Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRẦN THỊ LUYẾN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HĨA TRÊN
CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE TÍCH HỢP HỆ VI LƯU

Chun ngành: Kỹ thuật Hóa học
Mã số: 62520301

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà Nội – 2017


Cơng trình được hồn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học:
Hướng dẫn 1: PGS.TS. Mai Anh Tuấn
Hướng dẫn 2: PGS. TS. Huỳnh Đăng Chính

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ……

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
Hiện nay, các phương pháp phân tích sinh học phân tử truyề n thố ng (PCR,
ELISA…) đang được sử dụng phổ biến, cho kết quả tốt và độ chính xác cao, tuy
nhiên bên cạnh những ưu điểm cũng thể hiện những nhược điểm. Các phương pháp
trên đều phức tạp, yêu cầu kỹ thuật viên có tay nghề cao, yêu cầu phịng thí nghiệm
hiện đại tại những trung tâm nghiên cứu, phân tích trung ương hoặc các thành phố
lớn, trong quá trình thực hiện cần phải sử dụng các sinh phẩm và hóa chất đặc hiệu.
Các phương pháp trên đều cần hàng giờ đến hàng ngày để thực hiện và đặc biệt, các
thiết bị phân tích, chẩn đốn khơng thể dịch chuyển ra khỏi nơi lắp đặt ban đầu. Đây
cũng là một trong những điểm tồn tại cần được giải quyết khi thực hiện các chiến
dịch phân tích lưu động. Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển những kỹ thuật phân
tích có khả năng bổ sung, thậm chí thay thế một phần những kỹ thuật phân tích truyền
thống là thực sự cần thiết. Cảm biến sinh học là một trong những thiết bị được kỳ
vọng có khả năng thay thế một phần các kỹ thuật phân tích truyền thống nhờ khả
năng ứng dụng rộng rãi trong phát hiện virus gây bệnh, chẩn đốn lâm sàng, giám sát
mơi trường, phân tích độc học trong thực phẩm….
Vì lí do trên, chúng tôi quyết định thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển
cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu”.
Mục tiêu của luận án:
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu chế tạo và tích hợp cảm biến sinh học điện hóa
và vi bình phản ứng ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, bao gồm: 01)
biến tính bề mặt cảm biến sử dụng vật liệu có cấu trúc nano nhằm nâng cao hiệu quả
cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến; 02) tích hợp hệ điện cực
với vi bình phản ứng nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ và
03) phát triển và tùy biến qui trình đo lường điện hóa sử dụng cảm biến sinh học

khơng đánh dấu nhằm phát hiện các thành phần sinh học.
Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu của luận án là nghiên cứu thực nghiệm. Cách tiếp cận
trong quá trình nghiên cứu là từ các kết quả thực nghiệm, kết hợp với lý thuyết và các
tài liệu tham khảo, giải thích, so sánh, đánh giá và tối ưu qui trình thực nghiệm.
Nội dung của luận án:
Để giải quyết được mục tiêu của đề tài, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung:
Nội dung nghiên cứu 1: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở
dây nano polypyrrole. Trong nội dung nghiên cứu 1, mục tiêu của NCS là làm quen
với các kỹ thuật điện hóa được thực hiện trong một hệ đo mở, các phép đo điện hóa
khơng sử dụng các điện cực thương mại mà trên cơ sở các điện cực tự thiết kế và phát
triển, vật liệu thể mềm cấu trúc dây nano được chế tạo giữ vai trò làm lớp vật liệu
trung gian giữa bề mặt cảm biến và bộ chuyển đổi, giúp nâng cao hiệu quả cố định
thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA được lựa chọn làm đối
tượng đo vì DNA có độ bền, độ ổn định cao và dễ đặt mua. Nội dung nghiên cứu 1
bao gồm: nghiên cứu tổng hợp dây nano polypyrrole trên điện cực Pt sử dụng kỹ
thuật điện hóa nhằm biến tính bề mặt cảm biến; nghiên cứu cố định DNA dò lên bề
mặt cảm biến trên cơ sở dây nano polypyrrole; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa
DNA dị – DNA đích của cảm biến DNA điện hóa đã chế tạo.
1


Nội dung nghiên cứu 2: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ
vi lưu. Phát triển từ các kết quả đã đạt được trong nội dung nghiên cứu 1 với các phép
đo điện hóa được thực hiện trong hệ đo mở, đối với nội dung nghiên cứu 2, luận án
tập trung nghiên cứu các tính chất điện hóa diễn ra khi thu nhỏ bình điện hóa. Việc
thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng mẫu tiêu thụ có ý nghĩa rất quan trọng trong phân
tích y sinh vì các mẫu phân tích có thể là mẫu máu, vi khuẩn, virus… Nội dung
nghiên cứu 2 bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo và gắn kết hệ ba điện cực tích hợp
Pt và vi kênh PDMS; nghiên cứu tổng hợp điện hóa dây nano polypyrrole bên trong

vi bình phản ứng nhằm cố định DNA trong chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp
với hệ vi lưu; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dị – DNA đích của cảm
biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu đã chế tạo với các phép đo điện hóa được thực
hiện trong hệ đóng.
Nội dung nghiên cứu 3: Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp
bình phản ứng mini ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle. Sau khi hoàn thành
nội dung nghiên cứu 2 với các qui trình đo lường điện hóa được thực hiện trong một
bình điện hóa thu nhỏ, trong nội dung nghiên cứu 3 luận án sẽ tiến gần thêm một
bước đến ứng dụng thực tiễn. Các kết quả đạt được của luận án sẽ không chỉ dừng lại
ở các bài báo khoa học mà cịn có khả năng hướng đến sự hợp tác với các công ty,
các nhà sản xuất. Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử dụng DNA làm phần tử dị
cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, địi hỏi chi phí cao và thời gian dài,
luận án sẽ sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng
gà – một sản phẩm đã được bán trên thị trường do công ty cổ phần công nghệ sinh
học thú y BTV (Biotech-Vet) cung cấp, tương lai hướng đến việc đánh giá chất lượng
kháng thể theo đơn đặt hàng từ phía cơng ty. Nội dung nghiên cứu 3 bao gồm: nghiên
cứu thiết kế, chế tạo và ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế
Ag/AgCl và một bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể kháng
virus Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến sinh học;
nghiên cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã
chế tạo trong phát hiện virus Newcastle.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
Nhận thấy các phương pháp phân tích truyền thống đang được áp dụng rộng rãi,
có phổ kết quả rộng, độ chính xác cao nhưng đồng thời cũng có nhiều bất cập khi
triển khai sử dụng như đòi hỏi đội ngũ kỹ thuật viên có tay nghề cao, thiết bị và sinh
phẩm, hóa chất đắt tiền, chỉ tập trung ở các cơ sở phân tích tại các thành phố lớn,
trung ương..., luận án hướng tới việc phát triển một kỹ thuật phân tích mới trong đó
tập trung vào việc làm tăng độ nhạy, độ chọn lọc, làm giảm lượng mẫu phân tích, thời
gian phân tích.
Luận án tập trung vào phát triển cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thông tin di

truyền (DNA) và kháng thể của vật chủ, sử dụng kỹ thuật đo lường điện hóa. Để phát
triển cảm biến sinh học điện hóa, trước tiên, luận án đã tập trung nghiên cứu thiết kế
và chế tạo các điện cực khác với điện cực truyền thống. Bề mặt điện cực sau đó được
biến tính trên cơ sở lớp vật liệu trung gian với cấu trúc nano. Trên bề mặt phân cách
giữa dung dịch chứa mẫu phân tích và màng sinh học có cấu trúc nano, các tính chất
hóa lý diễn ra có phần khác so với những tính chất đó ở các điện cực truyền thống.
2


Các kỹ thuật quét thế vòng, thế tĩnh, tổng trở và kỹ thuật đo vi sai đã được triển khai
để nghiên cứu các tính chất điện hóa tại đây. Đối với việc phát triển cảm biến sinh
học điện hóa ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, vấn đề giảm thể tích
mẫu phân tích, thu nhỏ hệ thống phân tích có ý nghĩa quan trọng. Luận án đã tập
trung nghiên cứu các kỹ thuật đo lường điện hóa trong một vi bình phản ứng có thể
tích rất nhỏ thay vì thực hiện các phép đo trong hệ mở.
Những đóng góp mới của luận án:
Một trong những đóng góp mới của luận án là đã tổng hợp được vật liệu polime
dẫn polypyrrole (PPy) với cấu trúc dây nano nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm
biến, nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học. Dây nano PPy được
tổng hợp trực tiếp trên điện cực làm việc (WE), sử dụng kỹ thuật polime hóa điện
hóa, khắc phục được tình trạng vật liệu PPy được tạo thành dưới dạng đảo, có cấu
trúc hoa súp lơ. Đặc biệt, việc tổng hợp thành cơng vật liệu PPy có cấu trúc nano tại
chính xác một vị trí mong muốn bên trong vi bình phản ứng (thể tích 4 µl) là một
thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm
được. Hiện nay, số lượng cơng trình cơng bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp cấu
trúc nano bên trong hệ tích hợp vẫn cịn rất hạn chế.
Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực
tiếp từ trứng gà làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch cũng là một trong những
đóng góp mới của luận án.
Luận án cũng đã góp phần quan trọng trong việc thiết kế, chế tạo và gắn kết bình

phản ứng kích thước nhỏ tích hợp hệ điện cực có khả năng ghép nối với mạch đo,
trên cơ sở đó làm giảm lượng mẫu phân tích, làm tăng tỷ lệ tín hiệu/nhiễu khi đo
lường. Hiện tại, đây là vấn đề nghiên cứu cịn mới tại Việt Nam.
Thêm một đóng góp mới của luận án, đó là việc phát triển và tùy biến các qui trình
đo lường điện hóa được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ sử dụng cảm biến
sinh học không đánh dấu nhằm phát hiện các phần tử sinh học: DNA và virus
Newcastle.
Ngoài ra, việc làm chủ cơng nghệ chế tạo cảm biến điện hóa ba điện cực theo
phương pháp planar với chất lượng tương đương sản phẩm thương mại hiện nay cũng
là một trong những đóng góp thuyết phục của luận án.
Bố cục của luận án:
Luận án được trình bày trong 103 trang (khơng kể phần mục lục và danh mục các
tài liệu tham khảo). Cấu trúc của luận án gồm:
Mở đầu
1. Tổng quan
2. Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole
3. Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu
4. Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini
ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle
Kết luận
Các kết quả chính của luận án đã được cơng bố trong 09 cơng trình khoa học,
trong đó có 02 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành quốc tế ISI, 04 bài báo
3


được đăng trên tạp chí chuyên ngành trong nước và 03 báo cáo tại các hội nghị trong
nước và quốc tế.

1. TỔNG QUAN
1.1. Cảm biến sinh học điện hóa

1.1.2.2 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa
Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một
thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thơng tin phân tích định lượng hoặc bán định
lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực
tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer). Chất được gắn trên bộ phận
chuyển đổi được gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích
trong mẫu được gọi là “phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là
dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên- kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai
hóa DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym- cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các
phản ứng đặc hiệu này,
phần tử nhận biết sinh
học giữ vai trị dị tìm đối
tượng đích trong mẫu
phân tích và phần tử
chuyển đổi giữ vai trò
chuyển đổi tương tác sinh
học thành tín hiệu điện
hóa, quang, nhiệt… sau
đó đưa qua bộ phận xử lý
tín hiệu và hiển thị kết
quả đo, hình 1.3.
Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học

Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang,
chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi
cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có
nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng y sinh. Nguyên lý hoạt động
của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa
phần tử nhận biết sinh học và phần tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu

được nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa.
1.1.2.4 Tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa
Đối với việc tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa, các vấn đề được đặt ra
có thể là:
Việc lựa chọn, thiết kế và chế tạo điện cực cho cảm biến sinh học điện hóa có ý
nghĩa quyết định tới độ nhạy, chi phí của phép phân tích và khả năng tương thích với
các quy trình cố định. Các điện cực được sử dụng cho phát triển cảm biến sinh học
điện hóa thường là các kim loại quý như Pt, vàng và một vài dạng của cacbon bao
gồm sợi cacbon, graphit epoxi, graphene hoặc cacbon thủy tinh…Việc lựa chọn, thiết
kế và chế tạo điện cực phụ thuộc vào năng lực của đội ngũ nghiên cứu và điều kiện
cơ sở vật chất kỹ thuật của phòng sạch.
4


Vấn đề thứ hai được quan tâm nghiên cứu là nhằm mục đích tối ưu hóa quy trình
cố định phần tử cảm nhận sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trên bề
mặt của cảm biến. Để nâng cao hiệu quả cố định phần tử cảm nhận sinh học, bề mặt
cảm biến cần được biến tính nhằm tạo ra những nhóm chức có khả năng hình thành
các liên kết cộng hóa trị, liên kết hyđrô, hoặc các liên kết yếu Van der Waals... Có
nhiều phương pháp để biến tính bề mặt cảm biến, một trong những phương pháp đó
là sử dụng vật liệu polime dẫn. Trong các vật liệu polime dẫn, PPy thường được lựa
chọn làm lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và bộ chuyển đổi vì polime
dẫn PPy đáp ứng được những yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với bề mặt bộ chuyển đổi;
2) có độ tương thích sinh học cao, khơng làm thay đổi cấu trúc và biến tính các phần
tử cảm nhận sinh học; và 3) có khả năng truyền tải thơng tin tốt từ tương tác sinh học
xuống bộ chuyển đổi.
Vấn đề thứ ba cũng đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên
thế giới là nghiên cứu thiết kế, chế tạo và tích hợp hệ vi lưu, vi bình phản ứng với
cảm biến sinh học điện hóa nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu
thụ, đồng thời nâng cao tỉ lệ tín hiệu/nhiễu của phép đo. Sự kết hợp giữa cảm biến

sinh học điện hóa và hệ vi lưu được coi là một bước đệm để tiến tới chế tạo các bộ vi
phân tích điện hóa cầm tay, giữ vai trị quan trọng trong việc thực hiện các nhiệm vụ
phân tích lưu động. Tuy nhiên, hiện tại, vấn đề này còn tương đối mới tại Việt Nam.
Vấn đề thứ tư được tập trung hướng đến là nghiên cứu xây dựng qui trình đo
lường điện hóa nhằm phát hiện các thành phần sinh học (phần tử đích) trong mẫu
phân tích, trên cơ sở đó phát triển các thiết bị điện hóa phù hợp phục vụ cho việc đo
lường, phân tích điện hóa sử dụng cảm biến sinh học.
Để giải quyết được những vấn đề nêu trên, địi hỏi yếu tố liên ngành ở các nhóm
nghiên cứu: hóa học, vật lý, điện tử, sinh học, khoa học vật liệu... Trên thế giới,
những nhóm nghiên cứu liên ngành đang là xu hướng được ưu tiên trong nghiên cứu,
phát triển và chế tạo hệ đo điện hóa sử dụng cảm biến miễn dịch hoặc cảm biến
DNA.
1.2. Biến tính bề mặt cảm biến sinh học điện hóa sử dụng dây nano polypyrrole
Cảm biến DNA điện hóa hoạt động dựa trên kết quả khảo sát những thay đổi về đặc
tính điện hóa khi xuất hiện sự lai hóa đặc hiệu giữa các chuỗi DNA dị và DNA đích.
Khi nồng độ chuỗi DNA rất nhỏ, tương tác giữa hai chuỗi DNA chỉ làm thay đổi một
phần rất nhỏ tín hiệu điện hóa trên bề mặt của màng sinh học (nơi gắn kết DNA dị),
vì vậy hiệu quả truyền tải thơng tin điện hóa từ bề mặt cảm biến đến bộ chuyển đổi
quyết định độ nhạy của cảm biến DNA. Trong đó, kỹ thuật cố định DNA dò lên trên
bề mặt cảm biến là một yếu tố quan trọng góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu.
Hiện tại chưa có kỹ thuật ổn định để cố định trực tiếp chuỗi DNA dò lên trên bề mặt
của điện cực kim loại. Nói cách khác, người ta thường phải biến tính bề mặt điện cực
bằng cách sử dụng một lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và chuỗi DNA.
Lớp vật liệu trung gian này cần đáp ứng những yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với cả bề
mặt bộ chuyển đổi và sợi DNA; 2) có độ tương thích sinh học, khơng làm thay đổi
cấu trúc và biến tính sợi DNA; và 3) làm tăng hiệu quả quá trình truyền tải thông tin
từ tương tác sinh học xuống bộ chuyển đổi. Vật liệu polime dẫn, như polypyrrole
(PPy), polythiophene và polyanilin thường được lựa chọn trong chế tạo cảm biến sinh
5

học điện hóa, với vai trị làm lớp vật liệu trung gian giữa cảm biến và bộ chuyển đổi
vì vật liệu polime dẫn này đáp ứng đủ ba yêu cầu kể trên, do đó góp phần làm tăng độ
nhạy, độ chính xác, độ ổn định của cảm biến sinh học. Trong các vật liệu polime dẫn,
PPy được nhận định là thích hợp ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa nhờ khả
năng tạo ra cấu trúc nano với diện tích bề mặt lớn, khả năng tạo liên kết tốt với đối
tượng sinh học, khả năng biến tính để điều khiển độ dẫn, do đó góp phần cải thiện tỷ
lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến sinh học. Đối với việc
phát hiện các phần tử sinh học tại môi trường pH tự nhiên của cơ thể động vật, PPy
có ưu điểm hơn so với polythiophene và polyaniline do vật liệu này được tổng hợp từ
monome tại mơi trường pH trung tính. Bên cạnh đó, PPy cũng thể hiện những đặc
tính như độ bền cao, dễ tổng hợp và độ dẫn tốt.
Khả năng ứng dụng vật liệu polime dẫn nói chung và PPy nói riêng trong chế tạo
cảm biến sinh học điện hóa với vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt bộ
chuyển đổi và thành phần cảm nhận sinh học đã được chứng minh qua nhiều cơng
trình cơng bố quốc tế. Tuy nhiên, cho đến thời điểm hiện tại, trong nhiều cơng trình
đã cơng bố, vật liệu polime dẫn PPy chủ yếu được tổng hợp với cấu trúc hoa súp lơ
(màng PPy). Số lượng các cơng trình cơng bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp và
ứng dụng vật liệu PPy cấu trúc dây nano trong chế tạo cảm biến sinh học điện hóa
vẫn cịn hạn chế. Trong luận án này, vật liệu polime dẫn PPy với cấu trúc dây nano sẽ
được tổng hợp tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) bằng kỹ thuật điện hóa sử
dụng gelatin làm “khuôn mềm” định hướng cho sự phát triển dây nano. So sánh với
vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu PPy cấu trúc dây nano với diện tích bề mặt
riêng lớn hơn sẽ giúp nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên
bề mặt cảm biến, góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn
định của cảm biến sinh học.
1.4. Tích hợp cảm biến sinh học điện hóa và bình phản ứng mini
Việc tích hợp cảm biến điện hóa và hệ vi lưu, vi bình phản ứng nhằm thu nhỏ hệ
thống phân tích, giảm thể tích mẫu tiêu thụ là xu hướng đang thu hút được sự quan
tâm của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Tuy nhiên, hiện tại, vấn đề này còn

tương đối mới tại Việt Nam. Bên cạnh đó, trong các cơng trình cơng bố quốc tế, cảm
biến điện hóa tích hợp hệ vi lưu đã được ứng dụng để định lượng thuốc, sự thay đổi
hình dạng tế bào, kim loại nặng, và glucose trong dung dịch. Tuy nhiên, hiện nay,
trên thế giới, số lượng cơng trình cơng bố liên quan đến việc tổng hợp các vật liệu cấu
trúc nano bên trong hệ tích hợp vẫn còn rất hạn chế. Trong luận án này, việc tích hợp
cảm biến sinh học điện hóa và hệ vi lưu, tiếp sau đó là qui trình tổng hợp vật liệu cấu
trúc nano bên trong vi bình phản ứng nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm biến sẽ
được tập trung hướng đến. Việc tích hợp cảm biến sinh học điện hóa với vi bình phản
ứng trong phát hiện các phần tử sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…)
được cho là không những sẽ giúp thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu
thụ mà cịn góp phần nâng cao tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu, cải thiện độ chính xác của hệ
thống.
1.5. Kỹ thuật điện hóa trong nhận biết các thành phần sinh học
Trong các kỹ thuật điện hóa ứng dụng trong nhận biết các phần tử sinh học (DNA,
kháng nguyên/kháng thể), mỗi kỹ thuật đều có những ưu điểm riêng. Ưu điểm của
6


phương pháp EIS (phương pháp phổ tổng trở điện hóa) là trong suốt quá trình đo chỉ
cần đưa một điện áp kích thích nhỏ vào hệ nên hoạt tính của các thành phần sinh học
không bị ảnh hưởng và hệ vẫn được giữ ở trạng thái cân bằng. Hơn nữa phương pháp
EIS có độ ổn định cao, cho phép phân tích khơng chỉ tồn bộ q trình mà cả các giai
đoạn riêng rẽ, diễn ra đồng thời hoặc song song trong hệ nghiên cứu. Ưu điểm của
phương pháp đo vi sai là có thể loa ̣i bỏ sự nhiễu của mơi trường, do đó cho kết quả
đo chính xác ngay cả khi tín hiệu đo nhỏ hoặc bị nhiễu bởi các nguồn nhiễu khác. Ưu
điểm của phương pháp CV (phương pháp quét thế vòng) là do phương pháp này được
sử dụng rộng rãi trong phân tích điện hóa nói chung nên các thiết bị điện hóa được sử
dụng cho phép đo CV là phổ biến. Hơn nữa, khi mục tiêu xa hơn được hướng đến là
nghiên cứu thiết kế, chế tạo bộ vi phân tích điện hóa ứng dụng trong y sinh (sự kết
hợp của đầu đo tích hợp, vi bình phản ứng và thiết bị điện hóa cầm tay) thì phương

pháp CV là một lựa chọn phù hợp, khả thi trong việc thiết kế, chế tạo mạch đo cho
thiết bị điện hóa cầm tay. Trên cơ sở đó, trong luận án này, cả ba kỹ thuật điện hóa
trên sẽ được lựa chọn tùy thuộc vào từng nội dung nghiên cứu cụ thể và điều kiện cơ
sở vật chất kỹ thuật trong từng giai đoạn nghiên cứu.

2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ
SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE
2.1. Mở đầu
Trong nội dung nghiên cứu này, luận án sẽ hướng đến việc nghiên cứu chế tạo
cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole. Các kỹ thuật điện hóa được
thực hiện trong một hệ đo mở sẽ được tập trung nghiên cứu, các phép đo điện hóa
khơng sử dụng các điện cực thương mại mà trên cơ sở các điện cực tự thiết kế và phát
triển, vật liệu thể mềm PPy cấu trúc dây nano sẽ được chế tạo nhằm biến tính bề mặt
cảm biến, giúp nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt
cảm biến, DNA được lựa chọn làm đối tượng đo vì DNA có độ bền, độ ổn định cao
và dễ đặt mua.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Hóa chất
Bảng 2.1 Trình tự chuỗi đơn DNA
Chuỗi đầu dị (probe):
Thiol-C6-5’-AGACCTCCAGTCTCCATGGTACGTC-3’
Chuỗi đích (target):
5’-GACGTACCATGGAGACTGGAGGTCT-3’
Chuỗi đích khơng kết cặp:
5’-ACGCTGAGTACGGGTGCAAGAGTCA-3’

2.2.2. Điện cực tích hợp
Hệ hai điện cực Pt tích hợp bao gồm
điện cực làm việc với diện tích 0,8 mm2 và
điện cực đối với diện tích 5 mm2, hình 2.1.

Hình 2.1: (A): quy trình chế tạo rút gọn;
(B): điện cực dùng làm cảm biến

2.2.3. Tổng hợp dây nano PPy sử dụng kỹ thuật điện hóa
Quá trình tổng hợp dây nano PPy được thực hiện trên hệ điện hóa AutoLab
PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan. Bình điện hóa sử dụng điện cực Pt tích hợp (bao
7


gồm điện cực làm việc và điện cực đối) và điện cực so sánh Ag/AgCl trong dung dịch
KCl bão hòa. Dây nano PPy được tổng hợp trong môi trường trung tính, pH = 7,4 với
vai trị của đệm muối phốt phát (PBS). Dung dịch điện li được pha chế gồm: monome
pyrrole, gelatin 0,08% về khối lượng, LiClO4 0,1 M và đệm PBS. Dây nano PPy
được tổng hợp trực tiếp lên điện cực Pt (WE) nhờ kỹ thuật điện hóa: áp điện thế
không đổi 0,75V lên điện cực làm việc và đo dòng phản hồi I theo thời gian, gelatin
được sử dụng với vai trị làm khn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano
PPy.
2.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs
Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp lên bề mặt màng cấu tạo bởi các dây
nano PPy bằng phương pháp hấp phụ. 10 μl dung dịch DNA dò nồng độ 10 μM được
nhỏ đều, phủ lên điện cực Pt-PPy NWs trong 2 giờ. Sau đó điện cực được rửa sạch
nhiều lần bằng nước khử ion nhằm loại bỏ các sợi DNA dị khơng liên kết hoặc liên
kết yếu với dây nano PPy. Cuối cùng, cảm biến được làm khô tự nhiên và bảo quản ở
4 oC.
2.2.5. Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò
Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dị tại các nồng độ DNA
đích khác nhau được khảo sát sử dụng hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco
Chemie, Hà Lan. Dịng xoay chiều đặt vào có biên độ Eac = 10 mV, tần số biến thiên f
= 0,1 Hz đến 104 Hz, điện áp một chiều không đổi Edc = 0,25 V so với Ag/AgCl trong
dung dịch KCl bão hòa.

2.3. Kết quả và thảo luận
2.3.1. Tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Pt
2.3.1.3. Ảnh hưởng của gelatin – khuôn nano trong chế tạo dây polyme
Khi không sử dụng gelatin, PPy được hình thành trên bề mặt điện cực Pt với cấu
trúc hoa súp lơ (cauliflower). Để khắc phục hiện tượng này, gelatin được sử dụng với
vai trị như khn mềm trong q trình polime hóa, kết quả là PPy xuất hiện trên bề
mặt điện cực Pt với cấu trúc dây nano, đường kính dây khoảng 65 nm đến 105 nm,
chiều dài dây cỡ micromet.
Kích thước dây nano PPy
tổng hợp được là đồng đều,
đường kính đồng đều dọc
theo chiều dài của dây và dây
nano phân bố tương đối đều
trên bề mặt điện cực.
So sánh với vật liệu PPy
Hình 2.7: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong
cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu
pyrrole 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và:(a) 0 %wt gelatin;
PPy cấu trúc dây nano với
(b): 0,08 %wt gelatin. Thời gian tổng hợp PPy là 300 s.
đặc tính diện tích bề mặt
riêng lớn được cho là sẽ thuận lợi hơn cho quá trình cố định trực tiếp DNA dò lên
cảm biến DNA nhờ sự tạo thành liên kết giữa gốc amin trên dây nano PPy và gốc
phốt phát của DNA. Mối liên kết trực tiếp này cùng với khả năng truyền dẫn điện tử
tốt của dây nano PPy được cho là góp phần cải thiện độ nhạy của cảm biến DNA.
2.3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ monome pyrrole
8


Khi nồng độ ban đầu của Py là 0,15 M, PPy được hình thành trên bề mặt điện cực

Pt với cấu trúc hoa súp lơ (cauliflower), hình 2.9c. Với mục đích tổng hợp dây nano
PPy trên điện cực Pt, phản ứng polime
hóa cần được thực hiện trong điều kiện
nồng độ Py ban đầu thấp hơn. Khi nồng
độ ban đầu của Py là 0,1 M, dây nano
PPy có kích thước đồng đều hơn và phân
bố đồng đều hơn trên bề mặt cảm biến,
hình 2.9b, so với khi nồng độ ban đầu
của Py là 0,05 M, hình 2.9a. Với kích
thước đồng đều và sự phân bố đồng đều
của dây nano PPy trên bề mặt cảm biến,
quá trình cố định phần tử cảm nhận sinh
học lên trên dây nano PPy sẽ thuận lợi
Hình 2.9: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng
hơn, vì vậy giá trị nồng độ Py ban đầu
hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt
0,1 M được lựa chọn trong các quy trình
gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c):
tổng hợp dây nano PPy định hướng ứng
0.15 M. Thời gian tổng hợp PPy là 300 s.
dụng trong chế tạo cảm biến sinh học.
2.3.1.5. Thời gian polime hóa
Khi thời gian phản ứng là 150 giây, dây nano PPy bắt đầu hình thành trên bề mặt
điện cực Pt, hình 2.10a. Khi thời gian phản ứng là 200 giây, một số dây nano PPy
phát triển dài thêm, tuy nhiên, một số dây nano PPy vẫn ở trạng thái như khi bắt đầu
hình thành, hình 2.10b. Khi tăng thời gian phản ứng lên 300 giây, dây nano PPy tiếp
tục phát triển dài thêm với kích thước khá đồng đều, đường kính dây khoảng 65 nm
đến 105 nm, chiều dài dây cỡ micromet
và dây phân bố đồng đều trên bề mặt điện
cực Pt, hình 2.10c. Tuy nhiên, khi tiếp tục

tăng thời gian phản ứng lên 400 giây, do
dây nano PPy phát triển quá dài, hiện
tượng chồng chập các dây nano xuất hiện
dẫn đến sự phân bố không đồng đều của
dây nano trên bề mặt điện cực Pt, hình
2.10d. Như vậy, thời gian polime hóa 300
giây là phù hợp đối với nghiên cứu này vì
với sự phát triển ổn định, kích thước đồng
đều và sự phân bố đồng đều của dây nano
PPy trên bề mặt điện cực, quá trình cố Hình 2.10: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng
hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt
định phần tử cảm nhận sinh học lên trên
gelatin
và Py 0,1 M: (a): 150 s; (b): 200 s;
cảm biến sẽ thuận lợi hơn. Việc có thể
(c): 300 s; (d): 400 s
khống chế được thời gian phản ứng (trong
nghiên cứu này là 300 giây) là một trong những ưu điểm của phương pháp tổng hợp
điện hóa nhằm tạo ra các sản phẩm mong muốn (trong nghiên cứu này là dây nano
PPy).
2.3.1.6. Phổ FT-IR
9


Hai pic tại 1378 cm-1 và 1561 cm-1 lần lượt đặc trưng cho liên kết C-H trong cấu
trúc quinoid [79] và liên kết C=C trong cấu trúc aromatic [34] của PPy. Pic tại 1464
cm-1 đặc trưng cho dao động đối xứng của vịng PPy. Thêm vào đó, dao động của liên
kết C-N và liên kết N-H trong cấu trúc PPy cũng được ghi nhận tại các pic 791 cm-1
[131] và 3375 cm-1. Sự
có mặt của gốc PO43

được xác định bởi các
pic 1045 cm-1 và 2375
cm-1. Các pic tại 1682
cm-1 và 2923 cm-1 đặc
trưng cho gelatin và pic
tại 963 cm-1 đặc trưng

cho nhóm ClO4 . Kết quả
phân tích phổ FT-IR cho
thấy, dây nano PPy đã
Hình 2.11: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong
được hình thành trên điện
LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M
cực Pt (WE). Bên cạnh
dây nano PPy, xuất hiện thêm các sản phẩm phụ như gelatin, photphat và peclorat.
Các hợp chất này được cho là các chất pha tạp, dùng để biến tính dây nano PPy thu
được. Polime dẫn biến tính được nhận định là có độ dẫn điện cao hơn so với polime
dẫn thuần [53,118] và đặc tính này phù hợp với định hướng ứng dụng dây nano PPy
trong cảm biến sinh học với vai trò làm lớp vật liệu trung gian tăng cường hiệu quả
truyền tải tín hiệu từ tương tác sinh học đến bộ chuyển đổi.
Tóm lại, dây nano PPy đã được tổng hợp trực tiếp trên điện cực Pt sử dụng kỹ
thuật điện hóa phân cực thế tĩnh, giá trị điện thế 0,75V được giữ không đổi và gelatin
được sử dụng với vai trị làm khn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano
PPy. Khi nồng độ ban đầu của monome Py là 0,1 M và thời gian thực hiện phản ứng
polime hóa là 300 giây, dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt với kích thước
đồng đều và sự phân bố đồng đều. So sánh với vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật
liệu PPy cấu trúc dây nano với diện tích bề mặt riêng lớn hơn được cho là sẽ giúp
nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, góp
phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến DNA.
2.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định DNA dò

Tổng trở của cảm biến sau khi cố định
DNA dò, tăng lên đáng kể so với tổng trở
của cảm biến khi chỉ có dây nano PPy. Điều
này được giải thích là do các sợi đơn DNA
dị gắn kết trực tiếp lên dây nano PPy thông
qua sự tạo thành liên kết giữa gốc phốt phát
của DNA và gốc amin trên dây nano PPy,
dẫn đến làm tăng giá trị điện trở chuyển
điện tích vào điện cực Pt từ 23.63 KΩ đến
Hình 2.13: Phổ tổng trở của điện cực: (a)
Pt- PPy NWs; (b): Pt-PPy NWs-DNA dò
10


32.01 KΩ, bảng 2.2. Kết quả là tổng trở của cảm biến DNA tăng lên.
So sánh với các phương pháp cố định DNA sử dụng màng PPy [64,80], nhận
thấy, trong luận án này, kỹ thuật cố định trực tiếp DNA lên cảm biến sinh học với bề
mặt được chức năng hóa bằng dây nano polypyrrole là đơn giản, thuận tiện và cho
hiệu quả tốt. Màng cấu trúc bởi các dây nano polypyrrole đóng vai trị điện cực được
cố định DNA dị lên bề mặt của nó thơng qua mối liên kết trực tiếp giữa nhóm phốt
phát của DNA và nhóm amino của polypyrrole. Đồng thời, dây nano polypyrrole
đóng vai trị tăng cường khả năng truyền tải tín hiệu từ sự lai hóa DNA dị - DNA
đích đến bộ chuyển đổi sinh học, nhờ đó, độ nhạy của cảm biến sinh học có triển
vọng được cải thiện.
2.3.3. Đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dị- DNA đích
Nhận thấy, phổ tổng trở trong mặt phẳng phức bao gồm một bán cung ở vùng tần
số cao đặc trưng cho quá trình chuyển điện tích và một phần tuyến tính ở vùng tần số
thấp đặc trưng cho sự chuyển khối.
Tổng trở của cảm biến khi có DNA
đích trong dung dịch điện li, hình

2.14b-h, tăng lên đáng kể so với
tổng trở của cảm biến khi khơng có
DNA đích, hình 2.14a. Các chuỗi
DNA chứa các nhóm photphat tích
điện âm, trong khi đó, PPy là chất
bán dẫn loại p với hạt tải là các lỗ
trống. Khi có DNA đích trong dung
dịch điện li, hiện tượng lai hóa
DNA diễn ra trên bề mặt dây nano
PPy dẫn đến làm giảm mật độ hạt
tải của PPy, do đó làm giảm độ dẫn
Hình 2.14: Phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWsvà làm tăng tổng trở của cảm biến.
DNA dò tại các nồng độ DNA đích khác nhau
Từ sự thay đổi phổ tổng trở, có thể
nhận thấy, tại nồng độ DNA đích là 10 pM tín hiệu điện hóa được tạo ra bởi sự lai
hóa DNA đã được thiết bị đo thu nhận và hiển thị. Tín hiệu này càng thể hiện rõ (có
giá trị lớn hơn) khi tiếp tục tăng nồng độ DNA đích.
Đường phổ tổng trở Zim vs. Zre thực nghiệm có thể được mơ phỏng bằng một mạch
điện tương đương trong đó mỗi phần tử của mạch đại diện cho một tính chất điện của
hệ điện hóa. Mạch tương đương
Randles, thường được sử dụng để
mô phỏng hệ điện hóa trong dung
dịch điện li, gồm các thành phần sau:
(1) điện trở dung dịch Rdd; (2) trở
Hình 2.15: Mơ hình mạch tương đương Randles
kháng Warburg ZW; (3) điện dung
được sử dụng trong luận án
lớp kép Clk ; và (4) điện trở chuyển
điện tích Rct. Trong mơ hình mạch tương đương Randles, phần tử pha QCPE có thể
được sử dụng để hiệu chỉnh và thay thế cho phần tử điện dung lớp kép C lk, hình 2.15.

Điều này được giải thích là do trên thực tế, trong một hệ điện hóa khó có thể tồn tại
11


một tụ điện lý tưởng vì đặc tính khơng đồng nhất và độ gồ ghề của vật liệu trên bề
mặt điện cực.
Mối quan hệ giữa trở kháng Z(ω) và QCPE được biểu diễn theo phương trình [15]:
1
Z   
(2.1)
QCPE ( j ) n
trong đó, ω = 2πf là tần số góc, f là tần số, n là hệ số CPE, n có giá trị trong khoảng
từ 0 đến 1 và giá trị của n đặc trưng cho tính khơng đồng nhất và độ gồ ghề của bề
mặt điện cực [64]. Tương ứng với các giá trị n = 1, 0 và 0,5, Q CPE lần lượt đại diện
cho một tụ điện lý tưởng, một điện trở thuần hay một thành phần Warburg [123].
Bảng 2.2 Các thông số trở kháng mô phỏng theo mạch tương đương Randles

Bề mặt điện cực

Rs (Ω)

Rct (KΩ)

QCPE (μF)

n

χ2 (x 10-3)

PPy NWs

317

23.63

1.19

0.82

2.84

0 pM

295.3

32.01

0.74

0.90

2.43

10 pM

282.1

32.25

0.78

0.90

1.75

100 pM

269.6

32.33

0.76

0.90

2.23

1 nM

256.4

32.40

0.85

0.89

1.71

10 nM

219.3

32.57

0.92

0.89

1.71

100 nM

214.4

34.66

0.92

0.89

1.63

300 nM

207.6

36.24

0.92

0.89

1.62

500 nM

202.6

36.39

0.93

0.89

2.13

PPy NWs/DNA dị/DNA đích

Trong luận án này, n nhận giá trị từ 0,82 đến 0,90, chứng tỏ sự hiện diện của QCPE
trong mơ hình mạch tương đương Randles là cần thiết. Kết quả này cũng phù hợp với
những kết quả có được khi phân tích hình thái bề mặt của cảm biến được chức năng
hóa bởi dây nano PPy. Giá trị nhỏ của χ2 (chuẩn χ bình phương) cho thấy trong
khoảng nồng độ DNA đích từ 10 pM đến 500 nM, việc sử dụng mơ hình Randles trên
để mô phỏng tổng trở của hệ là hợp lý và kết quả thu được sau mô phỏng là đáng tin
cậy.
2.4. Kết luận
Một trong những đóng góp mới của luận án là việc tổng hợp được vật liệu polime
dẫn PPy cấu trúc dây nano tại chính xác một vị trí mong muốn (WE) sử dụng kỹ thuật
điện hóa, khắc phục được tình trạng tạo thành PPy cấu trúc hoa súp lơ.

Dây nano PPy được tổng hợp trực tiếp trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa
phân cực thế tĩnh, điện thế 0,75V được giữ không đổi và gelatin được sử dụng với vai
trị làm khn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano PPy. Khi nồng độ ban
đầu của monome Py là 0,1 M và thời gian thực hiện phản ứng polime hóa là 300 giây,
dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt với kích thước đồng đều và sự phân bố
đồng đều.
Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp trên bề mặt cảm biến sinh học trên cơ
sở dây nano PPy. Hiện tượng lai hóa DNA được khảo sát sử dụng phương pháp phổ
tổng trở điện hóa. Cảm biến DNA có giới hạn phát hiện 10 pM tại 25 oC.
12


3. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TÍCH
HỢP HỆ VI LƯU
3.1. Mở đầu
Phát triển từ các kết quả đã đạt được trong nội dung nghiên cứu 1 với các phép đo
điện hóa được thực hiện trong hệ đo mở, trong nội dung nghiên cứu 2, mục đích tích
hợp cảm biến DNA điện hóa với một bình phản ứng kích thước nhỏ có khả năng ghép
nối với mạch đo nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, đồng thời nâng cao tỷ lệ tín
hiệu/nhiễu sẽ được tập trung hướng đến. Việc thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng
mẫu tiêu thụ có ý nghĩa rất quan trọng trong phân tích y sinh vì các mẫu phân tích có
thể là mẫu máu, vi khuẩn, virus… Cũng trong nội dung nghiên cứu 2, dây nano PPy
sẽ được tổng hợp bên trong vi bình phản ứng nhằm biến tính bề mặt cảm biến (đã tích
hợp với hệ vi lưu) thay vì tổng hợp trong hệ mở như nội dung nghiên cứu 1. Cấu trúc
dây nano của PPy và hệ ba điện cực tích hợp với vi bình phản ứng được hi vọng sẽ
cải thiện các đặc tính của cảm biến sinh học điện hóa, đờ ng thời giúp thu nhỏ hê ̣
thớ ng phân tích.
3.2. Thực nghiệm
3.2.2. Hệ ba điện cực tích hợp kết nối với bình phản ứng mini
Chế tạo hệ ba điện cực tích hợp:

Hệ ba điện cực Pt tích hợp bao gồm WE với diện tích 0,8 mm2, CE với diện tích 5
mm2 và điện cực so sánh thay thế.

Hình 3.1: (a): mặt nạ cho chế tạo hệ ba điện cực tích hợp; (b): mặt nạ cho chế tạo khn SU-8

Chế tạo hệ vi lưu trên cơ sở vật liệu PDMS:
Khuôn SU-8 được chế tạo sử dụng kỹ thuật quang khắc, hình 3.3. Phiến SU-8
được dùng làm khn để chế ta ̣o các vi kênh PDMS (polydimethylsiloxane). Khuôn
SU-8 đươ ̣c cố đinh
̣ vào mô ̣t điã nhựa
petri. Tiề n chấ t polime PDMS và chấ t
đóng rắn (curing agent) (theo tỷ lê ̣ 10 : 1
về thể tích) đươ ̣c trô ̣n đề u và rót vào điã .
Sau đó, hỗn hợp trên đươ ̣c xử lý trong
biǹ h hút chân không để loa ̣i bỏ hoàn
toàn các bo ̣t khí và sẽ đóng rắ n sau 2 giờ
Hình 3.3: Quy trình chế tạo khuôn SU-8
gia nhiêṭ ta ̣i 70 oC. Cuố i cùng, phiế n
PDMS đươ ̣c lô ̣t ra khỏi khuôn, cắ t thành từng vi kênh riêng biêt,̣ khoan lỗ và luồ n
dây để ta ̣o đầ u vào và đầ u ra cho mỗi vi kênh.
Gắ n kế t vi kênh và điện cực:
Phương pháp gắ n kế t plasma oxy: Điện cực sau khi đươ ̣c xử lý bề mă ̣t bằ ng
phương pháp hoá sẽ được gắn kết với vi kênh PDMS trong buồ ng plasma oxi (10 Pa,
20 W, 20 s). Sự gắ n kế t giữa vi kênh PDMS và điêṇ cực được củng cố bằng cách gia
13


nhiêṭ trong 15 phút ở 70 oC, sau đó giảm nhiê ̣t đơ ̣ về nhiệt độ phịng.
3.2.3. Tổng hợp dây nano PPy trong bin
̀ h vi phản ứng

Dây nano PPy được tổng hợp trong vi biǹ h phản ứng sử dụng kỹ thuật điện hóa
phân cực thế tĩnh (PS-Potentiostatic): điện thế phân cực không đổi là 0,5 V trong thời
gian phản ứng là 1200 giây và quét thế vòng tuầ n hoàn: điêṇ áp từ 0 đế n 0,6 V, 6
vòng, tố c đô ̣ quét 25 mV/s. Các bước xử lý bề mặt điện cực và pha chế dung dịch
điện li được thực hiện tương tự như đã trình bày trong phần 2.2.3.
3.2.4. Cố định DNA dị trên điện cực Pt-PPy NWs
Quy trình cố định DNA dị lên điện cực Pt-PPy NWs được thực hiện tương tự như
đã trình bày trong phần 2.2.4. Tuy nhiên, vì hệ điện cực Pt tích hợp đã được gắn kết
với vi kênh PDMS nên dung dịch DNA dò cần được bơm vào vi bình phản ứng thay
vì thực hiện việc nhỏ phủ trực tiếp lên bề mặt điện cực làm việc (WE).
3.2.5. Phát hiêṇ tín hiêụ lai hoá DNA sử du ̣ng Lock-in Amplifier
Tín hiệu dòng xoay chiề u với tần số 10 kHz và biên độ 100 mV từ nguồ n phát
điện của thiế t bi ̣Lock-in Amplifier SR830 được đặt vào hai điện cực giống nhau tích
hợp trong các bình vi phản ứng. Trong đó, bề mặt của một điện cực được cố định
DNA dò/PPy NWs (đóng vai trò điện cực làm việc) và bề mặt của điện cực còn lại
được biế n tin
́ h chỉ với PPy NWs (đóng vai trò điê ̣n cực so sánh).

Hình 3.6: Hê ̣ đo vi sai sử dụng Lock-in Amplifier SR830 DSP

Khi 4 µl dung dich
̣ DNA đích (chuỗi bổ sung) được bơm vào biǹ h vi phản ứng,
hiêṇ tươ ̣ng lai hoá DNA sẽ diễn ra trên bề mă ̣t điện cực làm việc (đã đươ ̣c cố định
DNA dò), dẫn đến sự thay đổi điêṇ tích của màng dẫn, do đó làm chuyể n dich
̣ tín
hiệu đầu ra. Tín hiệu đầu ra từ điện cực làm việc và điện cực so sánh của cảm biến đi
qua hai điện trở 1 k, được thu thập trên kênh A và kênh B của Lock-in, sau đó sẽ
được xử lý và hiển thị kết quả trên máy tính.
3.3. Kết quả và thảo luâ ̣n
3.3.1. Kế t quả chế ta ̣o hê ̣ vi kênh tích hơ ̣p với điêṇ cư ̣c

Hình 3.7 mơ tả hệ vi kênh PDMS tích hợp với điện
cực. Kích thước của chip là 12 x 15 mm.
Thể tích của vi bình phản ứng được tính theo cơng thức:
V = a. b. h
Trong đó:
a là chiều rộng của kênh, a = 3,5 mm = 3500 µm
Hình 3.7: Cảm biến ba điện
b là chiều dài của kênh, b = 5 mm = 5000 µm
cực tích hợp sử dụng PRE Pt
h là chiều cao của kênh, h = 260 µm
trong bình phản ứng mini.
14


Như vậy, hệ ba điện cực tích hợp với vi kênh PDMS có thể tích rất nhỏ:
V = 3,5 . 5. 0,26 = 4,55 mm3 = 4,55 µl
3.3.1.1. Kế t quả đo bề dày vi kênh PDMS
Với tố c đô ̣ quay phủ SU-8 3050 thấ p nhấ t, 500 rpm, kế t quả đo bề dầy của vi kênh
PDMS là cao nhấ t, 260 µm. Khi tăng tớ c đô ̣ quay phủ SU-8 3050, bề dày của vi kênh
PDMS đo đươ ̣c sẽ giảm. Trong nghiên cứu này, viê ̣c chế ta ̣o vi kênh PDMS là nhằ m
mu ̣c đích tích hơ ̣p với cảm biế n sinh ho ̣c điêṇ hoá, sau đó sẽ thực hiêṇ quá triǹ h
polime hoá điêṇ hóa trong bin
̀ h vi phản ứng nhằ m biế n tiń h bề mă ̣t cảm biế n trên cơ
sở dây nano PPy, do đó, bề dày vi kênh PDMS khoảng 260 µm là phù hơ ̣p với mu ̣c
đích nghiên cứu và tố c đô ̣ quay phủ SU-8 đươ ̣c lựa cho ̣n cho các thí nghiê ̣m tiế p sau
là 500 rpm.
3.3.1.2. Kế t quả gắ n kế t vi kênh PDMS và điê ̣n cực
Quy trình gắ n kế t vi kênh PDMS với điêṇ cực bằ ng phương pháp plasma oxi và
phương pháp sử du ̣ng chấ t đóng rắn đều cho kế t quả tố t, tuy nhiên, phương pháp gắn
kết plasma oxi được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp sau vì những ưu điểm nổi

bật như thời gian gắn kết nhanh và chất lượng gắn kết tốt, ổn định qua nhiều thí
nghiệm. PDMS là hợp chất polime với các mắt xích cơ bản -O-Si(CH3)2-. Khi vi kênh
PDMS được xử lý trong buồng plasma oxy, các nhóm -CH3 có thể được thay thế bởi
các nhóm -OH [107]. Sau đó, vi kênh PDMS được ốp lên điện cực và các liên kết
cộng hóa trị bền vững được hình thành giữa nhóm >Si(CH3)-OH và nhóm ≡ Si-OH
(đồng thời giải phóng phân tử H2O) chính là ngun nhân dẫn đến sự gắn kết bền
chặt và ổn định giữa vi kênh PDMS và điện cực.
3.3.3. Tổ ng hơ ̣p PPy NWs trong bin
̀ h vi phản ứng
Ả nh FE-SEM của PPy NWs
Hình 3.13 là ảnh FE-SEM của dây nano PPy đươ ̣c tổng hợp sử dụng kỹ thuâ ̣t điêṇ
hoá phân cực thế tiñ h, hình 3.13a, và quét thế vòng tuầ n hoàn, hiǹ h 3.13b. Đố i với cả
hai trường hơ ̣p, sản phẩ m polime dẫn PPy đề u được hình thành trên bề mặt điện cực
làm việc với cấu trúc dây nano,
đường kính dây khoảng 80 nm
đến 110 nm và chiề u dài dây cỡ
vài micromet. Kích thước dây
nano PPy tổng hợp được là đồng
đều và dây nano phân bố tương
đối đều trên bề mặt điện cực.
Việc tổng hợp vật liệu polime
Hình 3.13: Ả nh FE-SEM của dây nano PPy được tổng
hợp trong vi bình phản ứng sử dụng kỹ thuật điê ̣n hoá:
PPy cấu trúc dây nano tại chính
(a) phân cực thế tiñ h (0,5 V, 1200 s);(b) quét thế vòng
xác một vị trí mong muốn (WE)
tuầ n hoàn (0-0,6V, 6 vòng, tố c độ quét 25 mV/s)
trong vi kênh có thể tích rất nhỏ
(4 µl) là thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế
giới làm được. Kết quả nghiên cứu này là một trong những đóng góp mới của luận

án. Thông thường, phản ứng tổng hợp điện hóa vật liệu cấu trúc nano được thực hiện
ở ngồi vi kênh (hệ đo mở), sau đó, tiến hành các bước gắn kết vi kênh và hệ điện
cực. Tuy nhiên, khi lựa chọn sử dụng phương pháp gắn kết plasma oxi (với những ưu
điểm nổi bật như thời gian gắn kết nhanh, chất lượng gắn kết tốt, phù hợp với mục
15


đích chế tạo hệ thống phân tích thu nhỏ), sản phẩm PPy NWs trên điện cực làm việc
sẽ bị phá hủy trong mơi trường plasma oxi, do đó, cần thực hiện qui trình gắn kết vi
kênh và hệ điện cực trước, sau đó thực hiện phản ứng trùng hợp điện hóa nhằm tổng
hợp PPy cấu trúc dây nano trong vi kênh.
Vai trò của gelatin đối với sự phát triển dây nano PPy trong bình vi phản ứng
Để hiểu rõ hơn về vai trò của gelatin đối với sự phát triển dây nano PPy trong bình
vi phản ứng, quá trình tổng hợp điện hóa đã được thực hiện sử dụng kỹ thuật phân
cực thế tĩnh (0,5 V, 150 s) với 0,08 %wt gelatin mà khơng có monome Py, hình 3.15a
và có 0,1 M monome Py, hình 3.15b. Trên hình 3.15a, có thể quan sát thấy các khối
gelatin hình viên nang đã được hình thành với đường kính khoảng 1 µm. Trong khi
đó, trên hình 3.15b, các dây nano PPy với đường kính khoảng 100 nm bắt đầu phát
triển xung quanh các khối gelatin.

Hình 3.14: Ảnh FE-SEM của các sản phẩm được tổng hợp điện hóa sử dụng kỹ thuật phân cực thế
tĩnh (0,5 V, 150 s), dung dịch điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, gelatin 0,08 % wt và: (a) khơng có
Py; (b) Py 0.1 M trong vi bình phản ứng

Gelatin có cấu trúc chuỗi dài gồm nhiều axit amin
khác nhau với các nhóm chức -NH2 và -COOH. Các
nhóm -NH của monome Py có thể tạo thành liên kết hidro
với các nhóm -COOH của gelatin, hình 3.16.
Kết quả là, monome Py được hấp phụ trên bề mặt của
Hình 3.15: Liên kết hidro

chuỗi gelatin và tiếp tục được polime hóa để phát triển giữa monome Py và gelatin
thành các dây nano PPy. Như vậy, gelatin đóng vai trị
như khn mềm định hướng cho sự hình thành vật liệu PPy cấu trúc dây nano [38].
3.3.4. Phát hiện hiện tượng lai hóa DNA
Khi 4 µl DNA đích 2 nM được bơm
vào vi bình phản ứng, hiện tượng lai hóa
DNA diễn ra nhanh, được đặc trưng bởi sự
thay đổi trong tín hiệu đầu ra (sự chênh
lệch thế, ΔE = 33 mV) và thời gian đáp
ứng chỉ là một vài giây, hình 3.18a. Điều
này được giải thích là do hiện tượng lai
hóa DNA diễn ra trên bề mặt điện cực làm
Hình 3.18: Tín hiệu lai hóa DNA, CDNA dị = 10
μM, T = 298K: (a) Chuỗi DNA đích 2 nM; (b)
Chuỗi DNA đích khơng kết cặp 2 nM
16


việc (đã đươ ̣c cố định DNA dò), dẫn đến sự thay đổi điêṇ tích của màng dẫn, do đó
làm chuyể n dich
̣ tín hiệu đầu ra.
Thí nghiệm trên được lặp lại tương tự nhưng với chuỗi DNA đích khơng kết cặp,
tín hiệu đầu ra gần như khơng thay đổi (sự chênh lệch thế, ΔE = 1 mV) và đã ổn định
ngay sau một phút, hình 3.18b.
Các mẫu DNA đích với nồng độ khác nhau được bơm vào vi bình phản ứng tích
hợp với cảm biến DNA điện hóa. Từ các kết quả đo vi sai, có thể tính được các giá trị
chênh lệch thế, ΔE (mV), tương ứng với các nồng độ DNA đích khác nhau được
thêm vào bình điện hóa. Trên cơ sở đó, xây dựng được đường chuẩn biểu diễn mối
quan hệ giữa tín hiệu đáp ứng, ΔE, và nồng độ DNA đích đã được thêm vào vi bình
phản ứng, hình 3.19. Kết quả thực nghiệm cho thấy giới hạn mà cảm biến có thể phát

hiện là 20 pM DNA đích. Khi tăng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 2 µM, kế t quả
đo vi sai, ∆E, tăng lên và đạt bão hòa tại nồng độ 200 nM DNA đích chứng tỏ có sự
tăng lên về số lượng bắt cặp DNA đích - DNA dị trên bề mặt dây nano PPy.

Hình 3.19: Tín hiệu lai hóa DNA tương ứng với các giá trị nồng độ DNA đích khác nhau

Hình 3.19 cho thấy, cảm biến DNA điện hóa đạt tuyến tính tốt trong khoảng nồng
độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE =
14,03Log C – 16,26 và bình phương hệ số tương quan đạt 0,9932.
3.4. Kết luận
Vi kênh PDMS và hệ ba điện cực tích hợp sử dụng PRE Pt đã được thiết kế, chế
tạo và gắn kết.
Dây nano PPy được tổng hợp trong vi bình phản ứng thay vì trong hệ mở. Việc
tổng hợp vật liệu PPy cấu trúc dây nano tại chính xác một vị trí mong muốn (WE)
trong vi kênh có thể tích rất nhỏ (4 µl) là thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại,
rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm được. Kết quả này là một trong những đóng
góp mới của luận án.
Trong q trình polime hóa điện hóa, do sử dụng PRE Pt, điện thế 0,5 V được giữ
không đổi thay vì giá tri ̣ 0,75 V áp du ̣ng cho hê ̣ mở sử du ̣ng điê ̣n cực so sánh
Ag/AgCl (KCl baõ hòa). Vai trò của gelatin đối với sự phát triển dây nano PPy cũng
được giải thích. Dây nano PPy được hiǹ h thành trong vi bình phản ứng có tính đồng
nhấ t cao và sự phân bố đồ ng đề u trên khắ p bề mă ̣t điê ̣n cực, thuận lợi cho quá trình
cố định DNA dị lên cảm biến DNA.
17


Sợi đơn DNA dò được cố định trực tiếp lên cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano
PPy. Hiện tượng lai hóa DNA diễn ra trong vi bình phản ứng được khảo sát sử dụng
phương pháp đo vi sai. Giới hạn phát hiện của cảm biến là 20 pM tại nhiệt độ 25 oC.
Cảm biến đạt tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM

tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 và bình phương hệ số
tương quan đạt 0,9932.
Bên cạnh đó, việc tích hợp cảm biến DNA điện hóa và vi bình phản ứng đã giúp
thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm đáng kể lượng mẫu tiêu thụ so với khi thực hiện
các phép đo trong hệ mở. Kết quả này cũng là một trong những đóng góp mới của
luận án.

4. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HĨA
TÍCH HỢP BÌNH PHẢN ỨNG MINI ỨNG DỤNG TRONG PHÁT
HIỆN VIRUS NEWCASTLE
4.1. Mở đầu
Sau khi hoàn thành nội dung nghiên cứu 2 với các qui trình đo lường điện hóa
được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ, trong nội dung nghiên cứu 3, luận án
sẽ tiến gần thêm một bước đến ứng dụng thực tiễn. Các kết quả đạt được của luận án
sẽ không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học mà cịn có khả năng hướng đến sự hợp
tác với các công ty, các nhà sản xuất. Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử dụng
DNA làm phần tử dị cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, địi hỏi chi phí
cao và thời gian dài, luận án sẽ sử dụng
kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết
xuất trực tiếp từ trứng gà – một sản phẩm đã
được bán trên thị trường do công ty cổ phần
công nghệ sinh học thú y BTV (BiotechVet) cung cấp, tương lai hướng đến việc
đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt
hàng từ phía cơng ty. Cũng trong nội dung
nghiên cứu 3, cảm biến miễn dịch điện hóa Hình 4.1: Mơ phỏng sơ lược hệ điện hóa
tích hợp bình phản ứng mini sẽ được phát mini đi kèm bình phản ứng mini và đầu đo
tích hợp
triển phù hợp với định hướng ứng dụng
trong phát triển một bộ vi phân tích điện hóa
phát hiện virus gây bệnh. Bộ vi phân tích điện hóa, sẽ là một hệ thống hoàn chỉnh bao

gồm: 01) đầu đo được cố định kháng nguyên/kháng thể; 02) bình phản ứng kích
thước nhỏ đảm bảo nâng cao tỷ số tín hiệu/nhiễu, tăng độ chính xác và giảm thể tích
mẫu phân tích; và 03) bộ thu thập và xử lý tín hiệu tích hợp trong hệ thống; có khả
năng được mở rộng và phát triển như một nền tảng (platform) cho việc phân tích các
đối tượng y sinh khác nhau, hình 4.1.
Cảm biến sinh học điện hóa tích hợp bình phản ứng mini được phát triển theo định
hướng ứng dụng trong chế tạo bộ vi phân tích điện hóa cho phép phát hiện nhanh các
dấu hiệu về virus gây bệnh sẽ giải quyết được những nhược điểm của các phương
pháp phân tích y sinh truyền thống và giữ vai trị quan trọng trong việc thực hiện các
nhiệm vụ phân tích lưu động. Nội dung nghiên cứu 3 sẽ bao gồm: nghiên cứu thiết
kế, chế tạo và ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl và
18


một bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus
Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến miễn dịch; nghiên
cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã chế tạo
trong phát hiện virus Newcastle.
4.2. Thực nghiệm
4.2.2. Thiết kế và chế tạo hệ điện cực tích hợp bình phản ứng mini
Hệ cảm biến bao gồm ba điện cực: WE/cảm biến miễn dịch (cố định kháng thể),
CE và RE. Hai điện cực vàng WE và CE được tích hợp lên trên cùng một chip. Kích
thước của chíp là 12 x 3,6 mm, đường kính của WE là 1 mm, diện tích của WE là πR2
= π0,52 =0,785 mm2. Điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl được chế tạo với kích thước
rất nhỏ gọn (đường kính 1 mm, chiều dài 10 mm). Thiết kế này cho phép ghép nối
với một bình phản ứng mini có thể tích nhỏ dao động từ 100 µL tới 1 ml, cho phép
thực hiện các phép đo với lượng mẫu rất nhỏ, đảm bảo độ chính xác cao, hình 4.3.

Hình 4.3: Bình phản ứng mini kết nối với hệ điện cực

Bình phản ứng mini được thiết kế và chế tạo trên cơ sở kỹ thuật vi cơ khí nhằm
mục đích sử dụng lặp lại nhiều lần (chỉ cần thực hiện các thao tác đóng, mở và thay
thế điện cực tương ứng với các phép đo khác nhau).
4.2.3. Cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến
Điện cực vàng sau khi được làm sạch bề mặt, được ủ với 20 µl dung dịch PrA (1
mg/ml) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, sau đó tiếp tục được ủ với 20 µl dung dịch GA
5 % (30 phút, nhiệt độ phòng), cuối cùng, điện cực được ủ với 20 µl kháng thể (60
µg/ml) ở 4 ᵒC trong 3 giờ. Sau khi kháng thể được cố định lên bề mặt điện cực, 20 µl
BSA 1% được sử dụng để khóa phủ các vị trí khơng đặc hiệu (30 phút, nhiệt độ
phịng). Sau mỗi bước cố định, điện cực đều được rửa sạch bằng nước khử ion và
được sấy khơ bằng khí N2 nhằm loại bỏ những phần tử không tương tác hoặc tương
tác yếu.
4.2.4. Phát hiện virus (bất hoạt) sử dụng cảm biến miễn dịch điện hóa
20 µl virus bất hoạt Newcastle được nhỏ lên trên điện cực ở nhiệt độ phòng trong
1 giờ. Sau đó, điện cực được rửa với nước khử ion để loại bỏ những phần tử đích
khơng tương tác hoặc tương tác yếu. Quá trình đo CV (Cyclic Voltammetry) được
thực hiện trên hệ điện hóa EC301 từ Stanford Research Systems. Bình điện hóa sử
dụng ba điện cực: điện cực làm việc (WE) là điện cực cảm biến miễn dịch/virus, điện
cực đối (CE) là điện cực Au tích hợp và điện cực so sánh (RE) là điện cực so sánh
thay thế Ag/AgCl. Dung dịch điện li gồm Fe(CN)63-/4- 0,03 M, KCl 0,1 M, khoảng
quét thế từ -0,2 đến 0,5 V và tốc độ quét 25 mV/s.
4.2.5. Thống kê và xử lý số liệu
Để xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đầu ra của cảm
biến miễn dịch (∆Ipeak) và hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml), các mẫu virus
19


Newcastle (bất hoạt) có hàm lượng thay đổi từ 102 đến 106 EID50/ml (EID50: 50%
Empryo Infective Dose – Liều nhiễm trùng trên phôi gà) đã được sử dụng. Từ các
đường CV thực nghiệm có thể xác định được giá trị dịng cực đại Ipeak và ∆Ipeak theo

các cơng thức sau [67]:
𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 = 𝐼𝑝,𝑎 − 𝐼𝑝,𝑐
(4.1)
∆𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 =

𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 (0)− 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 (𝑖)
𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 (0)

(4.2)

Trong đó:
Ipeak(0) là dịng cực đại của điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch);
Ipeak(i) là dòng cực đại của điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA/Ag (cảm biến miễn
dịch/virus Newcastle).
4.3. Kết quả và thảo luâ ̣n
4.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể
Dịng cực đại Ipeak của điện cực
Au/PrA (Ipeak, Au/PrA = 118,43 µA) giảm so
với điện cực Au (Ipeak, Au = 123,25 µA).
Giá trị Ipeak của điện cực Au/PrA/GA/Ab
(Ipeak, Au/PrA/GA/Ab = 114,51 µA) giảm so với
điện cực Au/PrA (Ipeak, Au/PrA = 118,43
µA). Cuối cùng, sau khi khóa phủ các vị
trị tương tác khơng đặc hiệu sử dụng
BSA, giá trị Ipeak của điện cực
Au/PrA/GA/Ab/BSA (Ipeak, cảm biến miễn dịch =
112,01 µA) giảm so với điện cực Au (Ipeak,
Au = 123,25 µA). Kết quả trên được giải
thích là do việc hấp phụ các lớp PrA,
Hình 4.10: Đường CV của điện cực: (a): Au;

(b): Au/PrA; (c): Au/PrA/GA/Ab và (d):
PrA/GA/Ab
và
cuối
cùng
là
Au/PrA/GA/Ab/BSA trong dung dịch
PrA/GA/Ab/BSA đã dẫn đến sự sụt giảm
K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M
điện thế tại bề mặt các lớp này, do đó làm
tăng giá trị điện trở chuyển điện tích của cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào
điện cực Au và làm giảm cường độ dòng của cảm biến.
Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử kháng thể IgG đã được tinh chế làm phần
tử dò cho cảm biến miễn dịch như trong phần lớn những công bố khác [21,30,106],
luận án đã tập trung nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus
Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà lên bề mặt cảm biến. Kháng thể IgG (đơn
dòng và đa dòng) đều phải được sản xuất và tinh chế tại các phịng thí nghiệm tiêu
chuẩn, sử dụng các bộ sinh phẩm thương mại và kỹ thuật hiện đại, vì vậy, địi hỏi chi
phí cao và thời gian dài [84,97]. Tuy nhiên, theo Jones và cộng sự [71], dịch bệnh
truyền nhiễm thường diễn ra bất ngờ, khó có thể dự đốn khi nào sẽ diễn ra dịch
bệnh, dẫn đến khó khăn trong việc chủ động nguồn kháng thể IgG tinh chế cần thiết
cho các xét nghiệm trong thời gian ngắn. Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng kháng thể
IgY thu thập từ trứng gà, khơng cần phải qua các qui trình tinh chế phức tạp, yêu cầu
kỹ thuật hiện đại, chi phí cao và thời gian dài làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch
sẽ khơng những giúp giảm chi phí mà cịn là giải pháp hiệu quả nhằm phát hiện kịp
20


thời virus gây bệnh trong các vụ dịch bệnh truyền nhiễm do khơng cịn phụ thuộc
nhiều vào nguồn kháng thể IgG tinh chế.

4.3.3. Đặc trưng tín hiệu tương tác virus – kháng thể
Giá trị Ipeak của điện cực cảm biến miễn dịch/virus Newcastle (Ipeak, cảm biến miễn
dịch/virus Newcastle = 97,90 µA) giảm so với Ipeak của cảm biến đo được khi chưa có
tương tác sinh học với virus Newcastle (Ipeak, cảm biến miễn dịch = 112,57 µA). Kết
quả trên được giải thích là do virus Newcastle đã được gắn kết trên bề mặt cảm biến
miễn dịch trên cơ sở tương tác đặc hiệu virus - kháng thể, dẫn đến cản trở q trình
chuyển điện tích của cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào điện cực Au, kết
quả là mật độ dòng điện giảm.

Hình 4.13: Đường CV của điện cực: (a):
cảm biến miễn dịch; (b): cảm biến miễn
dịch/virus VNNB trong dung dịch
K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1
M, tốc độ quét 25 mV/s

Hình 4.12: Đường CV của: (a): cảm
biến miễn dịch và (b): cảm biến miễn
dịch/virus Newcastle trong dung dịch
K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1
M, tốc độ quét 25 mV/s

Khi tương tác không đặc hiệu kháng nguyên (virus viêm não Nhật Bản) - kháng
thể (kháng virus Newcastle) diễn ra trên bề mặt cảm biến miễn dịch, giá trị Ipeak (Ipeak,
cảm biến/virus VNNB = 113,10 µA) gần như không thay đổi so với Ipeak của cảm biến đo
được khi chưa có tương tác sinh học với virus viêm não Nhật Bản (I peak, cảm biến =
112,57 µA). Kết quả trên cho thấy cảm biến miễn dịch điện hóa đã chế tạo có độ
chọn lọc tốt
4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến miễn dịch
4.3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể
Khi nồng độ kháng thể tăng từ 20 µg/ml

đến 60 µg/ml, tín hiệu đầu ra của cảm biến
(∆Ipeak) tăng lên. Kết quả này được giải
thích là do khi nồng độ kháng thể tăng, số
lượng kháng thể được cố định hiệu quả trên
bề mặt cảm biến sẽ tăng lên, nhờ đó, làm
tăng xác suất bắt cặp với kháng nguyên đặc
hiệu. Trong nghiên cứu này, kháng thể
được sử dụng làm phần tử dò cho cảm biến
miễn dịch là kháng thể IgY kháng virus Hình 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể
Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà và
đến giá trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch
21


nồng độ 60 µg/ml là giá trị nồng độ kháng thể
cao nhất (dung dịch kháng thể được cung cấp
bởi nhà sản xuất). Do đó, giá trị nồng độ
kháng thể 60 µg/ml sẽ được lựa chọn cho
những thí nghiệm tiếp sau.
4.3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp
kháng thể - virus
Hình 4.16 biểu diễn các đường CV của
điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f):
cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong
dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M,
4.16: Đường CV của điện cực: (a): cảm
KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi Hình
biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn
thời gian bắt cặp kháng thể - virus: (b): 15 dịch/virus Newcastle khi thay đổi thời gian bắt
cặp kháng thể - virus

phút, (c): 30 phút, (d): 45 phút, (e): 90 phút
và (f): 60 phút. Từ các đường CV thực
nghiệm, có thể tính toán để thu được các giá
trị Ipeak và ∆Ipeak theo các cơng thức (4.1) và
(4.2).
Hình 4.17 cho thấy khi thời gian bắt cặp
kháng thể - virus là từ 5 đến 15 phút, tín hiệu
đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) thấp
và gần như hông thay đổi. Khi tăng thời gian
bắt cặp kháng thể - virus từ 15 đến 60 phút,
Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian bắt
tín hiệu đầu ra của cảm biến tăng lên và đạt
cặp kháng thể - virus đến giá trị ∆Ipeak
giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602) tương ứng với
của cảm biến miễn dịch
thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 60 phút.
Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian bắt cặp
kháng thể - virus lên 90 phút thì tín hiệu đầu
ra của cảm biến miễn dịch cũng không tăng
lên nữa. Như vậy, khoảng thời gian 60 phút là
đủ để các liên kết đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể được thiết lập. Do đó,
thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 60 phút
sẽ được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp sau.
4.3.5. Độ nhạy của cảm biến miễn dịch
Hình 4.18 biểu diễn các đường CV của
điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f):
cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong
Hình 4.18: Đường CV của điện cực: (a):
dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn

dịch/virus Newcastle khi thay đổi hàm
0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi hàm
2
lượng virus Newcastle
lượng virus Newcastle: (b):10 EID50/ml, (c):
103 EID50/ml, (d): 104 EID50/ml, (e): 105 EID50/ml và (f): 106 EID50/ml.
Từ các đường CV thực nghiệm có thể tính được các giá trị Ipeak và ∆Ipeak theo các
công thức (4.1) và (4.2) tương ứng với các hàm lượng virus Newcastle khác nhau.
22


Hình 4.19 là đường chuẩn biểu diễn mối
quan hệ giữa tín hiệu đầu ra của cảm
biến miễn dịch (∆Ipeak) và hàm lượng
virus Newcastle (log EID50/ml). Hình
4.19 cho thấy, giới hạn phát hiện của
cảm biến miễn dịch là 102 EID50/ml
virus Newcastle. Cảm biến miễn dịch
điện hóa đạt tuyến tính tốt trong khoảng
hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến
106 EID50/ml với phương trình liên hệ
là: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 và
bình phương hệ số tương quan (R2) đạt
Hình 4.19: Sự thay đổi tín hiệu đầu ra của
cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) phụ thuộc vào hàm
0,9969.
lượng virus Newcastle (log EID50/ml)
4.4 Kết luận
Hệ ba điện cực sử dụng PRE
Ag/AgCl đã được thiết kế, chế tạo và ghép nối với một bình phản ứng mini. Việc sử

dụng PRE Ag/AgCl thay thế RE thương mại, sau đó tích hợp hệ điện cực với một
bình phản ứng mini (có khả năng sử dụng lặp lại nhiều lần, chỉ cần đóng, mở và thay
thế điện cực tương ứng với mỗi phép đo), giúp thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm
lượng mẫu tiêu thụ, là một trong những đóng góp mới của luận án.
Kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà được cố
định làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch thay vì sử dụng kháng thể IgG tinh chế
với qui trình tách chiết phức tạp địi hỏi chi phí cao và thời gian dài. Kết quả này
cũng là một trong những đóng góp mới của luận án.
Cảm biến miễn dịch tích hợp bình phản ứng mini được ứng dụng trong phát hiện
virus Newcastle sử dụng phương pháp CV. Khi nồng độ kháng thể được cố định là 60
µg/ml, thời gian bắt cặp kháng thể - virus là 1 giờ, tín hiệu đầu ra của cảm biến đạt
giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602). Giới hạn phát hiện của cảm biến là 102 EID50/ml tại
25 oC. Cảm biến đạt tuyến tính tốt trong khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102
đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 và bình
phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,9969.
Như vậy, cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã được phát
triển phù hợp với định hướng ứng dụng trong phát triển một bộ vi phân tích điện hóa.
Bộ vi phân tích điện hóa, sẽ là một hệ thống hoàn chỉnh bao gồm: 01) đầu đo được cố
định kháng ngun/kháng thể; 02) bình phản ứng kích thước nhỏ đảm bảo nâng cao
tỷ số tín hiệu/nhiễu, tăng độ chính xác và giảm thể tích mẫu phân tích; và 03) bộ thu
thập và xử lý tín hiệu tích hợp trong hệ thống; có khả năng được mở rộng và phát
triển như một nền tảng (platform) cho việc phân tích các đối tượng y sinh khác nhau.
Việc phát triển bộ vi phân tích điện hóa nói trên sẽ giúp khắc phục được những nhược
điểm của các phương pháp phân tích y sinh truyền thống và có ý nghĩa quan trọng
trong việc thực hiện các nhiệm vụ phân tích lưu động.

KẾT LUẬN CHUNG
Các kết quả chính của luận án được tóm tắt như sau:
1. Đã phát triển bộ cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano PPy:
23