Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của cà gai leo (solanum hainanensehance) in vitro và khảo sát khả năng chống oxi hóa của cao chiết từ rễ cây

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... v
MỤC LỤC .......................................................................................................................vi
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1
I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................................... 3
I.1.

Giới thiệu cây Cà gai leo. ................................................................................... 3

I.1.1.

Sơ lược về họ Solanaceae ........................................................................... 3

I.1.2.

Vị trí phân loại cây Cà gai leo ..................................................................... 3

I.1.3.

Đặc điểm hình thái cây Cà gai leo ............................................................... 4

I.2.

Hợp chất thứ cấp ................................................................................................. 6

I.2.1.

Giới thiệu ..................................................................................................... 6

I.2.2.

Ứng dụng công nghệ tế bào trong thu nhận hợp chất thứ cấp ..................... 9

I.2.3.

Những yếu tố ảnh hưởng đến tạo hợp chất thứ cấp. .................................. 10

I.2.4.

Alkaloid ..................................................................................................... 12

I.3.

Nuôi cấy mô...................................................................................................... 13

I.3.1.

Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật .......................................... 13

I.3.2.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ..................................... 14

I.3.3.

Mô sẹo........................................................................................................ 16

I.3.4.

Sự phát sinh hình thái ................................................................................ 17

I.4.

Sự kháng ôxi hóa .............................................................................................. 19

I.4.1.

Khái niệm về gốc tự do .............................................................................. 19

I.4.2.

Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể .......................................................... 20

I.4.3.

Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể .......................................................... 20

I.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng thử hoạt tính ức chế gốc
tự do DPPH ................................................................................................................. 21
I.5.1.

Nguyên tắc ................................................................................................. 22
vi


II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ...................................................... 23

II.1. Vật liệu ............................................................................................................. 23
II.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện................................................................. 23
II.1.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 23
II.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 23
II.1.4. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 24
II.1.5. Điều kiện nuôi cấy ..................................................................................... 24
II.1.6. Hoá chất dùng trong nuôi cấy mô .............................................................. 24
II.1.7. Hóa chất khảo sát khả năng kháng oxy hóa ............................................... 24
II.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 25
II.2.1. Tạo rễ bất định cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance ...................... 25
II.2.2. Khảo sát sự tạo rễ bất định từ lá ................................................................ 28
II.2.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cao thô từ rễ cây Cà gai
leo
30
III.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 33

III.1. Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân và lá Cà gai leo in vitro
trong môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA ....................... 33
III.1.1. Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân ....................................... 33
III.1.2. Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá .................................................... 35
III.2. Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân và lá Cà gai leo in vitro
trong môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA ..................... 36
III.2.1. Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân ....................................... 37
III.2.2. Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá .................................................... 39
III.3.

Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ rễ cây Cà gai leo .......... 42

III.4.

Thảo luận ....................................................................................................... 44

IV.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................. 46

IV.1.

Kết luận ......................................................................................................... 46

IV.2.

Đề nghị .......................................................................................................... 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 48
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................i
vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, song song với sự phát triển của đất nước thì một trong những vấn đề
đáng lo ngại chính là tình trạng sức khỏe của con người đã và đang bị đe dọa một
cách nghiêm trọng bởi các vấn nạn về ô nhiễm môi trường hay sự nóng lên của toàn
cầu. Trước mối nguy hại này, các bệnh tật con người ngày càng gia tăng, số ca bệnh
liên quan đến nhóm bệnh truyền nhiễm (như nhiễm trùng đường hô hấp, cúm, viêm
phổi …) tăng lên một cách rõ rệt. Nhằm đảm bảo sức khỏe và điều trị thì nhu cầu sử
dụng thuốc cũng ngày một gia tăng. Tuy nhiên, các loại thuốc hiện nay sử dụng đều
có nguồn gốc tổng hợp bằng các phương pháp hóa học nên ít nhiều cũng mang lại

các tác dụng phụ không mong muốn cho người sử dụng. Đặc biệt, việc tổng hợp hóa
học phải tốn nhiều thời gian, trải qua nhiều công đoạn và nhiều phản ứng tổng hợp
để có một hợp chất có tính dược lý trị bệnh. Do đó, phương pháp tách chiết các dược
liệu có nguồn gốc tự nhiên được nghiên cứu để khắc phục các nhược điểm trên. Thực
vật là một nguồn dược liệu quý có sẵn trong tự nhiên, cung cấp các hợp chất tự nhiên
có hoạt tính sinh học được ứng dụng trong việc sản xuất dược phẩm. Những hợp chất
này được coi là các chất trao đổi thứ cấp và hiện diện với một hàm lượng rất nhỏ
trong cây. Trong tự nhiên, các hợp chất này có vai trò trong việc chống lại các tác
nhân ngoại xâm như vi sinh vật và động vật (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011).
Trong những năm gần đây, việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật
đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu. Vấn đề đặt ra hiện nay là
nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến
động của điều kiện môi trường, địa lý và sự khai thác bừa bãi của con người. Kết quả
dẫn đến sự cạn kiệt nguồn dược liệu thiên nhiên (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011). Một
trong những giải pháp cho việc khắc phục vấn đề này chính là ứng dụng các kỹ thuật
nuôi cấy tế bào thực vật, đây được coi là một sự thay thế và duy trì nguồn nguyên
liệu cung cấp cho việc thu nhận các hợp chất thứ cấp cũng như cho việc sản xuất sinh
dược phẩm. Việc lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật do có nhiều ưu điểm
(1) Cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết các hoạt chất theo quy
mô công nghiệp mà không phụ thuộc vào các điều kiện tự nhiên; (2) Các nghiên cứu
1


về nuôi cấy tế bào thực vật cũng cho thấy hàm lượng các hoạt chất sinh học tích lũy
trong tế bào thường cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng ở cây ngoài
tự nhiên.
Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) là một cây thuốc quý, phân bố nhiều
ở Việt Nam và Trung Quốc, rễ của chúng thường được dùng làm thuốc chữa các bệnh
phong thấp, đau nhức xương, ho, rắn cắn,… (Đỗ Tất Lợi, 2004). Gần đây, nhiều tác
dụng dược lý khác của Cà gai leo đã được phát hiện như chống viêm, chống oxy hóa,

bảo vệ gan, ức chế sự tạo thành xơ gan, hạn chế sự phát triển khối u, làm bất hoạt các
virus gây bệnh mụn giộp ở người như Herpes simplex, Herpes zoster và Herpes
genitalis, bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn Salmonella
typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu (Nguyễn Hoàng Lộc và cs, 2010).
Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng tạo rễ bất định cây Cà gai leo in
vitro. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của
Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro và khảo sát khả năng chống oxy
hóa của cao chiết từ rễ cây” nhằm tìm ra được môi trường thích hợp để tạo được
nhiều rễ nhất. Từ đó tạo ra nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất thứ cấp alkaloid để
sản xuất dược phẩm. Đồng thời, bước đầu khảo sát khả năng chống oxi hóa của cao
chiết có trong rễ cây.

2


I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1.

Giới thiệu cây Cà gai leo.

Cây Cà gai leo thuộc họ Cà (Solanaceae) là một loại cây thân bụi ưa nắng, sống
nhiều năm, thường được trồng ở các nước nhiệt đới.
I.1.1.

Sơ lược về họ Solanaceae [3]

Họ Solanaceae gồm những cây thân cỏ, sống một, hai năm hay nhiều năm hoặc

cây bụi; đôi khi là cây gỗ nhỏ, ít khi cây gỗ to. Lá mọc cách, không có lá kèm. Hoa
đều, lưỡng tính, mẫu 5. Quả mọng mang đài còn lại hoặc quả nang. Hạt nhiều, có nội
nhũ, mầm cong hay thẳng.
Ở Việt Nam có 16 chi: Atrichodendron, Browallia, Brugmasia, Capsicum,
Cestrum, Cyphomandra, Datura, Lycianthes, Lycium, Lycopersicon, Nicotiana,
Petunia, Physalis, Solanum, Tubocapsicum; gần
50 loài.
I.1.2.

Vị trí phân loại cây Cà gai leo [2]

Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp:

Magnoliopsida

Bộ:

Solanales

Họ:

Solanaceae

Chi:

Solanum

Loài:

Solanum hainanense Hance

Tên đồng nghĩa: Solanum procumbens Lour.

Hình I.1: Cây Cà gai leo
Tên thông thường: Cà gai dây, Cà vạnh, Cà quýnh, Cà lù, gai cườm, chẻ nam

(Tày), b’ rongoon (Ba Na).

3


I.1.3.

Đặc điểm hình thái cây Cà gai leo [1], [7], [19]

I.1.3.1. Đặc điểm hình thái.
Cà gai leo là cây nhỏ leo, sống nhiều năm, dài khoảng 1m hay hơn. Thân hóa
gỗ ở gốc, nhẵn, phân cành nhiều; cành non tỏa rộng, phủ đầy lông tơ màu trắng, hai
mặt đều có gai ở gân chính nhất là mặt trên, cuống lá cũng có gai.
Hoa màu tím mọc thành xim 2-5 hoa ở kẽ lá, ít khi 7-9, đài có lông, xẻ thành 4
thùy tam giác nhọn, không gai; tràng có 4 thùy hình trái xoan nhọn; nhị 4 màu vàng,
chỉ nhị phình ở gốc.

Quả mọng, hình cầu nhẵn, có cuống dài, màu vàng sau đỏ, đường kính 5-7 mm;
hạt hình thận màu vàng.
Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 7-9.
I.1.3.2. Sinh thái, sinh trưởng và phát triển.
Cà gai leo phân bố chủ yếu ở vùng đồng bằng và trung du, không thấy ở miền
núi. Vùng phân bố tương đối phong phú ở Việt Nam bao gồm các tỉnh ven biển từ
Hải Phòng đến Bình Thuận. Cà gai leo còn thấy ở một vài nước nhiệt đới Châu Á
khác như Campuchia, Thái Lan, đảo Hải Nam – Trung Quốc.
Cà gai leo là cây ưa ẩm, ưa sang và có thể hơi chịu bóng, thường mọc tập trung
nhiều cá thể, lẩn trong các lùm bụi thưa ở quanh làng, bãi hoang, kể cả các bụi tre
gai. Cây mọc ở chỗ nhiều ánh sáng, sinh trưởng và phát triển tốt, ra nhiều hoa quả,
Cà gai leo có khả năng tái sinh bằng hạt hoặc từ các phần thân và các gốc còn lại sau
khi chặt. Ngoài ra, từ các đoạn than và cành trồng vào mùa xuân cũng có thể mọc
thành cây mới.
Nguồn Cà gai leo ở Việt Nam tương đối phong phú, các tỉnh ven biển miền
trung, từ Thanh Hóa trở vào có thể khai thác mỗi năm vài chục tấn nguyên liệu để
làm thuốc.
I.1.3.3. Bộ phận dùng.
Rễ và cành lá Cà gai leo thu hái quanh năm, rửa sạch, thái nhỏ, phơi bày hay
sấy khô, có khi dùng tươi.
I.1.3.4. Thành phần hóa học
4


Rễ và lá Cà gai leo mọc ở Việt Nam có cholesterol, β – sitosterol, lanosterol,
dihydrolanosterol. Ngoài ra, rễ chứa 3β – hydroxyl - 5α – pregnan -16 – on, rễ và lá
có solasodenon. Hai chất solasodine và neoclorogenin còn thu được sau khi thủy phân
dịch chiết rễ (Hoàng Thanh Hương, 1980).
Viện Dược liệu đã phân tích thành phần hóa học thấy có alkaloid, glycoalcaloid,
saponin, flavonoid, acid amin và sterol, trong đó nhân glycoalkaloid có tỷ lệ nhiều

hơn cả (Âu Văn Yên – Phạm Kim Mãn).
I.1.3.5. Tác dụng dược lý.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của α-solasonine
-

Trong mô hình gây phù thực nghiệm chân chuột bằng kaolin tạo nên giai
đoạn cấp tính của phản ứng viêm tương ứng với những biến đổi về mạch
máu gây thoát huyết tương ở khoảng ngoài tế bào, rễ và thân lá Cà gai
leo có tác dụng ức chế phù rõ rệt (rễ với liều 13,5kg và thân lá với liều
22,5kg trở lên).

-

Đối với giai đoạn bán cấp của phản ứng viêm tương ứng với sự tạo thành
tổ chức hạt, trong mô hình gây u hạt thực nghiệm với amian, rễ và thân
lá Cà gai leo có tác dụng ức chế rõ rệt (rễ với liều 5g/kg và thân lá từ
10g/kg chuột trở lên).

-

Tuyến ức có vai trò quan trọng trong sự hình thành hệ thống miễn dịch
của cơ thể, rễ và thân lá Cà gai leo có tác dụng gây thu teo tuyến ức chuột

5


cống non rõ rệt (rễ với liều 7,5g/kg và thân lá với liều 15g/kg chuột trở
lên).
-

Chỉ số tán huyết của rễ Cà gai leo xác định bằng phương pháp Brunel là
13 Cà gai leo tỏ ra không độc trong thí nghiệm về độc tính cấp và bán
cấp.

-

Sơ đồ nghiên cứu định lượng sinh học hoạt lực chống viêm thấy 1g rễ
Cà gai leo khô tương ứng với 2,5mg hydrocortisone, và 1g thân lá Cà gai
leo tương ứng 1,3mg hydrocortisone.

Rễ Cà gai leo chống độc lực của nọc rắn cobra trên chuột nhắt trắng và thấy Cà
gai leo có tác dụng bảo vệ chuột thí nghiệm chống độc lực liều cao nọc rắn, làm tăng
một cách có ý nghĩa tỷ lệ chuột sống sót với chuột đối chứng không uống Cà gai leo.
Các nghiên cứu thăm dò khả năng chống co thắt phế quản của một số thuốc
chữa hen cổ truyền bằng phương pháp khí dung histamine của armitage và thấy Cà
gai leo có tác dụng kéo dài thời gian chịu đựng của chuột được uống thuốc và đặt
trong buồng khí dung, làm thời gian triệu chứng khó thở chậm hơn so với chuột đối
chứng không uống Cà gai leo.
Việc nghiên cứu thăm dò khả năng ngăn chặn tiến triển xơ của Cà gai leo trên
mô hình gây xơ gan thực nghiệm của Maros cho thấy sau 3 tháng gây xơ gan trên
chuột cống trắng, xơ gan hình thành rõ rệt, thể hiện trên các chỉ tiêu hóa sinh và tổ
chức học. Ở thời điểm 5 tuần, quá trình bệnh lý mới tiến triển tới giai đoạn thoái hóa
mô gan, chưa có sự gia tăng rõ rệt của collagen. Nhưng khi xơ gan đã ở giai đoạn
hoàn chỉnh, song song với các biến đổi về tổ chức học, hàm lượng collagen ở gan xơ
cũng tăng cao gấp 2,5 lần so với bình thường. Cà gai leo với liều cho uống hàng ngày
6g/kg thể trọng chuột, tuy không ngăn chặn hoàn toàn quá trình xơ hóa, nhưng có tác
dụng làm chậm sự tiến triển của xơ. Hàm lượng collagen trong gan ở lô chuột dùng
Cà gai leo chỉ bằng 7,1% so với lô chuột chứng gây xơ không dùng thuốc. Thí nghiệm
cho thấy toàn bộ chuột ở lô chứng gây xơ đều bị xơ nặng hoặc vừa, còn ở lô dùng Cà

gai leo hầu hết chỉ xơ nhẹ hoặc không xơ.

I.2.

Hợp chất thứ cấp [4], [5], [6], [8]

I.2.1.

Giới thiệu
6


Ở thực vật có những chất đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc nên cơ thể,
những chất đó được gọi là những hợp chất sơ cấp. Gồm các polysaccharide, đường,
protein và chất béo. Ngoài những chất đó ra, còn có những hợp chất khác có nồng độ
ít hơn có cấu trúc rất khác nhau, hiện diện rải rác trong thực vật, động vật và vi sinh
vật. Trong nhiều trường hợp, vai trò của các hợp chất này trong cơ thể sinh vật tạo ra
chúng (sinh vật chủ) chưa được biết đến. Những hợp chất này được gọi là các hợp
chất thứ cấp, gồm có alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid. Cho đến nay,
người ta đã tìm thấy gần 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực vật khác nhau, và hằng
năm một số lượng lớn các chất mới được phát hiện thêm. Nguồn gốc của các chất thứ
cấp là các điểm cuối cùng của quá trình biến dưỡng, với chức năng ít chuyên biệt
(Harborne 1978, Harbornr & Tomas-Barberan 1991).
Các hợp chất thứ cấp có thể được sản xuất trong các loại tế bào đặc biệt như tế
bào tuyến tiết, lông tơ biểu mô, v.v… nơi mà chúng được tiết ra có chức năng như
các chất xua đuổi hay dẫn dụ. Một trong các chức năng dễ nhận thấy nhất ở các chất
thứ cấp đó là có vai trò sinh hóa trong cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân
gây bệnh và xâm hại. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là
alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, phổ biến trong thực

vật, ngày nay đã biết khoảng trên 6000 alkaloid từ hơn 5000 loài. Chúng có hoạt tính
sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao
gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid
như: cây thuốc phiện (họ Papaveraceae); cây canh-ki-na (họ Rubiaceae); cây cà độc
dược, thuốc lá và khoai tây (họ Solanaceae). Người ta thường gặp trong một cây tập
hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid,
đôi khi chỉ tập trung trong lá (thuốc lá, chè, cacao), trong quả (thuốc phiện), trong vỏ
(canh-ki-na), trong rễ (cây phụ tử, cây cà độc dược). Trong cùng một cây có thể tùy
theo bộ phận của cây mà tạo ra những alkaloid khác nhau (họ Taxaceae). Các alkaloid
có các hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ thần kinh (caffein,
atropin, strychnin…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropine…), một số tác
dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrine…), một số khác tác dụng lên bộ máy hô
7


hấp (morphin…). Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ,
chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994).
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và
dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước.
Terpenoid được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị
isoprene, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị
isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee, 2001).
Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các
cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi
thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001).

8


Hình 1.1: Mối quan hệ giữa chất sơ cấp và chất thứ cấp ở thực vật

I.2.2.

Ứng dụng công nghệ tế bào trong thu nhận hợp chất thứ cấp

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất
có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng
từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây,
sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được
mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật
nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết
một tỷ lệ lớn hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004).

9


I.2.3.

Những yếu tố ảnh hưởng đến tạo hợp chất thứ cấp.

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất
thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản
xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô
có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng
thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng
ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong
nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối
có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ
xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee, 2001).
I.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy
Vai trò của một số chất hóa học và các yếu tố vật lý trong môi trường nuôi cấy

khác nhau cho từng loại cây. Các yếu tố này bao gồm thành phần các chất trong môi
trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, ánh
sáng… Việc thay đổi các thành phần này có thể làm cho tế bào tăng tốc độ tăng
trưởng.
 Môi trường
Saccharose và glucose là nguồn carbon thích hợp trong nuôi cấy mô thực vật.
Nồng độ của chúng cũng ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của tế bào và hàm lượng
hợp chất thức cấp.
Trong thành phần môi trường khác có các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
như auxin và cytokinin có ảnh hưởng đáng kể trên sự tăng trưởng của tế bào và khả
năng sản xuất các chất biến dưỡng của tế bào. Ví dụ: tăng hàm lượng auxin như 2,4D trong môi trường sẽ kích thích sự phản phân hóa tế bào, vì vậy sẽ làm giảm bớt sản
lượng các chất biến dưỡng thứ cấp (Collin và Edwards, 1998).
 Nhiệt độ, pH, ánh sáng, nồng độ oxygen
Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ oxygen cần phải được xác định trong các
nghiên cứu khi nuôi tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp. Nhiệt độ thích hợp cho
việc nuôi cấy mô sẹo và tế bào là khoảng 17 - 250C. Trong quá trình nuôi cấy khi
giảm nhiệt độ sẽ làm tăng số lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo khối
10


lượng khô). Độ pH tối ưu khoảng 5,7 - 5,8 trước khi hấp khử trùng. Ánh sáng cũng
rất cần thiết trong một vài trường hợp. Nồng độ oxygen là yếu tố cần được kiểm soát
trong nuôi cấy, nhất là trong nuôi cấy bioreactor (Toivonen và cs, 1992).
I.2.3.2. Dòng tế bào
Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập.
Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi
cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, sau đó phương thức này đã được ứng
dụng rộng rãi.
I.2.3.3. Cung cấp tiền chất
Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi

cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian
nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản
phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ.
Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại
hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs, 2002; Moreno và cs, 1993).
I.2.3.4. Sự kháng bảo vệ thực vật
Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ
chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc
hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự
kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ
cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất.

11


I.2.4.

Alkaloid

I.2.4.1. Alkaloid
Polonopski định nghĩa: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số
có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động
vật, thường có dược tính rất mạnh và cho phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi
là thuốc thử chung cho alkaloid.
Các alkaloid có cấu trúc hóa học giống nhau chỉ giới hạn trong một họ thực vật
nhất định và có những cây thuộc nhiều họ khác nhau lại có chứa một loại alkaloid
như nhau. Một số hợp chất chứa nitơ không có dị vòng mà có mạch nhánh cũng được
xếp vào alkaloid như: capsaicin trong ớt (Capsicum anuum L.), colchicine trong cây
tỏi độc (Colchicum autumnale L.), vv…
Glycoalkaloid là 1 hợp chất thuộc nhóm alkaloid điển hình là solasonin và

solamacgin, khi thủy phân sẽ cho cùng một aglycon là solasodine. Glycoalkaloid có
nhiều trong cây họ Cà (Solanaceae), từ solasodin bán tổng hợp các thuốc steroid.
Solasodin có tác dụng chống viêm nên cũng được dung để chữa thấp khớp.
I.2.4.2. Sự thoái hóa alkaloid trong cây
Sau khi hình thành, alkaloid tiếp tục được biến đổi trong cơ thể thực vật. Ở một
số loài, alkaloid được tích lũy trong hạt và trong suốt quá trình nảy mầm alkaloid bị
biến đổi. Nitơ được dùng trong quá trình biến dưỡng cho cây con (Wink và cs, 1985).
Trong suốt thời gian phát triển, các alkaloid cũng được tổng hợp (Waller và cs, 1978).
Tế bào nuôi cấy cũng có thể phân giải alkaloid ngoại sinh được bổ sung vào (Wink
và cs, 1985).
I.2.4.3. Định tính alkaloid
Dựa vào các phản ứng tạo tủa của các alkaloid với các loại thuốc thử. Ta có một
số thuốc thử alkaloid đặc trưng dung định tính:
-

Thuốc thử Mayer: tạo tủa trắng với alkaloid

-

Thuốc thử Wagner: cho kết tủa màu nâu đất với các dung dịch alkaloid.

Thuốc thử Dragendorf: tạo tủa vô định với alkaloid, đôi khi kết tinh với dung
dịch muối alkaloid trong dung dịch acid sulfuric hay acid HCl loãng. Tủa có màu
vàng da cam hay màu đỏ gạch.
12


I.3.

Nuôi cấy mô

I.3.1.

Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

I.3.1.1. Auxin [8], [15]
Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò
quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin được tổng hợp trong ngọn
thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào
nhanh). Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi
Trang Việt, 2000).
Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào,
cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích
thích sự phân hóa mô dẫn. Auxin kích thích sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng
kéo dài dưới ngọn của thân. Sự kéo dài tế bào rễ cần những nồng độ thấp hơn nhiều
so với tế bào thân (Bùi Trang Việt, 2000).
Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của
các sơ khởi rễ này (Mai Trần Ngọc Tiếng và Cs, 1980). Auxin được vận chuyển
hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự
hình thành rễ bất định (Kuroha và Cs, 2002). Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với
các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), nhất
là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic).
Trong số các loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D được xem
là một auxin mạnh, có tác động hình thành mô sẹo. Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng
độ quá cao, auxin này sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền (Li và
Cs, 1998). Trong sự hình thành sơ khởi của rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA
thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh
trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng
chất điều hòa nội sinh trong nuôi cấy. Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng
IAA nội sinh tích lũy tăng cao. Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức

chế hoạt động của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA
do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định
(Li và Cs, 1998).
13


I.3.1.2. Cytokinin [8], [15]
Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể
thực vật. Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng
trưởng củ). Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và
là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi (Taiz và
Zeiger, 2002). Trong sự hình thành chồi, cytokinin có thể được xử lý riêng rẽ hay
phối hợp các loại để làm tăng khả năng hình thành và chất lượng chồi.
Ở nồng độ cytokinnin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi. Số
lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên, cũng có những
bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi. Cytokinin
ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình
thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ.
Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin
nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm
hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm
hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng
độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất
(Edwin, 1996).
I.3.2.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

I.3.2.1. Ánh sáng [8]
Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của tế

bào trong nuôi cấy in vitro. Mỗi loài thực vật khác nhau có những đáp ứng khác nhau
với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau. Cường độ chiếu
sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào
sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng. Ngược lại,
cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự
quang hợp kém hơn sự hô hấp.
I.3.2.2. Nhiệt độ [8]
Nhiệt độ trong khoảng 17 - 250C thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô
sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với
14


một nhiệt độ khác nhau. Toivonen và cộng sự (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ
trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính
theo trọng lượng khô).
I.3.2.3. pH [8]
Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho
cây. Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,7 - 5,8, đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ
muối khoáng.
I.3.2.4. Sự thoáng khí [8]
Thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt. Sự
thoáng khí được hiểu như sự hiện diện của O2 và CO2 giúp cho cây quang hợp và hô
hấp. Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ vào sự hiện diện của
khí CO2 trong không khí như một nguồn cung cấp carbon. Nồng độ khí CO2 trong
bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng quang tự dưỡng.
Quá trình hô hấp hiếu khí,O2 tham gia trực tiếp vào việc oxi hoá các chất hữu
cơ và là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử để sau đó hình thành.
Vì vậy nếu nồng độ O2 trong không khí giảm xuống dưới 10% thì hô hấp sẽ bị ảnh
hưởng và khi giảm xuống dưới 5% thì cây chuyển sang hô hấp kị khí - dạng hô hấp
không có hiệu quả năng lượng rất bất lợi cho cây trồng.

I.3.2.5. Muối khoáng [8]
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu
cầu của cây ngoài tự nhiên. Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi
lượng là điều cần thiết.
I.3.2.6. Nguồn Carbon [8]
Chủ yếu cho mô nuôi cấy là đường. Mô tế bào nuôi cấy có sự quang hợp giới
hạn, vì vậy người ta cần thêm glucid cần thiết cho sự tăng trưởng của mô vào môi
trường nuôi cấy.
I.3.2.7. Vitamin [8]
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin
thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin HCl (vitamin B1),
pyridoxine HCl (vitamin B6), acid nicotinic, myo-inositol.
15


I.3.2.8. Agar [8]
Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại
gelidium. Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường
gây chết mô do thiếu oxi.
I.3.2.9. Than hoạt tính [8]
Than hoạt tính ảnh hưởng trên ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều
hoà sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường. Khả
năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp
với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy.
I.3.2.10. Nước dừa [8]
Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện nay đã được chứng minh là myo-inositol
và một số amino acid khác. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong nuôi
cấy tế bào. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho
nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thụ nhanh hơn nitrogen vô
cơ.

I.3.3.

Mô sẹo [15]
Mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường

được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo
rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô
sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh được
áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin.
Sự tạo mô sẹo nhờ auxin thuộc một trong ba quá trình:
-

Sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong
cơ quan)

-

Sự phân chia của các tế bào tượng tầng.

-

Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình
này được ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không
có các tượng tầng điển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân
hóa (so với cây hai lá mầm).

16


Sự tạo mô sẹo cần phải chú ý đến tình trạng sinh lý của mô cấy, sự dùng

auxin riêng lẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin.
I.3.4.

Sự phát sinh hình thái [8]
Sự phát sinh hình thái ở thực vật là sự phát triển của tế bào, mô hay cơ

quan ở thực vật. Sự phát sinh hình thái ở thực vật phụ thuộc vào hai quá trình
căn bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí và hướng phân
chia của tế bào.
I.3.4.1. Phát sinh hình thái chồi bất định [8], [14]
Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với mô chóp mà còn xuất hiện
gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần cùng phát sinh libe - mộc hoặc ngoài biểu
bì, vì vậy chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân
hóa các tế bào trưởng thành. Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào
và sắp xếp tế bào giống như sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của
thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Chồi phân sinh ngọn có thể từ các tế bào biểu bì, mô hàng rào, mô khuyết
hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi phân hóa để hình thành tầng
phát sinh của chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái
hoạt động. Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách
đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi
ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa
thích hợp. Theo Buvat, có hai giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai
đoạn khử phân hóa và giai đoạn tái phân hóa (Gautheret; Bùi Trang Việt, 2003).
Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các
cơ quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân
sinh thứ cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lạp thể phân chia thành
các bóng nhỏ). Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trước khi bắt đầu giai đoạn
khử phân hóa: Mất dần tinh bột dự trữ trong các lạp hoặc tích lũy tinh bột dự trữ
và một số chất khác, nhưng sự tích lũy như vậy có thể làm chậm sự tạo mô phân

sinh.

17


Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp
sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Có sự phân chia
không bào thành những không bào nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng,
tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to (Esau, 1972; Bùi Trang Việt,
2003).
Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại
trạng thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng trải qua hai bước: bước
một, tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước
và hợp thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần trở về
hình dạng đặc trưng; bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch
nhân, tế bào chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp.
Sau đó, các tế bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp
phân hóa mà không qua sự phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000).
I.3.4.2. Phát sinh hình thái rễ bất định [3], [15]
Rễ bất định: Mọc trên thân hay lá. Các rễ có thể mọc ở trên thân ở vị trí
mắt hoặc ở nách lá hoặc ở dọc theo thân, ở vị trí bất định nên gọi là rễ bất định.
Rễ bất định thường gặp ở những cây họ Lúa và nhiều cây ở lớp Hành. Có khi rễ
phụ xuất phát từ gốc thân to dần ra làm thành những cột chống đỡ thân khi phần
gốc của cây bị tiêu hủy. Ở các cây Đa, rễ phụ nảy sinh từ những nhánh trên cao,
lúc đầu nhỏ, nhưng khi đụng đất rễ ấy phù to ra thành cột nâng đỡ cành.
Rễ bất định có thể có ở trụ hạ diệp của một cây con, ở các mấu và lóng của
thân và ở rễ. Hầu hết rễ bất định phát sinh kiểu nội sinh, mặc dù vẫn có những
trường hợp phát sinh ngoại sinh.
Các rễ bất định sinh trên thân tạo ra hệ thống rễ chính ở các cây có mạch
bậc thấp, hầu hết cây một lá mầm, cây hai lá mầm nhân giống bằng thân và rễ

hoặc thân bò, các cây thủy sinh, các cây sống hoại sinh và ký sinh. Rễ được hình
thành trên cành giâm cũng là những rễ bất định.
Sự hình thành rễ bất định gồm ít ra là hai giai đoạn có thể phân biệt được
dưới kính hiển vi (Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự, 1980): giai đoạn tạo sơ

18


khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe - mộc hay chu luân, và giai đoạn
kéo dài sơ khởi rễ này.
Rễ bất định thường được khởi sinh ở vùng lân cận của các mô mạch dẫn
đang được phân hóa của cơ quan đã tạo ra chúng. Nếu cơ quan này còn non, sơ
khởi rễ bất định được khởi sinh bằng một nhóm tế bào ngoại vi của hệ thống
mạch dẫn. Nếu cơ quan đó già hơn, vị trí khởi sinh nằm sâu hơn, gần với tầng
sinh mạch. Ở các thân non, các tế bào tạo ra sơ khởi rễ thường được hình thành
từ mô mềm giữa các bó mạch dẫn. Ở những thân già hơn, chúng hình thành từ
một tia mạch. Đôi khi rễ bất định được khởi sinh bằng các phân chia trong vùng
tầng phát sinh. Rễ bất định xuất phát từ vùng giữa các tia mạch hoặc ở tầng phát
sinh làm cho rễ gần gũi với mộc và libe của cơ quan mẹ. Điều này thuận lợi cho
việc thiết lập đường nối mạch giữa hai cơ quan này.

I.4.

Sự kháng ôxi hóa

I.4.1.

Khái niệm về gốc tự do
Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự

sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung
cấp cho mọi hoạt động sống của con người.
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng
oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy
tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn
gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là gốc dạng oxy
hoạt động (ROS: Reactive oxygen species).
Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxide (O-2), đây là gốc
tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxide (O2-) nhiều gốc tự do và các
phân tử khác nhau của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl
(HO-), hydroperoxyl (HOO-), peroxyl (ROO-), alkoxyl (RO-), lipoperoxyde
(LOO-), H2O2 ( Halliwell, 1991).
Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng
phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA gây rối loạn các quá
trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do
19


tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng
với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng
dây truyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.
Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những
căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá,
dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có
nhiều chlorine và ngay cả oxy (Donald, 2002)
I.4.2.

Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm

soát, nó là ngồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần
cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm
trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh,
co bóp cơ thịt (Lester, 1999).
I.4.3.

Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người

mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày.
Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như:
ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm
trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế
bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng rồi chết. Chúng
tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt,
trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các
phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở
DNA, RNA, làm chất collagen và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn
nheo, cơ khớp cứng nhắc.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây:
Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã
và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty thể, phá vỡ
nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu
kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được.
20


Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây
tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những thay đổi trong mô và tế bào.
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây

ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty
thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc,
khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng.
Các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất
chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxide dismutase
(SOD), enzyme glutathione peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để
tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong
cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô
(homeostasis). Trạng thái sinh lí này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress). Hay
nói cách khác stress oxy hóa là sự rối loạn giữa các chất chống oxy hóa và các
chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa.
Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường,
tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa
đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng
oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi,
tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần
có những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng
ta cũng cần khảo sát them những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu
và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu.

I.5.

Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng thử

hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Năm 1922, Golschmidt và Rem đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu
tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản
ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).
DPPH không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH có
cực đại hấp thu tại 520nm, sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam (Patrik và cs, 2005)

21


Ngày nay, DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do.
Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và
ổn định.
I.5.1.

Nguyên tắc
Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho

hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch
phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa
bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

Hình 5.1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH

22


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

II.

II.1.

Vật liệu

II.1.1.

Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật và phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở
Thành Phố Hồ Chí Minh Cơ sở III, Bình Dương
Thời gian: 10/2014 đến 04/2015
II.1.2.

Đối tượng nghiên cứu

Hạt Cà gai leo được khử với Javel 10%, trong thời gian 5 phút. Sau 1 tháng
nảy mầm, lá và đoạn thân cây được lấy làm mẫu bố trí thí nghiệm.
Rễ cây Cà gai leo được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy in vitro rửa sạch, phơi
khô, cô cao và tiến hành khảo sát khả năng kháng oxi hóa.
II.1.3.

Thiết bị và dụng cụ

Dụng cụ:
-

Dụng cụ pha môi trường: becher, ống đong, ca nhựa, micropipette,
đũa thủy tinh.

-

Dụng cụ cấy: dao mổ, đĩa petri, đèn cồn, bông thấm nước, chai môi
trường.

-

Dụng cụ nhuộm mẫu: dao lam, becher, đĩa đồng hồ, ống nhỏ giọt.

-

Dụng cụ khảo sát khả năng kháng oxy hóa: bộ chiết Soxhlet, ống
nghiệm, giấy nhôm, becher, nồi.

Thiết bị:
-

Cân phân tích

-

Cân kỹ thuật

-

Máy cất nước

-

Máy đo pH

-

Autoclave

-

Tủ cấy

-

Đèn UV

-

Đèn neon tạo nguồn sáng
23