Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây thất diệp nhất chi hoa (paris polyphylla sm )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NÔNG LỆ THÙY

NGHIÊN CỨU THU THẬP VÀ LƢU TRỮ
NGUỒN GEN CÂY THẤT DIỆP NHẤT CHI HOA
(PARIS POLYPHYLLA SM.)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. VŨ THỊ THU THỦY

THÁI NGUYÊN - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa được sử dụng để bảo vệ cho bất kỳ một học vị nào.
Tác giả

NÔNG LỆ THÙY

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thu Thủy đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành công trình
nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, Ban lãnh đạo
Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học và các
thầy cô giáo, cán bộ của Khoa, sự giúp đỡ tận tình của TS. Nguyễn Thị Thu
Ngà, KTV Trần Thị Hồng đã giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài NCKH cấp Bộ
có mã số

- -

-

Sinh họ

ủ trì.

-

Tôi xin cảm ơn sự động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian
học tập và hoàn thành luận văn.
Tác giả

NÔNG LỆ THÙY

ii


MỤC LỤC
Trang

Trang bìa phụ
Lời cam đoan ........................................................................................................ i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii
Mục lục ...............................................................................................................iii
Danh mục các bảng.............................................................................................. v
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa ............................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ............................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học ............................................................................ 4
1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng ............................................................ 5
1.1.4. Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa ............................... 7
1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ...................................................... 8
1.3. Một số phương phương pháp lưu trữ và bảo tồn giống cây trồng ................... 10
1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ) ........................................................................... 11
1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ) ...................................................................... 12
1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ......................................... 13
1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro ......... 13
1.3.3.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro .............................................. 15
1.3.3.3. Các đường hướng trong nhân giống in vitro ........................................ 18
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................... 22
2.1.1. Vật liệu..................................................................................................... 22

iii

2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 23
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ...................................................................... 23
Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mô tả và chụp ảnh....... 23
2.2.2. Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên ........ 23
2.2.3. Phương pháp phân lập gen rpoC1 ........................................................... 23
2.2.4. Phương pháp nuôi cấy in vitro ................................................................ 24
2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................ 26
2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm ................................................................... 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................... 27
3.1. Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền núi
phía Bắc của Việt Nam ...................................................................................... 27
3.1.1. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình GiaLạng Sơn ........................................................................................................... 27
3.1.2. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Quản BạHà Giang ............................................................................................................ 29
3.1.3. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Sa Pa- Lào Cai 30
3.2. Kết quả phân tích gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa .................... 32
3.3. Kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa trồng tại tỉnh Thái Nguyên34
3.4. Kết quả bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa in vitro ................................... 37
3.4.1. Kết quả khử trùng mẫu ............................................................................ 37
3.4.2. Kết quả thăm dò môi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu
nghiên cứu.......................................................................................................... 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 47

iv


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D

2,4 Dichlorphenoxyacetic acid

Cs

Cộng sự

CT

Công thức

ĐHST

Điều hòa sinh trưởng

IBA

Indole-3-buttyric acid

BAP

6-Benzylaminopurine

IAA

Indole - 3 - acetic - acid

MS

Murashige and Skoog

NAA

1-Naphthalene acetic acid

GA3

Gibberellic acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Mẫu cây thu được tại huyện Bình Gia - Lạng Sơn ........................... 27
Bảng 3.2. Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang.................... 29
Bảng 3.3. Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Sa Pa .......................... 31
Bảng 3.4. Tên loài và mã số trình tự gen rpoC1 ............................................... 33
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây Thất diệp nhất chi hoa..... 35
Bảng 3.6. Đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng
sinh trưởng tại Thái Nguyên. ............................................................................. 36
Bảng 3.7. Kết quả khử trùng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa ............................ 38
Bảng 3.8. Kết quả khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa .............................. 40

Bảng 3.9. Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa .................................... 41
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ ........... 44

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái cây Bảy lá một hoa................................................................... 3
Hình 3.1. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn ........ 28
Hình 3.2. Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Hội Hoan, huyện Bình Gia .. 28
Hình 3.3. Mẫu củ thu được tại Quản Bạ - Hà Giang ......................................... 29
Hình 3.4. Quả và hạt cây Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang ................... 30
Hình 3.5. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Sa Pa ................................................. 31
Hình 3.6. Cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng của cây in vitro
tại Thái Nguyên ................................................................................................. 37
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 ....................................... 32
ất diệp nhất chi hoa ..... 34

rpo

ệt Nam ............................................................................... 34
Hình 3.9. Mẫu hạt sạch cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên môi trường MS cơ bản.. 39
Hình 3.10. Mẫu sạch khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa ............................... 42
Hình 3.11. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mô lá. ........ 43
Hình 3.12. Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên môi trường MS có
bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng ................................................... 44
Hình 3.13. Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính ........... 45
Hình 3.14. Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l ........................................... 45

vi

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa học là Paris polyphylla Sm., hay còn
gọi là cây Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài, chi hoa đầu, tảo hưu,
thảo hà xà…[9]. Chi Paris gồm 27 loài phân bố rộng khắp ở Châu Âu và Châu
Á trong đó tập trung nhiều nhất ở Trung Quốc. Chi Paris gồm các loài từ 03lá
đến 11 lá. Loài Paris Polyphylla có 13 giống [52].
Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được phát hiện tại các vùng núi
Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng
Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên
vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9]. Theo y học cổ truyền, cây
Thất diệp nhất chi hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, trị rắn cắn, trị viêm
tuyến vú, trị sốt rét, trị ho lâu ngày [9]. Trong những năm gần đây, cây Thất
diệp nhất chi hoa còn được phát hiện có tác dụng diệt khuẩn, kháng viêm mạnh,
ức chế các virus, tăng cường chức năng của tuyến thượng thận, an thần, trấn
tĩnh, chống ho. Đặc biệt, cây có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi và ung thư
dạ dày, kéo dài tuổi thọ cho người bệnh [11], [42], [43], [46].
Với nhiều tác dụng chống lại bệnh nên cây Thất diệp nhất chi hoa đang là
đối tượng được thu mua và khai thác với số lượng lớn. Bên cạnh đó, nạn phá
rừng làm nương rẫy dẫn đến giảm khả năng tái sinh và phân bố của cây Thất
diệp nhất chi hoa trong tự nhiên bị thu hẹp.
Theo phân hạng về độ góc bảo tồn, cây Thất diệp nhất chi hoa được xếp
hạng EN A1 c,d, và cấp đánh giá ở mức hiếm (R). Cây cũng được khuyến cáo
khai thác, sử dụng hợp lí và cần thiết phải lưu giữ và bảo vệ nguồn gen [6].
Việc lưu giữ và bảo tồn giống cây trồng có thể được thực hiện bằng nhiều
cách khác nhau như: bảo tồn tại chỗ, bảo tồn chuyển chỗ và bảo tồn in vitro.
Công tác tái sinh và nhân giống vô tính cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực
1

hiện tại một số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam như: Hà Giang, Sơn La, Lai
Châu. Tuy nhiên, kết quả tái sinh cây chưa được như mong muốn.
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thu thập và lƣu
trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) nhằm
bảo tồn nguồn gen và phục vụ cho công tác phục tráng giống sau này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thu thập được một số cây Thất diệp nhất chi hoa ở một số miên núi phía
Bắc Việt Nam
Bước đầu sử dụng được kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu định
loại mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa .
Lưu trữ được một số mẫu cấy Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh
trưởng và nuôi cấy in vitro.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm và thu thập mẫu của Thất diệp nhất chi hoa ở một
số địa phương miền núi phía Bắc Việt Nam.
Phân lập và xác định trình tự nucleotit của gen rpoC1
Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi
hoa trong phòng sinh trưởng cây in vitro của phòng công nghệ tế bào tại trường
Đại học sư phạm Thái Nguyên.
Nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.

2


Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa
học là Paris polyphylla Sm., hay còn gọi là
Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài,
chi hoa đầu, tảo hưu, thảo hà xà [9].
Theo trung tâm dữ liệu thực vật
Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa
được phân loại thuộc giới thực vật; ngành
thực vật có hoa, mộc lan, hạt kín; lớp một
lá mầm; bộ củ nâu; họ trọng lâu; chi Paris

Hình 1.1. Hình thái cây Bảy lá một hoa [60]

[54]. Chi này gồm có 27 loài, loài Paris
Polyphylla gồm 13 giống có dị thảo từ 3 - 11 lá [52].
Cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy đầu tiên ở độ cao 1500 - 3000m
tại dãy núi Hymalaya (Ấn Độ) và được Smith miêu tả lần đầu vào năm 1813
[9]. Trên thế giới, cây phân bố ở Trung Quốc (bao gồm An Huy, Phúc Kiến,
Quảng Đông, Giang Tây, Tứ Xuyên...), Ấn Độ, Nepal và Myanma [25].
Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy ở các vùng núi
Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng
Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên
vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9]. Theo nghiên cứu của
Pectelot, ở nước ta ít nhất có 5 loài khác nhau, trong đó có 3 loài được mô tả
khá kĩ.
Loài thứ nhất có tên khoa học là Paris delavayi Franch. Cây của loài
Paris delavayi Franch có thân gầy, cao chừng 1m, cành lá khoảng 2/3 phía trên
thân. Lá dài chừng 20cm, rộng khoảng 3,5cm, có 3 gân xuất phát từ cuống lá,
gân giữa rõ hơn, gân hai bên chạy cách theo mép lá chừng 5mm. Cuống lá dài
3

khoảng 2cm, phiến lá hình mác dài, đầu lá và cuống lá nhọn. Cánh tràng hình
sợi. Lá đài nhỏ hơn lá thật, dài khoảng 4 - 4,5cm, rộng khoảng 8mm. Thường
thấy mọc ở độ cao khoảng 1.400m đến 1.800m, trong những rừng ẩm ở Sapa
(Lào Cai). Loài này ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6 hoặc tháng 7 [9].
Loài thứ 2 có tên khoa học Paris hainanensis. Loài này có thân cây to,
cao chừng 0,80m. Lá tập trung thành vành, gồm 6 lá, ở vào khoảng 2/3 ở phía
trên thân. Lá dài khoảng 20cm, rộng khoảng 12cm. Đầu lá nhọn, hình ba cạnh
dài 1cm. Cuống lá dài tới 7cm, phiến lá hình trứng rộng, hơi không đối xứng.
Lá đài khoảng 5cm, rộng khoảng 2cm. Cánh tràng hình sợi, dài gấp 2 lần lá đài.
Loài Paris hainanensis ra hoa vào tháng 4, đậu quả vào tháng 6, loài này hay
gặp hơn ở những vùng rừng ẩm, thấp quanh Sapa, độ cao chừng 1500m [9].
Loài thứ 3 được gọi là Paris fargessi Franch. Thân của loài này cao
chừng 1m đến 1,3m. Vành lá cũng ở khoảng 2/3 phía trên thân, gồm 5 lá. Cuống
lá dài khoảng 5 - 5,5cm, phiến lá hình bầu dục, phía cuống hình tim, đầu lá
nhọn, lá có 5 gân. Lá đài hình mác, dài khoảng 6cm, rộng khoảng 1,2cm. Cánh
tràng hình sợi, ngắn hơn lá đài. Cây ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6. So
với các loài trên, loài Paris fargessi Franch hiếm hơn [9].
Trong số 2 loài Paris chưa xác định được tên, có một loại cao tới 2,5m.
Petelot phát hiện thấy 2 cây nhỏ trên đường từ Sapa (Lào Cai) đến Bình lư (Tam
Đường – Lai Châu) [9]. Loại thứ 2 được phát hiện ở độ cao 400m vùng núi Ba
Vì (Hòa Bình) và trên bờ suối có nhiều bóng rợp, khoảng giữa từ Hà Nội đến
Hòa Bình [9].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học
Cây Thất diệp nhất chi hoa là một loại cây nhỏ, sống lâu năm. Cây
thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ cao trên 600m và ưa bóng,
hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn. Phần thân trên mặt
đất, lụi hàng năm vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa

4


đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Trong tự nhiên, thường chỉ
những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm mới thấy có hoa, quả [25].
Cây Thất diệp nhất chi hoa ưa nơi có khí hậu mát, ít gió, nhưng không chịu
được úng. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn mà chỉ ở phạm vi các vườn cây
thuốc tại một số địa phương theo phương thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân
rễ. Theo đó, hàng năm vào khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo
trong vườn ươm hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có
một hoa, mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao. Thân rễ
Thất diệp nhất chi hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng.
Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [25].
Theo Đỗ Tất Lợi, ở Việt Nam cây Thất diệp nhất chi hoa được mô tả là
những cây có thân rễ ngắn, dài chừng 5 - 15cm, đường kính 2,5 - 5cm rất nhiều
đốt, khó bẻ, vết bẻ trông như có bột, màu vàng trắng hay xám vàng. Từ thân rễ
nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng đứng cao tới 1m, phía gốc có một số lá
thoái hóa thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng, gồm 3-10
lá, nhưng thường là 7 lá. Cuống lá dài 2,5 - 3cm, phiến lá hình mác rộng, dài
15- 21cm, rộng 4 - 8cm. Đầu phiến lá nhọn, mép lá nguyên, hai mặt lá nhẵn,
mặt dưới màu xanh nhạt, đôi khi có màu tím nhạt. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh
cành, cuống hoa dài 15 - 30cm. Số cánh tràng bằng số lá đài, hình sợi rủ xuống,
màu vàng nâu. Chiều dài của cánh tràng bằng hay ngắn hơn chiều dài của lá đài.
Nhụy màu đỏ tím, bầu thường gồm 3 ngăn. Quả mọng, màu tím đen. Ở Sapa,
cây ra hoa vào các tháng 3, 4, 5 và tạo quả vào các tháng 10 - 11 [9].
Người ta thường dùng thân rễ với tên Tảo hưu. Có thể thu hái Tảo hưu
quanh năm, nhưng tốt nhất là vào thu đông, tảo hưu được đào về rửa sạch và
phơi khô [9].
1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng
Bộ phận làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa là thân rễ. Theo

đông y, Tảo hưu có vị ngọt, hơi cay, tính bình, không độc. Tác dụng chủ yếu
của Tảo hưu là thanh nhiệt, giải độc, điều trị rắn độc cắn, trị viêm tuyến vú,
5


trị sốt rét, trị ho lao, trị ho lâu ngày, trị hen xuyễn... Nếu dùng ngoài da thì
đắp lên những nơi sưng đau [9].
Các công trình nghiên cứu y học hiện đại đã tìm thấy trong cây Thất diệp
nhất chi hoa có chất glicozit. Đặc biệt loại glucozit có lợi cho sức khỏe được kể
đến như tinh chất saponin (gọi là paridin C16H28O7) và tinh chất paristaphin
(C38H64O18) [9], [32].
Ở Nepal, Devkota (2005) đã cô lập được 6 hợp chất từ Paris polyphylla.
Các hợp chất là: przewalskinone B, polyphyllin C, polyphyllin D, saponin-1,
stigmasterol và stigmasterol-3-O-P-D-glucoside [33]. Theo đó, nghiên cứu của
Lee và cộng sự (2005), hợp chất polyphylin D của cây Thất diệp nhất chi hoa có
thể được sử dụng trong điều trị ung thư vú [40]. Một số nghiên cứu khác cũng
cho thấy, các hợp chất saponin của cây Thất diệp nhất chi hoa gây ức chế sự
tăng trưởng của khối u của bệnh ung thư phổi trên chuột thử nghiệm và gây độc
đối với các dòng tế bào ung thư của người như dòng tế bào ung thư dạ dày [41],
hay các dòng tế bào ung thư phổi A549 [42]. Dòng tế bào ung thư đại tràng
(LoVo và W-116), dòng tế bào ung thư thực quản (ECA 109) hay các bệnh ung
thư đường tiêu hóa nói chung [50].
Năm 2008, Deng và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của
saponin từ cây Thất diệp nhất chi hoa với Cladosporium cladosporioides và loài
Candida. Kết quả cho thấy, saponin có hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính này được
đem so sánh với một số thuốc thương mại, từ đó đưa ra một giải pháp thay thế
hữu hiệu cho các loại thuốc tổng hợp [32].
Năm 2005, Wang đã nghiên cứu thấy 2 hợp chất steroid là dioscin và
polyphyllin D có tiềm năng là tác nhân chống lại ký sinh trùng Dactylogyrus [50].
Năm 2012, Li và cộng sự đã phân lập được bốn hợp chất saponin steroid

mới đó là parisyunnanasides G-J và 3 hợp chất đặc biết của Paris polyphylla
var. Yunnanensis là padelaoside B, pinnatasterone, và 20-hydroxyecdyson. Tất

6


cả các hợp chất trên được đánh giá có khả năng gây độc chống lại tế bào ung
thư bạch cầu CCRF của người [41].
Ngoài ra, cây Thất diệp nhất chi hoa còn có tác dụng trong điều trị các rối
loạn về da liễu [9], hoạt động co cơ tử cung trên chuột thí nghiệm [36], hoạt
động diệt tinh trùng có hiệu quả ở chuột, thỏ và người. Vì vậy, có thể sử dụng
làm thuốc tránh thai [9]. Wang (2005) cho rằng Paris polyphylla var yunanensis
ở dạng thô có thời gian làm đông máu nhanh hơn so với Paris polyphylla
chinensis và chứng tỏ thành phần saponin 6 (một nhóm pennogennin) trong
những loài này là thành phần chính trong thuốc dùng để cầm máu [50].
1.1.4. Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa
Hiệu quả làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực hiện với
nhiều bài thuốc quý được sử dụng trong dân gian để chữa rắn cắn, ho hen... Sau
đây xin giới thiệu một số bài thuốc hay bằng cách sử dụng cây Thất diệp nhất
chi hoa để điều trị như:
* Chữa rắn độc cắn: Dùng 6g bột cây Thất diệp nhất chi hoa sắc uống 1
lần và uống 2 đến 3 lần trong một ngày. Hoặc có thể sắc 20g cây Thất diệp nhất
chi hoa lấy nước uống trong ngày. Nếu dùng thân rễ tươi thì giã nát, sau đó trộn
với rượu trắng đắp vào chỗ bị rắn cắn, cách chữa này không kể liều lượng [59].
* Chữa sốt cao co giật, quai bị, sởi: Trộn 4g bột khô của cây Thất diệp
nhất chi hoa với 12g bạc hà và 8g thiên hoa phấn sắc lấy nước uống. Chia làm 3
lần uống trong ngày sẽ chữa được sốt cai, co giật, quai bị, sởi.
* Chữa trẻ nhỏ kinh sài, chân tay co giật: Dùng bột Thất diệp nhất chi
hoa để uống, uống 4-5 lần/ ngày, mỗi lần 0,5 - 1g [59].
* Chữa lòi dom: Mài củ cây Thất diệp nhất chi hoa trộn với dấm rồi bôi

trực tiếp nước thuốc vào hậu môn, sau đó dùng gạc băng lại. Ngày làm 2 - 3 lần
sẽ khỏi bệnh lòi dom [59].

7


* Chữa ho, hen suyễn lâu ngày: Sắc 15g Thất diệp nhất chi hoa lấy
nước uống; hoặc hầm với thịt gà hay phổi lợn để ăn [59].
* Chữa các loại mụn độc sƣng thũng: Thất diệp nhất chi hoa trộn với
dấm, giã nát, đắp lên chỗ sưng đau. Làm đến khi khỏi bệnh [59].
1.2. Một số phƣơng pháp định danh thực vật
Việt Nam là đất nước có hệ sinh thái đa dạng, ở đó số loài thực vật cũng
vô cùng phong phú. Để mô tả, xếp loại hay định tên cho thực vật người ta phải
dùng nhiều phương pháp phân loại khác nhau. Có 2 nhóm phương pháp chủ yếu
đó là phương pháp truyền thống và phương pháp phân loại phân tử. Các phương
pháp truyền thống cần phải kể đến như: hình thái so sánh, giải phẫu so sánh, cổ
thực vật học, hóa sinh học...
Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, người nghiên cứu sẽ dựa vào đặc
điểm hình thái, nhất là hình thái cơ quan sinh sản. Những thực vật càng gần
nhau thì càng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau. Hiện nay, ngoài những
đặc điểm hình thái bên ngoài, người ta còn dùng cả những đặc điểm vi hình thái
(micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc của tế bào, của mô, kể cả cấu trúc
siêu hiển vi, để phân loại [61].
Với phương pháp giải phẫu so sánh, đây là phương pháp chính xác và
khách quan cho phép xác lập mối quan hệ thân cận không những của các nhóm
lớn (như lớp, bộ, họ) mà còn cả các nhóm nhỏ (giống, loài...) và quan hệ chủng
loại. Ví dụ: cây 2 lá mầm phân biệt với cây 1 lá mầm bởi cấu tạo và sự sắp xếp
của mô dẫn truyền trong thân. Phương pháp này bổ sung thêm cho phương pháp
hình thái so sánh [61].
Phân loại theo phương pháp cổ thực vật học, người nghiên cứu dựa vào

các mẫu hóa đá của thực vật để tìm quan hệ thân thuộc, tìm nguồn gốc của các
nhóm thực vật [57].
Những nghiên cứu về bào tử và phấn hoa, đặc biệt di tích của phấn
hoa trong các thời đại địa chất đã giúp xác định thành công quan hệ họ
8


hàng của một số thực vật và góp phần vào việc xây dựng hệ thống chủng
loại phát sinh [61].
Theo phương pháp hóa sinh học, các loài gần nhau thường chứa những
hợp chất hoá học giống nhau. Ví dụ, các loài thuốc lá chứa nicotin, các loài họ
Hoa môi chứa tinh dầu... Phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, nó cho
ta hướng tìm những hợp chất cần thiết trong các loài gần gũi nhau [61].
Phương pháp phát triển cá thể, dựa trên cơ sở của qui luật phát triển cá
thể: Trong quá trình phát triển, mỗi cá thể đều lặp lại những giai đoạn (những
hình thức) chủ yếu mà tổ tiên nó đã trải qua. Theo dõi quá trình phát triển lịch
sử của cây để xét đoán quan hệ nguồn gốc của nó [61].
Ngày nay, khoa học hiện đại ngày càng phát triển, các phương tiện
nghiên cứu về định loại sinh vật khá nhanh chóng và chính xác nhờ phương
pháp phân loại học phân tử. Theo đó, phân loại học phân tử là phương pháp
phân loại sinh vật ở mức độ phân tử thông qua các dẫn liệu so sánh hóa sinh của
các phân tử lớn như DNA, RNA, protein [56].
Hiện nay, phân loại sinh học phân tử đã và đang trở thành khoa học mũi
nhọn trong phân loại học, bổ sung cho phân loại học truyền thống những
phương pháp nghiên cứu mới và đặc biệt phân loại hoàn toàn khác với những
phân loại đã dùng trước đây. Một số phương pháp thường dùng hiện nay như:
so sánh hàm lượng và thành phần protein, so sánh trình tự gen lục lạp, trình tự
rRNA... [56].
Đa số hệ gen lục lạp thường tồn tại ở dạng vòng kép, lớn. Hệ gen lục lạp
chỉ chứa khoảng 100 gen, đặc biệt với thực vật ở cạn các gen gần như là giống

nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosom, 30 - 31 tRNA, 21 loại protein
ribosom và 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase [49].
Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ chứa những đoạn trình tự bảo thủ, khó
bị đột biến, và gần như không biến đổi trong quá trình tiến hóa. Do vậy,
nhiều nhà khoa học đã sử dụng các đoạn gen này ở các loại thực vật khác
nhau để làm chỉ thị định danh thực vật. Các vùng gen trong hệ gen lục lạp
9


được sử dụng trong công nghệ mã vạch DNA hiện nay như atpF-atpH,
gen matK, gen rbcL, gen rpoC1, vùng xen psbK-psbI, vùng xen trnH-psbA
và vùng gen nhân ITSAB [49].
rpoC1 là một gen mã hóa cho tiểu phần của
Gen rpoC1 rất bảo thủ mức độ đột biến trong trình tự nucleotit của gen có
thể phân biệt được loài này với loài kia, hay xác định được quan hệ họ hàng với
các loại nghiên cứu. Theo Kwon - Lee KH và cs (2010) cho rằng gen rpoC1 có
thể là một marker quan trọng để phân biệt nhân sâm trồng và nhân sâm hoang
dại [39]. Phân tích trình tự gen rpoC1 cho phép xác định sự khác biệt giữa các
chủng C. Raciborskii [37]. Trên GenBank hiện nay đã có 10 trình tự gen rpoC1
của lúa [56].
Ở cây Thất diệp nhất chi hoa các công trình nghiên cứu về gen rpoC1
công bố còn khá hạn chế. Theo Do và cs (2014) phân lập gen rpoC1 từ DNA
của chi Paris polyphylla thu được gen có kích thước 2784bp trong đó gồm 2
exon và 1 intron [30]. Theo Zhu và cs phân lập gen rpoC1 của chi Paris công
bố trên ngân hàng gen Bank có mã số GU178917 đến GU178922. Đều thu được
gen có kích thước giống nhau dài 487bp trong đó chứa 1 intron từ DNA nhằm
xác định loài của 10 loại paris đã lấy mẫu nghiên cứu [64].
Theo tổ chức Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (The Barcode of
Life Data - viết tắt là BOLD) để tăng hiệu quả giám định loài cần kết hợp kết
quả của nhiều vùng gen trong đó có gen rpoC1. Ví dụ, như tổ hợp gen rpoC1

kết hợp với gen rpoB và gen matK hay sự kết hợp của rpoC1 với gen matK
và gen trnH-psbA; một tổ hợp khác là sự kết hợp của 5 gen bao gồm rbcL,
trnH, atpF-H, psbK-I, và gen matK cũng đã được thực hiện [62].
1.3. Một số phƣơng phƣơng pháp lƣu trữ và bảo tồn giống cây trồng
Nằm ở vùng Đông Nam châu Á với diện tích khoảng 330.541 km2, Việt
Nam là một trong 16 nước có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới. nguồn tài
nguyên đa dạng sinh học trong các ngành Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy sản
10


hàng năm cung cấp cho đất nước khoảng 2 tỷ đô la [9]. Nguồn tài nguyên
thiên nhiên quý giá về sinh giới này, có thể đáp ứng những nhu cầu hiện tại và
tương lai của chúng ta trong quá trình phát triển về kinh tế, y tế... Tuy nhiên
thay vì bảo tồn nguồn tài nguyên này, thì trong thực tế hoạt động khai thác quá
mức và bừa bãi nguồn tài nguyên quý giá này. Nhiều loài hiện đã trở nên
hiếm, một số loài đang có nguy cơ bị diệt vong. Hiện nay, nguồn tài nguyên
này đang suy thoái nhanh chóng [12]. Nhiều báo cáo đã ghi nhận sự biến mất
của các loài thực vật bị đe dọa ở Việt Nam trong đó có những loài cây thuốc
quý có tên trong sách đỏ do tình trạng khai thác không có kế hoạch. Khi các
loài thực vật biến mất khỏi tự nhiên, đó là sự ra đi vĩnh viễn và nguồn gen
không thể tái tạo được [6].
Theo số liệu điều tra của Viện Dược liệu năm 2000, Việt Nam có tới
3.800 cây thuốc thuộc khoảng 270 họ thực vật. Các loài cây thuốc phân bổ khắp
các vùng sinh thái ở Việt Nam. Trong số đó, phần lớn các cây thuốc là mọc tự
nhiên và khoảng 20% đã được gieo trồng. Từ năm 1988, công tác bảo tồn nguồn
gen cây thuốc đã được triển khai. Tuy vậy, trong số 848 loài cây thuốc được xác
định cần bảo tồn mới chỉ có 120 loài, dưới loài được bảo tồn trong các vùng và
các cơ sở nghiên cứu
Để ngăn ngừa sự suy thoái đa dạng sinh học, Việt Nam đã tiến hành công
tác bảo tồn đa dạng sinh học khá sớm. Hai hình thức bảo tồn đa dạng sinh học

phổ biến được áp dụng ở Việt Nam là: Bảo tồn nội vi hay nguyên vị (Insitu
conservation) và bảo tồn ngoại vi hay chuyển vị (Exsitu conservation).
1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ)
Bảo tồn nội vi bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích bảo
vệ các loài, các chủng và các sinh cảnh, các hệ sinh thái trong điều kiện tự
nhiên. Tuỳ theo đối tượng bảo tồn để áp dụng các hình thức quản lý thích hợp.
Thông thường bảo tồn nguyên vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu
bảo tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp.
11


Bảo tồn tại chỗ hay bảo tồn nội vi (Insitu conservation) là hình thức bảo
tồn nguồn gen tại vùng chúng được trồng, được tồn tại trong điều kiện sinh thái
tự nhiên, có thể bảo tồn trong trang trại, bảo tồn trong vườn gia đình hoặc xây
dựng các vườn quốc gia [12].
Bảo tồn nội vi là hình thức chủ yếu ở Việt Nam, phương pháp này thể
hiện rõ rệt nhất là đã xây dựng và đưa vào hoạt động hệ thống một hệ thống
rừng đặc dụng. Theo số liệu thống kê đến 10/2006 – Cục kiểm lâm và viện điều
tra quy hoạch rừng có 128 khu bảo tồn rừng. Trong đó, có 30 Vườn quốc gia
(VQG), 48 Khu dữ trữ thiên nhiên, 12 khu bảo tồn loài và sinh cảnh, 38 khu bảo
vệ cảnh quan, với tổng diện tích 2.400.092 ha, chiếm gần 7,24% diện tích tự
nhiên trên đất liền của cả nước. Như Khu bảo tồn vườn quốc gia Cúc Phương là
khu bảo tồn được thành lập đầu tiên ở miền bắc, vườn quốc gia Ba Bể (Bắc
Cạn), vườn quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai)... Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền
vẫn bị đe dọa [12]
1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ)
Bảo tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển chỗ (ex-situ consertion) là một trong
những biện pháp quan trọng và có hiệu quả trong bảo tồn và phát triển đa dạng
sinh học.
Bảo tồn ngoại vi bao gồm các vườn thực vật, vườn động vật, các bể nuôi

thuỷ hải sản, các bộ sưu tập vi sinh vật, các bảo tàng, các ngân hàng hạt giống,
bộ sưu tập các chất mầm, mô cấy... Các biện pháp gồm di dời các loài cây, con
và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống thiên nhiên của chúng. Mục đích của
việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân nuôi vô tính hay cứu hộ trong
trường hợp: Nơi sinh sống bị suy thoái hay huỷ hoại không thể lưu giữ lâu hơn
các loài nói trên, Dùng để làm vật liệu cho nghiên cứu, thực nghiệm và phát
triển sản phẩm mới, để nâng cao kiến thức cho cộng đồng.
Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro là một trong các phương
pháp bảo quản nguồn gen có vai trò quan trọng và là một bước tiến bộ vượt bậc

12


của khoa học kỹ thuật trong công tác nhân giống cây trồng. Bảo quản in vitro
chỉ thực hiện trong không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ được khối lượng lớn cá
thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp hiệu quả đối với cây
trồng nhân giống vô tính [12].
1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ lâu đã thành công trên
nhiều đối tượng cây trồng, đặc biệt kỹ thuật này có nhiều đặc tính ưu việt mà
các loại hình khác không có được như: Có khả năng bảo quản giống đơn giản,
cây có tỷ lệ phục tráng cao, tạo ra số lượng đồng đều không hạn chế, tiết kiệm
chi phí và nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết
về tính toàn năng của tế bào. Theo Haberland.G, nhà thực vật học người Đức,
tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể,
khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đó đều có khả năng tái sinh và phát triển
thành cá thể hoàn chỉnh [35].
Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn

chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên
quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và
tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [1]. Morel là người
đầu tiên đã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống lan quý
Cymbidium bằng phương pháp này [47]. Trong một thời gian ngắn người ta có
thể thu được hàng triệu cá thể. Nhờ vậy, mà hoa Cymbidium vốn đắt tiền đã có
giá thành hạ hơn và đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của nhiều người. Ở Thái
Lan, 90% hoa lan thương mại được nhân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
Thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở
đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác như cây ăn quả,
cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh... Ở nhiều nước trên thế

13


giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, đặc biệt ở Hà Lan đã sử dụng phương
pháp này để nhân giống cúc cho hệ số nhân giống cao từ 410-1010/năm [8]. Các
lĩnh vực ứng dụng khác trong kỹ thuật in vitro cũng mang lại nhiều kết quả
trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là
kết quả của các quá trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các
cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi
sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các
chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào. Còn quá trình phản phân
hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô
chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp,
chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia [1].
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thành công cần đảm bảo 3 yếu tố chính:
Thứ nhất, bảo đảm điều kiện vô trùng. Môi trường để nuôi cấy mô và tế
bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng... rất thích hợp cho các loại

nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất
nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài
bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi
trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Nên thí
nghiệm phải bỏ đi và trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết
dần. Chính vì vậy, vô trùng tuyệt đối là điều kiện cần thiết đầu tiên để thành công
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật [5].
Thứ hai, chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. Trong
hàng trăm loại môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây và nhiều
mục đích nuôi cấy khác nhau, về cơ bản có thể chia làm 3 loại, môi trường nghèo
dinh dưỡng điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C; Môi trường có
hàm lượng dinh dưỡng trung bình điển hình như môi trường B5 của Gamborg và
môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MS (Murashige – Skoog). Mỗi loại
cây khác nhau, thích nghi với từng môi trường khác nhau. Với những đối tượng
14


cây trồng mới chưa có tài liệu trước đó, cần thăm dò môi trường phù hợp trên
từng đối tượng loại cây trồng. Hiện nay môi trường MS được coi là môi trường
thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về mặt dinh dưỡng [5].
Thứ 3, chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. Các
mô có thể sử dụng làm mô cấy như là thịt quả non, chồi nách, cuống hoa, đế hoa,
mô phân sinh..., khi đặt vào môi trường nuôi cấy có chứa một chất sinh trưởng
thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa. Sau khi cấy, mô cấy cần đặt
trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định, tùy vào các mục đích nghiên cứu
mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau. Chẳng hạn, quá trình tạo mô sẹo có thể
cần bóng tối hay ánh sáng, nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất
thiết phải có ánh sáng [5].
Vì vậy, cần thực hiện đúng các thao tác kỹ thuật và lựa chọn môi trường
nuôi cấy phù hợp nhằm đạt kết quả cao trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.

1.3.3.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống
vô tính Đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh
học khi gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính
in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Trên thực tế, có nhiều loài thực vật nhân
giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô
tính in vitro là do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ
số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi
nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về
hình thái và thành phần hoá học [8]. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn
trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp vì các cây có chất
lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối
với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như Ô dầu,
Bạch truật có hạt nảy mầm chậm, hay với đan sâm hạt chín không đều và thời
gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà. Một số cây gỗ
khác có thời gian sinh trưởng kéo dài như Sơn thù và Đỗ trọng khi di thực về
15


trồng ở SaPa phải mất mười năm cây mới ra hoa, bộ phận làm thuốc của cây
sơn thù là quả nhưng khi cây còn trẻ chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả. Các
cây Tam thất, Nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu
hoạch đến đâu cần gieo ngay đến đó gây nhiều khó khăn cho sản xuất…[2]. Mặt
khác, phương pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều
nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức
tạp, hệ số nhân thấp, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống
rất lãng phí, tốn kém.
Việc không đồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính)
trong nhân giống truyền thống sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn
định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh

dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng
các thành phần hoạt chất, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng
tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5% đến 11,3%, hàm lượng lynalylacetat từ
11% đến 78%; cây Bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm
lượng và thành phần tinh dầu [48].
Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính
được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn lao,
nhân giống vô tính tạo ra các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì
được các tính trạng của cây mẹ nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản
phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến khi thu
hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời
gian nảy mầm của hạt kéo dài…[3]. Chính vì vậy, phương pháp nhân giống
in vitro ngày càng được khai thác và sử dụng một cách triệt để. Có rất nhiều
loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng được nhân nhanh bằng
phương pháp này. Ví dụ: Từ một cây D.floribunda bằng phương pháp nhân
giống thông thường chỉ tạo ra 8 - 10 cây con trong vòng một năm, nhưng
cùng thời gian một năm với phương pháp nhân giống in vitro bằng cách sử
dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng vạn cây D.floribunda, hay tạo ra
16


26 vạn cây Cam thảo trong năm tháng [29].
Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự (1993) đã đạt được hệ số nhân
532 trong vòng 1 năm đối với khoai tây [16]. Hệ số nhân giống của cây Hà
thủ ô đỏ là 105/ năm. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất 10 - 15 năm mới
cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt. Ứng dụng nhân nhanh in vitro cho
đối tựơng này, người ta có thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt
nhau trong vòng một năm [48]. Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết (1994)
dự tính hàng năm có thể thu được 76 cây giống khi nuôi cấy chồi của cây
cẩm chướng [10].

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất
lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta
đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949)
đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần
đỉnh sinh trưởng. Riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus. Nguyên nhân
của hiện tượng này là đỉnh sinh trưởng không có hệ thống mô dẫn làm cho virus
và vi sinh vật không có khả năng xâm nhập. Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng
hợp của auxin và auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus. Qúa trình phân
chia tế bào đỉnh sinh trưởng không kéo theo sự phân chia của virus [43].
Nuôi cấy mô tế bào chủ yếu được dùng để phục tráng và nhân nhanh theo
các hướng vi nhân giống, sản xuất hạt giống nhân tạo và làm sạch bệnh. Qua
nuôi cấy in vitro, tế bào được trẻ hoá thông qua quá trình phản phân hoá để trở
về trạng thái phôi sinh. Từ đó cho ra đời những cây con có tuổi sinh lý trẻ hơn,
làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn đến tăng năng suất và chất lượng sản
phẩm [12]. Những kỹ thuật này, ở nước ngoài đã được áp dụng trên phần lớn
cây trồng. Đối với cây thuốc, giống địa hoàng, ở Trung Quốc, Hàn Quốc, bạch
truật ở Nhật Bản…. cũng đã thành công theo phương pháp này.
Sở dĩ nuôi cấy in vitro có thể chủ động trong sản xuất do có những điểm
khác biệt so với các phương pháp nhân giống truyền thống đó là, nhân giống in

17