Xác định đồng thời thành phần caffeine, theobromine và theophylline trong một số loại chè phân bố ở miền bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE
VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN
BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội –2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE
VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN
BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số:60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Văn Ri, Bộ môn
Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà
Nội đã giao đề tài này cho tôi và tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm
quý báu cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Chu Đình Bính đã định hƣớng nghiên cứu
cho luận văn này, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Chu Ngọc Châu đã tận tình hƣớng dẫn
và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Để hoàn thành đƣợc luận văn này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của
các thầy cô tại Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự
Nhiên.
Xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Công nghiệp rừng,
Bộ môn Bảo quản Lâm sản đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn của tôi đƣợc hoàn
thành.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những ngƣời đã quan tâm giúp
đỡ và động viên, khuyến khích tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Hà Nội, Ngày 08 tháng 12 năm 2016
Học viên cao học

Đoàn Thị Bích Ngọc

i


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................10

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................12
1.1. Tổng quan Chè (Camellia sinensis (L.) Kuntze) ............................................12
1.1.1.Nguồn gốc và phân loại các loài Chè .......................................................12
1.1.2. Thành phần hoá học của chè ...................................................................13
1.2. Hoạt tính của nhóm ankaloid. ........................................................................15
1.2.1. Hoạt tính sinh học của caffeine. ..............................................................15
1.2.2. Hoạt tính sinh học của theophyline .........................................................17
1.2.3. Hoạt tính sinh học của theobromine .......................................................18
1.3.Các phƣơng pháp phân tích thành phần ankaloid. ..........................................18
1.3.1. Phƣơng pháp điện di mao quản ...............................................................18
1.3.2. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại gần ...........................................................19
1.3.3. Phƣơng pháp phổ Raman ........................................................................21
1.3.4. Phƣơng pháp sắc lỏng .............................................................................22
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU Error!
Bookmark not defined.
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu. Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu .......... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................... Error! Bookmark not defined.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC.................. Error!
Bookmark not defined.
2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngƣợc RP-HPLC ..... Error! Bookmark not defined.

ii


2.2.3. Detector UV-Vis ...................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.4. Phân tích định lƣợng bằng HPLC ........... Error! Bookmark not defined.
2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu. ...... Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Dụng cụ ................................................... Error! Bookmark not defined.

2.3.2. Thiết bị .................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.3. Hóa chất .................................................. Error! Bookmark not defined.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN ................ Error! Bookmark not defined.
3.1. Khảo sát các điều kiện xác định đồng thời caffeine, theobromine và
theophylline bằng phƣơng pháp HPLC ................. Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký ............... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Khảo sát điều kiện chiết mẫu. ................. Error! Bookmark not defined.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ................... Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn xác định đồng
thời caffeine, theophylline và theobromine....... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ. ... Error!
Bookmark not defined.
3.2.3. Độ chụm (độ lặp lại) ............................... Error! Bookmark not defined.
3.2.4. Độ đúng (độ thu hồi) ............................... Error! Bookmark not defined.
3.2.5. Đánh giá, so sánh kết quả phân tích caffeine trong mẫu chè bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong luận văn.Error! Bookmark not defined.
3.3. Phân tích mẫu thực ......................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1 Phân tích mẫu lá chè. ............................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2 Phân tích mẫu búp chè. ............................ Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Đánh giá kết quả phân tích ...................... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ............................................................... Error! Bookmark not defined.

iii


TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................23
PHỤ LỤC .................................................................. Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC BẢNG:
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè.....................................................................13

Bảng 1.2: Tổng quan các phƣơng pháp RP-HPLC gần đây cho việc xác định các
methylxanthine. ......................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.1: Bảng địa điểm lấy mẫu búp chè và lá chè.Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1: Mối quan hệ giữa bƣớc sóng và diện tích picError!

Bookmark

not

defined.
Bảng 3.2: Khảo sát dung môi pha động .................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.3: Khảo sát pH pha động .............................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4: Khảo sát thành phần pha động.................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.5: Khảo sát sự thay đổi tốc độ pha động....... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.6: Khảo sát dung môi chiết mẫu chè............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7: Khảo sát khả năng chiết mẫu chè tại năm cấp nhiệt độ khác nhau. . Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.8: Khảo sát các thời gian chiết mẫu chè khác nhauError! Bookmark not
defined.
Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% đƣợc sử
dụng trong quá trình chiết. ........................................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.10: Điều kiện tối ƣu xác định đồng thời TB, TP và CF trong chè ........ Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính........ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.12: Bảng giá trị đánh giá sai số hệ thống của các đƣờng chuẩn. .......... Error!
Bookmark not defined.

iv

Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện tính theo phƣơng trình hồi quyError!

Bookmark

not defined.
Bảng 3.14: Giới hạn định lƣợng theo phƣơng trình hồi quy.Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.15: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.16: Bảng tính toán kết quả độ lặp của phép đoError!

Bookmark

not

defined.
Bảng 3.17: Độ lặp của phƣơng pháp trên mẫu chè. .. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.18: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ...... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.19: Độ thu hồi của phƣơng pháp phân tích... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.20: Kết quả xác định phần trăm caffeine trong các mẫu chè tại hai phòng thí
nghiệm. ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.21: Bảng chi tiết các địa chỉ lấy mẫu lá chè. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.22: Kết quả phân tích đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong
mẫu lá chè.................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.23: Đánh giá các kết quả phần trăm ankaloid trong các mẫu lá chè ở các tỉnh
khác nhau theo phƣơng pháp song sánh các giá trị trung bìnhError! Bookmark not
defined.
Bảng 3.24. Bảng chi tiết các địa chỉ lấy mẫu búp chè.Error!

Bookmark

not

defined.
Bảng 3.25: Kết quả phân tích đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong
mẫu búp chè .............................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.26: Độ lệch chuẩn tƣơng đối của các mẫu búp chè đã đo đƣợc ở các tỉnh
khác nhau................................................................... Error! Bookmark not defined.

v


Bảng 3.27: Đánh giá các kết quả phần trăm ankaloid trong các mẫu búp chè ở các
tỉnh khác nhau theo phƣơng pháp song sánh các giá trị trung bìnhError! Bookmark
not defined.
Bảng 3.28: Tỉ lệ phần trăm khối lƣợng các ankaloid trong mẫu lá và mẫu búp chè.
................................................................................... Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC HÌNH VẼ:
Hình 1.1: Cấu trúc của caffeine, theophyline và theobromine..................................15
Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống HPLC .............................. Error! Bookmark not defined.
Hình 2.2: Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-ATVP của Shimazu Nhật
Bản ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ cực đại của theobromine, theophylline và caffeine ...... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.2: Mối quan hệ giữa bƣớc sóng và diện tích pic.Error!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.3: Sắc đồ khảo sát hai loại cột ....................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4: Khảo sát dung môi pha động .................... Error! Bookmark not defined.

vi


Hình 3.5: Sắc đồ khảo sát pH pha động .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.6: Ảnh hƣờng của %ACN đến diện tích pic và thời gian lƣu. .............. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát thành phần pha động ....... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.8: Ảnh hƣởng của tốc độ pha động đến diện tích pic.Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.9: Sắc đồ khảo sát tốc độ pha động. .............. Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10. Quy trình phân tích ankaloid trong chè ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.12: Sắc đồ khảo sát dung môi chiết mẫu chè.Error!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.13: Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.14: Sắc đồ các điểm nhiệt độ chiết mẫu khác nhauError!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.15: Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.16: Sắc đồ tại các thời gian chiết mẫu khác nhauError!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.17: Ảnh hƣởng của lƣợng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% với diện tích pic.
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.18: Sản phẩm phản ứng của EGCG với amoniac.Error!

Bookmark

not

defined.
Hình 3.19: Sắc đồ khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng dung dịch NH3 1%/ Etanol 60%
đƣợc sử dụng trong quá trình chiết. .......................... Error! Bookmark not defined.

vii


Hình 3.20: Khảo sát khoảng tuyến tính của (a) theobromine, (b) theophylline và (c)

caffeine. ..................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.21: Đƣờng chuẩn của (a) theobromine, (b) theophylline và (c) caffeine.
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.22: Độ lệch chuẩn tƣơng đối của các ankaloid ở các nồng độ khác nhau.
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.23: Độ thu hồi của các ankaloid ở các nồng độ khác nhau.Error! Bookmark
not defined.
Hình 3.24: Phần trăm khối lƣợng các ankaloid trong các mẫu lá chè .............. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.25: Phần trăm khối lƣợng các ankaloid trong các mẫu búp chè ........... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.26: Tỉ lệ ba thành phần ankaloid trong mẫu búp với mẫu lá chè .......... Error!
Bookmark not defined.

viii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MeOH

: Methanol

TB

: Theobromine

TP

: Theophylline

CF

: Caffeine

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

NIR

: Phổ hồng ngoại gần
(Near-infrared spectroscopy)

FTIR

: Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier
Fourier transform infrared spectroscopy)

LOD

: Giới hạn phát hiện
(Limit of detection)

LOQ

: Giới hạn định lƣợng
(Limit of quantitation)

SD

: Độ lệch chuẩn
(Standard deviation)

RSD

: Độ lệch chuẩn tƣơng đối
(Relative standard deviation)

ix


10


MỞ ĐẦU
Chè xanh có tên khoa học Camellia sinensis(L.) Kuntze. Nó là một loại thức uống rất
phổ biến trên thế giới, ở các nƣớc châu Á đặc biệt là vùng Đông Á. Chè là một phần
không thể thiếu trong nền văn hóa cũng nhƣ ẩm thực. Việt Nam cũng đã trồng và sử dụng
chè từ hàng nghìn năm nay. Chè đƣợc phân loại theo từng vùng xuất xứvà có hƣơng vị
đặc trƣng riêng. Ở Việt Nam có một số vùng trồng chè có hƣơng vị chè vƣợt trội hơn các
vùng khác nhƣ là Thái Nguyên, Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ…Khi uống chè ta thấy hệ
thần kinh trung ƣơng và dạ dày đƣợc kích thích, đồng thời cảm thấy có vị đắng và tê tê ở
đầu lƣỡi. Thành phần chính dẫn đến các cảm giác đó là do nhóm ankaloid có trong chè
bao gồm caffeine (1,3,7-trimethylxanthine), theobromine (3,7-dimethylxanthine), và
theophylline (1,3-dimethylxanthine). Caffeine trong chè chiếm khoảng 2-5% khối lƣợng
khô. Theobromine và theophylline với hàm lƣợng khô nhỏ hơn nhiều so với hàm lƣợng
của caffeine, chiếm khoảng

0,33% khối lƣợng chất khô [7], nhƣng chúng có vai trò về

dƣợc tính quan trọng hơn so với caffeine.
Hiện nay, việc phát triển các phƣơng pháp phân tích để xác định đồng thời caffeine,
theobromine, và theophylline trong các sản phẩm thực phẩm, dịch sinh học và đồ uống
hoặc sô cô la, cũng nhƣ trong quá trình sản xuất dƣợc phẩm đang rất đƣợc quan tâm. Một
số phƣơng pháp phân tích khác nhau đã đƣợc đề xuất để xác định những methylxanthine
này. Tuy nhiên, chỉ có một vài phƣơng pháp trong đó có phƣơng pháp sắc ký có khả năng
tách biệt hoàn toàn ba hợp chất theobromine, theophylline và caffeine trong mẫu phân
tích mà bƣớc xử lý mẫu trƣớc khi đo đơn giản và cho giới hạn phát hiện thấp. Trong
nghiên cứu này, một phƣơng pháp phân tích đã đƣợc phát triển để xác định đồng thời
caffeine, theobromine và theophylline trong chè bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao pha đảo (HPLC) với bộ phát hiện UV, cho phép bơm trực tiếp mẫu mà không cần xử
lý trƣớc, ngoại trừ một bƣớc lọc. Phƣơng pháp này có thời gian lƣu ít hơn 12 phút và cho
giới hạn phát hiện thấp.

11


Dựa trên những lý do đó, tôi đã lựa chọn tên luận văn: “Xác định đồng thời thành
phần caffeine, theobromine, và theophylline trong một số loại chè phân bố ở Miền
Bắc Việt Nam”

12


Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan Chè (Camellia sinensis(L.) Kuntze)
Tên Khoa học: Camellia sinensis (L.) Kuntze.
Tên tiếng Việt: Chè, Trà.
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại các loài Chè

Nguồn gốc
Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên đƣợc phát hiện bởi ngƣời Trung Quốc. Ngày
nay, cây chè đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Đến nay có 56 nƣớc trồng chè, sản xuất và chế biến chè ở các quy mô khác nhau, phân bố
ở khắp 5 châu.
Các vùng trồng chè ở Việt Nam
Cây chè đƣợc trồng nhiều ở Việt Nam, nó đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhƣ:
-

Tây Bắc: Sơn La, Lai Châu, Điện Biên, Yên Bái.

-

Đông Bắc: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng.

-

Trung du và miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội, Vĩnh
Phúc.

-

Phía bắc miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Tây Nguyên, Lâm Đồng,
Gia Lai, Kon Tum.

Phân loại
Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh cây chè, chè
đƣợc chia làm 4 loại:
a. Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. Macrophylla)
b. Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. Bohea)

c. Chè Shan (Camellia sinensis var. Shan)
d. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica)
Cả 4 loại trà trên đều có trồng ở Việt Nam nhƣng phổ biến nhất là 2 loại trà: trà
Camellia sinesisvar.Macrophy và trà Camellia sinesisvar.Shan.
13


- Camellia sinensisvar. Macrophylla đƣợc trồng nhiều nhất ở các tỉnh trung du với
các tên gọi của địa phƣơng (theo màu sắc lá) nhƣ: Trung du lá xanh, Trung du lá vàng,
v.v...
- Camellisa sinensisvar. Shan đƣợc trồng ở miền núi các tỉnh miền bắc và ở phía nam
Tây Nguyên (Lâm Đồng). Ở mỗi địa phƣơng có các giống khác nhau nhƣ: Shan Mộc
Châu, Shan Tham Vè, Shan Trấn Ninh ... [3]
1.1.2. Thành phần hoá học của chè
Thành phần hóa học của chè biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống, điều
kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác.Để khảo sát đặc tính lý, hóa của chè, ta sẽ tìm
hiểu thành phần các chất có trong lá chè, từ đó tìm hiểu vai trò và ý nghĩa của nó.
Hiện nay thành phần lá trà đƣợc mô tảkhá đầy đủthành phần lá trà đƣợc mô tả trong bảng
1.1 sau [1]:
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè
Hàm lƣợng (%)
75-80

Thành phần
Nƣớc
Flavanol:
(-) Epigallocatechin gallate (EGCG)
(-) Epicatechin gallate (ECG)
(-) Epigallo catechin (EGC)
(-) Epicatechin (EC)

(+) Catechin (C)
(+) Gallcatechin (GC)
Caffeine
Theobromine
Theophylline
Acid hữu cơ (citric, malic, oxalic,…)
Đƣờng (glucose, fructose, saccharose, raffinose, stachyose)
Xơ (cellulose, hemicellulose, lignin)
Protein và acid amin
Lipid
Khoáng
Chất màu (carotenoid, chlorophyl)
14

8-12
3-6
3-6
1-3
1-2
3-4
3-4
0,33
0,33
0,5-0,6
4-5
4-7
14-17
3-5
5-6
0,5-0,6

Enzyme
1.1.2.1.Nƣớc
Nƣớc là thành phần chủ yếu trong búp chè. Trong búp chè (1 tôm + 3 lá) hàm lƣợng
nƣớc thƣờng có từ 75-82%. Hàm lƣợng nƣớc trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi
cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn hái…
1.1.2.2.Polyphenol
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần đƣợc quan tâm nhiều nhất trong lá chè.
Các hợp chất polyphenol của lá chè rất khác với các hợp chất polyphenol đƣợc tìm thấy
trong các loại cây khác. Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC, EGCG,
EGC, ECG…). Ngoài ra, trong thành phần polyphenol của chè còn có một số chất khác tỉ
lệ thấp nhƣ các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin...) các dẫn xuất glucoside nhƣ
myricetin - 3 - glucoside, kaempferol-3 rhamnodiglucoside..., các leucoanthocyanin, các
hợp chất polyflavonoit nhƣ theaflavin (theaflavin-3-gallate, theaflavin-3'-gallate,
theaflavin-3,3'-digallate...), thearubigin (procyanidine, procyanidine gallate...). Các dạng
hợp chất nhƣ theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp chè và lá chè non
nhƣng tăng dần tỉ lệ trong các lá chè già hơn [7].
1.1.2.3.Alkaloid
Alkaloid là nhóm hợp chất vòng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân tử. Phần lớn các
alkaloid là những chất không màu, có vị đắng và ít hòa tan trong nƣớc. Trong lá chè,
ngƣời ta tìm thấy các alkaloid chủ yếu là caffeine, theobromine và theophylline. Trong
đó, caffeine chiếm khoảng 2 – 5% lƣợng chất khô; theobromine và theophyllinevới hàm
lƣợng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lƣợng của caffeine, chiếm khoảng 0,33%khối lƣợng
chất khô. Tuy vậy, vai trò của theobromine và theophylline trong dƣợc tính của cây chè
quan trọng hơn so với caffeine [7]. Nhóm ankaloid này cũng góp phần tạo nên hƣơng vị
đắng của chè. Mức độ của các hợp chất phụ thuộc vào giống, độ tuổi và khí hậu của chè
đƣợc sử dụng.

15

1.1.2.4. Protein và axit amin
Protein trong búp chè phân bố không đều, chiếm khoảng 15% tổng lƣợng chất
khô của lá chè tƣơi. Các axit amin cơ bản trong lá chè bao gồm: aspartic, arginin,
alutamic, serin, glutamin, tyrosin, valin, phenylalanin, leucin, isoleucin và theanin …
Trong đó theanin chiếm hàm lƣợng cao nhất, khoảng 50-60% tổng hàm lƣợng axit
amin tự do. Theanin là axit amin đặc trƣng của cây chè, theanin chỉ có thể đƣợc tìm
thấy ở các cây họ chè và một số ít các loài nấm [1]

1.2. Hoạt tính của nhóm ankaloid.
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ hấp dẫn nhất và có nhiều nghiên cứu rất quan tâm
đến chúng. Các chất caffeine, theophylline và theobromine trong nhóm ankaloid đều là
những chất thông dụng và đƣợc con ngƣời sử dụng hàng ngày. Các alkaloid đó có các
hoạt tính dƣợc lý nhƣ tác nhân trị liệu sinh học. Mặc dù cấu trúc hóa học của chúng:
caffeine (1,3,7-trimethylxantine), theophylline (1,3 dimethylxantine) và theobromine
(3,7-dimethylxantine) rất giống nhau, các hoạt tính sinh học rất khác nhau; Ví dụ, trong
tác dụng lợi tiểu thứ tự dƣợc tính tăng: caffeine < theophylline thứ tự các hiệu ứng trên thần kinh trung ƣơng nhanh chóng giảm dần. Cấu trúc hình học
và điện tử của các alkaloid phản ánh rõ dƣợc tính của chúng.

Hình 1.1: Cấu trúc của caffeine, theophyline và theobromine.
1.2.1. Hoạt tính sinh học của caffeine.
Caffeine là một hoạt chất có dƣợc tính. Tùy thuộc vào liều lƣợng, nó có thể gây
kích thích nhẹ đối với hệ thần kinh trung ƣơng. Bất kì tác động dƣợc lý nào của caffeine
đều nhất thời, thông thƣờng tác dụng này sẽ ngƣng sau vài giờ. Caffeine không tích
16


tụtrong cơ thể theo thời gian sử dụng. Nó thƣờng bài tiết và thải ra ngoài sau vài giờ

sửdụng. Một số ngƣời có thể bị mất ngủ do caffeine. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu
cho thấy rằng những ngƣời tiêu thụ caffeine có trí nhớ tăng và cải thiện khả năng tranh
luận. Và những ngƣời này có thành tích cao trong khả năng vận động, cải thiện khả
năngluyện tập thính giác thị giác. Tùy theo hàm lƣợng hấp thu, caffeine có thể gây kích
thích nhẹ. Đôi khi nó cũng dẫn đến việc gây nghiện ở một số ngƣời. Triệu chứng thƣờng
thấy nhất là đau đầu, mệt lả hoặc trạng thái mơ màng. Sự đau đầu có thể xuất hiện sớm
nhất sau khi sử dụng lƣợng caffeine cuối cùng khoảng 18 giờ. Các tác động này thƣờng
không kéo dài, khoảng một ngày hoặc hơn và thƣờng giảm dần khi giảm lƣợng caffeine
sử dụng. Ngoài ra, caffeine còn có tác dụng giảm đau đầu, giúp con ngƣời cảm thấy
năngđộng. Kích thích hệ thần kinh trung ƣơng, làm tinh thần minh mẫn, tăng hiệu suất
làmviệc.
Caffeine có thể làm tăng hiệu quả diệt tế bào ung thu của thuốc chống ung thƣ. Các
chất gây phá hủy DNA và có thể có thể hỗ trợ trong việc khắc phục sự kháng thuốc tự
nhiên [50]. Bức xạ ion hóa và các tác nhân alkyl hóa làm tăng hiệu lực độc của caffeine
đối với các tác nhân phá hoại DNA. Shoyab [43] đề xuất rằng tác nhân chống u ung thƣ
của caffeine có thể liên quan đến khả năng ức chế sự tạo liên kết các chất chuyển hóa
hoạt động của các chất gây ung thƣ đối với chuỗi DNA tế bào.Do đó caffeine có thể đƣợc
sử dụng trong việc điều chỉnh hoạt tính của các loại thuốc thêm vào trong cơ thể. Sự kết
hợp của caffeine với adriamycin (một loại thuốc chống ung thƣ) có thể làm tăng đáng kể
hoạt tính kháng u trong cơ thể mà không làm tăng tác dụng phụ của nó.Caffeine ức chế
các hoạt chất gây ung thƣ trong khói thuốc lá, nhƣng việc sử dụng đồng thời chất caffeine
và thuốc lá tạo thành một mối nguy hại lớn đối với thai nhi đang phát triển [12]. Caffeine
làm giảm lƣợng paracetamol do đólàm giảm độc tính cho gan. Anderson và đồng nghiệp
[40] đã chỉ ra rằng caffeine làm tăng epinephrine trong huyết tƣơng, tăng tiêu thụ oxy và
chuyển hóa carbohydratee, trong khi giảm quá trình chuyển hóa lipid. Caffeine cũng làm
thay đổi hoạt động tim mạch bằng cách gia tăng động mạch huyết áp.

17

1.2.2.Hoạt tính sinh học của theophyline
Theophylline thƣờng đƣợc sử dụng để ngăn ngừa và điều trị thở khò khè, hơi thở
nặng nề, tức ngực trong bệnh hen suyễn, viêm phế quản mạn tính, khí thủng phổi và một
số bệnh về phổi khác. Thuốc có tác dụng mở rộng đƣờng dẫn khí ở phổi, giúp bạn dễ thở
hơn.
Hoạt tính sinh học của theophylline đƣợc ứng dụng rộng rãi và có tác dụng nhanh
chóng. Ito và đồng nghiệp(2002) [28] cho thấy với liều lƣợng thấp theophylline có tác
dụng chống hen suyễn bằng việc tăng hoạt hóa của HDAC sau đó đƣợc tập hợp bởi
corticosteroid để ngăn chặn các gene gây viêm. Nó còn có hoạt tính chống viêm thích
hợp để điều trị hen phế quản, khi đƣợc thêm vào thuốc làm giãn phế quản và làmgiảm
hàng đờm. Taheuchi et al, (1999), [45] thấy rằng theophyline có thể chết tế bào
eosinoplies ở bệnh nhân hen phế quản, và hiệu quả lâm sàng của nó có thể làm giảm các
tế bào viêm trong đƣờng hô hấp. Theophyline cũng tăng cƣờng chuyển hóa lipid từ các
mô mỡ, sau đó kích thích sự chuyển dịch carnitine vào các mô thận để tạo nhóm acylcarnitine cho quá trình oxy hóa tiếp theo bên trong ti thể.
Việc điều trị kéo dài sử dụng theophylline có thể tăng hoặc giảm phản ứng miễn dịch,
tùy thuộc theo liều dùng, thông qua các modul chuyên biệt mà ảnh hƣởng đến hoạt tính
adenosine deaminase và tình trạng corticosteroid của tiểu cầu. Việc điều trị bằng
theophyline ở liều phù hợp có thể không tạo nên tác dụng phụ đối với độ chắc xƣơng,
nhƣng đối với bệnh nhân sử dụng liều lớn cần phải đƣợc theo dõi kỹ càng để kiểm soát
tình trạng khối xƣơng. Heparin và theophylline ở liều trung bình có hiệu quả kích hoạt
các enzyme chuyển hóa, giữ cho thời gian hoạt động của tinh trùng lâu hơn, và hiệu quả
kìm hãm các tinh trùng hoạt tính quá cao. Theophyline làm tăng lƣợng glucocorticoid
trong huyết thanh, và đƣợc sử dụng nhƣ chất giãn cơ hoặc giãn mạch máu, và cũng hiệu
quả nhƣ là một chất kích thích lợi tiểu và tim mạch [37]. Nhƣng nó có nguy cơ gây loét
cao, tăng sự phát triển của sâu răng và hiệu ứng này có thể liên quan đến cơ chế làm thay
đổi thành phần của nƣớc bọt.

18

1.2.3. Hoạt tính sinh học của theobromine
Theobromine là một chất kích thích thần kinh trung ƣơng nhẹ, nhƣng có tính lợi tiểu
mạnh hơn, kích thích tim và làm giãn nở động mạch vành mạnh hơn caffein.
Theobromine ức chế sự tăng Adriamycin trong quy mô thí nghiệm, tăng hoạt tính chống
gây u của Adriamycin và nồng độ Adriamycin trong các khối u [39] mà không tạo ra ảnh
hƣởng đối với tim và gan. Theobromine còn ức chế sự tăng doxorubicin từ các tế bào u,
tăng nồng độ doxorubin trong u và nâng cao hiệu quả chống u của doxorubicin.
Theobromine ức chế mạnh mẽ các tác nhân sinh u từ gốc urethane. Theobromine và
theophyline cùng sinh ra hoạt tính chống viêm cao, chống lại sự viêm cấp tính do acid
acetic trong khi caffeine không có hoạt tính này [26].

1.3.Các phƣơng pháp phân tích thành phần ankaloid.
Trƣớc đây, một số các phƣơng pháp để xác định lƣợng caffeine, theobromine và
theophylline trong các cây trồng lấy thức uống nhƣ chè, cà phê và ca cao đã đƣợc phát
triển. Thông thƣờng, chỉ có 1 chất chiếm chủ đạo trong 1 loại cây trồng, ví dụ caffeine
trong cà phê hay theobromine trong ca cao. Trong quá khứ, các phƣơng pháp phân tích
chỉ tập trung vào việc xác định mỗi lần chỉ một hợp chất, trong khi các chất liên quan sẽ
bị loại bỏ trong quá trình tinh chế hoặc đƣợc cộng gộp để tính tổng hàm lƣợng. Hầu hết
trong các phƣơng pháp thời kỳ đầu, caffeine và theobromine đƣợc chiết bằng nƣớc nóng
hoặc dung dịch kiềm nóng, tiếp đó là đƣợc chuyển định lƣợng sang một dung môi hữu
cơ, thƣờng là chloroform. Sau khi tinh chế lƣợng chiết chloroform, thông thƣờng rất khó
đối với hạt ca cao bởi có lƣợng chất béo lớn, sau đó các hợp chất này sẽ đƣợc đo bằng
nhiều phƣơng pháp khối lƣợng, Kjeldahl và chuẩn độ. Trong nhiều ví dụ, việc chiết rất
mất công sức và việc xác định lƣợng cuối cùng lại bị ảnh hƣởng bởi các chất làm nhiễu
còn lại sau quá trình chiết chƣa hiệu quả. [29]
1.3.1. Phƣơng pháp điện di mao quản
Điện di mao quản (CE) đã đƣợc phát triển nhƣ là một kỹ thuật để phân tích các phân
tử tích điện, bao gồm protein, peptide và oligonucleotide. So với phƣơng pháp tách thông
19

thƣờng nhƣ HPLC, CE cung cấp hiệu quả cao hơn (gần hoặc vƣợt 1 000 000 đĩa lý
thuyết), phân tích thời gian ngắn hơn, yêu cầu khối lƣợng mẫu nhỏ hơn và chi phí vận
hành thấp. Việc áp dụng phƣơng pháp này đã đƣợc mở rộng với các phân tử trung hòa bởi
sự ra đời của điện di mao quản micellar (MECC) đƣợc phát triển đầu tiên bởi Terabe et
al, (1984) [46]. Trong MECC, chất phân tích đƣợc tách ra trên cơ sở cả tính kỵ nƣớc của
chúng và độ linh động điện di. Chất tan có thể phân chia giữa chất kỵ nƣớc của các
mixen và pha nƣớc dẫn đến tốc độ di chuyển khác nhau trong hệ thống MECC. MECC
đƣợc sử dụng để tách cả phân tử hữu cơ trung tính và phân tử hữu cơ tích điện, bao gồm
dẫn xuất axit amin, các vitamin tan trong nƣớc, dƣợc phẩm và axit nucleic [12].
Khi sử dụng phƣơng pháp MECC, phƣơng pháp này nhanh chóng, với sự chuẩn bị
mẫu ít hoặc không cần chuẩn bị mẫu. Lee et al. [31] đã mô tả sự chia tách của
theophylline và chất tƣơng tự của nó bằng phƣơng pháp MECC với detector UV trong
mẫu huyết tƣơng ngƣời. Việc tách mất 12 phút và các mẫu đƣợc chiết với ethyl acetate.
Thormann et al. [48] đã báo cáo việc xác định các purin trong huyết thanh bằng MECC
với việc tiêm mẫu trực tiếp. Việc tách mất 14 phút và chỉ theophylline và acid uric đƣợc
tách.
Yeping Zhao (1996) sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản micellar (MECC) để
tách caffeine và các chất dẫn xuất của nó, theobromine, paraxanthine, theophylline và
1,3,7 axit trimethyluric vằng việc sử dụng natri lauryl sulfat (SDS) nhƣ pha micellar.
Những ảnh hƣởng của pH, nồng độ mixen, nồng độ đệm, muối đệm, điện áp đặt và thời
gian tiêm đã đƣợc nghiên cứu để lựa chọn các điều kiện tối ƣu cho sự quyết tâm của
caffeine và bốn chất tƣơng tự của nó trong thuốc. Caffeine và ba chất tƣơng tự của nó đã
đƣợc tách trong vòng 120 s với giới hạn phát hiện thấp. Các mẫu có thể đƣợc phân tích
sử dụng tiêm trực tiếp với độ phân giải thích hợp và tính lặp lại.[54]
1.3.2. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại gần
Phổ hồng ngoại gần (NIR) sử dụng bƣớc sóng 780-2500 nm để đo độ hấp thụ, tính
toán các nhóm chức hữu cơ và số lƣợng dự đoán một yếu tố cụ thể. Nó đã đƣợc sử dụng
rộng rãi để phân tích chất lƣợng thực phẩm và để xác định các alkaloid chính trong thực
20

phẩm.
Phổ hồng ngoại gần (NIRS) đã đƣợc sử dụng cho phân tích thực phẩm từ năm 1938.
Sự phát triển chính của NIRS cho phân tích xác định cà phê đã đƣợc đánh giá bởi Schulz
từ năm 2004. Đánh giá này kể đến những thử nghiệm thành công đầu tiên áp dụng NIRS
cho việc thẩm định 2 loại cà phê hạt khác nhau “Arabica” và “Robusta”. Thông thƣờng,
cà phê hạt “Arabica” đƣợc đánh giá cao hơn “Robusta” và do đó đắt hơn. Do vậy việc
xác định về sự không đạt kiểm định chất lƣợng và dán nhãn mác sai rất quan trọng và ảnh
hƣởng đến việc bảo vệ ngƣời tiêu dùng. Bài đánh giá cũng kể đến một phƣơng pháp NIR
tƣơng tự cho việc xác định đồng thời thành phần khô trong cà phê “Robusta” xanh và hỗn
hợp các loại cà phê rang, bột sấy khô lạnh, các loại đồ uống cà phê sấy khí và cà phê
uống liền. Các phƣơng pháp cổ điển để xác định các loại cà phê - chủ yếu dựa vào từng
loại đặc trƣng các nguyên tố khoáng chất, các hợp chất dễ bay hơi, hoặc các thành phần
chứa lƣu huỳnh – rất tốn thời gian. Sự phát triển của hiệu chuẩn NIRS cho phép thực hiện
sự đặc trƣng hóa trong thời gian tƣơng đối ngắn. So sánh với phổ FTIR thu đƣợc ở cùng
mẫu, phƣơng pháp NIR thể hiện sự vƣợt trội. Phƣơng pháp tiếp cận khác là kết hợp cả
phổ hồng ngoại gần và hồng ngoại trung cho xác định các loại cà phê sấy lạnh. Schulz
cũng báo cáo về phân tích thành công NIRS cho caffeine và theobromine trong chè
(Camellia sinensis). Caffeine dạng viên có giới hạn định lƣợng thấp chỉ 13,7g/100g cho
thấy phƣơng pháp này linh động và nhanh chóng hơn so với các phƣơng pháp khác nhƣ
là sắc kí lỏng. Phƣơng pháp FTIR-ATR có thể nhanh chóng xác định đƣợc hàm lƣợng
caffeine trong các loại nƣớc có gas,mà không cần sử dụng các chất dung môi hữu cơ. Các
phƣơng pháp phổ khác cũng có thể xác định đƣợc các ankaloid bao gồm phƣơng pháp
phổ cực tím, phổ NMR và phổ khối [27].
FT-NIR đã đƣợc chứng minh là một công cụ phân tích mạnh mẽ để phân tích một
loạt các mẫu đƣợc sử dụng trong nông nghiệp, dinh dƣỡng, hóa dầu, dệt may và các
ngành công nghiệp dƣợc phẩm, đặc biệt là việc sử dụng nó trong phân tích chất lƣợng
của nông sản và các mẫu dƣợc phẩm. Các kỹ thuật quang phổ FT-NIR là một phân tích
kỹ thuật không phá hủy mẫu với những ƣu điểm của phân tích nhanh chóng mẫu đơn

giản, và các mẫu nhỏ, và đặc biệt là việc sử dụng các mẫu rắn. So với phƣơng pháp phân
21


tích thông thƣờng, FT-NIR là một kỹ thuật nhanh chóng, chính xác, và không phá hủy
mẫu có thể đƣợc sử dụng nhƣ là một thay thế các phƣơng pháp đánh giá cảm quan thông
thƣờng và phƣơng pháp hóa học tốn thời gian[18].
Kể từ năm 1990, các nỗ lực của các nhà khoa học đã đƣợc thực hiện để dự đoán đồng
thời các alkaloid và các chất phenolic trong lá trà xanh sử dụng phƣơng pháp quang phổ
hồng ngoại gần (Schulz et al,1999) [42]. Một số nghiên cứu về phân tích định lƣợng các
chất chống oxy hóa trong trà xanh bằng NIR cũng đã đƣợc báo cáo bởi Zhang et
al,(2004) [53]. Gần đây, một số nhà nghiên cứu cũng áp dụng phƣơng pháp quang phổ
hồng ngoại gần để phân tích đồng thời các hàm lƣợng của các axit amin tự do, caffeine,
tổng polyphenol, và amylose trong trà xanh (Chen et al, 2006) [19].
1.3.3. Phƣơng pháp phổ Raman
Phổ Raman đã đƣợc chứng minh là phƣơng pháp phân tích tuyệt vời cho việc xác
định các dƣợc chất và chất hóa sinh có trong cây và các sinh vật trong tự nhiên. Vìlà
phƣơng pháp định lƣợng nhanh chóng, rõ ràngcác dƣợc phẩm với sự có mặt của các chất
phụ gia và tá dƣợc. Vì vậy các kỹ thuật phổ Raman đƣợc sử dụng trong khoa học pháp y
để phân tích vỏ cây, gỗ, trái cây và các loại hạt thực vật mà không cần phƣơng pháp chiết
[41]. Trong một nghiên cứu mới đây [22], những hạt giống của cây Guarana, Paullinia
sorbilis (hoặc Paullinia cupana), đƣợc chứng minh là có chứa caffeine dạng khan phức
với tanains; chất chiết xuất từ những hạt giống có chứaxanthine alkaloid, guaranine, hoặc
caffeine. Các nghiên cứu về phổ Raman đã chỉ ra rằng thành phần alkaloid chính trong
guarana là caffeine. Kết quả này có liên quan để xác định caffeine trong nhà máy chiết
xuất guarana đƣợc lấy từ nhiều nguồn nhà máy nhỏ.
Phƣơng pháp phổ FT-Ramancó thể xác định caffeine, theophylline, và theobromine
đã đƣợc nghiên cứu ở dải dao động đặc trƣng của chúng. Xét về cấu trúc riêng biệt và đối
xứng nhóm của các phân tử, phân tích phối trí thông thƣờng đã đƣợc áp dụng để hỗ trợ
việc phân tích định tính phổ dao động. Dải dao động mạnh cho phổ FT-Ramantại

1600/1560 cm-1. Caffeine có trong hạt cà phê với nồng độ tƣơng đối cao của các alkaloid
này (lên đến 8%), cũng nhƣ theophylline và theobromine với số lƣợng nhỏ hơn.
22


Theobromine đã đƣợc phân biệt với caffeine và theophylline bởi sự xuất hiện của nó ở
bƣớc sóng 620 cm-1, caffeinexuất hiện tại bƣớc sóng643 và 741 cm-1 và theophylline xuất
hiện tại 668 cm-1. Hơn nữa, các tác giả đã thành công trong việc phân biệt caffeine dạng
khan và dạng monohydrate của nó bằng cách so sánh tín hiệu phổ gốc cacbonyl xảy ra
trong dải bƣớc sóng 1656 và 1698 cm-1[25].
1.3.4. Phƣơng pháp sắc lỏng
Có hai loại phƣơng pháp sắc ký lỏng có thể xác định đƣợc các chất theobromine,
theophylline và caffeine là phƣơng pháp sắc ký ion và phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo.
1.3.4.1. Phƣơng pháp sắc ký ion
Phƣơng pháp sắc ký ion đã đƣợc đề xuất để xác định đồng thời các chất caffeine,
theobromine và theophylline. Sự tách dựa trên rửa rải đẳng dòng và xác định ở bƣớc sóng
hấp thụ tử ngoại ở 274 nm. Hiệu suất thu hồi với các mẫu khác nhau dao động từ 87%
đến 103%. Ngoài ra, các cơ chế duy trì trong ba hợp chất trên các loại nhựa trao đổi ion
khác nhau. Các kết quả thu đƣợc cho thấy trao đổi ion sắc ký có thể là một lựa chọn tốt
để sắc ký lỏng thông thƣờng cho việc tách và xác định một số phân tử hữu cơ trung tính
hòa tan trong nƣớc và một số chất kị nƣớc nhất định.Chen et al, (2002);đã sử dụng sắc ký
ion để xác định đồng thời 3 loại xanthine trong các mẫu thực phẩm và dƣợc phẩm. Giới
hạn xác định của các 3 loại chất cần phân tích đều ở dƣới mức µg/mL. Mức độ thu hồi
mẫu giả cho cả 3 loại chất cần phân tích (khoảng từ 2mg/g đến 20mg/g) trong các mẫu
chứa ca cao sử dụng sắc ký trao đổi anion đạt cao hơn 90%. Các kết quả so sánh đƣợc từ
caffeine và theobromine sử dụng cả 2 kỹ thuật trao đổi anion và cation; theophylline
không xác định đƣợc bằng cả 2 phƣơng pháp [16].
Một phƣơng pháp sắc ký ion mới đã đƣợc đề xuất để xác định đồng thời các chất làm
ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartame, acesulfame-K), chất bảo quản (acid benzoic,
axit sorbic), caffeine, theobromine và theophylline. Việc tách đƣợc thực hiện trên một cột

phân tích trao đổi anion hoạt động ở 40oC trong vòng 45 phút bởi quá trình rửa rải
isocratic với dung dịch NaH2PO4 (pH 8.20) 5 mM có chứa 4% (v / v) acetonitrile, và
đƣợc xác định bằng detector bƣớc sóng phát hiện hấp thụ tia cực tím. Các giới hạn phát
23