Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

Header Page 1 of 89.

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
-----------------*-------------------

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR
CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2014

Footer Page 1 of 89.


Header Page 2 of 89.

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
-----------------*-------------------

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR
CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012
Chuyên ngành: Vi sinh Y học
Mã số

: 62.72.01.15

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Đặng Đức Anh
2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai

HÀ NỘI – 2014

Footer Page 2 of 89.


Header Page 3 of 89.

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.

NGHIÊN CỨU SINH

Hoàng Vũ Mai Phương

Footer Page 3 of 89.


Header Page 4 of 89.

iv

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:
 Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
 Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung Ương.
Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện
cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và
lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi
lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp
đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những
kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ

Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác
tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã
nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức
khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên
của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu.
Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết
lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành
quả ngày hôm nay.

Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013
HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
Footer Page 4 of 89.


Header Page 5 of 89.

v
MỤC LỤC

Trang phụ bìa.................................................................................................... i
Lời cam đoan..................................................................................................... ii
Lời cảm ơn......................................................................................................... iii
Mục lục .............................................................................................................. iv
Chữ viết tắt ........................................................................................................ vii
Danh mục bảng ................................................................................................. viii
Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ......................................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................... 1
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN............................................................................ 4

1.1. Vi rút cúm A ............................................................................................... 4
1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A................................................. 4
1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A.............................................................. 11
1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A ...................... 13
1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A ............................... 15
1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm............................................................. 16
1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A ......................................................................... 17
1.2. Phòng và điều trị cúm A ............................................................................ 18
1.2.1. Văc xin phòng cúm ................................................................................... 18
1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A ....................................................................... 20
1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới ....................................................................... 23
1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút ............ 25
1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine ..................... 25
1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir...................... 26
1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A...... 27
Footer Page 5 of 89.


Header Page 6 of 89.

vi

1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc ................................................. 27
1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự
thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm ........................................................... 28
1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của
neuraminidase ..................................................................................................... 32
1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm........................................................... 34
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 37

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 37
2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm ................................................................. 38
2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................... 38
2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm .................................................................................. 42
2.4. Phân tích số liệu.......................................................................................... 51
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ............................................................................... 53
3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 ............................ 53
3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A .......................... 54
3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A ....................................... 60
3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng
thuốc oseltamivir .............................................................................................. 65
3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam,
2001-2012 .......................................................................................................... 69
3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ
nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn
nghiên cứu .......................................................................................................... 72
Footer Page 6 of 89.


Header Page 7 of 89.

vii

CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN............................................................................. 86
4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu .......... 86
4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông
qua giá trị ức chế 50% (IC50)............................................................................... 88
4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc
oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam ..................... 94

4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến
và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. ...................................................... 98
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 101
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Footer Page 7 of 89.


Header Page 8 of 89.

viii

CHỮ VIẾT TẮT

ABI
APHL

Applied Biosystems
Association of Public Health Laboratories
(Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng)

ATSH

An Toàn Sinh Học

DNA

Deoxiribonucleic Acid
Global Influenza Surveillance and Response System

GISRS

(Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu)

IC50

Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút)

IQR

Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị)
International Society for Influenza and other Respiratory

ISIRV-AVG

Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về
cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm
nghiên cứu thuốc kháng vi rút)

Kb

Kilobase

NAI

Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase)

NIID

National Institute of Infectious Diseases - Japan
(Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản)

PCR

Polymerase Chain Reaction

pdm

Pandemic

PTN

Phòng Thí Nghiệm

RNA

Ribonucleic Acid

RT-PCR

Reverse transcription-polymerase chain reaction

SOP

Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn)

TCYTTG

Tổ chức Y tế Thế giới

US-CDC
WHO

Footer Page 8 of 89.

United States- Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ)
World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)


Header Page 9 of 89.

ix
DANH MỤC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1.

Các phân đoạn gen của vi rút cúm A ............................................................

6

3.1.

Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu .........
53

3.2.

Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu
và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn ................................ 56

3.3.

Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và
2009 .............................................................................................................
60

3.4.

Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm
2009 và 2011 ................................................................................................
61

3.5.

Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 ...........................
62

3.6.

Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 ................................
62

3.7.

Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với
oseltamivir................................................................................................64

3.8.

Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm
đột biến ........................................................................................................
70

3.9.

Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu
dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen)..........
71

Footer Page 9 of 89.


Header Page 10 of 89.

x
DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình

Tên hình

Trang

1.1.

Cấu trúc vi rút cúm .......................................................................................
4

1.2.

Hình ảnh vi rút cúm ......................................................................................
4

1.3.

Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm ...........
10

1.4.

Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm ....................................................
10

1.5.

Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút ...........
12

1.6.

Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine ........................
21

1.7.

Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir ..........................................................
22

1.8.

Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase
trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào .............................................
23

2.1.

Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen ................................................
50

3.1.

Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1.............
66

3.2.

Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm
A/H1N1pdm09 .............................................................................................

67

3.3.

Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1..............
68

3.4.

Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1..............
69

3.5.

Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................
74

3.6.

Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 –
nhóm 2, 2001-2009 .......................................................................................
75

3.7.

Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................
76

3.8.

Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm
2, 2001-2009 ................................................................................................
77

3.9.

Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................79

3.10.

Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................80

3.11.

Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 .................................................
83

Footer Page 10 of 89.


Header Page 11 of 89.

xi

3.12.

Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 ................................84

3.13.

Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 ...............................
84

Sơ đồ
2.1.
2.2.

Tên sơ đồ

Trang

Quá trình phân lập vi rút cúm ................................................................ 43
Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm ..........
45

Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

3.1.

Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 .................
55

3.2.

Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên
cứu ...............................................................................................................

57

3.3.

Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong
nghiên cứu ................................................................................................58

3.4.

Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên
cứu ...............................................................................................................
58

3.5.

Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên
cứu ...............................................................................................................
59

4.1.

Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 ........................................
86

Footer Page 11 of 89.


Header Page 12 of 89.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn
đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở
Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi
khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ
dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ
dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998,
dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh
cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá
trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa
Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên
21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc
biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao.
Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là
tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu
hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch
cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải
có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn
dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin
sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split
vaccine)…). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine,
oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút
cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút
có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ
quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể
ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả
năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm
kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh
nhân và xã hội [28, 81, 90, 121].

Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn
cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan
Footer Page 12 of 89.


Header Page 13 of 89.

2

truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như
mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN)
trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan.... Các nghiên cứu tập
trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ
hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng
thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các
nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1
lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến
2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009)
[27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với
amantadine.
Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên
chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại
học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37].
Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp
nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm
2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ
hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có
nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian
của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc.
Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành,

tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một
nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại
thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên
cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt
Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu:
-

Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi
rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam.

-

Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với
oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50).

Footer Page 13 of 89.


Header Page 14 of 89.

-

3

Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy
cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu
vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.

Footer Page 14 of 89.

Header Page 15 of 89.

4

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN
1.1. Vi rút cúm A
1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A
Cấu tạo chung
Vi

rút

cúm

thuộc

họ

Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B
và C, trong đó típ A và B thường
gây thành dịch, típ C gây bệnh
nhẹ và không lan thành dịch. Hệ
gen của vi rút cúm A là Axit
Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia
8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein.
Hình 1.1. Cấu trúc vi rút cúm
Nguồn: />
Về

mặt

cấu

trúc,

nucleocapsid được bao bọc bởi
màng protein nền (M1), phía ngoài

màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là
lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng
sinh chất của tế bào chủ. Protein M2
đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài,
tạo thành các kênh ion, làm cho pH
trong endosome thay đổi, có vai trò
quan trọng trong việc hình thành hạt

Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm

vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại

Nguồn: www.nature.com

glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).
Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1
và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid
bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là
neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân
gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp

Footer Page 15 of 89.


Header Page 16 of 89.

5

ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2
(polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein).
Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại
trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA
và các protein không cấu trúc NS (non structure).
Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A
Hệ gen của vi rút cúm A
Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút
cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1). Đoạn RNA 1, 3, 4, 5
và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân
đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13
nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3'
(3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay
cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn
tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử
phân tích trình tự gen của vi rút.
Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút
Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã
hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và
khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng
tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme
phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2,
kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác

định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm
nhiễm.

Footer Page 16 of 89.


Header Page 17 of 89.

6

Bảng 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A
Đoạn
RNA

Chiều dài
đoạn gen
(Nucleotide)

Protein
được mã
hóa

Chiều dài protein
được mã hóa
(Axit amin)

Chức năng

1

2341

PB2

759

Polymerase khởi đầu phiên mã

PB1

757

Kéo dài phiên mã, hoạt hóa
enzyme nội bào

PB1-F2

87

Thúc đẩy quá trình chết của tế
bào chủ

2

2341

3

2233

PA

716

Kéo dài phiên mã

4

1778

HA

550

Ngưng kết hồng cầu, bám gắn
xâm nhập vào tế bào chủ

5

1565

NP

498

Bám gắn với RNA, điều khiển
quá trình nhân lên của vi rút.

6

1413

NA

454

Giải phóng vi rút khỏi tế bảo
chủ

M1

252

Protein nền: Thành phần chính
của vi rút.

M2

97

Kênh ion, cởi áo và lắp ráp
thành phần vi rút

NS1

230

Protein đối kháng interferon,
điều khiển dấu ấn của vi rút
trên tế bào chủ

NS2

121

Chuyển RNA vi rút từ nhân ra
tế bào chất (trong tế bào chủ)

7

8

Footer Page 17 of 89.

1027

890


Header Page 18 of 89.

7

Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit
sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có
mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic. Ngoài ra, HA gắn vào
thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng
cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118]. Năm vị trí
quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác
với kháng thể của vật chủ. Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng

nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc
tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút.
Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme,
neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được
phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho
quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề
mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. Việc loại
bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự
ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo
vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng
đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của
neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết
của tế bào chủ. Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm
trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn
tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động
của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm
nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122].
Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt
heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định
phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại
hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi

Footer Page 18 of 89.


Header Page 19 of 89.

8

[105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1

đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9).
Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi
rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]:
 Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8
 Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9.
Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm
ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có
thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai.
Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải
phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác
quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể
HA. Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị
trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1
tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V,
Q136K, R292K và N294S.
Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao,
mã hóa cho hai protein M1 và M2. Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26
đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 2651 và từ 740-1007 [19, 65]. Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp
vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của
vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút,
tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi. M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương
tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh
ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết
protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào
trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57].

Footer Page 19 of 89.


Header Page 20 of 89.

9

Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này. Tuy
nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion
với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin
chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và
G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang
Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52].

Hiện tượng kháng

amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng
cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen
M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á
Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53].
Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các
phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase. Phức
hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích
hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1.3 và hình 1.4). Trong quá
trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có
liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia
cầm H5N1. Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút
cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ
mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37oC, khi
mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào
đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33oC) [99]. Đột biến này đã
được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62,
63]. Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy
quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi

rút cúm B và C [65, 122].
Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi
rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo
thành hạt vi rút mới [43]. Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng
hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. Ngoài ra, NP tương tác

Footer Page 20 of 89.


Header Page 21 of 89.

10

với và các protein PB1 và PB2 nhưng không xảy ra với protein PA [85]. Các
enzyme này khi hoạt hóa sẽ tham gia vào quá trình nhân lên và phiên mã RNA của
vi rút cúm đồng thời hoạt động như một nuclease nội bào có liên hệ với
ribonucleoprotein (RNP).

Hình 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm
Nguồn: />
Hình 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm
Nguồn: Paul Digard, Dept. Pathology, University of Cambridge.
Protein không cấu trúc (NS1-NS2): NS1 và NS2 được mã hóa bởi đoạn RNA
số 8. Phần NS1 có chức năng cản trở sự di chuyển của mRNA tế bào từ nhân ra tế
bào chất tạo điều kiện cho RNA của vi rút được phiên mã ở ribosome của tế bào
chủ. Ngoài ra, NS1 còn được cho là tham gia vào ức chế quá trình sản xuất
interferon, chất có khả năng làm giảm sự nhân lên của vi rút cúm, của tế bào chủ.
Phần NS2 của protein không cấu trúc này được tổng hợp sau NS1 và được biết với
chức năng tạo thuận lợi cho việc vận chuyển các RNP mới được tổng hợp từ nhân
ra tế bào chất tăng cường cho quá trình nhân lên của vi rút [43, 118, 122].

Footer Page 21 of 89.


Header Page 22 of 89.

11

1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A
Sự bám dính của vi rút
Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng
heamagglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt
tế bào. Tùy vào tế bào chủ là tế bào biểu mô đường hô hấp của người hay gia cầm
mà vi rút cúm có thể sử dụng phần α2,3 hay α2,6 axit sialic trong protein HA để
bám dính vào thụ cảm thể của tế bào chủ. Ngay khi quá trình bám dính hoàn thành,
vi rút tiếp tục ngay quá trình thâm nhập vào tế bào chủ.
Sự thâm nhập của vi rút
Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào, toàn bộ vi rút được bao bọc
bởi màng tế bào chủ và đưa vào trong tế bào chất của tế bào chủ qua thể thực bào
trong điều kiện pH thấp.
Sự cởi áo của vi rút
Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào,
đồng thời làm tăng cường sự hòa màng từng phần của protein HA trên màng sinh
chất với màng của thể thực bào. Dòng ion từ nội bào tràn vào hạt vi rút dẫn đến sự
mất liên kết giữa các protein của vi rút, khiến cho các RNP vi rút thoát khỏi sự kiểm
soát của vỏ vi rút (vi rút cởi áo). Khi quá trình hòa màng đã hoàn thành, các RNP
được giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ.
Sự tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút
Khác với các vi rút mang RNA sợi đơn âm, RNA của vi rút cúm được tổng hợp
và nhân lên tại nhân tế bào. Các RNP được chuyển vào nhân tế bào, phức hợp

polymerase gắn vào RNA của vi rút, đồng thời cắt mRNA của tế bào chủ bằng hoạt
động của nuclease nội bào. Nuclease nội bào của vi rút cắt đầu 5’ đã được gắn mũ
và metyl hóa của mRNA của tế bào chủ với độ dài khoảng 13 đến 15 ba-zơ và dùng
đoạn này làm mồi để tổng hợp mRNA của vi rút. Enzyme RNA polymerase của vi

Footer Page 22 of 89.


Header Page 23 of 89.

12

rút thực hiện quá trình tổng hợp sợi mRNA bổ sung với RNA đơn âm. Phần intron
(vùng câm) của mRNA vi rút bị cắt bởi các enzyme của tế bào để các protein M1
hay NS1 được tổng hợp mà không cần thêm một sự phân cắt nào. Một số protein
mới được tổng hợp quay trở lại nhân tế bào gắn vào RNA để hình thành RNP. Các
protein còn lại di chuyển tới lưới nội bào và thể Golgi thực hiện quá trình glucosyl
hóa sau đó tiếp tục tới màng tế bào và gắn vào lớp lipid kép của màng. Khi quá
trình gắn của các protein vào màng hoàn chỉnh, các RNP và M1 liên kết các thành
phần lại để tạo nên hạt vi rút. Cuối cùng, hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế
bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của neuraminidase (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút
Nguồn: Nature Review – Drug Discovery

Footer Page 23 of 89.


Header Page 24 of 89.

13

1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A
Những thay đổi nhỏ trên gen
Polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức
năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên (khoảng
một lỗi sai sau mỗi lần nhân lên) và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới.
Những biến đổi này xuất hiện một cách tự nhiên trên các phân đoạn gen của vi rút
cúm nhưng chỉ làm xuất hiện những thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên của vi
rút. Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA thường được quan
tâm hơn bởi những tác động của chúng lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới
trong quy trình gây dịch tại các năm tiếp theo, ước tính khoảng một phần trăm khác
biệt trong số axit amin của HA và NA xuất hiện trong mỗi mùa dịch [6, 43, 70].
Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút
cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút
mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng
năm. Những thay đổi nhỏ xảy ra trên protein bề mặt HA và NA được ghi nhận
thường xuyên nhưng lại hiếm khi với các nucleoprotein [52].
*Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA
Protein HA đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện kháng nguyên của vi rút
cúm. Vùng đầu chỏm của protein HA mang 5 vùng quyết định kháng nguyên, mỗi
sự thay đổi trong những vùng này cũng có ảnh hưởng nhất định đến đặc tính kháng
nguyên của vi rút [51, 94]. Protein HA của vi rút A/H3N2 có sự thay đổi sau mỗi 3
năm. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch chéo giữa vi rút H3N2 lưu hành nổi trội với vi
rút H3N2 lưu hành trước đó vẫn xảy ra [97]. Điều này chứng tỏ sự thay đổi nhỏ trên
phân đoạn gen mã hóa HA chưa tạo ra được sự né tránh miễn dịch toàn bộ của vi rút
cúm cho dù tần suất thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H3N2
diễn ra nhanh (3 năm), những chủng H3N2 mới vẫn chịu ảnh hưởng của miễn dịch
tồn lưu được tạo ra bởi vi rút lưu hành những năm trước đó.

Footer Page 24 of 89.


Header Page 25 of 89.

14

*Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa NA
Cũng giống protein HA, protein NA cũng có những thay đổi nhỏ xảy ra trong
quá trình hoạt động. Các nghiên cứu đã chỉ ra sự thay đổi của axit amin xảy ra trên
bề mặt của protein NA, nơi có các điểm gắn với axit sialic (vị trí 222, 329 và 344
trên gen N2) [92, 118]. Tương tự kháng nguyên bề mặt HA, kháng nguyên NA cũng
có khả năng tạo kháng thể có tính bảo vệ. Các đột biến, thay đổi trên protein NA
(đặc biệt tại khu vực bảo tồn) ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của NA trong quá
trình đáp ứng miễn dịch, vi rút cúm thay đổi để "tránh né" ảnh hưởng của kháng thể
kháng NA, tạo nên một dòng kháng thể mới khác biệt so với dòng kháng thể thu
được trước đây khi chưa xuất hiện đột biến [92]. Tuy nhiên, chỉ miễn dịch thu được
khi tác dụng với phần bảo tồn của NA mới mang tính bảo vệ.
*Những thay đổi nhỏ trên gen M
Tìm hiểu về tiến hóa của gen M cho thấy M1 có sự thay đổi axit amin ở mức
26,4% và M2 có sự thay đổi 48,5% axit amin. Sự khác biệt này là do gen M2 chịu
áp lực chọn lọc của kháng thể bảo vệ cao hơn M1. Tuy nhiên, sự thay đổi nhiều trên
gen M2 chỉ quan sát thấy trên các vi rút cúm người và cúm lợn, hầu như không xảy
ra với các chủng cúm gia cầm. Quan sát gen M1, hầu hết các thay đổi trên gen đều
không dẫn đến thay đổi axit amin, ngoài ra, so sánh tần suất đột biến theo năm trên
M1 và M2 và các gen còn lại của vi rút cho thấy tần suất này thấp hơn tần suất đột
biến của gen còn lại, do vậy có thể coi gen M là gen có tính bảo tồn cao [29].
Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên
Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm so sánh các vi rút phân lập được từ
những vụ dịch những năm 1918, 1947-1956, 1957-1967, 1968 cho thấy những vụ

dịch này cùng có một nguyên nhân là cúm A phân típ H1N1 nhưng có sự biến đổi
lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên (không có hoặc có kết quả phản
ứng chéo với hiệu giá không cao khi thực hiện phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
giữa vi rút mới xuất hiện và các kháng thể tồn lưu tạo ra bởi các phân típ vi rút cũ).

Footer Page 25 of 89.