Tieu Luan Phan tich thuc pham AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
◊…….◊
TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ
PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
GVHD: Ths. Hoàng Thị Kim Khuyên
Lớp: ĐHPT5
SVTH: Nguyễn Hữu Tiến

Huỳnh Thị Bích Vân

09078011

09082441


NỘI DUNG

1. Tổng quan về Aflatoxin và phƣơng pháp phân tích

2. Tổng quan về E.Colivà phƣơng pháp phân tích


1. Tổng quan về Aflatoxin và phƣơng pháp phân tích

1. 1 Tổng quan về Aflatoxin

1.2 Các phƣơng pháp xác định Aflatoxin

1.3 Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng

1.4 phƣơng pháp Elisa


1.1 Tổng quan về Aflatoxin

Khái niệm, tính chất
Độc tính
Các thực phẩm chứa Aflatoxin
Giới hạn cho phép


Khái niệm, công thức cấu tạo
 Aflatoxin là một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus,
parasiticus và fumigatus.
 Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là
• AFB1: C17H12O6
• AFB2: C17H14O6
• AFG1: C17H12O7
• AFG2: C17H14O7
 Giữa 4 loại trên thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản
và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất


Khái niệm, công thức cấu tạo

Hình. AFB1 và AFB2

Hình. AFG1 và AFG2

Độc tính
 Độc tính của aflatoxin cao gấp 10 lần HCN và gấp 68 lần Arsen.
 Gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết ngƣời khoảng 10mg)
 Phá huỷ tế bào gan, thận và các bộ phận sống còn khác.
 Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch.
 Ăn mòn thành ruột và dạ dày.
 Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết, gây ra ung thư cho gia súc, gia
cầm.Và nếu con người ăn thịt chứa aflatoxin thì có thể bị ung thư

gan.
Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư.
Hình. Bệnh ung thƣ gan


Thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin


Giới hạn cho phép
FDA đƣa ra giới hạn tối đa
Hàm lƣợng

ML
Tiêu chí

(ppm)
Ngô và các loại hạt cho vật
20

Bộ Y tế Việt Nam

nuôi chưa trưởng thành.

Tiêu chí
(g/kg)
5

Aflatoxin
15

vật nuôi đã trưởng thành

Ngô và các loại hạt dùng cho
200

lợn thịt từ 100 pound trở lên
Ngô và các loại hạt cho bò

300

giai đoạn cuối

B1,

B2, G1, G2

Ngô và các loại hạt cho giống
100

Aflatoxin B1

Aflatoxin
0.5

M1

trong sữa và các
sản phẩm sữa


1.2 Các phƣơng pháp phân tích Aflatoxin
Phƣơng pháp
định tính

• Phương pháp BGYF

•Phương pháp vi cột.
•Phương pháp cột ái lực - típ Florisil.
•Phƣơng pháp Elisa.
Phƣơng pháp
định lƣợng

•Phương pháp huỳnh quang kế - ái lực
•Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng.
•Phương pháp sắc ký lỏng (LC)


Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng phân tích Aflatoxin

Nguyên tắc
Dụng cụ - hóa chất

Quy trình phân tích
Công thức tính Aflatoxin
Lƣu ý


Nguyên tắc

Mẫu sau khi xử lý sẽ được đưa qua cột sắc ký, cột được nhồi
bằng các gel kháng thể.
Khi mẫu đi qua cột, các gel kháng thể sẽ làm nhiệm vụ hấp phụ

các vi nấm Aflatoxin.
Sau đó, chúng ta rửa cột bằng nước cất để loại bỏ các chất còn
lại và giải hấp Aflatoxin bằng dung môi methanol.
Tiến hành định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng.


Dụng cụ - Hóa chất
THIẾT BỊ
 Cột sắc ký ái lực miễn dịch

 Micro pipet
 Bình chạy TLC
 Bản TLC silicagel 10 x 10 cm

 Bình thổi khí N2
 Xiranh 20 – 30 ml

 Mycrosiringe Hamilton 10 l

 Dụng cụ làm khô gia nhiệt
 Máy lắc Vortex
Máy soi đèn UV 395nm

HOÁ CHẤT
 Dung dịch chiết mẫu:
MeOH/Nước cất (75:25)
 Methanol HPLC grade chiết mẫu
 Aflatoxin chuẩn B1 trong Benzen
- Acetonitrit (98:2)
 Dung dịch triển khai: Cloroform
– Aceton (9:1)
 Nước cất


Quy trình phân tích
Chuẩn bị mẫu
5g NaCl
125ml MeOH 70%

25g mẫu

Trộn đều

Lắc đều. Để yên

Lấy 15ml pha

15p-20p. Lọc

loãng 1/3 nƣớc.
Lọc và lấy 15ml

Mẫu đã
nghiền

Bình định mức

phân tích


Quy trình phân tích
Qua cột sắc ký

H2O vào đầy cột.
Tránh tạo bọt khí

20 ml PSB để rửa
Dịch lọc qua cột (tốc độ 1 giọt)

20ml dd chiết mẫu đã lọc
Bơm 2-3 ml không khí qua cột
để khô, tháo cột và lau cột.

Lấy 15 ml dd
1ml MeOH rửa
giải, hứng dd
Dd mẫu

Quy trình phân tích
Qua cột sắc ký

Hình. Minh hoạ cột


Quy trình phân tích
Định lƣợng
Làm khô dd giải
hấp bằng khí N2 ở
40-50oC

Chấm mẫu và chuẩn
trên giấy silicagen

Hoà tan cặn bằng
Benzen-acetonitril
(98:2)

Clorofom-aceton (9:1)

Cho vào hệ dung
môi, đậy nấp

Khoảng 30 phút
Soi đèn UV 365nm

Lấy bản ra. Làm

Kết quả.

khô


Công thức tính toán
Nồng độ của Aflatoxin B1 là
𝑺. 𝒀. 𝑽 𝒈
𝑨𝒍𝒂𝒕𝒐𝒙𝒊𝒏 𝑩𝟏 =
(
𝒉𝒐ặ𝒄 𝒑𝒑𝒃 )
𝑿. 𝑾 𝒌𝒈
Trong đó:
S: thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu (l)

Y: Nồng độ của Aflatoxin B1 chuẩn (0.5 l/ml hoặc 0.5 ppm)
V: thể tích hoà tan cặn (200 l)
X: Thể tích có độ sáng bằng S l chuẩn

W: Số gam mẫu đi qua cột (1g)


Lƣu ý

 Chấm trong tủ hút để dung môi bay nhanh, chấm từ từ để các chấm

thật nhỏ, kích thước chỉ khoàng 1mm/chấm,\.
 Đeo găng tay khi làm thí nghiệm.
 Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước Javen 10 %.

 Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm
trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa.


Phƣơng pháp Elisa phân tích Aflatoxin

Nguyên tắc
Dụng cụ - hóa chất

Quy trình phân tích
Công thức tính Aflatoxin
Lƣu ý


Nguyên tắc
Phương pháp này kết hợp của kháng thể và kháng nguyên.
Kháng thể kháng Aflatoxin được phủ lên bề mặt các giếng nhựa thử.

Aflatoxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với Aflatoxin có gắn enzyme.
Tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ có màu. Càng nhiều Aflatoxin
trong mẫu thì càng ít Aflatoxin có gắn enzyme bám vào kháng thể.

Như vậy, màu sẽ đậm khi có ít Aflatoxin và màu nhạt khi có
nhiều Aflatoxin.
Bằng phương pháp đo màu trên máy Elisa có thể xác định được
hàm lượng Aflatoxin.


Dụng cụ - Hóa chất

THIẾT BỊ
• Micro pipet 1,8,12

• Máy đọc Elisa
• Máy lắc (để chiết mẫu)
• Máy lắc Vortex

• Pipet tip
• Giếng mini phủ kháng thể
• Và các dụng cụ thủy tinh của

phòng thí nghiệm

HOÁ CHẤT
• Methanol để chiết mẫu
• Cơ chế B (H2O2/ Đệm axetat)
• Các thành phần của bộ kit Elisa
để kiểm tra Aflatoxin
• Đệm pha cộng hợp
• Cơ chế A (TMB)
• Dịch hãm
• Nước cất
• Cộng hợp Enzim 10x
• Aflatoxin B1(1,2,4,8 ppb)


Quy trình phân tích
Chuẩn bị mẫu

25 ml MeOH 60%

5g mẫu

Trộn đều

Mẫu đã
nghiền

Lắc đều. Để yên

Lấy 15ml phân

15p-20p. Lọc

tích

Bình định mức


Quy trình phân tích
Phân tích mẫu
50 ml chuẩn

50 ml MeOH

50 ml mẫu

50 ml MeOH

Tiến hành song song

Các giếng mẫu (không phải Erlen, hình minh họa)

Để yên 10p.
Cho vào
chậu nƣớc
Javen 5%.

Phân tích

Rửa lại 5 lần

Đập khăn

 = 450 nm

bằng dd rửa

giấy.


Công thức tính toán
Màu đậm  Aflatoxin ít
Màu nhạt  Aflatoxin nhiều

Tính độ ức chế màu theo công thức:
𝐴1
% Ứ𝑐 𝑐ℎế = 1 −
. 100
𝐴0

A1: là mật độ quang A của mẫu
A0: Là mật độ quang A của chuẩn.
Dựa vào % ức chế màu của mẫu và đồ thị Aflatoxin của chuẩn tính được
nồng độ Aflatoxin của mẫu.
Nồng độ Aflatoxin trong mẫu = 5. Nồng độ Aflatoxin trong giếng