NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------

Nguyễn Thị Thu Tươi

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN OsHKT2,1 MÃ
HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION Ở MỘT
SỐ GIỐNG LÚA
Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành : Công nghệ Sinh học
(Chương trình đào tạo : Chuẩn)

LỜI CẢM ƠN
Cán bộ hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này ngoài sự cố gắng của bản
thân, tôi đã nhận được sự động viên giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô, gia
đình và bạn bè.
Hà tôi
Nộixin
- 2014
Lời đầu tiên của khóa luận
gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới
TS. Đỗ Thị Phúc- người đã trực tiếp hướng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt
quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Hồng Vân, cùng tập thể các thầy cô trong bộ môn Di truyền học- Khoa Sinh

học- Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội đã hết
lòng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Và tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị nghiên cứu viên, các anh chị
học viên cao học, các sinh viên phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền học và
phòng thí nghiệm Sinh học thụ thể và phát triển thuốc đã cùng tôi chia sẻ niềm
vui, khó khăn trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè
thân thiết đã luôn góp ý, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt những năm tháng học tập và phát triển.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội,ngày 25 tháng 5 năm 2014.
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Tươi

BẢNG KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu
ADN
Bp

Tiếng Anh
Deoxyribonucleic
Base pair

TiếngViệt
AcidAcid deoxyribonucleic
Cặp bazơ nitơ

22

Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
CDS

Coding sequence

CTAB

Cetyl trimethylamoni bromide

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic

Kb

Kilobase

M

Maker

Thang chuẩn

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

IRRI

Trình tự mã hóa cho protein

AcidEthylen tetraacetic acid

Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

33


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỤC LỤC

44


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B

55


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có truyền thống trồng lúa với nền văn minh lúa nước
có trên 4.000 năm lịch sử.Việt Nam nằm trong vùng địa lý – được xem như là
khởi nguyên của cây lúa, chạy dài từ chân núi Hi Mã Lạp Sơn cho đến bờ biển
Đông. Lúa gạo là nguồn thức ăn căn bản của dân tộc Việt Nam. Cây lúa có thể
sinh sống và thích nghi trong nhiều điều kiện khác nhau: lúa rẩy, lúa nước trời,
lúa nước sâu, lúa nổi; với nhiều điều kiện đất đai khác nhau như phèn, mặn,
phù sa, thành phần cơ giới từ sét nặng đến cát pha; chịu được nóng, lạnh, khô,
hạn ở các vĩ độ, cao độ vô cùng thay đổi mà không phải loài cây lương thực
nào cũng có thể có những tính trạng vô cùng đa dạng như vậy. Lúa gạo cung
cấp nguồn lương thực cơ bản, tạo việc làm cho hàng triệu người, đóng vai trò
quan trọng trong đời sống kinh tế, xã hội chính trị trong lịch sử phát triển đât
nước Việt Nam.
Trong tình trạng nguồn lương thực khan hiếm và giá lương thực tăng
như hiện nay, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực. Theo
thống kê năm 2002: diện tích đất trồng trọt trên thế giới chiếm 10% trong tổng
số 13 tỉ ha. Sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nông nghiệp đã được báo
động trong nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây. Do sự thay đổi khí
quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm dần lên, băng tan ở
hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp (như đồng bằng sông Cửu Long).
Như vậy, lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn trong nhiều năm

sau. Với tầm quan trọng như vậy, người ta đã hoạch định một thứ tự ưu tiên
trong đầu tư nghiên cứu tính chống chịu mặn và chống chịu khô hạn trên toàn
thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống cây trồng, sau đó là tính chống chịu lạnh,
chống chịu ngập úng, chống chịu đất có vấn đề (acid, thiếu lân, độ độc sắt, độ
độc nhôm, thiếu kẽm, Mg, Mn và một số chất vi lượng khác như Cu,…). Do
đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là
một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu.

66


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Cây trồng trên đất nhiễm mặn bị ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát
triển và năng suất. Khả năng điều hòa cân bằng hàm lượng ion Na + trong tế
bào là một trong những cơ chế quan trọng giúp cây sinh trưởng, phát triển
trong điều kiện đất nhiễm mặn. Cơ chế điều hòa được thực hiện thông qua
việc: Hạn chế lượng ion Na+ đưa vào tế bào; Khu trú ion Na + vào không bào;
Thải loại ion Na+ ra ngoài môi trường.
Gen OsHKT2,1 mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na + vào tế
bào ở cây lúa. Nghiên cứu cấu trúc, chức năng của gen OsHKT2,1 giúp làm
sáng tỏ cơ chế chịu mặn của cây lúa. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên
cứu “Nghiên cứu trình tự gen OsHKT 2,1 mã hóa cho protein vận chuyển
ion ở một số giống lúa” nhằm nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT2,1 ở
lúa.

77


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tổng quan về tính chịu mặn của cây lúa
1.1.1. Vài nét sơ lược về cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính của
nước ta và nhiều nước trên thế giới.Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các
nước Châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180 - 200 kg/người, ở Châu
Mỹ, Châu Âu khoảng 100 kg/người[2,9].

Hình 1.Cây lúa (Oryza sativa L.)
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo
(Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và
Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza
glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô
tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã
phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi
Oryza gồm tất cả 19 loài [85].
Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa
Quốc tế, Philippines năm 1967 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20
loài lúa dại và hai loài lúa trồng.

88


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New
Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia
thành bốn nhóm genome [85]. Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ
gen của từng loài được ghi ở Bảng 1.
Bảng 1: Phân loại chi Oryza[85].

Ngày nay, các nhà phân loại học đều thống nhất là chi Oryza có 23

loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza
glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. [2, 4]. Loài Oryza
glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được
gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica.

99


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn
có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v..
Nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của gen bằng phương pháp địa lý thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng [2,7,8]. Kết quả cho thấy,
cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau
của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai
loài phụ là Indica và Japonica. Và đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của
3 nhóm lúa được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa
Đặc tính

INDICA

JAVANICA

JAPONICA

Thân

-Thân cao

-Thân cao trung bình

Thân thấp

Chồi

-Nở bụi mạnh

-Nở bụi thấp

Nở bụi trung bình

Lá

-Lá rộng, xanh nhạt

-Lá rộng, cứng, xanh
nhạt

Lá hẹp, xanh đậm

-Hạt thon dài, dẹp

Hạt

-Hạt hầu như không
có đuôi
-Trấu ít lông và lông
ngắn
-Hạt dễ rụng

Sinh học

-Tính quang cảm rất
thay đổi

-Hạt to, dầy
-Hạt không có đuôi hoặc
có đuôi dài
-Trấu có lông dài
-Ít rụng hạt

-Tính quang cảm rất yếu

-Hạt tròn, ngắn
-Hạt không đuôi tới
có đuôi dài
-Trấu có lông dài và
dầy
-Ít rụng hạt
-Tính quang cảm rất
thay đổi

1.1.2. Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn tới cây lúa
Đất mặn được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm trên thế
giới, bởi nó ảnh hưởng rất lớn đến diện tích và năng suất cây trồng. Tính chất
vật lý và hoá học của đất mặn rất đa dạng, biến thiên tuỳ thuộc vào nguồn gốc
1010


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B

của hiện tượng mặn, độ pH của đất, hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chế độ
thuỷ văn và nhiệt độ [2,6,8] Những ảnh hưởng của đất nhiễm mặn tới cây lúa
được thể hiện ở những nội dung sau:
1.1.2.1. Ảnh hưởng sinh lý, sinh hóa tới cây
-Gây hạn sinh lý.
Mặn ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây


Sự trao đổi nước: mặn thường cản trở sự hấp thu nước của cây và có thể
gây nên hạn sinh lý và cây bị héo lâu dài…



Sự tổng hợp xytokinin bị ngừng vì rễ là cơ quan tổng hợp phithormon
nên cây thiếu xytokinin ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cơ quan trên
mặt đất.



Sự hút khoáng của rễ cây bị ức chế nên thiếu chất khoáng. Do thiếu
Phospho (P) nên quá trình phosphoryl hoá bị kìm hãm và cây thiếu năng
lượng.[6,8]



Sự vận chuyển và phân bố các chất đồng hoá trong mạch libe bị kìm
hãm nên các chất hữu cơ tích luỹ trong lá ảnh hưởng đến quá trình tích
luỹ vào cơ quan dự trữ…

-Kìm hãm sinh trưởng

Sự ức chế sinh trưởng của cây khi bị mặn là đặc trưng rõ rệt nhất.
Trong đất mặn, các thực vật kém chịu mặn ngừng sinh trưởng do các chức
năng sinh lý bị kìm hãm. Nồng độ muối càng cao thì kìm hãm sinh trưởng càng
mạnh. [2,8]
-Ảnh hưởng sinh hóa:
Khi đất nhiễm mặn, nồng độ ion Na + trong đất cao, cây hấp thu nhiều
ion Na+ gây ức chế sự tăng trưởng của tế bào thực vật. Khi đó có sự hấp thu
cạnh tranh giữa Na+ và K+ thông qua hệ thống vận chuyển thông

1111


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
thường[30,34]. Như vậy, mức độ cao của nồng độ Na+, hoặc tỷ lệ Na+ / K+
cao,gây ngộ độc chuyển hóa bởi một cuộc cạnh tranh giữa Na + và K+ khi K+
kích hoạt nhiều enzym [14].Hơn nữa,ở nồng độ cao, Na+ có thể thay Ca2+ từ
màng tế bào,dẫn đến một sự thay đổi trong bào tương của màng tế bào . Điều
này có thể được thấy rõ từ sự rò rỉ của K + ở các tế bào[22]. Sự hấp thu Na+
cao và sự rò rỉ của K+ dẫn đến sự mất cân bằng trong tỷ lệ Na + / K+ trong bào
tương. Do đó, lần lượt, dẫn đến nhiều sự mất cân bằng trong các phản ứng
enzyme của tế bào, giảm mứcđộ oxy hóa,… Trong trường hợp nặng những tác
động bất lợi góp phần ức chế sự tăng trưởng và gây chết ở thực vật.
1.1.2.2.Sự biểu hiện gen liên quan đến tính chịu mặn.
Theo nghiên cứu của Mimura et al. 2003, Gárbarino and Dupon, 1988
cho thấy khả năng duy trì Na+ ở nồng độ thấp dưới điều kiện mặn là một yếu
tố quyết định khả năng chịu mặn quan trọng đối với thực vật. Các nhà nghiên
cứu đã tiến hànhnghiên cứu trên giống lúa chịu mặn (Pokkali) và giống lúa
không có khả năng chịu mặn (BRRI Dhan29) trong cùng một điều kiện mặn ở
những nồng độ NaCl khác nhau nhóm nghiên cứu thu được kết quả như sau:
Pokkali giữ Na+ ở một nồng độ thấp hơn nồng độ của Na + ở giống BRRI

Dhan29 trong cùng điều kiện xử lý mặn.
Sự biểu hiện gen liên quan đến tính chống chịu mặn được thể hiện qua
quá trình truyền tín hiệu gây áp lực mặn vào tế bào, các gen mã hóa cho các
protein có chức năng chuyên hóa ở các mô được khởi động và hàng loạt quá
trình phiên mã, dịch mã xảy ra từ đó biểu hiện thành tính trạng và kết quả được
thể hiện trên hình đối với giống Pokkali còn đối với giống BRRI Dhan29 thì
do không chứa gen kháng mặn nên không biểu hiện ra kiểu hình.

1212


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B

Hình 2. Cây lúa sau 2 tuần trồng trong điều kiện nồng độ NaCl khác nhau
(cvs. BRRI Dhan29 và Pokkali)
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy: quá trình vận chuyển làm giảm bớt
nồng độ ion Na+ đưa vào tế bào sẽ làm giảm số lượng độc hại do ion Na + gây
ra cho tế bào. Con đường này giúp duy trì áp lực của việc đáp ứng thải loại
chất độc của cây trong điều kiện mặn.

1313


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
1.1.3.Tính chống chịu mặn của cây lúa
Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo
các giai đoạn sinh trưởng khác nhau đối với cây lúa. Cơ chế chống chịu mặn
của cây được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [59,60].
Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ
thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác

nhau[54,66,67]. Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở
giai đoạn hạt nẩy mầm, sau đó trở nên rất mẫn cảm trong giai đoạn mạ (tuổi lá
2-3), rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trưởng, kế đến nhiễm trong
thời kỳ thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời
kỳ hạt chín[67,69].Tuy nhiên, một vài nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa trổ,
nó không mẫn cảm với stress do mặn [54,55]. Do đó, người ta phải chia ra
nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây
trồng.
Theo Yeo và Flower (1984), những thay đổi sinh lý của cây lúa liên
quan đến tính chống chịu mặn được tóm tắt như sau:
• Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư
thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc.
• Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng
được tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân.
• Chuyển vị từ rễ đến chồi – Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp
với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi,
làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi .
• Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển
từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không
thể chuyển ngược lại.

1414


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
• Chống chịu ở mô – Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các
không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với
hoạt động sinh trưởng của cây
• Ảnh hưởng pha loãng – Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng
độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước

trong chồi
Tỉ lệ Na+/K+ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa
chống chịu mặn [41,42,43].Tất cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ
Na+ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na+/K+ trong chồi (< 1).
Mỗi một giống lúa đều có một hoặc hai cơ chế nêu trên, không phải có
tất cả [90]. Phản ứng của cây trồng đối với tính chống chịu mặn vô cùng phức
tạp, đó là hiện tượng tổng hợp từ những yếu tố riêng lẻ. Do vậy, mục tiêu của
chúng ta là phối hợp tất cả những cơ chế sinh lý ấy vào trong giống lúa cải tiến
tính chống chịu mặn.
1.2.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật
Kali (K+) có thể tạo lên đến 10 % tổng số trọng lượng khô của cây và
là cation phong phú nhất trong bào tương vì nó tương thích với cấu trúc protein
thậm chí ở nồng độ cao.Ở cấp độ tế bào, cation này được sử dụng cho các chức
năng cơ bản như: trung hòa điện của các nhóm anion, kiểm soát các tế bàophân
cực màng, điều hòa áp suất thẩm thấu và điều chỉnh sức trương của tế
bào[19]. Ở cả cấp độcơ thể, K+được tham gia vào các chức năng tích hợp . Ví
dụ, liên quan đến sự tham gia của nótrong điều chỉnh sức trương của tế bào,
K+đóng một vai trò trong hướng kích thích, cho phép thực vật điều chỉnh độ
mở các khí khổng trên bề mặt lá. Tầm quan trọng củacác chức năng này có thể
giải thích lý do tại sao vận chuyển K + qua màng tế bào đã được nghiên cứu
rộng rãi hơn các ion dinh dưỡng khác.
Để hoạt động trao đổi chất ở thực vật có hiệu quả thì nồng độ ion Kali
( K+ ) cần phải được duy trì trong khoảng từ 100-200mM ở trong tế bào chất.

1515


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết
tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng tế

bào nhờ có một số lượng lớn các gen vận chuyển K + [58,86,87,88]. Nhiều loài
thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của nhóm glycophyte thực hiện
hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh hưởng gây hại của mặn.
Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K + và hạn chế hấp thu Na +
vào bào tương. Cơ chế hấp thu Na+ trong rễ cây và trong lá được minh họa
trong hình [86]

Hình 3.Cơ chế hấp thu Na+ trong rễ cây và trong lá [86]
Với: Ep:lớp biểu bì; Co: vỏ; En: nội bì; Pe: vỏ trụ/trụ bì ;
Ve: tế bào mạch ống;Bu:tế bào bó mạch ;Ms: tế bào mesophyll;
Cc: tế bào kèm.

1616


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Có những cơ chế hấp thu Na + khác nhau vào tế bào thực vật: Kênh vận
chuyển cation không chuyên biệt-Nonselective cation channels ( NSCCs ) là
con đường chủ đạo để Na+ được hấp thu vào trong tế bào thực vật[23]. Tuy
nhiên , cấu trúc phân tử của các NSCCs vẫn chưa được làm rõ. Và vận chuyển
có ái lực cao với kali ( HKTs ) là một họ gen mã hóa cho protein có vai trò
trung gian giúp Na+ được hấp thụ vào trong tế bào thực vật[41,42]
Ngoài những NSCCs và HKTs , các protein khác có thể tham gia vào
trung gian vận chuyển ion Na+ dưới điều kiện mặn là HAK / KT / KUP- kênh
vận chuyển Kali, KEA antiporters, vận chuyển có ái lực thấp với cation LCT-1
(low affinity cation) [74,75]
1.3.Họ protein HKT ở thực vật
1.3.1.Cấu trúc của họ protein ở thực vật
Khảnăng chịu mặn trong nhiều loài thực vật được tỷ lệ nghịch với mức
độ tích lũy ion Na+ trong thân cây, đặc biệt là trong cây lúa [1]. Trong

Arabidopsis và lúa, protein HKT (High-affinity K + Transporter ) có vai trò
quan trọng trong việc kiểm soát vận chuyển tích lũy Na + [2-6] , do đó xác
định được khả năng chịu mặn của cây. Tuy nhiên, trong khi protein lúa mì
TaHKT1 vận chuyển cả Na+ và K+ thì protein AtHKT1 trong Arabdiopsis
thaliana lại vận chuyểnNa+ [7,8] và trình tự của hai protein này không liên
quan chặt chẽ với nhau. Nghiên cứu gần đây cho thấy các protein thuộc họ
protein HKT ở lúa và Arabidopsis được biểu hiện trong các tế bào xylem và
bảo vệ lá khỏi stress mặn bằng cách loại bỏ muối natri từ nhựa xylem [5,6]. Để
tránh nhầm lẫn về cấu trúc và chức năng giữa các protein HKT thuộc các loài
thực vật khác nhau, một nhóm các nhà khoa học của CSIRO Plant Industry và
các tổ chức khoa học khác đã đưa ra danh pháp quốc tế cho họ protein HKT
này ( Bảng 3)

1717


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Bảng 3 .Danh sách các protein thuộc họ protein HKT

a: Từ dự án bộ gen cây dương, athttp :/ / genome.jgi-psf.org.
b: Dịch từ trình tự nucleotide.
c: Bởi vì OsHKT1; 2 là một gen giả (gen giống với các gen khác nhưng trình
tự bazơ của chúng có những sai sót làm cho chúng không có khả năng chứa
những thông tin sinh học hữu ích) trong giống lúa Nipponbare, và stop codons
trong gen bị bất hoạt để tạo ra một chuỗi axit amin có độ dài đầy đủ.
Dựa vào độ dài trình tự gen HKT mã hóa cho các acid amin thuộc họ
ptotein HKT và các công cụ tin sinh học cần thiết: neighbor-joining, UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) and maximum
parsimony,… các nhà khoa học đã chia họ gen HKT ở thực vật thành 2 nhóm
chính đó là: gen HKT từ các loài thực vật 2 lá mầm nằm trong chính phân họ

đầu tiên[82,84,85] . Ngược lại, 9 gen HKTđược tìm thấy ở lúa [9] là đa dạng
hơn và phân chia giữa hai phân họ.Hay các gen HKT thuộc loài 2 lá mầm và
gen OsHKT4- OsHKT8 ở lúa được xếp vào phân họ 1.(Ví dụ: AtHKT1 trở
thành AtHKT1; 1 và OsHKT4 trở thành OsHKT1; 1). Các gen HKT từ các loài
hòa thảo được xếp vào phân họ 2.
1818


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Hệ thống đặt tên này có những ưu điểm rõ ràng về cả chức năng và
tiến hóa riêng biệt giữa các gen trong một phân họ và giữa các gen trong một
loài. Do đó, sự khác biệt giữa trình tự TaHKT1 ( TaHKT2 ; 1) và AtHKT1
( AtHKT1 ; 1) được hỗ trợ bởi sự phân chia giữa 2 nhánh, trong khi những
điểm tương đồng giữa TaHKT1 ( TaHKT2 ; 1) và OsHKT2 ( OsHKT2 ; 2)
được chỉ ra rõ ràng. Trong ký hiệu này: số thứ hai là để chỉ phân biệt gen
trong một loài , và không phản ánh các mối quan hệ -tiến hóa, tên TaHKT2 ; 1
không chỉ một mối quan hệ gần gũi với OsHKT2 ; 1 hơn OsHKT2; 3.Các gen
thuộc họ gen HKT được chia thành hai nhánh chính là dựa vào sự thay thế
glycine / serine của acid amin đầu tiên trong chuỗi protein HKT [7,9]. Tất cả
các gen HKT của phân họ 1 có một serine ở vị trí đầu, trong khi các gen HKT
của phân họ 2 (trừ OsHKT2 ; 1) có một glycine .
Phân tích chức năng của TaHKT2 ; 1, AtHKT1 ; 1 và gen lúa cho thấy
sự thay thế đặc biệt này có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc xác định
phương thức vận chuyển Na+ [ 7,9,10 ]. Điều này có liên quan đến việc nghiên
cứu khả năng chịu mặn ở thực vật.

Hình 4.Cấu trúc hai nhóm gen vận chuyển HKT ở thực vật
Mặc dù Protein vận chuyển HKT là rất quan trọng tuy nhiên không có
cấu trúc ba chiều (3D) của các protein này trong các Protein Data Bank. Các

1919


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
thông tin dự đoán cấu trúc cho các protein HKT chủ yếu được dựa trên phân
tích sử dụng các công cụ tin sinh học. Gần đây, các mô hình phân tử của các
gen vận chuyển HKT ở lúa: OsHKT1, 5 và OsHKT1, 4, dựa trên một cấu trúc
tinh thể của vi khuẩn TrkH K+vận chuyển từ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
(VpTrkH), đã được xây dựng, và các dữ liệu cấu trúc đã được đồng nhất với dữ
liệu sinh lý. Một cấu trúc tinh thể VpTrkH đã được sử dụng ở đây, protein vận
chuyểnHKT này có cùng tính chất và chức năng như một hệ quả của sự giống
nhau giữa trình tự và cấu trúc.

Hình 5. Mô hình cấu trúc phân tử của một số gen thuộc họ gen HKT dựa
trên một cấu trúc tinh thể của vi khuẩn TrkH

2020


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
1.3.2.Chức năng của protein HKT
Chức năng quan trọng của protein HKT trong việc giúp cho thực vật có
thể tồn tại trong điều kiện đất nhiễm mặn cao đã được khẳng định trong các thí
nghiệm loại gen trực tiếp làm cây mẫn cảm với muối và thông qua biểu hiện
biến đổi gen của các gen trong họ gen HKT ở các loài thực vật khác, ví dụ:
biểu hiện của các OsHKT1; 1 gen trong gạo cho phép cây lúa phát triển tốt hơn
trong điều kiện mặn.

Hình 6: Chức năng vận chuyển của protein HKT.
Hình minh họa chức năng vận chuyển của protein trong việc bảo vệ

thực vật từ những stress do mặn. HKT vận chuyển và ngăn ngừa Na+ tích tụ
trong lá, do đó bảo vệ thực vật khỏi tác động của mặn.
Như chúng ta đã biết ion Na+ là một ion có hại đối với tế bào, Na + ở
nồng độ cao sẽ ức chế sự tăng trưởng của cây. Vì vậy protein HKT có 2 chức
năng quan trọng là:
Chức năng vận chuyển ion qua màng tế bào: Protein HKT được mã
hóa bởi họ gen HKT có vai trò quan trọng trong việc hấp thu Na + từ ngoài môi
trường vào tế bào ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm . Tuy nhiên, kích
2121


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
thước của họ gen HKT trong cây hai lá mầm là nhỏ hơn kích thước họ gen
HKT trong cây một lá mầm. Ví dụ: trong cây Arabidopsis chỉ có một gen
AtHKT trong khi ở lúa có tới 9 gen OsHKT 1-9 [34,37,39]
Chức năng thứ hai của họ protein HKT là giúp cây cân bằng nồng
độ Na+ và K+ khi cây gặp điều kiện mặn: Ion Na+ có tác động phá vỡ và cản
trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây. Ion K + có vai trò quan trọng làm
kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn của cây.
Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Do
vậy, cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na + và gia
tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na-K trong chồi [53].
1.3.3. Họ protein HKT ở lúa
Ở lúa có chín gen thuộc họ gen HKT ( OsHKT1 -9) (Bảng 4) đã được
xác định, chỉ có OsHKT5 được coi là một gen không có chức năng , do sự tồn
tại của ba stop codons trong mRNA của nó [33,34].Tất cả các gen khác có
chức năng mã hóa các protein có vai trò vận chuyển riêng biệt thể hiện trong
các mô và / hoặc cơ quan khác nhau . Horie et al. (2001 ) cho rằng OsHKT1
(hay OsHKT2;1) mã hóa cho protein vận chuyển một Na+ và OsHKT2 (hay
OsHKT2;2) mã hóa cho protein đồng vận chuyển một Na + / K+.

Garciadeblás et al. (2003) cũng cho thấy OsHKT1 có ái lực cao với vận
chuyển Na+ và OsHKT4 (hay OsHKT1;1) có ái lực thấp với vận chuyển Na +.
OsHKT8(hay OsHKT1;5) gần đây đã được biết đến là một gen mã hóa cho
protein có vai trò vận chuyển Na+ , góp phần vào khả năng chịu mặn ở thực vật
bằng cách duy trì cân bằng nồng độ K + [70] . Do đó, họ gen HKT ở lúa có vai
trò quan trọng đối với cân bằng nồng độ ion ở thực vật nhờ việc loại bỏ ion
Na+ trong điều kiện đất nhiễm mặn [13]mặc dù một số gen khác trong họ gen
HKT có vai trò mã hóa cho protein vận chuyển Na+.
Bảng 4: Danh sách thuộc họ gen HKT ở lúa
Protein

Species

Common name

2222


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
OsHKT1;1

Oryza sativa

Rice

OsHKT1;2

Oryza sativa

Rice

OsHKT1;3

Oryza sativa

Rice

OsHKT1;4

Oryza sativa

Rice

OsHKT1;5

Oryza sativa

Rice

OsHKT2;1

Oryza sativa

Rice

OsHKT2;2

Oryza sativa

Rice

OsHKT2;3

Oryza sativa

Rice

OsHKT2;4

Oryza sativa

Rice

Và vị trí, kích thước các đoạn exon , intron của 9 genesOsHKT được
biểu thị trên hình sau:

Hình 7. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thước các đoạn exon, intron của chín
gen OsHKT ở lúa
Các thanh màu đen đại diện cho khung đọc mở, và các vị trí và độ dài của
intron được quy định bởi các vết cắt và thanh màu xám. Intron lớn đượcđưa ra khỏi
cấu trúc mô hình gen và độ dài được ghi nhận. Các đường chấm chấm nối hai mảnh

2323


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
màu đen của OsHKT2 không cho thấy sựtương đồng với gen HKT khác. Đoạn này
nằm ngoài cấu trúc mô hình, và chiều dài được ghi nhận.

1.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến gen

OsHKT2,1
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của gen mã
hóa cho protein vận chuyển ion Na + ở lúa.Biểu hiện của OsHKT1, OsHKT2 và
OsVHA đãđược nghiên cứu nhờ kỹ thuật RT-PCR và trong situ PCR [41]
Gần đây, một gen OsHKT thể khảm từ giống lúa chịu mặn Nona
Bokra đã được cô lập [32].Gen này có vùng 5'tương ứng với gen OsHKT2 ;2,
nhưng vùng 3'tương ứng với các OsHKT2;. Gen mới này được gọi là
OsHKT2; 2/1và nó là kết quả của đột biếnmất đoạn 15 kb trên nhiễm sắc thể
số 6 của Nona Bokra, dẫn đến mộtliên kết giữa đầu 5' gen OsHKT2; 2 và đầu
3' gen OsHKT2; 1 [32] .
Biểu hiện của OsHKT2; 2/1 trong tếbào trứng ếch hoặc tế bào nấm
men cho thấy rằng OsHKT2 ; 2/1 cho phép hấp thu cả Na + và K+ qua màng
tế bào ngay cả khi nồng độ Na + bên ngoài cao [32]. Hoạt động của protein
OsHKT2; 2/1là tương tự với OsHKT2; 2 hơn OsHKT2;1 [32]. Như OsHKT2;1
vàOsHKT2; 2, protein OsHKT2; 2/1 được biểu hiện trong rễ cho phép vận
chuyển ion K+ qua màng tế bào. Trái ngược với OsHKT2; 1, biểu hiện của
OsHKT2; 2/1 giảm xuống trong điều kiện mặn nhưng chức năng không bị mất
đi [32] . Hơn nữa, mức giảm biểu hiện này trong OsHKT2; 2/1 là ít nghiêm
trọng hơn so với việc giảm biểu hiện của gen OsHKT2; 1 và OsHKT2;2. Điều
này cho thấy OsHKT2; 2/1 đóng một vai trò quan trọng trong việc vận chuyển
ion K+ khi cây gặp điều kiện mặn [32] .
Một nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng gen OsHKT2,1 là nghiên cứu
đột biến định hướng được thực hiện trên cDNA gen OsHKT2 ; 1của giống lúa
Nipponbare (Ni-OsHKT2;1) để xác định biến thể trên gen. Gen Ni-OsHKT2,1
được biểu hiện trong tế bào trứng ếch và được nghiên cứu chức năng khi được
biểu hiện ở tế bào trứng. Ni- OsHKT2 ; 1, khi biểu hiện trong tế bào trứng,
giống như một Na+-K+ symport ở nồng độ Na + và K+ rất thấp, và như là một

2424

Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Na+ Uniport với nồng độ Na+ trong khoảng millimolar [19,20]. Ni- OsHKT2; 1
được chứng minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện
tích - điện áp (I- V) .Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT2 ; 1không tiếp tục vận
chuyển K+ nữa. Một đặc tính đặc trưng của OsHKT2; 1 là có ái lực cao với K+.
Các tính chất chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT2; 1 ở lúa
được so sánh với biến thể OsHKT2; 1biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận
thấy không có sự khác biệt về tính thấm Na + và K+ cũng như cho thấy tính chất
chức năng chính của Ni- OsHKT2; 1 được bảo toàn trong 6 biến thể: G17/V,
G17/V D403/E, R21/K R32/K, R21/R32 K/ KD403/E, F61/ S và các biến thể
D403/ E gen OsHKT2,1 trong tế bào trứng ếch [32]
1.5.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài
Dựa trên cơ sở những hiểu biết nêu trên , những tồn tại hiện có xung
quanh khả năng chịu mặn của lúa chúng tôi đề xuất nghiên cứu “ Nghiên cứu
trình tự gen OsHKT2,1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống
lúa” với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu chính sau:
1.5.1.Mục tiêu
Phát hiện sự sai khác trong trình tự nucleotide của gen OsHKT2,1 và
trong trình tự acid amin suy diễn tương ứng của protein mã hóa bởi gen
OsHKT2,1 ở một số giống lúa.
1.5.2. Nội dung nghiên cứu




Nhân bản gen OsHKT2,1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số
giống lúa
Xác định trình tự gen OsHKT 2,1ở một số giống lúa.
So sánh trình tự nucleotide của gen OsHKT2,1 và trình tự acid amin suy

diễn ở một số giống lúa.

2525