Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn streptomyces 40 16 tổng hợp lên

Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy h ớng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu, ngời đã hớng tận tình và giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại Khoa
Công nghệ Sinh học - Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình học tập.
Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những ngời đã giúp đỡ và động viên
tôi trong thời gian qua. Với khát vọng thì nhiều nhng thời gian và kiến thức của
bản thân có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự chỉ
bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Phạm Thị Ngọc

Chú giải chữ viết tắt
ADN
: axit Deoxyribonucleic
B.cereus
: Bacillus cereus ATCC 9946
B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441
B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633
D
: Đờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Dmhc
: Dung môi hữu cơ
E.Coli
: Escheriachia Coli ATCC 25922
P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108
S(Spiral)
: Xoắn lò xo
s
: độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh
S.typhi
: Salmonella typhi DT220
S.flexneri : Shigella flexneri DT 122
S.lutea
: Sarcina lutea ATCC 9314
Sm(smooth) : Nhẵn
S.aureus
: Staphylococus aureus ATCC 1228
VSV
: Vi sinh vật
ISP
: Chơng trình Streptomyces Quốc tế
MT
: Môi trờng
dd
: Dung dịch

VK
: Vi khuẩn

Đặt vấn đề
Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ
sinh học cũng đợc coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế
giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh,
vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng nh các lĩnh vực khác phục
vụ đời sống con ngời đang có những phát triển vợt bậc.
Từ những phơng pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi
sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số
hơn 10.000 chất kháng sinh đợc tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo
ra còn khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ
khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh
Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt một số loài
trong chi này có khả năng tổng hợp các chất chống ung th và điều trị HIVAIDS.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu lớn đối với các nhà nghiên cứu, đó là
sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh và các chất hóa trị liệu khác.
Do đó các nhà khoa học và các chuyên gia y tế đã không ngừng tìm kiếm những

phơng sách để chống lại hiện tợng này.
Tại bộ môn Vi sinh và Sinh học trờng Đại học Dợc Hà Nội, chúng tôi tiến
hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau:
+ Từ chủng Streptomyces đã đợc phân lập, chọn giống sinh tổng hợp
kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến,
+ Nghiên cứu môi trờng nuôi cấy và điều kiện lên men tối u,
+ Nghiên cứu đặc điểm, hình thái và sinh lý nhằm xác định tên khoa học
của chủng Streptomyces 40.16 theo khóa phân loại ISP,
+ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính
của kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 40.16 tổng hợp lên.

PHần 1
TổNG QUAN
1.1. VI NẫT V KHNG SINH [5][6][8][11]

1.1.1.Lch s
Nm 1928, nh vi khun hc ngi Anh Alexander Fleming trong khi
nghiờn cu t cu khun ụng nhn thy xung quanh khun lc mc xanh nhim
vo hp peptri nuụi tụ cu to thnh vũng vụ khun. Hin tng kỡ l ny ó
c Fleming nghiờn cu v phõn lp thun khit v xỏc nh c mc xanh
ú l Penicillium notatum mt chng to ra penixilin.
Nm 1941 penixilin c nghiờn cu sn xut phc v iu tr cho
thng binh trong i chin th gii th II v k nguyờn ca cht khỏng sinh
c tha nhn. Cho n nay ngi ta ó phỏt hin v mụ t khong hn 8000
cht khỏng sinh khỏc nhau cú ngun gc t nm mc, x khun v vi khun.
Thut ng khỏng sinh (antibiotic) c Waksman N.A gi t 1944 khi ụng
phỏt minh ra streptomycin t mụi trng nuụi cy Streptomyces griseus
1.1.2 nh ngha

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

Kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng
ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chän lọc một nhóm vi sinh vật xác
định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng
độ thấp.
1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí
chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng
trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên
trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức
tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng lên thành tế
bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp
ADN, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô
hấp và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.
1.1.4.Phân loại kháng sinh
Ph©n lo¹i kh¸ng sinh cã thÓ theo nhiÒu c¸ch, nhng theo cÊu tróc hãa häc
lµ khoa häc nhÊt.B¶ng 1 giíi thiÖu mét sè nhãm kh¸ng sinh quan träng.

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02

Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

B¶ng 1: Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hoá học
Phân loại
Nhóm kháng sinh
1. Các kháng sinh có chứa Aminoglycosid
đường trong phân tử
Orrthsomycin
N-glycosid
C-glycosid
Glycolipid
2. kháng sinh chứa vòng
lacton lớn (macrocyclic
lacton)
3. Quinon và các kháng
sinh cùng họ

4. Các kháng sinh
aminoacid và peptid

Kháng sinh macrolid
Kháng sinh polyen
Ansamycin
Macrotetrolid
Anthracyclin
Naphthoquinon
Benzoquinon

Các tetracyclin
Dẫn xuất aminoacid
Kháng sinh betalactam
Kháng sinh peptid
Chromopeptid
Depsipeptid

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Kháng sinh cụ thể
Streptomycin,
neomycin
Everninomycin
Streptothricin
Vancomycin
Moenomycin
Erythromycin
Candicidin, nistatin
Rifamicin
Tetranactin
Adriamycin
Actinorhodin
Mitomycin
Tetracyclin,
teramycin
Cycloserin
Penicilin,
Cephalosporin
Bacitraxin,
polymycin

Actinomycin
Valinomycin
Lớp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp
5. Kháng sinh dị vòng
chứa nitơ
6.Kháng sinh dị vòng
chứa oxy
7. Các Kháng sinh nhân
thơm

Phạm Thị Ngọc
Các Kháng sinh nucleosid

Polyoxin

Các Kháng sinh polyether

Monensin

Dẫn xuất benzen, c¸c ªte th¬m Cloramfenicol
Novobiocin

1.1.5 Khái niệm về kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của
nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hoá trị liệu.
Kháng sinh chủ yếu mất tác dụng theo 3 cơ chế: Thay đổi vị trí đích,
giảm tính thấm của thuốc hoặc do tác động của enzym làm mất hoạt tính của

kháng sinh. Tính kháng kháng sinh được di truyền cho các thế hệ tiếp theo. Bản
chất di truyền tính kháng thuốc được khẳng định nhờ tác nhân gây đột biến vµ
plasmid. Các quá trình này lan truyÒn tÝnh kh¸ng thuèc ngoµi nhiÔm s¾c thÓ xảy
ra ở mức độ phân tử, tải nạp nhờ bacteriophage và biến nạp vào vi khuẩn vµ
tiÕp hîp.
1.1.6 Sơ đồ mô tả quy trình sản xuất kháng sinh

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

G iố n g tru y ề n ủ tro n g p h ò n g th í n g h iệ m
B ìn h n h â n g iố n g C 1 , C 2 ,C 3
B ìn h lê n m e n tạ o k h á n g s in h
D ịc h s a u lê n m e n
Lọc
S in h k h ố i

D ịc h lọ c

S in h k h ố i k h ô

D ịc h c h iế t K S
đậm đặc
T in h c h ế

D ịc h
c h iế t s in h k h ố i

Sản phẩm
T in h c h ế

T in h c h ế
S ả n p h ẩ m đ ã k iể m
n g h iệ m

Sản phẩm
T in h c h ế

n g h i ệ Smả n
phẩm đóng gói

Hình 1. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

1.1.7 Ứng dụng của kháng sinh
Kháng sinh được sử dụng trong y học từ 1940 (penixilin) sau đó một loạt

các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được
sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo.
Bảng 2 :Một vài kháng sinh quan trọng có giá trị kinh tế cao
Tên kháng sinh

Vi sinh vật sản xuất kháng sinh

Hoạt phổ

Penicilin G

Penicillium chrysogenum

Kháng khuẩn

Streptomycin

S. griseus

Kháng lao

Tetracyclin

S. aureofaciens

Kháng khuẩn

Chloramfenicol

S. venezuela

Kháng khuẩn

Oxytetracyclin

Str. Rimosus

Kháng khuẩn

Cephalosporin C

Cephalosporium acremonium

Kháng khuẩn

Actinomycin D

S. antibioticus

Kháng ung thư

Bleomycin

S. verticillum

Kháng ung thư

Daunorubicin

S. peucetius

Kháng ung thư

Mitomycin C

Streptomyces sp

Kháng ung thư

Kanamycin

S. kanamyceticus

Kháng khuẩn

Nistatin

S. noursei

Kháng nấm

Fumagillin

Aspergillus fumigatus

Kháng protozoa

Griseofulvin

Penicillium griseofulvum

Kháng nấm

Nisin

Streptococcus sp.

Bảo quản thực phẩm

Natamycin

Streptococcus sp.

Bảo quản thực phẩm

Rifamycin

Nocardia mediteranei.

Kháng lao

Polymyxin B

Bacillus polymyxa

Kháng khuẩn

Gentamycin

Micromonospora purpurea.

Kháng khuẩn

Kháng sinh còn được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm
trùng của động vật như viêm phổi ở trâu bò, tụ huyết trùng ở lợn, v.v…Trong
chăn nuôi kháng sinh được sử dụng làm chất bổ sung vào thức ăn nhằm kích

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng víi mục đích này
(các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…).
Kháng sinh còn được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu diệt
các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi ở
lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây
có củ,v.v…Kháng sinh còn kích thích nẩy mầm của hạt. Thường ngâm hạt
trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm, vừa tiêu
diệt mầm bệnh trong đất.
Kháng sinh còn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản
thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản
được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ
được tốt hơn(vÝ dô nizin).
1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15]
1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn

* Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn
thật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nÊm tia) nhưng lại có khích thước và
cấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong
đất, nước và trong các chất hữu cơ.
- Những đặc điểm ®Æc trng cña x¹ khuÈn :
+ Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn
+ Nhân của xạ khuẩn lµ nh©n kh«ng ®iÓn h×nh
+ Màng tế bào xạ khuẩn không chứa xenlulo và kitin
+ Sự phân chia tế bào của xạ khuẩn theo kiểu của vi khuẩn
+ Xạ khuẩn không có giới tính
- Tuy vậy xạ khuẩn lại có hình th¸i, cấu tạo sợi, phát triển bằng phân
nhánh thành những sợi nhỏ, dài gọi là khuẩn ti (hipha), mỗi khuẩn ti do một tế
bào hình thành, tập hợp của các khuẩn ti này gọi là hệ khuẩn ti.
* Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn :
Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

- Đường kính khuẩn ti xạ khuẩn khoảng 0,2 - 3,0 μm
- Màu sắc của khuẩn ti khÝ sinh rất phong phú: màu trắng, vàng, đỏ, lục,
tía, nâu, đen…
- Thành tế bào dày từ 7,5-10,0 nm, không có xenlulo và kitin
- Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính.
* Phân loại:

Actinomycetales

Actinoplanaceae

Actinomycetaceae

Nocardia

Streptomycetaceae

Streptomyces

Micromonospora

H×nh 2: S¬ bé ph©n lo¹i x¹ khuÈn
1.2.2.Đặc điểm hình thái và sinh lí của xạ khuẩn chi Streptomyces

* Đặc điểm hình thái:
- Khuẩn lạc tạo thành từng cụm, bề mặt khô ráp, xù xì, dạng phấn ,
không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ.
- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi
cấy.
- Khẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hoà tan
trong nước, có sắc tố chỉ hoà tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty cơ chất mọc trong môi trường nuôi cấy, không phân cách
trong suốt quá trình phát triển

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02

Khoá luận tốt nghiệp

Phạm Thị Ngọc

- Khuẩn ty khÝ sinh: khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài trong
không khí thành những khuẩn ty khÝ sinh và có đường kính từ 1,0-1,4 μm.
+ Chuỗi bào tử: được hình thành từ khuẩn ty ký sinh, có nhiều hình dạng
khác nhau: th¼ng, móc câu, xoắn, uốn cong.
+ Bào tử trần: được hình thành do sự phân cắt của sợi bào tử, là cơ quan
sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có thể hình cầu, hình elipsoid, hình
que, hình trụ. Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi 3- 50 bào tử hoặc nhiều
hơn. Bề mặt của bào tử có thể có dạng trơn nh½n (sm), xù xì (wa), có gai (sp),
hoặc có tóc (ha).
* Đặc điểm sinh lý:
- Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hoá cao. §ể phát triển
chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và
nguồn năng lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh
bột. Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit.
- Streptomyces là vi sinh vật có thành tế bào kiểu CW1 có chứa L-DAP
(diaminopimelat) và glycin.
- Streptomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của
chúng thường là 25-300C, một vài loài có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu
thường từ 6,8-7,5.
- Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces: sắc tố tạo thành từ Streptomyces
được chia thành bốn loại: sắc tố hoà tan, sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố
melanoid, sắc tố khuẩn lạc.
1.2.3.Phân loại Streptomyces

Chi Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau .Việc phân loại và xác định tên xạ khuẩn là rất quan trọng. Có rất nhiều
khoá phân loại Streptomyces khác nhau: phân loại theo Krasillkow, Waksman,
Gauze, Shirling & Gottlieb, ngoài ra còn có thể phân loại theo kiểu gen. Hội
Khoa Công Nghệ Sinh Học

Lớp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

ngh "Vi sinh vt th gii ln X" (c t chc ti Mexico vo nm 1970) chn
khoỏ phõn loi ca E.B.Shirling & Gottlieb lm khoỏ phõn loi chớnh phõn
loi chi Streptomyces v t tờn quc t l International Streptomyces Project
(ISP)
Khoỏ phõn loi da vo cỏc c im:
- c im hỡnh thỏi hc ca x khun :
+ Mu sc ca khun ty c cht, khun ty khí sinh,
+ Hỡnh dng chui bo t,
+ B mt bo t.
- c im sinh lớ hc:
+ Kh nng to sc t ho tan,
+ Kh nng to sc t melanoid,
+ Kh nng s dng cỏc ngun ng ca x khun.
1.2.4 Kh nng sinh tổng hp khỏng sinh ca Streptomyces

Mt s khỏ ln khỏng sinh do các loi Streptomyces sinh tng hp, rất đa

dạng, có trong hầu hết các nhóm phân loại kháng sinh.
1.3 CI TO GING VI SINH VT [1][5][8][10][11][15]
1.3.1.Mc ớch

Trong thực tế không thể phân lập đợc từ tự nhiên một chủng VSV có khả
năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lợng đủ để thỏa mãn yêu cầu
của sản xuất công nghiệp. Các VSV phân lập từ cơ chất tự nhiên thờng có hoạt
tính thấp đồng thời trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của chúng thờng giảm
dần. Vì vậy việc cải tạo giống VSV bằng nhiều biện pháp khác nhau nhằm thu
đợc những chủng có hoạt tính cao, ổn định là một trong những điều kiện quan
trọng và cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trớc khi đa ra công nghiệp hóa.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

1.3.2.Phân lập giống xạ khuẩn

Ngời ta thờng lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ruộng, bùn, nớc cống để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh. Từ các mẫu trên đem phân lập
khiết những xạ khuẩn sinh kháng sinh bằng các phơng pháp đặc trng và trên các
môi trờng chọn lọc.
Các phơng pháp phân lập giống xạ khuẩn: phơng pháp cấy dịch chiết trên
bề mặt thạch, phơng pháp cấy đất trực tiếp trên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV
kiểm định, phơng pháp làm giàu đất, phơng pháp thêm kháng sinh vào môi trờng phân lập, phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung th.
1.3.3. Các phơng pháp cải tạo giống

A. Phơng pháp chọn lọc ngẫu nhiên:
Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấy
những dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất
hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh.
B.Đột biến nhân tạo
Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột
biến (lý, hóa, sinh học). Các tác nhân này khi sử dụng với liều lợng thích hợp
sẽ giết chết hầu hết các VSV, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ở NST,
gây ra đột biến gen liên quan đến cấu trúc gen làm thay đổi 1 hay nhiều
nucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm. Đây là loại đột biến có ý
nghĩa trong công nghiệp kháng sinh, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫn
đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hay tăng cờng.
*ánh sáng UV khả năng đâm xuyên kém nhng với những tế bào VSV có kích
thớc nhỏ (0,3-3 m) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy đợc dùng phố
biến trong đột biến cải tạo giống.
*Cơ chế: Tia UV tác dụng lên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gây
dime hóa thymin (do làm đứt các liên kết hyđro trong mạch kép ADN của tế
bào VSV). Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C 5 và C6. Hậu
quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymeraza dễ lắp 1 nucleotit không chính
xác vào vị trí trên. Đồng thời trên sợi AND cũng xuất hiện một dimepyrimidin
khác gọi là quang sản phẩm 6-4. ở đây C6 của 5 (thymin hoặc cytozin) đợc liên
kết với C4 của 3 (thờng là Cytozin). Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu
của đột biến gây nên bởi ánh sáng UV.
*Các yếu tố ảnh hởng đến hiệu quả gây chết vầ tần số phát sinh đột biến:

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02

Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

-Liều lợng chiếu: Đợc đặc trng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu, khoảng
cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Thực nghiệm cho thấy những đột biến dơng thờng xuất hiện ở những liều lợng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1-1%, còn đột
biến âm thờng xuất hiện ở liều lợng chiếu cao hơn.
-ánh sáng thờng: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánh
sáng thờng (bớc sóng =320-480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50-80% tế bào đợc phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tợng này gọi là quang phục
hoạt.
Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trờng nuôi cấy, trạng thái sinh lí
của vi sinh vật cũng ảnh hởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV.
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn.
Các giống vi sinh vật rất rễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo
quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng không chỉ ở các trung tâm giữ giống
quốc gia mà ngay cả ở phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết.
Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ
thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di
truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
Có rất nhiều phơng pháp giữ giống VSV khác nhau. Tùy vào loại VSV để
chúng ta chọn phơng pháp giữ giống cho phù hợp. Đối với giữ giống xạ khuẩn
trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phơng pháp giữ giống trên môi trờng
thạch nghiêng để trong tủ lạnh 20C.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02

Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

1.4. Dinh dỡng và môi trờng nuôi cấy [5]
Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môi trờng xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhng vì hấp thu các chất dinh dỡng và
thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cờng độ trao đổi chất của
chúng là rất lớn. Các chất dinh dỡng qua màng vào tế bào và đợc chuyển hóa
thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hóa
và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trởng, đồng thời tạo ra các sản
phẩm trao đổi chất.
Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV
dị dỡng. Để phát triển VSV cần một lợng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N, P
và một trong những nguyên tố vi lợng là Mn, Mo, Zn,
Cu Môi trờng dinh
dỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trởng và tạo thành sản
phẩm của VSV. Thông thờng các môi trờng nuôi cấy sử dụng nớc máy thì
không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lợng vì các chất này đã có đủ trong
các cơ chất dinh dỡng ở dạng tạp chất. Trong quá trình lên men ngời ta có thể
thêm một số nguyên tố vi lợng đặc biệt hoặc tiền chất là chất đặc hiệu cho sản
phẩm tạo thành nh tiền chất axít phenoxyacetic trong quá trình lên men sản
xuất penicillin V. ở đây cũng cần lu ý, một môi trờng nuôi cấy thuận lợi cho sự
phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trờng đảm bảo cho sản xuất
sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Môi trờng lên men tốt nhất phải là môi trờng
đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn và chi phí
thấp với chủng VSV cho trớc.
Thành phần môi trờng và chế độ tối u hóa đợc xác định theo hai cách: tối
u hóa kinh điển và sử dụng phơng pháp toán học quy hoạch thực nghiệm.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2][5][8]
1.5.1. Bản chất của quá trình lên men

Lên men thực chất là phản ứng ôxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác
của các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lợng và tạo ra
các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men.
1.5.2. Giống vi sinh vật

Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật chỉ là công cụ tác động và điều
khiển lên quá trình sinh học còn giống vẫn là khâu quan trọng, quyết định giá
trị kinh tế của quá trình sản xuất. Giống VSV dùng trong quá trình lên men phải
là các tế bào sinh dỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng
hóa vật chất cao nhất. Do đó trớc khi lên men phải có giai đoạn tạo giống.
Giống VSV đợc tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau, trên máy lắc tròn
hoặc bình nón, rồi đến bình giống.
1.5.3. Các phơng pháp lên men

* Phơng pháp lên men bề mặt:
Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trờng rắn,
đặc hay lỏng. VSV hấp thụ các chất dinh dỡng của môi trờng và sử dụng ôxi
không khí để hô hấp trên bề mặt môi trờng dinh dỡng. Vì vậy yêu cầu của công
nghệ lên men bề mặt là bề mặt môi trờng phải đủ rộng, lớp môi trờng không

quá sâu (5-10cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trờng khoảng 60% (có trờng
hợp 90- 100%) để tránh khô bề mặt môi trờng.
Lên men bề mặt có u điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu t ban đầu thấp.
Nhng có nhợc điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thờng thấp, khó
cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp kháng
sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong các
phòng thí nghiệm để chọn giống.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

* Phơng pháp lên men chìm:
Phơng pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong
không gian 3 chiều của môi trờng lỏng
Trớc khi lên men phải có giai đoạn tạo giống
- Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),
- Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,
- Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m3.
Tỷ lệ giống trong môi trờng là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy mô
của bình lên men.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi trờng: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trờng, các sản phẩm trao
đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trờng. Để đảm bảo những điều kiện tối u cho
sự phát triển của VSV trong quá trình lên men ngời ta đã đa ra một số biện pháp
nh: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều chỉnh pH hay

dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men phân tích để
đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên men .
- u điểm của phơng pháp lên men chìm là:
+ Sử dụng môi trờng dinh dỡng tối u, đáp ứng đợc nhu cầu sinh lý của
VSV,
+ Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao,
+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít
nhân công.
- Nhợc điểm:
Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện
vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu t lớn.
Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính:
- Lên men gián đoạn (lên men mẻ):
Quá trình lên men gián đoạn đợc xem nh một hệ thống kín. Trong suốt
thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trờng lên men,
trừ việc cung cấp ôxi (dới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điều
chỉnh pH. Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềm
tàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3).

lnx
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc
Pha dừng

Pha log

Pha suy tàn

Pha
tiềm
tàng
t(h)
Hình 3: Đờng cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT
lỏng.Với:
x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men
t: thời gian lên men.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trởng của VSV hoặc khi
việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang
lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ sung:
Lên men có bổ sung là biến tớng phát triển của lên men mẻ đống kín.
Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất
nitơ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu lên
men các thành phần đó đợc đa vào với một nồng độ thấp và đợc bổ sung vào hệ
thống trong quá trình lên men.
- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trờng dinh dỡng đợc bổ sung
liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men.
Quá trình này xem nh một hệ mở.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi
trờng dinh dỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định
kỳ sau những khoảng thời gian xác định.
1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7]

Trong hầu hết các trờng hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một lợng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l). Kháng sinh là sản phẩm trao
đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm trong
sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ: penixilin,
streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài. Vì vậy phải chiết tách để lấy
kháng sinh. Việc lựa chọn phơng pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh.
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

Một số phơng pháp tách chiết hay đợc sử dụng:
- Phơng pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,
- Phơng pháp kết tủa,
- Phơng pháp dùng nhựa trao đổi ion.
Dù lựa chọn phơng pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu đợc một
sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất kháng
sinh thờng áp dụng một số phơng pháp chiết tách và tinh chế nh: lọc, chiết, hấp
thụ và sắc ký.
1.6.1. Chiết xuất

* Định nghĩa: Chiết là phơng pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp)
không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên
cứu.
* Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan
với nhau.
* Các phơng pháp chiết lỏng lỏng:

- Chiết đơn (chiết 1 lần): Thờng cho hiệu suất thấp nhng đơn giản, tốn ít
thời gian.
- Chiết lặp (chiết nhiều lần): Hiệu suất chiết cao tuy nhiên tốn thời gian
và công sức.
- Chiết ngợc dòng cho kết quả tốt hơn.
1.6.2. Tách sản phẩm

* Định nghĩa: Là một nhóm các phơng pháp hóa học, vật lý và hóa lý
nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp
đơn giản tách riêng từng chất.
* Các phơng pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay đợc dùng:
- Phơng pháp chia cắt pha: Là phơng pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất (một
pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha).
- Phơng pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phơng pháp nh là:
chiết, thẩm thấu, các phơng pháp sắc ký.
* Sắc ký:
Là một nhóm các phơng pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của
hỗn hợp. Sự tách sắc kí đợc dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác
nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một
pha động.
Các phơng pháp sắc ký:
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
Nguyên tắc: Là phơng pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ
(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở
đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ
tùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn
chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân
cực. Chất phân cực ta chọn ngợc lại.
- Sắc ký trao đổi ion:
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit.
Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi
anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lợng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Nguyên tắc: Là phơng pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành
tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10
mm) đợc nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
* Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trong
chân không trớc khi kết tinh.
* Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thờng
giảm theo nhiệt độ.
* Sấy khô: Có nhiều phơng pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ
thoáng khí hoặc hút.
* Nghiền vỡ tế bào VSV: Trờng hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất
nội bào, để thu đợc kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng phơng pháp
vật lý, hóa học hoặc sinh học.
1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13]
[16][17].

1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn

Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit đợc STH từ
Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng
ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao
chép của phân tử HIV trong tiến trình trởng thành.
Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh đợc TMC-25 có cấu trúc giống hệt của
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Lên men STH TMC-25 đợc
tiến hành trên máy lắc ở 270C trong 5 ngày.
Dịch lên men thu đợc lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol,
dịch chiết đợc tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủa
thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex
LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu đợc TMC-25 dới dạng
bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối sau
quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu đợc 24,5mg TMC-25.
1.7.2. Tinh chế và đặc trng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ
Streptomyces albidoflavus.
Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin.
Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trờng chứa thịt- da có thể
sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào. Dịch lên men chủng Streptomyces
albidoflavus đợc ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó đợc lọc qua
màng lọc có kích thớc 0,45àm( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi đợc cô đặc

10 lần bằng máy cất đặc chủng. Khi so sánh độ nhạy để ức chế enzym, các đặc
trng cơ chất với Streptomyces griseus proteinaza B (SGPB) đã cho thấy đây là
một enzym mới đợc đặt tên là SAKaza, khá tơng đồng với SGPB.
1.7.3. Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung th vú từ Streptomyces
hygroscopicus
Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã đợc sự thu hút
bởi những đặc tính dợc lý học của nó nh: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế
enzym sao mã ngợc, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung th với
nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCI.
Đặc tính kháng ung th của geldanamycin do ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt
sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung th. Các nghiên cứu cũng cho thấy sử
dụng geldanamycin để điều trị ung th sẽ tăng tính hiệu quả của phơng pháp điều
trị đồng thời, ví dụ: xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong giai đoạn 2
giám sát lâm sàng.
Gendanamycin đợc sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus
var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-Epoxy-8-demethyl
Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

geldanamycin, đợc tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
Streptomyces hygroscopicus var.geldanus đợc lên men trên môi trờng
YPD, pH đợc điều chỉnh ở 6,5 bằng H2SO4 2,5N hoặc NaOH 2,5N, cấp khí
bằng hỗn hợp khí chứa oxy hoà tan là 30%.

Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửa
giải là MeOH.
Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng
sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay đợc sinh tổng
hợp từ Streptomyces sp.
1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ
Streptomyces sp.
Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồm
tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ
Streptomyces sp. USF 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp
tetrapetalone A. HLO (Human Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là
những enzym xúc tác đầu tiên tơng ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh
ra một loạt các chất gây bệnh cho ngời nh leukotrien, lipoxin, prostaglandin.
Nghiên cứu đợc tiến hành trên Lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean
Lipoxygenase)
Streptomyces sp. USF 4727 đợc nuôi cấy trong môi trờng thích hợp,
dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C đợc tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa
giải bằng MeOH và Aceton đợc gộp lại và làm bốc hơi dới áp suất giảm, sau đó
tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan:
ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4).
Tetrapetalone B đợc tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó
sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH 20, dung môi rửa giả là MeOH,
tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu đợc 10mg bột từ 7,2l môi trờng
Tetrapetalone A có IC50 là 190 ( M)

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02

Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

Phần 2
Nguyên liệu và phơng pháp
2.1.Nguyên liệu

2.1.1.Giống vi sinh vật
*Chủng xạ khuẩn:
Giống xạ khuẩn Streptomyces 40.16 phân lập và tuyển chọn có khả năng
sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định, do
phòng thí nghiệm Vi sinh Kháng sinh bộ môn Vi sinh và Sinh học trờng Đại
học Dợc Hà Nội cung cấp.
*Chủng vi sinh vật kiểm định:
Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh và sinh học trờng Đại học Dợc
Hà Nội cung cấp:
-Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922 (E.coli)
Proteus mirabilis BV 108 (P.mirabilis)
Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri)
Salmonella typhi DT220 (S.typhi)
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.aeruginosa)
-Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus ATCC1128 (S.aureus)
Bacillus pumilus subtilis ATCC 10241 (B.pumilus)
Bacillus subtilis ATCC 6633 (B.subtilis)
Bacillus creus ATCC 9946 (B.creus)
Sarcina lutea ATCC 9341 (S.lutea)
-Các loại nấm mốc: Mốc đen 1, Mốc xanh 1, Cadida, Asp.niger

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

2.1.2.Các môi trờng nuôi cấy
*Môi trờng phân lập:
Chủng xạ khuẩn 40.16 đợc phân lập trên môi trờng 1 (MT1): Tinh bột
khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch
1,8g; Nớc vừa đủ 100ml.
*Môi trờng nuôi cấy và khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh:
+Môi trờng 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4
0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nớc vừa đủ 100ml; pH=6,8-7,2.
+Môi trờng 2 (MT2): Tinh bột 2g; KCl 0,05g; NaNO 3 0,2g; K2HPO4
0,1g; MgSO4,7H2O 0,01g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ 100ml.
+Môi trờng3 (MT3): Lactoza 3g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; NH4NO3
0,2g; MgSO4,7H2O 0,01g; Na2SO4 0,05g; Cao ngô 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,07,2; Nớc vừa đủ 100ml.
+Môi trờng 4 (MT4): Glucoza 2g; Cao ngô 0,5g; NH4NO3 0,2g; CaCO3
0,4g; K2HPO4 0,5g; MgSO4,7H2O 0,15g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ
100ml.
+Môi trờng 5 (MT5): Bột đậu tơng 1g; Cao thịt 2g; CaCO3 0,2g;
(NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ 100ml.
+Môi trờng 6 (MT6): Bột ngô 2g; CaCO3 0,2g; NaCl 0,1g; CoCl2,H2O
0,002g; K2HPO4 0,05g; Bột đậu tơng 1,5g; Cao nấm men 0,5g; Thạch 1,8g;
pH=7,0-7,2; Nớc vừa đủ 100ml.

+Môi trờng 7 (MT7): Sacaroza 3g; Bột đậu tơng 1g; CaCO3 0,2g;
CoCl2,H2O 0,002g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nớc
vừa đủ 100ml.
*Môi trờng lên men là các môi trờng trên ở dạng dung dịch (không có
thạch), ví dụ MT1dd: Tinh bột khoai tây 2g; K 2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g;
KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Nớc vừa đủ 100ml

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02


Khoỏ lun tt nghip

Phm Th Ngc

*Các môi trờng sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định
Các môi trờng sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định đợc giới thiệu tại bảng
sau:
Bảng các môi trờng kiểm định
Thành phần
Môi trờng

NaCl
(%)

Cao
Pepton Glucoza Thạch
thịt (%) (%)
(%)

(%)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

-

-

Thạch thờng

0,5

0,3

0,5

-

1,8

Sabouraud lỏng

1

2

-

Sabouraud đặc

1

2

1,8

pH

7,0-7,4
6,0-6,5

*Các môi trờng phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trờng ISP1 đến ISP9):
Dung dịch muối vi lợng của ISP: FeSO4,7H2O 0,01g; MnCl2,4 H2O 0,1g;
ZnSO4, 7H2O 0,1g; nớc cất vừa đủ 1000ml; pH=7,0-7,2.
-ISP1: Tryptone 5,0g; cao nấm men 3,0g; nớc cất 1000ml; pH=7,0-7,2 trớc khử trùng.
-ISP2: Cao nấm men 40g; dịch chiết Malt 10,0g; glucoza 4,0g; nớc cất
1000ml; pH=7,3; Thạch 20g.
-ISP3: Bột yến mạch 20,0g; thạch 18,0g; dung dịch muối vi lợng 1,0ml;
nớc cất 1000ml; pH=7,0-7,4.
IPS4: Tinh bột 10,0g; K2HPO4 1,0g; MgSO4,7H2O 1,0g; NaCl 1,0g;
(NH4)2SO4 2,0g; CaCO3 2,0g; dung dịch muối vi lợng 1,0ml; thạch 20,0g; nớc
cất 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP5: L-asparagin 1,0g; glyxerin 10,0g; K2HPO4 1,0g; dung dịch muối vi
lợng 1,0ml; thạch 20g; nớc cất 1000ml; pH=7,0-7,4.dung dịch muối vi lợng

1,0ml; thạch 20,0g; nớc cất 1000ml; pH=7,0-7,4.

Khoa Cụng Ngh Sinh Hc

Lp 02-02