ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
=======
NGUYỄN THỊ NHUNG
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ
TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo
HÀ NỘI - 2016
LỜI CẢM ƠN
Bản khóa luận này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Lê Thị
Hồng Hảo.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.
TS Lê Thị Hồng Hảo đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn và góp ý giúp
em hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị
Hà Bình đã hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An
toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa Độc
học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá,
đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến
thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học
hoá K24, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ,
chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
bên tôi, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập và trong
cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót.
Tôi rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên.
Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016
Nguyễn Thị Nhung
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ...................................................................................2
1.1. Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ ..................................................2
1.1.1 Giới thiệu về STX ...................................................................................4
1.1.2 Giới thiệu về NEO ...................................................................................4
1.1.3 Giới thiệu về GTX-1 ............................................................................... 5
1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) ...............................................................6
1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ ....................................7
1.2. Các phƣơng pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh
vỏ ..........................................................................................................................9
1.2.1. Các phƣơng pháp thử sinh học ...............................................................9
1.2.2. Phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA ........................................10
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................ 11
1.2.4 Kỹ thuật điện di .....................................................................................13
1.2.5 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) ...............13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................16
2.1. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu ..............................................................16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..........................................................................16
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................16
2.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ...................................................................16
2.2.2 Phƣơng phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) .................................17
2.2.3. Thẩm định phƣơng pháp ......................................................................23
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................26
2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu ..............................................................................26
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................26
2.3.2. Dung môi, hóa chất ..............................................................................27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............. Error! Bookmark not defined.
3.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS Error! Bookmark not defined.
3.1.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy của thiết bị khối phổ MS/MS Error! Bookmark not d
3.1.2 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Error! Bookmark
3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu ....................... Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu ....................... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu Error! Bookmark not def
3.2.3 Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết Error! Bookmark not defined.
3.2.4. Khảo sát thể tích dung môi chiết .......... Error! Bookmark not defined.
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích .............. Error! Bookmark not defined.
3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc ........................ Error! Bookmark not defined.
3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) Error! Bookmark not define
3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính .................. Error! Bookmark not defined.
3.3.4 Độ chính xác (accuracy) của phƣơng pháp phân tích (độ đúng và độ
chụm) .............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế ................... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................... Error! Bookmark not defined.
PHỤ LỤC ...................................................................................................................
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP
3
Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của
các PSP
6
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định
PSP 11
Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm viêc̣
Error!
Bookmark
not
defined.
Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chất Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4: Chương trình gradient
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7: Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết Error!
Bookmark
not
defined.
Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung môi chiết
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.9: Ion mẹ và ion con của STX, GTX-1, NEO Error!
Bookmark
not
Bookmark
not
defined.
Bảng 3.10: LOD và LOQ của STX, GTX-1, NEO
Error!
defined.
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các PSP
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu
Ngao Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu
Hàu Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội
Error!
Bookmark not defined.
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP 3
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX 4
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo 5
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1
5
Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 18
Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử
Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực
20
22
Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực 22
Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient 4
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 2
theo tác giả Van De Riet Error! Bookmark not defined.
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 2 Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3 Error! Bookmark not defined.
Hình 3.5:Sắc kí đồ các PSP 100 ng/mL trong quy trình 3
Error!
Bookmark
not defined.
Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình không gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100
ng/mL
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.8: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình pha loãng đến hiệu suất
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
thu hồi
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.9: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích chiết đến hiệu suất thu
hồi
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11: Phổ khối của các PSP
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng không có tín hiêụ chấ t phân tích.
Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn ở mức 200 ng/mL
Error!
Bookmark
not
defined.
Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn ở mức 200 ng/mL
Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.15: Sắc kí đồ STX tại LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg trên
mẫu) Error! Bookmark not defined.
Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên
mẫu) Error! Bookmark not defined.
Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên
mẫu) Error! Bookmark not defined.
Hình 3.18: Đường chuẩ n STX theo diêṇ tích pic
Error!
Bookmark
not
Hình 3.19: Đường chuẩ n GTX-1 theo diêṇ tích pic Error!
Bookmark
not
defined.
defined.
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diêṇ tích pic
Error!
Bookmark
defined.
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
not
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
CAN
AOAC
Tiếng Anh
Acetonitrile
Association of Official
Analytical Communities
Tiếng Việt
Acetonitril
Hiệp hội các nhà phân tích chính
Độc tố nhuyễn thể gây mất trí
ASP
Amnesic Shellfish Poisoning
CAD
Collision Gas Pressure
Áp suất khí va chạm
CE
Collision Energy
Năng lƣợng va chạm
CUR
Curtain Gas
Khí màng
CXP
Collision Cell Exit Potential
Thế đầu ra
DP
Declustering Potential
Thế phân mảnh
DSP
Diarrhetic Shellfish Poisoning
Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy
d-SPE
Dispersive solid phase
extraction
nhớ
Chiết phân tán pha rắn
Eq
Equivalents
Tƣơng đƣơng
ESI
Electronspray ionization
Ion hóa phun điện tử
FLD
Fluoroscence detector
Detector huỳnh quang
GCB
Graphitized carbon black
Than hoạt tính
GS1
Ion Source Gas 1
Khí nguồn ion 1
GS2
Ion Source Gas 2
Khí nguồn ion 2
GTX-1
Gonyautoxins-1
Độc tố gonyautoxins-1
HPLC
High performance liquid
chromatography
Nguyễn Thị Nhung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trường ĐHKH Tự Nhiên
HILIC
IS
LC-MS/MS
Hydrophilic interaction liquid
chromatography
Ionspray Voltage
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry
Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc
Thế phun ion
Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lƣợng
MBA
Mouse bioassay
Thử nghiệm sinh học trên chuột
ML
Maximum level
Giới hạn tối đa cho phép
MS
Mass spectrometry
Khối phổ
NEO
Neosaxitoxin
Độc tố neosaxitoxin
PSP
Paralytic Shellfish poisoning
Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
R(%)
Recovery
Hiệu suất thu hồi
RSD(%)
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tƣơng đối
SD
Standard Deviation
Độ lệch chuẩn
SPE
Solid phase extraction
Chiết pha rắn
STX
Saxitoxin
Độc tố saxitoxin
TEM
Ion source temperature
Nhiệt độ nguồn
Nguyễn Thị Nhung
Trường ĐHKH Tự Nhiên
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây việc nuôi trồng thủy sản nói chung và việc nuôi
các loài hai mảnh vỏ nói riêng đã và đang phát triển rầm rộ ở nhiều địa phƣơng
ven biển nƣớc ta. Điều này đã góp phần vào việc phát triển ngành kinh tế biển,
phục vụ cho nhu cầu thị trƣờng tiêu thụ trong và ngoài nƣớc, tăng thêm thu nhập,
cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cƣ ven biển.
Đô thị hóa, ô nhiễm môi trƣờng làm môi trƣờng biển ngày càng bị suy
thoái tạo điều kiện cho sự xuất hiện và bùng nổ của các loài vi tảo biển độc hại.
Các loài thân mềm hai mảnh vỏ là đối tƣợng trung gian chính để gây ra hiện
tƣợng ngộ độc ở ngƣời và các sinh vật bậc cao nhƣ chim biển, thú biển. Đặc biệt
sự có mặt các nhóm độc tố độc tố gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning).
Chính vì vậy, nghien cứu phát hiện các độc tố cần đƣợc quan tâm để giảm nguy
cơ ảnh hƣởng đến sức khỏe cũng nhƣ tính mạng của con ngƣời.
Trong đề tài này tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
PSP (Paralytic Shellfish Poisoning). Độc tố này gây nguy hiểm đến sức khoẻ và
tính mạng con ngƣời là do động vật nhyễn thể bị nhiễm và tích lũy độc tố PSP do
ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm loài Dinophysis spp, Aurocentum,
prorocentrumlima.Việc xác định một số độc tố nhuyễn thể gây liêt cơ là rất cần
thiết, là công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp “Xác định đồng
thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối
phổ LC-MS/MS”. Phƣơng pháp hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao.
Mục tiêu của thực hiện đề tài luận văn là:
- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS.
- Sơ bộ đánh giá một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
tiêu thụ tại Hà Nội.
Nguyễn Thị Nhung
1
Trường ĐHKH Tự Nhiên
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là một nhóm các alkaloid gây độc
trên thần kinh. STX là độc tố PSP đƣợc phát hiện sớm nhất vào năm 1957, và kể
từ đó đến nay đã có 57 dẫn xuất đƣợc mô tả [28].
Độc tố PSP là những độc tố thân nƣớc và chịu đƣợc nhiệt độ cao nên khó
có thể bị phá hủy khi nấu ăn hay đun nóng [15], [18]. Chúng có thể đƣợc chia
thành 4 phân nhóm chính [8], [22], [28]:
Độc tố nhóm carbamate gồm: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO),
gonyautoxins (GTX1-4) có độc tính mạnh nhất.
Độc tố nhóm decarbamoyl gồm: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX),
decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có độc tính trung bình, đƣợc báo cáo
xuất hiện trong một vài động vật hai mảnh vỏ, nhƣng ít đƣợc tìm thấy trong các
loài tảo độc.
Các độc tố nhóm N-sulfocarbamoyl nhƣ: B1 [GTX5], B2 [GTX6] and C14 ít mạnh hơn.
Nhóm thứ 4 là nhóm deoxycarbamoyl nhƣng độc tính của nó chƣa đƣợc
xác định 1 cách rõ ràng [12].
STX là độc tố mạnh nhất trong nhóm PSP. Độc tính của các PSP khác đƣợc
xác định dựa trên độc tính của STX bởi Oshima đƣợc trình bày ở bảng 1.1 [24].
Nguyễn Thị Nhung
2
Trường ĐHKH Tự Nhiên
Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP
Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP
Độc tố
R1
R2
R3
Hệ số độc
M
STX
-H
-H
-H
1
299
NEO
-OH
-H
-H
0,92
315
GTX-1
- OH
-H
-OSO3-
0,99
411
GTX-2
-H
-H
-OSO3-
0,36
395
GTX-3
-H
-OSO3- -H
0,64
395
GTX-4
- OH
-OSO3- -H
0,73
411
R4
O
NH2
O
- Nguồn gốc: Sinh ra bởi vi sinh vật sống cộng sinh trên một sinh vật khác, gồm
các tảo dinoflagellates Gonyaulax catenella và G. Tamarensi, tìm thấy ở các loài
nhuyễn thể ở vùng Alaska, Saxidomus giganteus và các loài, Mytiluscalifornianeus. Độc tố có thể sản sinh riêng biệt bởi S. giganteus hay M.
californianeus.
- Lý hóa tính: Các độc tố PSP không bị phân hủy bởi nhiệt ở môi trƣờngacid
nhƣng không bền vững và dễ bị oxy hóa trong môi trƣờng kiềm.
- Tác hại: Các triệu chứng nhiễm độc PSP có thể xuất hiện sau khi ăn vài phút
cho đến 10 giờ. Triệu chứng bao gồm cảm giác tê ở môi, cổ, mặt, cùng cảm thấy
nhƣ có kiến bò trong các ngón tay và ngón chân, nhức đầu, chóng mặt và buồn
nôn, nói năng không còn mạch lạc, mạch đập nhanh, thở khó... Trƣờng hợp nặng
có thể dẫn đến tử vong do suy hô hấp.
- Hệ số độc: Trong nhóm các độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ thì STX là độc tố
Nguyễn Thị Nhung
3
Trường ĐHKH Tự Nhiên
mạnh nhất và ta quy ƣớc nó có hệ số cao nhất là 1. Độc tố có độ mạnh thứ hai là
GTX-1 và đến NEO. Độc tố ít gây độc nhất là độc tố GTX-2.
- Xâm nhập: qua đƣờng ăn uống, hít thở.
- Cơ chế tác dụng: Saxitoxin và các dẫn chất khác phong bế kênh Na+ của các tế
bào thần kinh do đó chúng gây ảnh hƣởng đến hoạt cả hoạt động thần kinh và các
phản ứng của hệ cơ.
1.1.1 Giới thiệu về STX
- Danh pháp thƣờng: Saxitoxin
- Danh pháp quốc tế:
(3aS-(3a-α,4-α,10aR*))-2,6-diamino-4-(((amino-carbonyl)oxy)methyl)3a,4,8,9-tetrahydro-1H,10H-pyrrolo(1,2-c)purine-10,10-diol
- Công thức cấu tạo:
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX
- Công thức thu gọn: C10H17N7O4
-
Khối lƣợng mol phân tử : 299.29 g/mol
1.1.2 Giới thiệu về NEO
- Danh pháp thƣờng: Neosaxitoxin
- Danh pháp quốc tế:
Nguyễn Thị Nhung
4
Trường ĐHKH Tự Nhiên
[(3aS,4R,10aS)-5,10,10-Trihydroxy-2,6-diiminooctahydro-1H,8Hpyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate
- Công thức cấu tạo:
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo
- Công thức thu gọn: C10H17N7O5
-
Khối lƣợng mol phân tử : 315.286 g/mol.
1.1.3 Giới thiệu về GTX-1
- Danh pháp thƣờng: Gonyautoxins-1
- Danh pháp quốc tế: {4-[(carbamoyloxy)methyl]-5,10,10-trihydroxy-2,6diimino-decahydropyrrolo[1,2-c]purin-9-yl}oxidanesulfonic acid
- Công thức cấu tạo:
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1
Nguyễn Thị Nhung
5
Trường ĐHKH Tự Nhiên
- Công thức thu gọn: C10H17N7O9S
-
Khối lƣợng mol phân tử
: 411.34848g/mol.
1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML)
- Mức tối đa cho phép (ML) là giới hạn của độc tố PSP , đƣợc phép tồn tại về
mặt pháp lí hoặc xem nhƣ có thể chấp nhận đƣợc ở trong nhuyễn thể hai mảnh
vỏ, mà không gây hại cho ngƣời sử dụng.
Bảng 1.2: Một số nƣớc đã đƣa ra qui định giới hạn tối đa cho
phép (ML) của các PSP nhƣ sau [13]:
Đất nƣớc/
Sản phẩm
Độc tố
Mƣ́c cho phép
Australia
Động vật có vỏ
Saxitoxin
80 µg/100g
Canada
Nhuyễn thể
PSP
<80µg/100g
Châu Âu
Nhuyễn thể
PSP
80µg/100g
Guatemala
Nhuyễn thể
Saxitoxin
400 MU/100g
HongKong
Động vật có vỏ
PSP
400 MU/100g
Nhâ ̣t
Nhuyễn thể
PSP
400 MU/100g
Hàn Quốc
Nhuyễn thể
Gonyautoxins
400 MU/100g
Úc
Động vật có vỏ
Na Uy
Tấ t cả
PSP
40-80 µg/100g
Panama
Nhuyễn thể
PSP
400 MU/100g
Singapore
Nhuyễn thể
Saxitoxin
80 µg/100g
Mỹ
Nhuyễn thể
PSP
80 µg/100g
Vùng lãnh thổ
Nguyễn Thị Nhung
6
PSP, NSP, DSP,
ASP
40-80 µg/100g
Trường ĐHKH Tự Nhiên
Nhận xét: Hiện nay Việt Nam chƣa đƣa ra qui định giới hạn tối đa cho phép
(ML) của các PSP. Vậy chúng tôi chấp nhận giá trị ML bằng 80 µg/100g là giá trị
ML của Mỹ và nhiều nƣớc khác.
1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
Ảnh hƣởng đến động vật giáp xác thân mềm.
Thủy triều đỏ là tên gọi khi vùng biển có hiện tƣợng nở hoa bùng phát của tảo.
Khi tảo nở hoa gây ảnh hƣởng xấu đến hàng loạt động vật giáp xác thân mềm
nhƣ nghêu, trai, sò vẹm, hàu. Những đợt bùng phát tảo nở hoa xảy ra ở cửa sông,
mặt biển nhanh chóng tích tụ những đám hoa. Sự nở hoa của tảo có khi làm nƣớc
biển có màu đỏ, có khi màu xanh, màu xám… Đa số các loài tảo nở hoa làm môi
trƣờng xấu đi, làm giảm lƣợng oxi hòa tan trong nƣớc làm cho động vật biển chết
hàng loạt [14].
Ở Việt Nam, hiện tƣợng thủy triều đỏ xuất hiện chủ yếu ở khu vực vùng biển
Nam Trung Bộ. Trong đó Bình Thuận là nơi hiện tƣợng này xảy ra thƣờng xuyên,
hàng năm từ tháng 3 đến tháng 9. Gần đây, trong khoảng tháng 3-6/2012 ở Cát
Bà Hải Phòng cũng đã xuất “thủy triều đỏ”, tuy nhiên loại tảo này có tên
Noctiluca scintillans không sinh độc tố, nên không có nguy cơ gây độc cho ngƣời
[11].
Ảnh hƣởng của tảo độc trong ao tôm.
Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon và P. orientalis ở Đài Loan, Trung
Quốc và Malaysia có nhiều giống tảo nở hoa do môi trƣờng giàu ding dƣỡng bao
gồm: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp,
chúng gây ra tình trạng thiếu oxy máu, tiết ra độc tố PSP, ASP làm giảm sinh
trƣởng ở tôm, gây bệnh, hoặc trực tiếp gây chết tôm.
Ở Việt Nam, tảo độc Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực Vân Phong thuộc
vùng biển Khánh Hòa đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ƣớc tính
Nguyễn Thị Nhung
7
Trường ĐHKH Tự Nhiên
khoảng 6 tỷ đồng.
Ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời.
Ở ngƣời, nhiễm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là do ăn phải nhuyễn thể
chứa độc tố này. Nhuyễn thể bị nhiễm và tích lũy các loại độc tố này là do ăn tảo
độc.
Dấu hiệu đầu tiên của sự nhiễm độc trên ngƣời xuất hiện khoảng 5-30 phút sau
khi ăn nhuyễn thể bị nhiễm với các triệu chứng: cảm giác kim châm hoặc tê nhẹ
đến liệt cơ hô hấp hoàn toàn. Trong trƣờng hợp nặng có thể tử vong do liệt cơ hô
hấp, xảy ra trong vòng từ 2-12h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc PSP.
Mỗi năm, các trƣờng hợp ngộ độc do PSP vẫn đƣợc ghi nhân trên toàn thế giới.
Từ năm 1970 có khoảng 1.600 trƣờng hợp ngộ độc do PSP đã đƣợc báo cáo, dặc
biệt là ở Bắc Mỹ và Châu Âu. Bên cạnh đó, có thêm khoảng 900 trƣờng hợp ngộ
độc PSP đƣợc ghi nhận ở các vùng trên thế giới mà trƣớc đó PSP chƣa đƣợc biết
đến.
Ở Nhật, trƣờng hợp ngộ độc đầu tiên đƣợc ghi nhận vào cuối những năm 1960. Ở
Malaysia, Philippin và Indonesia, các ca ngộ độc đầu tiên đƣợc báo cáo vào
những năm 1970 và đầu những năm 1980. Trong suốt 20 năm qua, dƣờng nhƣ có
sự gia tăng các vụ ngộ độc PSP do việc nuôi và tiêu thụ nhuyễn thể đƣợc mở
rộng.
Nhóm nhuyễn thể đƣợc xác định trong những vụ ngộ độc PSP gồm chủ
yếu động vật thân mềm hai mảnh vỏ gồm vẹm, ngao, hàu, điệp và sò. Cần chú ý:
do PSP tích lũy trong nhuyễn thể nên chúng có thể gây ngộ độc cho ngƣời cả khi
không có hiện tƣợng thủy triều đỏ. Tác dụng độc lên động vật.
PSP có thể gây độc lên nhiều động vật khác nhƣ cá, chim, ếch, gà, chuột, thỏ, chó
mèo. Trong các thí nghiệm trên động vật, PSP làm chết thú thử nghiệm do gây
liệt hệ thống hô hấp. Ngoài ra, PSP thể hiện tác dụng độc lên hệ thần kinh cơ, hệ
thần kinh trung ƣơng, hệ thống tim mạch và ở liều 1 µg/kg trọng lƣợng cơ thể đã
Nguyễn Thị Nhung
8
Trường ĐHKH Tự Nhiên
gây tăng huyết áp.
Hấp thụ và thải các độc tố PSP trong cơ thể thủy sản.
Trong quá trình lọc thức ăn, các tế bào và bào tử của tảo giáp đã chuyển vào thực
quản dạ dày của nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Nội tạng của nhuyễn thể chỉ chiếm
30% tổng khối lƣợng của mô mềm nhƣng lại chứa đến 96% tổng độc tố. Trong
cơ thể động vật nhuyễn thể, các độc tố tập trung nhanh chóng trong nội tạng và
sau giảm dần. Thành phần các độc tố không giống nhau mà biến đổi theo thời
gian và vị trí trong động vật. Cơ khép vỏ không tích lũy độc tố mà thực tế cho
thấy đã làm bất hoạt độc tố. Ống tiêu hóa, màng, tuyến sinh dục và mô mang giữ
lại độc tố với trọng lƣợng khác nhau giữa các mô và giữ các loài. Sau khi hấp thụ
và phân bố, các độc tố có thể bị biến đổi. Các loài hai mảnh vỏ có cách xử lý và
phản ứng với PSP khác nhau và sự nhạy cảm của chúng với độc chất này cũng
khác nhau, ví dụ: vẹm tích lũy các độc tố PSP nhiều hơn hàu trong cùng hoàn
cảnh. Các nghiên cứu nuôi trong phòng thí nghiệm cho thấy vẹm hấp thụ dễ dàng
các độc tố của tảo giáp nhƣng với lƣợng độc tố tƣơng đƣơng nhƣ thế thì hàu
ngừng lọc.
1.2. Các phƣơng pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ
Có hai nhóm phƣơng pháp chính để xác định các độc tố sinh học biển
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bao gồm nhóm phƣơng pháp sinh học và nhóm
phƣơng pháp hoá học:
1.2.1. Các phƣơng pháp thử sinh học
Thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phƣơng pháp thử nghiệm
chính trong hầu hết các chƣơng trình giám sát ngộ độc thủy sản. MBA đƣợc sử
dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phƣơng pháp chính thức
của AOAC.
Nguyễn Thị Nhung
9
Trường ĐHKH Tự Nhiên
PSP trong mẫu đƣợc chiết tách bằng dung dịch HCl 0,1N, dịch chiết đƣợc
tiêm vào chuột theo tỷ lệ 1 mL dịch/20 g chuột, quan sát biểu hiện của chuột
trong vòng 60 phút và xác định thời gian chết của chuột. Dựa vào thời gian chết
của chuột tra bảng Sommer sẽ xác định đƣợc giá trị đơn vị chuột (MU), từ đó
tính đƣợc nồng độ độc tố PSP trong mẫu [23], [30].
Tác giả Đào Việt Hà – Viện Hải Dƣơng Học Nha Trang [1] đã tiến hành
thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA.AOAC 1990) để xác định hàm lƣợng độc
tố PSP trong nghêu Meretrix lyrata tại một số vùng nuôi trọng điểm khu vực Cần
Giờ. Tác giả đã tiến hành tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng (Swiss wiss) (có trọng
lƣợng 20g ± 2g) 1 mL dịch chiết thô, sau đó theo dõi triệu chứng và thời gian
chết của chuột (nếu xảy ra). Tính toán độc lực tổng dựa theo phƣơng pháp
AOAC, 1990. Kết quả cho thấy, hàm lƣợng độc tố PSP ở tất cả các mẫu đều dƣới
mức độ phát hiện của phƣơng pháp MBA (36 µg/100g, với hệ số CF = 0.18).
-
Ƣu điểm: thời gian thực hiện nhanh, có khả năng đánh giá đƣợc tổng các
độc tố và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp.
-
Nhƣợc điểm là độ nhạy thấp, không thể tự động hóa, không định danh
chính xác loại chất độc, bị ảnh hƣởng bởi các đặc tính động vật và đặc biệt là vấn
đề đạo đức [22], [23]. Do đó, nhóm phƣơng pháp này hiện nay không còn đáp
ứng đƣợc nhu cầu và dần đƣợc thay thế bằng các phƣơng pháp hoá học .
1.2.2. Phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA
ELISA (Enzym-linked immunosorbent assay) là một kĩ thuật sinh hóa để
phát hiện kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu xét nghiệm, và thƣờng đƣợc
quan sát bởi sự thay đổi màu sắc. Usleber và cộng sự bằng cách sử dụng các
kháng thể đa dòng đã phát triển thành công kit thử nghiệm cho STX. Giới hạn
phát hiện là 4 ng/g mô nhuyễn thể [26].
-
Ƣu điểm: Dễ thực hiện và thời gian phân tích ngắn.
Nguyễn Thị Nhung
10
Trường ĐHKH Tự Nhiên
-
Nhƣợc điểm: chi phí mua kit thử đắt, không có khả năng định danh và
phân loại các thành phần của độc tố PSP. Do đó, khi phát hiện mẫu thử dƣơng
tính phải dùng phƣơng pháp sắc ký để kiểm tra [23].
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang
(HPLC-FLD) là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất trong phân tích các PSP
và AOAC 2005:06.
Ƣu điểm của phƣơng pháp là có độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Nhƣợc điểm là tốn thời gian vì các PSP phải đƣợc dẫn xuất hóa trƣớc cột
hoặc sau cột để phân tích bằng detector huỳnh quang. Ngoài ra, việc xác định
PSP phức tạp hơn do sự chồng chéo các sản phẩm oxi hóa các chất tƣơng tự PSP
trong trƣờng hợp oxi hóa trƣớc cột.
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp HPLC-FLD để xác
định PSP
TLTK và
Nền mẫu và điều kiện phân tích
Tác giả
Kết quả
- Nền mẫu: sinh khối tảo khô
- Điều kiện sắc kí
LOD =
+ Cột C18
+ Kênh
Etheridge
A:
acid
heptanesulfonic
[12]
6
octanesulfonic
mmol/L,
và
ammonium
photphat 48 mmol/mL và tetrahydrofuran
B:
acid
heptanesulfonic
(µg/g)
LOQ =
0,07
0,75% trong nƣớc
+ Kênh
0,035
7
octanesulfonic
mmol/L,
và
(µg/g)
ammonium
photphat 48 mmol/mL, tetrahydrofuran 1% và
Nguyễn Thị Nhung
11
Trường ĐHKH Tự Nhiên
ACN 10% trong nƣớc
+ Oxi hóa trƣớc cột
+ Tốc độ dòng 1 mL/phút
+ Bƣớc sóng kích thích: 330 nm
+ Bƣớc sóng phát xạ: 390 nm.
- Nền mẫu: Trai, nghêu, sò, hàu
LOD =
- Điều kiện sắc kí
0,017
+ Cột Angilent Zorbax Bonus RP (3,5 µm; 4,7 x
µg/g
150 mm)
+ Kênh A: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 5,5
Wiberg
[27]
LOQ =
0,051
mM trong nƣớc (pH = 7,1)
+ Kênh B: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 16,5
mM, methylnitril 11,5% trong nƣớc (pH = 7,1)
µg/g
Độ thu
+ Oxi hóa sau cột
hồi: 88%
+ Tốc độ dòng 0,8 mL/phút
– 113%
+ Bƣớc sóng kích thích và phát xạ: 330 nm và 390
nm
- Nền mẫu: Hàu, sò, hến
- Điều kiện sắc kí
LOD =
+ Cột Supelcosil LC-18 (5 µm; 4,6 x 15 mm)
+ Kênh A : ammonium formate 0,1 M
Llewellyn
+ Kênh B : ammonium forrmate 0,1 M trong 5%
[20]
ACN/H2O (pH = 6)
+ Oxi hóa trƣớc cột
+ Tốc độ dòng 2 mL/phút
+ Bƣớc sóng kích thích: 330 nm
0,02 µg/g
LOQ =
0,06 µg/g
Độ thu
hồi: 70 –
104%
+ Bƣớc sóng phát xạ: 390 nm
Nguyễn Thị Nhung
12
Trường ĐHKH Tự Nhiên
1.2.4 Kỹ thuật điện di
Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tƣơng đối mới đã đƣợc phát triển
và ứng dụng trong lĩnh vực phân tích độc tố . Điê ̣n di mao quản là mô ̣t kỹ thuâ ̣t
tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau c ủa các phân
tƣ̉ chấ t mang điê ̣n tích trong cô ̣t mao quản dƣới ảnh hƣởng của điê ̣n trƣờng ta ̣o
bởi điê ̣n áp cao thế (15 – 30 kV) đă ̣t vào hai đầ u mao quản . Các độc tố này di
chuyển qua cột khi điện áp cao đƣợc áp vào và có th ể đƣợc phát hiện khi chúng
đi qua một detector UV hoặc huỳnh quang. Kỹ thuật này đƣợc áp dụng cho các
hợp chất mang điê ̣n , và thậm chí khi không có điện tích nó có thể hợp chất bẫy
trong mixen mà sau đó sẽ di chuyển.
Wright và cô ̣ng sƣ̣ (1989) [29] áp dụng một hệ thống CE cùng với một
máy dò huỳnh quang để xác định STX. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các STX
ở cấp µg /kg. Mặc dù khối lƣợng tiêm là nhất thiết phải nhỏ (1-10 nL), giới hạn
phát hiện lý thuyết cho các mẫu nằm trong khoảng pg/kg. Những nhƣợc điểm
hiện nay với kỹ thuật là không xác đinh
̣ đƣơ ̣c độc tố hỗn hợp.
Thibault và cô ̣ng sƣ̣ (1991) đã áp dụng một phƣơng pháp CE cho các mẫu
sinh vật biển. Sƣ̣ phân tách của Neo và STX đã đạt đƣợc và sử dụng phép đo phổ
UV với gi ới hạn phát hiện cỡ 1,5 µg/mL. Các tác giả cho rằng kỹ thuật CE-UV
có thể áp dụng cho vi ệc kiểm tra thƣờng xuyên các chất độc trong các chiết xuất
tự nhiên, nhƣng giới hạn phát hiện hiện nay là quá cao đ ể có thể sử dụng trong
các chƣơng trình giám sát.
1.2.5 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS)
Gần đây phƣơng pháp sắc kí lỏng tƣơng tác ƣa nƣớc kết hợp với detector
2 lần khối phổ cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao khi phân tích các PSP (HILICMS/MS).
Liyang Zuo [31] đã sử dụng kĩ thuật QuEChERS (nhanh, dễ dàng, giá rẻ,
hiệu quả, bền và an toàn) cho việc tách chiết, làm sạch và phát hiện 10 độc tố
PSP trong thực phẩm biển bằ ng HILIC-MS/MS ở chế đô ̣ ESI dƣơng.
Nguyễn Thị Nhung
13
Trường ĐHKH Tự Nhiên
-
Nền mẫu: nhuyễn thể + cá.
-
Dung môi chiết: ACN/H2O (90:10, v/v).
-
Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ HLB và than hoạt tính GCB).
-
Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80® (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: HCOOH 0,1% trong ammonium formate 2 mmol/L.
+ Kênh B: HCOOH 0,1% trong ACN.
+ Chạy theo chƣơng trình gradient.
Kết quả: Các nghiên cứu ở ba mức thêm chuẩn PSP trong khoảng 8,1-
225,5 µg/kg cho độ thu hồi trung bình từ 71,3% đến 104,6% với độ lệch chuẩn
tƣơng đối (RSD) ≤ 15,8%.
Mattarozzi [21] đã tối ƣu hóa phƣơng pháp xử lý mẫu bằng kĩ thuật
QuEchERS để phân tích độc tố PSP bằng phƣơng pháp HILIC-MS/MS.
-
Nền mẫu: trai.
-
Dung môi chiết: HCOOH 0,1%.
-
Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ polymeric ABS Elut – NEXUS).
-
Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80 (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: acetonitril 95% với 5% là amoni format 20 mM và acid
formic 26 mM (pH = 3,2).
+ Kênh B: 95% nƣớc và 5% là amoni format 20 mM và acid formic
26 mM (pH = 3,2).
+ Chạy theo chƣơng trình gradient.
Kết quả: Phƣơng pháp cho giới ha ̣n phát hiê ̣n của các PSP là
3 µg/kg,
giới hạn định lƣợng là 7 µg/kg; hiê ̣u suấ t thu hồ i trong khoảng tƣ̀ 98 – 109% tại
mƣ́c thêm chuẩ n LOQ và mƣ́c giƣ̃a đƣờng chuẩ n xây dƣ̣ng .
Aversano [10] đã tiến hành phân tích các độc tố PSP bằng phƣơng pháp
HILIC-MS. Nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát dung môi pha động và lựa chọn
Nguyễn Thị Nhung
14
Trường ĐHKH Tự Nhiên