biết của enzim giới hạn thuộc gen lac
Z. vì sản phẩm của phản ứng PCR nhô ra nu A ở đầu 3’ còn vector nhô ra nu T ở
đầu 3 do đó dưới tác dụng của enzim nối T4 ligase sẽ tạo nên vector tái tổ hợp.
2.

Biến nạp vector vào tế bào chủ.

Sau khi tạo thành vector tái tổ hợp chúng tôi tiến hành biến nạp vector vào tế bào
chủ. Tế bào chủ được chọn là vi khuẩn E.coli vì chúng có khả năng sinh sản rất
nhanh nên số lượng bản sao tạo ra lớn, dễ dàng tiếp nhận vector, vector trong tế
bào có khả năng nhân lên một cách độc lập không phụ thuộc vào sự nhân lên của
hệ gen tế bào chủ. Sau khi biến nạp vetor vào tế bào chủ E.coli, chúng tôi tiến hành
nuôi lắc trong LB lỏng trong 1 giờ để tạo ra nhiều tế bào. Sau đó cấy trải trên môi
trường LB đặc có bổ sung ampicillin. Nuôi qua đêm ở 370C thu được kết quả như
hình ảnh dưới đây.

14


Hình 3: Hình ảnh khuẩn lạc mọc lên trên môi trường chọn lọc.

Khuẩn lạc mọc lên trên đĩa thạch toàn màu trắng vì trong môi trường không bổ
sung cơ chất X-gal nên ta không thể dùng dấu chuẩn chọn lọc này để chọn được
dòng mang vector tái tổ hợp. Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh
ampicillin nên chỉ những tế bào mang vector tái tổ hợp có chứa gen kháng
ampicillin mới có khả năng tạo thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy này. Tuy
nhiên, cũng có thể có dòng tế bào đột biến có khả năng kháng ampicillin cũng sẽ
tạo thành khuẩn lạc.
Chọn 4 khuẩn lạc bất kì, nuôi trong dịch lỏng trong 4 ống khác nhau ta được 4
dòng vi khuẩn khác nhau.
3.

Phân tích sản phẩm tạo dòng.

Sau khi chọn được các dòng vi khuẩn khác nhau có khả năng mang vector tái tổ
hợp, ta tiến hành phân tích sản phẩm tạo dòng xem dòng nào có mang vector tái tổ

15


hợp mà ta mong muốn. Có nhiều hướng có thể phân tích sản phẩm tạo dòng trong
đó có tách chiết DNA plasmid hoặc dùng enzim cắt giới hạn (RE).
3..1. tách chiết DNA plasmid
Vector tái tổ hợp sau khi ta gắn đoạn DNA vào chúng đóng vòng và trong tế bào
E.coli chúng tồn tại giống như một phân tử Plasmid, có khả năng nhân lên độc lập.
Vector pTZ57RT có kích thước 2886bp, sau khi chèn 1 đoạn 600 bp chúng có kích
thước 3486bp. Như vậy plasmid mà ta tách được sau khi điện di kiểm tra nếu có
kích thước 3486bp thì có nghĩa là dòng tế này có mang vector tái tổ hợp. Sau khi
tách chiết DNA plasmid và điện di kiểm tra chúng tôi thu được kết quả như hình
ảnh:

Hình 4: Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid.
Từ hình ảnh điện di ta có thể thấy:
-

Dòng 1: việc tách chiết DNA plasmid không thành công, không nhìn thấy
băng vạch nào.

16


-

Dòng 2,3 và 4: hình ảnh điện di xuất hiện 3 băng nhưng khá mờ, hơn nữa
không có macker để so sánh kích thước nên ta dự đoán băng trên cùng có thể
là vector tái tổ hợp mà ta đưa vào, chúng có kích thước lớn hơn kích thước
vector ban đầu 600bp nên di chuyển chậm nhất. Băng thứ hai mờ hơn là các
vector tự đóng vòng mà không mang gen ta muốn chèn, chúng có kích thước
bằng với kích thước vector ban đầu,hoặc có thể là các vector tái tổ hợp ở
dạng dãn xoắn nên chúng có kích thước nhỏ hơn vector tái tổ hợp nên chúng
di chuyển nhanh hơn. Vạch dưới cùng sáng nhất là các phân tử RNA chưa bị
loại bỏ hết.

Kết luận: dòng 2,3 và 4 có thể mang vector tái tổ hợp. Tuy nhiên để chắc chắn
hơn nữa ta có thể kiểm tra bằng enzim cắt giới hạn (RE).
3.2

phân tích DNA tái tổ hợp bằng enzim giới hạn.

Plasmid tách chiết được từ thí nghiệm trên có thể mang vector tái tổ hợp ở dòng
2,3,và 4 được sử dụng trong thí nghiệm này. Theo nguyên tắc, đoạn gen chúng

ta chèn vào vector sẽ được chèn vào vùng gen lac-Z mà ở đó cũng có chứa điểm
nhận biết của các enzim giới hạn khác nhau. Ta chọn 2 enzim nằm ở 2 đầu của
gen chèn vào và chỉ có 1 điểm nhận biết duy nhất để sau phản ứng cắt gen
không bị cắt thành nhiều đoạn. Sau khi xem bản đồ vector pTZ57RT ta chọn
được 2 enzim EcoRI và BamHI, trong đó BamHI nằm sát đầu gen, EcoRI nằm
cách đầu gen 30 bp. Phản ứng được thực hiện trong buffer tango. Nếu kết quả
điện di sản phẩm cắt có xuất hiện băng khoảng 630 bp tức là vector chắc chắn
mang đoạn gen ta cần chèn. Sau khi tiến hành phản ứng cắt và điện di sản phẩm
cắt ta thu được hình ảnh như sau:

17


Hình5:Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid bằng RE
Theo hình ảnh điện di sản phẩm cắt thì ta thấy việc cắt plasmid bằng enzim không
thành công, ở cả 4 mẫu đều không xuất hiện băng 630bp hoặc cũng có thể có đoạn
630bp mà ta mong muốn cắt nhưng với hàm lượng rất ít nên ta không thể nhìn thấy
trên ảnh điện di. Có các băng sáng chồng lên nhau đó là các RNA hoặc các sản
phẩm thừa trong quá trình tách plasmid.
KẾT LUẬN: Ta không tách được dòng gen rRNA 16s.

18