Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ( panax ginseng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
HD1: TS. NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG
HD2: PGS.TS. PHẠM THỊ THANH HÀ

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG,
PGS.TS. PHẠM THỊ THANH HÀ và ThS. CAO CÔNG KHÁNH đã tận tình
hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và
viết luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO, ban lãnh đạo
Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia và các anh chị, các bạn
công tác tại Viện Kiểm định Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng hiện đại.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là
các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong
quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học Hoá K24,
đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm Hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ
những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ
mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016
Học viên

Nguyễn Thị Hạnh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Abs

Tiếng Anh
Absorbance

ACN

Tiếng Việt
Độ hấp thụ quang
Acetonitril

Association of Official

Hiệp hội cộng đồng phân tích

AOAC

Analytical Community

chính thức

AS

Asymmetry factor

Hệ số đối xứng pic

GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí

High performance liquid
HPLC

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High performance thin layer
HPTLC

chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IR

Infrared

Hồng ngoại

Liquid chromatography tandem
LC-MS/MS mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

PDA

Photodiode Array

Mảng diod quang

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RP-HPLC

Reverse phase-HPLC

Sắc ký lỏng pha đảo

RS

Resolution

Độ phân giải

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

TLC

Thin layer chromatography

Lớp mỏng hiện năng cao
Thực phẩm chức năng

TPCN
tR

Retention time

Thời gian lƣu

USP

United States Pharmacopeia

Dƣợc điển Hoa Kỳ

UV-VIS

Ultraviolet-Visible

Tử ngoại và khả kiến


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Tác dụng đặc trƣng của từng loại ginsenosid .............................................. 7
Bảng 1.2. Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol 9

Bảng 1.3. Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol ............................................ 10
Bảng 1.4. Saponin với aglycon là acid oleanolic
Bảng 3.1. Chƣơng trình gradient 1, 2

26

Bảng 3.2. Chƣơng trình gradient 3, 4

27

11

Bảng 3.3. Danh mục các pha động HPTLC khảo sát ................................................ 29
Bảng 3.4. Kết quả định lƣợng ginsenosid trong mẫu TPCN dạng dung dịch với số lần chiết bằng nbutanol khác nhau.

34

Bảng 3.5. Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của các chất ............................... 37
Bảng 3.6. Độ lặp lại hệ số lƣu giữ Rf

38

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn Rg1, Rg1

41

Bảng 3.8. Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 43
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Rg1, Rb1 trên HPTLC

43

Bảng 3.10. Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1

44

Bảng 3.11. Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1

46

Bảng 3.12 . Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng

47

Bảng 3.13. Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm .................... 48
Bảng 3.14. Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu nƣớc sâm ..................... 49
Bảng 3.15. Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng bột .... 50
Bảng 3.16. Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu viên
nang mềm trên HPTLC ............................................................................................. 51
Bảng 3.17. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng.......................... 52
Bảng 3.18. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm ......................... 53
Bảng 3.19. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu dung dịch .......................... 54

Bảng 3.20. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng trên HPTLC ..... 55
Bảng 3.21. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm trên HPTLC..... 56
Bảng 3.32. Kết quả phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 trong các TPCN ...................... 57



DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 . Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng

8

Hình 1.2. Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol ................................. 9
Hình 1.3. Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol ..................................... 10
Hình 1.4. Cấu trúc Saponin với aglycon là acid oleanolic ........................................ 10
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1 ..................................................... 11
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1 ..................................................... 11
Hình 3.1. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 1 27
Hình 3.2. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 2 27
Hình 3.3. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 3 28
Hình 3.4. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với gradient 4 28
Hình 3.5. Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 1

29

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng MeOH ở nồng độ khác nhau .
................................................................................................................................... 31
Hình 3.7. Sắc đồ sử dụng với dung môi chiết MeOH 70%

31

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng EtOH ở nồng độ khác nhau
32

Hình 3.9. Đồ thị biểu thị hiệu quả chiết mẫu với các dung môi hữu cơ loại lipid .... 33
Hình 3.10. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu ....................................................................... 37
Hình 3.11. Sắc đồ của mẫu trắng .............................................................................. 39
Hình 3.12. Sắc đồ dung dịch mẫu trắng TPCN có thêm ginsenosid Rg1, Rb1 .
Hình 3.13. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1,Rb1 ........................................ 39
Hình 3.14 . Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rg1...................................................... 40
Hình 3.15. Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rb1....................................................... 40
Hình 3.16. Sắc đồ dung dịch thử thêm chuẩn ginsenosid ......................................... 41
Hình 3.17. Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 phân tích trên HPLC .............................. 42
Hình 3.18. Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500pm ................................................ 42
Hình 3.19. Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 trên HPTLC ........................................... 44
Hình 3.20. Sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 phân tích trên HPTLC

45


Hình 3.21. Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha trong dung dịch mẫu trắng ................... 45
Hình 3.22. Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần 5 của viên nang cứng ............................. 47
Hình 3.23. Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềm lần 1.................................... 48
Hình 3.24 . Sắc đồ phân tích độ lặp lại mẫu nƣớc sâm lần 1 .................................... 49
Hình 3.25. So sánh độ lặp lại của sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân
sâm dạng bột ............................................................................................................. 50
Hình 3.26. Sắc đồ phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, RB1 trong mẫu viên
nang mềm trên HPTLC. ............................................................................................ 51
Hình 3.27. Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang cứng lần 1. ...
................................................................................................................................... 52
Hình 3.28. Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang mềm lần 1 ....

................................................................................................................................... 53
Hình 3.29. Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong dung dịch lần 1 ......... 54
Hình 3.30. Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 .............................................. 57
Hình 3.31. Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 ............................................. 57


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN
DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 13
1.1. Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm

13

1.1.1.

Giới thiệu chung về nhân sâm

1.1.2.

Tác dụng đặc trƣng của nhân sâm 14

1.1.3.

Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid

1.1.4.

Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1

13

15

1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích ginsenosid

19

20

1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu

Error! Bookmark not defined.

1.4. Tổng quan về kỹ thuật HPTLC

Error! Bookmark not defined.

1.4.1. Sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not defined.
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Error! Bookmark not defined.
2.1. Mục tiêu nghiên cứuError! Bookmark not defined.
2.2. Nội dung nghiên cứu

Error! Bookmark not defined.

2.3. Đối tƣợng nghiên cứu

Error! Bookmark not defined.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Error! Bookmark not defined.

2.4.1.

Khảo sát các điều kiện HPLC

2.4.2.

Khảo sát các điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPTLC

Error! Bookmark not defined.
Error!

Bookmark not defined.
2.4.3.

Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Error! Bookmark not defined.
8


2.4.4.

Thẩm định quy trình Error! Bookmark not defined.

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Error! Bookmark not defined.

2.6. Nguyên vật liệu, thiết bị

Error! Bookmark not defined.

2.6.1.

Thiết bị và dụng cụ Error! Bookmark not defined.

2.6.2.

Hóa chất, thuốc thử Error! Bookmark not defined.

2.6.3.

Dung dịch chuẩn

Error! Bookmark not defined.

CHƢƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

Error! Bookmark not defined.

3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPLC

Error!

Bookmark not defined.
3.2. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPTLC

Error!

Bookmark not defined.
3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
3.4. Thẩm định phƣơng pháp

Error! Bookmark not defined.

Error! Bookmark not defined.

3.4.1. Tính thích hợp hệ thống Error! Bookmark not defined.
3.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu
3.4.3. Khoảng tuyến tính

Error! Bookmark not defined.

Error! Bookmark not defined.

3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng Error! Bookmark not defined.
3.4.5.

Độ lặp lại của phƣơng pháp

Error! Bookmark not defined.

3.4.6.

Độ thu hồi của phƣơng pháp

Error! Bookmark not defined.

3.4.7.

Kết quả áp dụng phƣơng pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 trong một số

sản phẩm Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN

Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

21

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.
9


Phụ lục 1: Sắc đồ đƣờng chuẩn Error! Bookmark not defined.
Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại

Error! Bookmark not defined.

Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi Error! Bookmark not defined.

10


MỞ ĐẦU
Từ xa xƣa, nhân sâm (tên khoa học là Panax Ginseng) đã đƣợc xem là thảo dƣợc quý
hiếm. Hoạt chất chính tạo nên tác dụng kỳ diệu của nhân sâm là thành phần ginsenosid.

Hợp chất này đƣợc phân thành hai nhóm chính là nhóm Rb1 và nhóm Rg1. Vài năm gần
đây nhiều nhà khoa học hƣớng tới sự quan tâm đặc biệt tới nhân sâm với rất nhiều nghiên
cứu đƣợc công bố. Ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới, nhân sâm đƣợc biết đến không chỉ
là nguồn dinh dƣỡng quý báu mà còn là một vị thuốc vô cùng quan trọng. Theo nghiên
cứu khoa học và sách đông y thì nhân sâm có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời.
Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao. Nguồn nguyên liệu này chủ
yếu đƣợc nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên rất dễ bị giả mạo, sản phẩm nhập về chất
lƣợng không đáp ứng đƣợc chất lƣợng. Vì vậy việc kiểm soát tính đúng và chất lƣợng
nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng. Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lƣợng nguyên
liệu nhân sâm và thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ở nƣớc ta vẫn còn nhiều hạn chế
dẫn tới tình trạng ngƣời dân sử dụng nhầm dƣợc liệu hoặc mua phải dƣợc liệu đã bị chiết
hết hoạt chất, kém chất lƣợng. Điều này không những gây ảnh hƣởng đến sức khỏe của
ngƣời bệnh, quyền lợi ngƣời tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi ngƣời khi sử
dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế và Kinh tế của đất nƣớc.
Thông thƣờng các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân tích hàm ginsenosid Rg1 và Rb1
bao gồm: các phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký
lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký bản mỏng hiệu năng
cao (HPTLC)... ở Việt Nam phƣơng pháp đƣợc sử dụng chủ yếu là phƣơng pháp HPLC .
Phƣơng pháp HPLC đƣợc áp dụng tại viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thức Phẩm
Quốc Gia để định tính và định lƣợng ginsenosid trong thực phẩm chức năng có chứa
nhân sâm. Tuy nhiên chƣa có tiêu chuẩn về việc định lƣợng ban hành ở Việt Nam. Do
vậy việc áp dụng phụ thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm cụ thể. Ngoài ra, phƣơng
pháp HPTLC cho thấy tiềm năng áp dụng để kiểm tra nhanh chất lƣợng của nhân sâm và
các sản phẩm từ sâm. Do vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu với hi vọng xây dựng
một phƣơng pháp nhằm so sánh, kiểm chứng phƣơng pháp phân tích. Xuất phát từ những
yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định một số
11


ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (Panax Ginseng)”.

Mục tiêu nghiên cứu:
 Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 và Rb1) bằng
kỹ thuật HPTLC và HPLC.
 Thẩm định phƣơng pháp đã đã xây dựng theo các tiêu chí của thế giới.
 Áp dụng triển khai phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâm
trên thị trƣờng Hà Nội.

12


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm

1.1.1. Giới thiệu chung về nhân sâm
Bộ phận thƣờng sử dụng là rễ củ đã đƣợc phơi hay sấy khô của Nhân sâm (Panax
ginseng C.A. Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.)
còn có tên gọi khác là họ Ngũ gia bì. Hầu nhƣ tất cả các loài trong họ nhân sâm
(Araliaceae) đều đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền ở nhiều nƣớc Á-Âu; đặc
biệt là ở các nƣớc Đông-Bắc Á. Sâm trồng gọi là viên sâm, sâm mọc hoang gọi là sơn
sâm.
Viên sâm: Sâm trồng, phơi hoặc sấy khô, rễ cái có hình thoi hoặc hình trụ tròn, dài
khoảng 3 - 15 cm, đƣờng kính 1 - 2 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, phần trên hoặc
toàn bộ rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên tục, rải rác và nông.
phần dƣới có 2 - 3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, dài, thƣờng có mấu dạng củ nhỏ không
rõ. Thân rễ (Lô đầu) sát ở đầu rễ, dài 1 - 4 cm, đƣờng kính 0,3 - 1,5 cm, thƣờng cong và
co lại, có rễ phụ (gọi là Đinh) và có vết sẹo thân, tròn, lõm, thƣa (gọi là Lô uyển). Chất
tƣơng đối cứng, mặt bẻ màu trắng hơi vàng, có tinh bột rõ, tầng phát sinh vòng tròn, màu
vàng hơi nâu, vỏ có ống tiết nhựa, dạng điểm, màu vàng nâu và những kẽ nứt dạng xuyên

tâm. Mùi thơm đặc trƣng, vị hơi đắng và ngọt.
Hồng sâm: Hấp, sấy và phơi khô rễ viên sâm thu đƣợc Hồng sâm; Hồng sâm có dạng rễ
cái hình thon hoặc hình trụ, dài khoảng 3 - 15 cm, đƣờng kính 1 - 2 cm, mặt ngoài trong
mờ, màu nâu hơi đỏ, đôi khi có một vài vết đốm màu nâu hơi vàng thẫm, có rãnh dọc,
vân nhăn và các vết sẹo rễ con; phần đầu rễ cái có các vòng tròn gián đoạn, không rõ nét,
phần đuôi rễ cái mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhau và nhiều rễ con cong queo, hoặc
chỉ mang những vết sẹo thân, tròn, lõm (Lô uyển); một số thân rễ mang 1 - 2 rễ phụ, còn
nguyên dạng hoặc đã gẫy (gọi là đinh). Chất cứng và giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa nhƣ
sừng. Mùi thơm đặc trƣng, vị ngọt và hơi đắng.
Sơn sâm: Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô. Dƣợc liệu là rễ cái, dài bằng hoặc
13


ngắn hơn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hoặc hình trụ, dài 2 - 10 cm, mặt ngoài màu
vàng hơi xám, có vân nhăn dọc, đầu trên có các vòng vân ngang, trũng sâu, dày đặc,
thƣờng có 2 rễ nhánh, các rễ con trông rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏ sắp xếp có thứ tự; có mấu
nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu”. Thân rễ mảnh dẻ, nhỏ, dài, bộ phận trên có các vết
sẹo thân, dày đặc, các rễ phụ tƣơng đối dày đặc, trông tựa nhƣ hình hạt táo.
Nhân sâm mọc hoang và đƣợc trồng ở đông bắc Trung quốc, Triều Tiên, Liên xô cũ. Việc
trồng trọt nhân sâm rất công phu, sau 5-6 năm mới thu hoạch. Đất phải tốt. Cây ƣa bóng
râm. Thu hoạch vào mùa xuân và mùa thu, rễ củ đƣợc rửa sạch, phơi nắng nhẹ, hoặc sấy
nhẹ đến khô. Ngƣời ta cho rằng loại mọc hoang có giá trị hơn loại trồng. Hiện nay nƣớc
ta chƣa trồng đƣợc, còn phải nhập nhân sâm của nƣớc ngoài.
Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thành phần khác
nhau, tuy nhiên ginsenosid, chính là thành phần quyết định tác dụng của nhân sâm.
Đây chính là chất có khả năng tạo ra những ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe.
1.1.2. Tác dụng đặc trƣng của nhân sâm
Theo y học cổ truyền nhân sâm có công dụng: Đại bổ nguyên khí, ích huyết, kiện tỳ ích
phế, sinh tân, an thần ích trí. Chủ trị: Khí hƣ muốn thoát, chân tay lạnh, mạch vi, tỳ hƣ, kém
ăn, phế hƣ ho suyễn; tân dịch thƣơng tổn, miệng khát nƣớc, nội nhiệt tiêu khát, đái tháo,

bệnh lâu ngày gầy yếu, tâm hồi hộp, suy tim kiệt sức, hay choáng ngất. Thành phần hoạt chất
của ginsenosid trong nhân sâm có tác dụng đặc trƣng khác nhau đƣợc tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1. Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid
Ginsenosid

Tác dụng đặc trƣng

Ro

Phân giải rƣợu, chống viêm gan và phục hồi hƣ tổn gan.

Rb1

Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ƣơng làm

14


dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan.
Rb2

Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đƣờng, phòng chống xơ cứng
gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan.

Rc

Làm dịu cơn đau, tăng tốc độ tổng hợp protein.
Ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ, ngăn cản hoặc hạn
chế sự phát triển của ung thƣ vú

Rd

Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thƣợng thận

Re

Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy.

Rf

Làm dịu cơn đau trong các tế bào não

Rg1

Khả năng gây hƣng phấn thần kinh trung ƣơng, chống và phục
hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt
protease.

Rg2

Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng
khả năng lƣu thông máu lên não, kéo dài thời gian sống của tế
bào.

Rh1

Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu.

Rh2

Ức chế các tế bào ƣng thƣ, hạn chế khối u phát triển

1.1.3. Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid
Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen. Khi thuỷ phân các saponin này thu
đƣợc 3 loại sapogenin là: acid oleanolic, 20 (s) protopanaxadiol và 20 (s)
protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc damaran. Các Saponin trong Nhân sâm gọi là
ginsenosid đƣợc phân loại dựa vào cấu trúc của ba sapogenin trên. Saponin còn gọi là
saponosid là một nhóm glycosid gặp rộng rãi trong thực vật, đôi khi trong động vật (Hải
sâm, cá sao). Tuy nhiên Saponin ở Nhân sâm có cấu tạo hoá học khác so với giới thực vật
khác, để phân biệt sự khác biệt này ngƣời ta gọi là Ginsenosid là từ ghép của Nhân sâm
(ginseng) + glicozit (glycosid).
Hầu hết các ginsenosid có cấu trúc dammarane triterpenoid với bộ khung gồm bốn vòng
steroid cố định. Nhiều gốc đƣờng khác nhau (ví dụ nhƣ glucose, rhamnose, xylose và
15


arabinose) gắn ở vị trí C-3, C-6 hoặc C-20. Ginsenosid đƣợc đặt tên là 'Rx', với 'R' là viết
tắt của gốc và 'x' mô tả mức di động của chúng trên các tấm sắc ký lớp mỏng, tính phân
cực giảm từ chỉ số "một" đến "h".Ví dụ, Ra là một hợp chất phân cực ít nhất và Rb phân
cực hơn so với Ra... Độ phân cực của các ginsenosid dẫn đến khả năng phân tách của của
các ginsenosid cũng khác nhau đƣợc minh họa trên hình 1.1

Hình 1.1. Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng

Chất lƣợng và thành phần của ginsenosid trong cây nhân sâm bị ảnh hƣởng bởi các yếu tố
nhƣ: loài, tuổi, bộ phận của cây, phƣơng pháp canh tác, mùa thu hoạch và phƣơng pháp
bảo quản. Tổng hàm lƣợng Saponin trong nhân sâm là tỷ lệ thuận với độ tuổi của nó, đạt
tới mức đỉnh điểm vào khoảng sáu tuổi.
Hợp chất Saponin thƣờng đƣợc cấu tạo từ hai phần:

 Phần đƣờng : glycol, phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose, acid
galactunoic, acid D-glucuronic...
 Phần phi đƣờng : aglycol ( còn gọi là Sapogenin), là phần chính quyết định hoạt
tính của hợp chất Saponin.
Phần aglycol của Saponin có trong nhân sâm đƣợc chia thành ba loại: protopanaxadiol,
protopanaxatriol và oleanane. Trong đó, protopanaxadiol và protopanaxatriol là những
Saponin triterpenoid tetracyclic có cấu trúc dammarane, còn oleanane là Saponin
16


triterpenoide pentacylic. Những hoạt tính sinh học rất đặc biệt của nhân sâm là do những
Saponin có cấu trúc dammarane mang lại. Cấu trúc các Saponin có aglycon là
protopanaxadiol đƣợc minh họa trong hình 1.2, 1.3, 1.4 và bảng 1.2, 1.3, 1.4
21
R2O
OH

20S
12
19
1
3

10

15

8
7

5

27

17

11 18 13
14

30

A

R1O

29

28

Hình 1.2. Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol
Bảng 1.2. Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol
Tên
Ginsenosid-Rb1

R1
G1c2-G1c

R2

G1c6-G1c

Ginsenosid-Rb2
Ginsenosid-Rb3

G1c2-G1c
G1c2-G1c

Glc6-Ara(p)
Glc6-Xyl

Ginsenosid-Rc
Ginsenosid-Rd

G1c2-G1c
G1c2-G1c

Glc6-Ara(f)
Glc

Ginsenosid Rh1
Glc2-Rha
glc = glucose; ara(p) = arabinose trong dạng pyranose;
ara(f)= arabinose trong dạng furanose;

17

Glc

21
R2O
OH

20S
12
19

15

14
9

1

8

10
3

27

17

11 18 13

5

7

30

B

HO

29

28

OR1

Hình 1.3. Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol
Bảng 1.3. Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol
R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol
Tên
R1
R2
Ginsenosid-Re
Glc2-Rha
G1c
2
Ginsenosid-Rf
G1c -G1c
H
Ginsenosid Rgl
Ginsenosid-Rh1

Glc
G1c

Glc
H

Ginsenosid-Rg1

G1c2-G1c

Glc6-Xyl

rha = rhamnose;

Hình 1.4. Saponin với aglycon là acid oleanolic
Bảng 1.4. Saponin với aglycon là acid oleanolic

Tên

R1
18

R2


Ginsenosid R0

Glc A2- Glc

G1c

glc = glucose;

1.1.4. Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1
a. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1
Chất

này

có

tên

theo

IUPAC:

(3β,12β)-20-{[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-

glucopyranosyl]oxy}-12-hydroxydammar-24-en-3-yl

2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-

glucopyranoside. Cấu tạo chi tiết đƣợc biểu diễn trong hình 1.5

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1
- Công thức phân tử: C54H92O23
- Khối lƣợng phân tử: 1109,295g/mol
- Nhiệt độ nóng cháy 197 ~ 1980C
- Độ tan: Dễ tan trong nƣớc (H2O), MeOH (MeOH), alcohol, pyridine, và dimethyl
sulfoxide (DMSO), không tan trong diethyl ether và benzen.
b. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1
Chất này có tên theo IUPAC: (3β,6α,12β)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3,12dihydroxydammar-24-en-6-yl β-D-glucopyranoside. Công thức cấu tạo đƣợc biểu diễn

chi tiết trong hình 1.6

19


Hình 1.6. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1

- Công thức: C42H72O14
- M: 801,013 g/mol.
- Nhiệt độ nóng chảy 194 ~ 1960C
- Độ tan: Dễ tan trong nƣớc (H2O), methanol (MeOH), pyridime. Ít tan trong ethyl
acetat, cloroform. Không tan trong diethyl và benzen.
1.2.

Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích ginsenosid

Ginsenosid là đối tƣợng phân tích có thành phần nền phức tạp. Thông thƣờng, trong
ginsenosid không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau, mà thƣờng
chứa một nhóm các chất có tính chất tƣơng đối giống nhau. Các chất trong cùng một
nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thế hoặc các thành
phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hoá học. Chính vì
vậy, việc sử dụng các phƣơng pháp quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang,…) để phân
tích định lƣợng một thành phần trong dƣợc liệu gặp nhiều khó khăn và hầu nhƣ là không
thể thực hiện đƣợc.
Sắc ký là một trong những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất thông dụng nhất
hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lƣợng hoá học, các phƣơng
pháp sắc ký cho phép định lƣợng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với
quá trình phân tích các mẫu dƣợc liệu. Ngƣời ta có thể định lƣợng một chất hay định
lƣợng đồng thời nhiều chất trong một lần định lƣợng nếu chọn đƣợc điều kiện thích hợp.
Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng dùng là: sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký

điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí bản mỏng hiệu năng cao
20


(HPTLC). Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký bản mỏng hiệu năng
cao (HPTLC) là phƣơng pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên
nói chung và nghiên cứu dƣợc liệu nói riêng. Ƣu điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là
có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so
với sắc ký khí (thƣờng dùng với các đối tƣợng dễ bay hơi). Với pha tĩnh ngày càng đƣợc
hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, ngày nay có
thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt để phân
tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay
hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnh vực dƣợc liệu, HPLC thƣờng
đƣợc sử dụng nhất trong định lƣợng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch
chiết dƣợc liệu bằng việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân
tích. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có nhiều tác giả đã sử dụng phƣơng pháp
HPLC để phân tích ginsenosid Rg1 và Rb1 trong dịch sinh học [17][30][34].
Năm 1996, Trong một nghiên cứu William A.Court và cộng sự [17] đã nghiên
cứu xác định đồng thời (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Ro, Rg1) ginsenosids trong Panax
quinquefolium bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC. Thể tích bơm
mẫu 5 µl, cột Waters Symmetry C18 (150mm×3,9 mm, 5µm), tiền cột C18 tƣơng ứng .
Tốc độ dòng 1,15 ml/phút và bƣớc sóng hấp thụ 203 nm. Pha động là dung dịch
đệm phốt phát (A), dung dịch acetonitrile (dung dịch B) và H2O (dung dịch C),
Chƣơng trình gradient pha động nhƣ sau: 0-15 phút: 81%-79% A, 19% - 21% B;
15-24,5 phút: 79% - 73,7% A, 21% - 26,3% B; 24,5-29 phút: 73,7% - 73% A, 26,3%
- 27% B; 29-43phút: 73% - 66% A, 27% - 34% B; 43-47 phút, 66 -64%A, 34-36%B;
47-54 phút : 54-57 %A, 36-43% B; 54-55 phút: 57-0%A, 43-85%B, 0-15%C; 55-59
phút 85%B, 15%; 81%A, 19%B. Cách 2: Nhóm tác giả sử dụng vòi phun tự động
1040A, detecter diode array, cột tách carbohydrate cartridge(250 x 4,6mm) và cột
bảo vệ cùng loại. Với cùng bƣớc sóng và thể tích bơm cột nhƣ trên. Tốc độ dòng

1,5ml/phút. Pha động là dung dịch H2O (A) và acetonitril (B). TÀI LIỆU THAM
KHẢO
A - Tiếng Việt
21


1. Trần Tử An (2010), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Bộ Y tế Việt Nam: Thông thƣ số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 “Hƣớng dẫn việc quản lý
các sản phẩm thực phẩm chức năng”.
4. Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Cang, Nguyễn Ngọc Khôi và Phạm Vinh Quang
(2002), “Định tính và định lƣợng các Ginsenosid trong các chế phẩm viên nang
mềm chứa nhân sâm trên thị trƣờng thuốc việt nam”, Y học thành phố Hồ Chí
Minh, 1(6).
5. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các
phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
6. Võ Thị Bạch Huệ (2007), Hóa Phân Tích, Nhà xuất bản giáo dục.
7. Nguyễn Chu Huy, Trịnh Nam Trung, Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Văn Bạch, Đào Văn
Đôn (2014), “Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd
trong viên nang ukata bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí y - dược học quân
sự, (1).
8. Phạm Luận (2000), Giáo trình Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại Học
Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGHN.
9. Phạm Luận (2010), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, khoa Hóa học, Trƣờng
ĐHKHTN Hà Nội.
10. Dƣơng Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá
Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị
Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Công Luận,và Đoàn Trọng Đức
(2010), “Xác định hàm lƣợng saponin và dƣ lƣợng một số chất điều hòa sinh
trƣởng trong callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Công

nghệ Sinh học, 8(2), tr,189-202.
11. Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm,
Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hƣơng "Họ nhân sâm
(Araliaceae juss) nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam",
Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5.
22


12. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh
vật, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật.
13. Trần Quang Trung, Phan Thị Thu Hằng, Nguyễn Văn Bạch (2013), “Xác định hàm
lƣợng Ginsenosid Rb1, Re, Rg1 trong sâm ngọc linh tự nhiên và sinh khối tế bào
sâm ngọc linh bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC”, Tạp
chí Y dược học quân sự, (9).
14. Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lầu, Nguyễn Văn Bạch (2013), “ Định lƣợng
Ginsenosid Rb1, Re, Rg1 bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”, Tạp
chí Y dược học quân sự, (1).
B - Tài liệu tiếng nƣớc ngoài
15. Bonfill M, Casals I, Palazón J, Mallol A and Morales C (2002), "Improved high
performance liquid chromatographic determination of Ginsenosid in Panax
ginseng

based

pharmaceuticals

using

a

diol

column",

Biomedical

Chromatography, 16, pp. 68-72.
16. Chen W, Dang Y, Zhu C (2010), “Simultaneous determination of three major
bioactive saponins of Panax notoginseng using liquid chromatography-tandem
mass spectrometry and a pharmacokinetic study”, Chinese Medicine.
17. Court WA, Hendel HG, and Elmi J (1996), “Reversed-phase high-performance liquid
chromatographic determination of Ginsenosid of Panax quinquefolium”, Journal
of Chromatography A, 755, pp. 11-17.
18. Fuzzati N (2004), “Analysis methods of Ginsenosid”, Journal of Chromatography B,
812, pp.119-133.
19. Guan J, Lai CM and Li SP (2007), “A rapid method for the simultaneous
determination of 11 saponins in Panax notoginseng using ultra performance liquid
chromatography”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44, pp.
996-1000.
20. Jing B (2013), “Simultaneous determination of four active components in Shengmai
injection and its application to the quality control in productive process”, Journal
of Chemical and Pharmaceutical Research, 5(12), pp. 971-974.
23


21. Kim IW, Hong HD, Choi SY, Hwang DH, Her Y, and Kim SK (2011),
“Characterizing a Full Spectrum of Physico-Chemical Properties of Ginsenosid
Rb1 and Rg1 to Be Proposed as Standard Reference Materials”, Journal of
ginseng research, 35(4), pp. 487-496.
22. Kim SN, Ha YM, Shin H, Son SH, Wu SJ, Kim YS (2007), “Simultaneous

quantification of 14 Ginsenosid in Panax ginseng C.A.Meyer (Korean red
ginseng) by HPLC-ELSD and its application to quality control”, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, pp. 164-170.
23. Lai CM, Li SP ,Yu H,Wan JB, Kan KW and Wang YT (2006), “A rapid HPLC–ESIMS/MS for qualitative and quantitative analysis of saponins in “XUESETONG”
injection”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40, pp. 669-678.
24. Laua AJ, Woob SO, Koha HL (2003), “Analysis of saponins in raw and steamed
Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode
array detection”, Journal of Chromatography A, 1011, pp.77-87.
25. Leung KW and Alice Wong AST(2010), "Pharmacology of Ginsenosid: a literature
review", Chinese Medicine, pp. 5-20.
26. Li L, Zhang JL, Sheng YX, Ye G, Guo HZ, Guo DA (2004), “Liquid
chromatographic method for determination of four active saponins from Panax
notoginseng

in

rat

urine

using

solid-phase

extraction”,

Journal

of

Choromatongraphy B, 808, pp. 177-183.
27. Liu S, Cui M, Liu Z, and Song F (2004), “Structural Analysis of Saponins from
Medicinal Herbs Using Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry”,
Journal of the American Society for Mass Spectrometry,15(2), pp. 133- 141.
28. Park SJ, Lim KH, Noh JH, Jeong EJ, Kim YS , Han BC, Lee SH, Moon KS (2013),
“Subacute Oral Toxicity Study of Korean Red Ginseng Extract in Sprague-Dawley
Rats”, Toxicological Research, 29(4), pp. 285- 292.
29. Shi W, Wang Y, Li J, Zhang H, Ding L (2006), “Investigation of ginsenosides in
different parts and ages of Panax ginseng”, Food Chemistry, 102 (2007), pp. 664668.
24


30. Shin Y, Sun C, Zheng Bo, Li Y, Wang Y (2010), “Simultaneous determination of nine
Ginsenosid in functional foods by high performance liquid chromatography with
array detector detection”, Food Chemistry, 123, pp. 1322-1327.
31. Steinmann D, Ganzera M (2011), “Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant
analysis”Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55, pp. 744-757.
32. Vanhaelen-Fastré RJ, Faes ML and Vanhaelen MH (2000), “High-performance thinlayer chromatographic determination of six major Ginsenosid in Panax ginseng”,
Journal of Chromatography A, 868, pp. 269-276.
33. Wan JB, Lai CM, Li SP, Lee YM , Kong LY , Wang YT (2005), “Simultaneous
determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and
pressurized liquid extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 41, pp. 274–279.
34. Wang J, Qiao L, Li S and Yang G (2013), “Protective Effect of Ginsenosid Rb1
Against Lung Injury Induced by Intestinal Ischemia-Reperfusion in Rats”,
Molecules 2013, 18, pp. 1214-1226,
35. Yi JH, Kim MY, Kim YC, Jeong WS, Bae DW, Hur JM and Jun M (2010), “Change
of Ginsenosid Composition in Red Ginseng Processed with Citric Acid”, Food
Sci, Biotechnol, 19(3), pp. 647-654.

25