Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể BC 1f1 của tổ hợp lai NPT1 x KC25 mang QTL gen tăng số hạt trên bông

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ NHUNG

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC
CÁ THỂ BC1F1 CỦA TỔ HỢP LAI NPT1 x KC25
MANG QTL/ GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. TRẦN ĐĂNG KHÁNH

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản khóa luận này, tôi luôn nhận đƣợc sự giúp đỡ về nhiều
mặt của các thầy cô giáo.
Trƣớc tiên, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Đăng Khánh,
ngƣời đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi hoàn thành bản khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Nhƣ Toản và các thầy cô giáo khoa
Sinh – KTNN Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt cho tôi các kiến
thức và phƣơng pháp nghiên cứu khoa học khi học tập tại trƣờng.
Khóa luận đƣợc thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền
Nông nghiệp Việt Nam. Tại đây, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình của các
anh chị trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm
ơn sự giúp đỡ quý báu đó.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình, ngƣời thân
và toàn thể bạn bè trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện, không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong
nhận đƣợc sự góp ý chân thành.
Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội,

tháng

năm 2016

Tác giả

Trần Thị Nhung


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn khoa học của TS. Trần Đăng Khánh.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc sử
dụng công bố ở bất cứ công trình khoa học nào.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã đƣợc
ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả

Trần Thị Nhung


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài.................................................... 2
NỘI DUNG ........................................................................................................... 4
Chƣơng I. Tổng quan tài liệu ................................................................................ 4
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu ............................... 4
1.1.1. Vài nét sơ lƣợc về cây lúa. .......................................................................... 4
1.1.2. Giới thiệu về giống lúa bố mẹ. .................................................................... 7
1.1.2.1. Giống nhận QTL/gen: NPT1 .................................................................... 7
1.1.2.2. Giống cho QTL/gen ................................................................................ 7
1.2. Cơ sở khoa học của việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử .............. 7
1.2.1. Chỉ thị phân tử ............................................................................................. 7
1.2.2. Những ƣu điểm và ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống
cây trồng .............................................................................................................. 11
1.2.2.1. Tính ƣu việt của chọn giống nhờ chỉ thị phân tử ................................... 11
1.2.2.2. Những ứng dụng của chỉ thị phân tử ...................................................... 11
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .................................................. 14
1.3.1. Trên thế giới .............................................................................................. 14
1.3.2. Tại Việt Nam ............................................................................................. 18
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 21
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................... 21
2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu .......................................................................... 21
2.1.2. Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm ............................................... 21
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 21


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 22
2.3.1. Phƣơng pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận

QTL/gen .............................................................................................................. 22
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ph ng thí nghiệm ............................................. 24
2.3.2.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số................................................... 24
2.3.2.2. Phƣơng pháp PCR với mồi SSR ............................................................ 25
2.3.2.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% ........................................... 26
2.3.2.4. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 3% .............................................. 27
2.3.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5% .............................. 27
2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................... 29
2.4. Cách bố trí thí nghiệm .................................................................................. 30
2.5. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 33
3.1. Kết quả lai tạo thế hệ BC1F1 của tổ hợp F1 x ( NPT1 x KC25) ................... 33
3.2. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ ........................................................ 35
3.3. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số .......................................................... 35
3.4. Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể BC1F1...... 37
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 40
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 41
Phụ lục : Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .................................... 46


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AND

:

Axit Deoxyribonucleic

AFLP

:

Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài
các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc

RAPD

:

Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN
đƣợc nhân bản ngẫu nhiên

RFLP

:

Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài
mảnh phân cắt giới hạn

STS

:

Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã đƣợc đánh dấu

RGA

:

Resistance Gene Analog – Vùng tƣơng đồng gen kháng

SNP

:

Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn

SSR

:

Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

Bp

:

Base pair – Cặp bazơ nitơ

cDNA

:

Complementary DNA – Thƣ viện AND bổ trợ

Cs

:

Cộng sự

Ctv

:

Cộng tác viên

CTPT

:

Chỉ thị phân tử

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate

MABC

:

Marker Assisted Backcrossing – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử kết
hợp lai trở lại

MAS

:

Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

NST

:

Nhiễm sắc thể

PCR

:

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/ QTLs

:

Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lƣợng

TBE

:

Tris-Boric Acid-EDTA


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể, kiểu gen
và phân bố địa lý ................................................................................................... 5
Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa .......... 6
Bảng 1.3. Một số chỉ thị phân tử phổ biến, đặc điểm và tiềm năng ứng dụng ..... 9
Bảng 2.1. Các chỉ thị cho đa hình giữa giống NPT1 x KC25 tại vị trí QTL/gen 21
Bảng 2.2. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR ..... 26
Bảng 2.3. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR .............................................. 26


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. QTL/gen và chỉ thị phân tử liên kết với yếu tố cấu thành năng suất
đƣợc xác định trong 10 năm qua. .................................................................... 17
Hình 2.2. Các bƣớc thí nghiệm trong chọn tạo giống lúa tăng số hạt trên bông
bằng phƣơng pháp sử dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại ................................ 23
Hình 3.1. Ghép cây sau khi đã khử đực .......................................................... 33
Hình 3.2. Kết quả lai tổ hợp F1 x NPT1 .......................................................... 34
Hình 3.3. Hình ảnh khảo sát đa hình ADN giữa dòng/giống nghiên cứu với chỉ
thị RM445, RM500, RM21615 ....................................................................... 35
Hình 3.4. Kết quả tách chiết ADN và tinh sạch ADN các cá thể BC1F1 ........ 36
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sàng lọc cá thể BC1F1 với chỉ thị RM445 ........... 37
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sang lọc cá thể BC1F1 với chỉ chỉ thị RM500 ..... 38
Hình 3.7. Kết quả chạy điện di trên Agarose 3% với chỉ thị RM21615 ......... 39


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực quan trọng, với diện tích trồng
khoảng 148,4 triệu hecta trên toàn thế giới ( trong đó châu Á chiếm 135
triệu hecta). Lúa gạo là một trong những cây trồng cung cấp nguồn lƣơng

thực quan trọng nhất, lúa có ảnh hƣởng đến đời sống của ít nhất 50% dân số
thế giới. Năm 2014 sản lƣợng gạo đạt 496,6 triệu tấn giảm 0,2% so với năm
2013(497,5 triệu tấn gạo) [8].
Việt Nam có tổng diện tích gieo trồng lúa ƣớc đạt hơn 7,8 triệu ha, giảm
96,8 ngàn ha so với năm 2013, nhƣng do năng suất đạt 57,4 tạ/ha, tăng 1,7 tạ/ha,
nên sản lƣợng lúa cả nƣớc đạt 44,84 triệu tấn, tăng 80,4 vạn tấn so với năm
2013, xuất khẩu khoảng 5,96 triệu tấn gạo ( Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, 2014) [7]. Ở Việt Nam lúa gạo là một trong những sản phẩm xuất khẩu
chủ lực của nền nông nghiệp và cũng là nguồn lƣơng thực chính của hơn 90
triệu dân trong nƣớc.
Do quá trình đô thị hóa, công nghiêp hóa diễn ra nhanh chóng, diện tích
đất dành cho việc trồng lúa ngày càng bị thu hẹp, và chịu những ảnh hƣởng tiêu
cực từ biến đổi khí hậu làm năng suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, cùng với áp lực dân
số ngày càng tăng đ i hỏi nguồn cung lƣơng thực ngày càng lớn. Vì vậy, việc
đáp ứng sản lƣợng lƣơng thực là rất cần thiết.Việc phát triển nguồn giống đã
đƣợc cải tiến cho năng suất cao, chất lƣợng tốt là yếu tố quan trọng cho việc
đảm bảo hệ thống sản lƣợng lúa. Chọn tạo giống lúa có khả năng năng suất cao
là hết sức cần thiết, cấp bách và có ý nghĩa cho an toàn lƣơng thực và tăng thu
nhập của nông dân.
Ngày nay, công nghệ sinh học đã tạo ra một công cụ hỗ trợ to lớn cho công
tác chọn tạo giống cây trồng. Việc áp dụng những kỹ thuật ở mức độ phân tử
cho phép chuyển những gen mong muốn vào trong các giống cây trồng phổ
1


biến, và chúng ta có thể du nhập những gen mới từ loài hoang dại gần gũi với
loài cây trồng. Vấn đề có tính chiến lƣợc trong ứng dụng chỉ thị phân tử vào lĩnh
vực chọn giống chính là: “ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử”, sử dụng chỉ thị phân
tử ADN cho phép phân tích di truyền và những tính trạng nông học quan trọng
là một công cụ rất hiệu quả trong chọn giống lúa. Sử dụng chỉ thị phân tử liên

kết chặt với các QTL/gen mong muốn trong chọn tạo giống mới, góp phần tiết
kiệm thời gian và công sức cho quá trình nghiên cứu. Bằng con đƣờng chọn
giống nhờ chỉ thị phân tử nhiều gen kháng sâu bệnh và gen quy định năng suất,
chất lƣợng đã đƣợc đƣợc quy tụ thành công vào một số giống lúa. Xuất phát từ
những thực tế trên tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá
thể BC1F1 của tổ hợp lai NPT1 x KC25 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông”
với mục tiêu thông qua phƣơng pháp MABC (Marker – Assisted Backcrossing )
chọn đƣợc các dòng triển vọng tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho nghiên cứu sau.
2. Mục đích nghiên cứu
-

Ứng dụng chỉ thị phân tử để xác định sự có mặt của QTL/gen tăng số hạt

trên bông của các cá thể trong quần thể BC1F1 (NPT1 x KC25).ghể BC1F1 (NPT1
3. Phạm vi nghiên cứu
-

Nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc ứng dụng phƣơng pháp MABC

chọn lọc cá thể BC1F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông phục vụ cho công
tác chọn tạo giống lúa.
-

Đề tài thực hiện từ tháng: Tháng 6/2015 đến tháng 5/2016.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài
- Ý nghĩa khoa học của đề tài
+ Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp phƣơng pháp lai trở lại để chọn lọc nhanh
và chính xác các cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông nhằm rút ngắn thời
gian, công sức chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lƣợng lớn cá thể gieo trồng hàng

vụ và giúp khắc phục đƣợc một vài hạn chế của phƣơng pháp chọn giống truyền
thống.
2


- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
+ Những thành công bƣớc đầu trong quy tụ QTL/gen tăng số hạt trên bông
nhờ sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công
tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với tính trạng năng suất mà c n đối với
nhiều đặc tính nông học quan trọng khác đáp ứng nhu cầu lƣơng thực con ngƣời.
+ Những cá thể trong quần thể BC1F1 triển vọng đƣợc chọn lọc trong đề tài
này sẽ đƣợc trồng thử nghiệm và tiếp tục đánh giá, chọn ra các d ng lúa có năng
suất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3


NỘI DUNG
Chƣơng I. Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Vài nét sơ lược về cây lúa.
Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Graminae), tộc Oryzae, chi Oryza, có tổng số
nhiễm sắc thể 2n = 24. Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt
đới ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và
Trung Mỹ và một phần ở Châu Úc. Trong đó, chỉ có 2 loài là lúa trồng, còn
lại là lúa hoang hằng niên và đa niên. Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi
rộng rãi và chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L. Loài này
hầu nhƣ có mặt ở khắp nơi từ đầm lầy đến sƣờn núi, từ vùng xích đạo, nhiệt đới
đến ôn đới, từ khắp vùng phù sa nƣớc ngọt đến vùng đất cát sỏi ven biển nhiễm
mặn, phèn… Một loài lúa trồng khác là Oryza glaberrima Steud, chỉ đƣợc

trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Châu Phi và hiện đang bị thay thế dần bởi
Oryza sativa L [10].
Tateoka (1963) [29] (trong Oka, 1988) [27] lại phân biệt 22 loài, trong đó,
cũng thống nhất 2 loài lúa trồng O. sativa L. và O. glaberrima Steud. Tateoka
xem dạng lúa Châu Phi (O. perennis Moench) nhƣ là một loài riêng O. barthii
A. Chev., và dạng lúa Châu Á và Châu Mỹ thuộc về loài O. rufipogon Griff.
Tateoka cũng bổ sung 2 loài mới: O. longiglumis Jansen và O. angustifolia
Hubbard (Bảng 1.1) [29].
Năm 1928 - 1930, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã phân loại lúa trồng
thành 2 nhóm “Indica” và “Japonica” dựa trên cơ sở phân bố địa lý, hình thái
cây và hạt, độ bất dục khi lai tạo và phản ứng huyết thanh (Serological
reaction). Các nhà nghiên cứu Nhật Bản sau đó đã thêm một nhóm thứ 3
“Javanica” để đặt tên cho giống lúa cổ truyền của Indonesia là “bulu” và
“gundil”. Tên gọi của 3 nhóm thể hiện nguồn gốc xuất phát của các giống lúa từ
3 vùng địa lý khác nhau. Từ “Javanica” có gốc từ chữ Java là tên của một đảo
4


của Indonesia. Từ “Japonica” có lẽ xuất xứ từ chữ Japan là tên nƣớc Nhật Bản.
Còn “Indica” có lẽ có nguồn gốc từ India (Ấn Độ) (Bảng 1.2) [26].
Bảng 1.1. Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc
thể,kiểu gen và phân bố địa lý

Nhóm/loài

2n

Kiểu gen

Phân bố địa lý

Nhóm Oryzae
sativa L.
24
AA
Khắp thế giới, lúa trồng
rufipogon Griff.
24
AA
Châu Á, Châu Mỹ
barthii A. Chev.
24
AA
Châu Phi
glaberrima Steud.
24
AA
Châu Phi, lúa trồng
breviligulata A. Chev. et Roehr.
24
AA
Châu Phi
australiensis Domin
24
EE
Châu Úc
eichingeri A. Peter
24
CC
Châu Phi

punctata Kotschy
24, 48 BB, BBCC Châu Phi
officinalis Wall.
24
CC
Châu Á
minuta J.S. Presl
48 BBCC
Châu Á
latifolia Desv.
48 CCDD
Châu Mỹ
alta Swallen
48 CCDD
Châu Mỹ
grandiglumis Prod.
48 CCDD
Châu Mỹ
Nhóm Schlechterianae
schlechteri Pilger
New Guinea
Nhóm Granulatae
meyeriana Baill.
24 Châu Á
Nhóm Ridleyanae
ridleyi Hook. F.
48 Châu Á
longiglumis Jansen
48 New Guinea
Nhóm Angustifoliae

brachyantha A. Chev. et Roehr.
24 FF
Châu Phi
angustifolia Hubbard
24 Châu Phi
perrieri A. Camus
24 Malagasy

5


tisseranti A. Chev.
Nhóm Coarctatae

24 Châu Phi

coarctata Roxb.

48 Châu Á
Nguồn: Oka, 1988
[27]

Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa
Đặc tính INDICA

JAVANICA

JAPONICA

Thân

-Thân cao

-Thân cao trung bình

Thân thấp

Chồi

-Nở bụi mạnh

-Nở bụi thấp

Nở bụi trung bình

Lá

-Lá rộng, xanh nhạt

-Lá rộng, cứng, xanh nhạt Lá hẹp, xanh đậm

Hạt

-Hạt thon dài, dẹp

-Hạt to, dầy

-Hạt tròn, ngắn

-Hạt hầu nhƣ không -Hạt không có đuôi hoặc -Hạt không râu tới

có râu

có đuôi dài

có râu dài

-Trấu ít lông và lông -Trấu có lông dài

-Trấu có lông dài

ngắn

và dầy

-Hạt dễ rụng

-Ít rụng hạt

Sinh học -Tính cảm quang rất -Tính cảm quang rất yếu
thay đổi

-Ít rụng hạt
-Tính quang cảm
rất thay đổi
Nguồn: Chang, 1985
[17]

6

1.1.2. Giới thiệu về giống lúa bố mẹ.
1.1.2.1. Giống nhận QTL/gen: NPT1
Khái niệm về dạng lúa đƣợc đặt tên là dạng hình mới (New Plant TypeNPT) đã đƣợc bắt đầu đề cập vào các thập niên 60. Tuy nhiên gần đây Peng và
cs (1994) mô tả òng lúa NPT dựa trên kết quả của sự mô phỏng và các tính
trạng mới với các đặc điểm hình thái học dễ lựa chọn để so sánh với các tính
trạng sinh học thực vật trong chƣơng trình lai tạo.
Dạng hình mới NPT thƣờng có một số đặc điểm sau: Khả năng đẻ nhánh
thấp khoảng 3-4 nhánh chính nếu gieo sạ, ít nhánh phụ, số hạt trên bông khoảng
200-250 hạt, chiều cao khoảng từ 90-100 cm, thân dày, mập và dai, lá dày, màu
xanh đậm, đứng thẳng, thời gian sinh trƣởng khoảng 100-130 ngày.
NPT1 là d ng đƣợc trồng khá phổ biến, có khả năng chống chịu và kháng
sâu bệnh tốt do vậy mà nó sẽ đƣợc sử dụng làm giống nhận QTL/gen.
1.1.2.2. Giống cho QTL/gen
KC25 là giống thích hợp với khí hậu cận ôn đới, sinh trƣởng bình thƣờng ở
nhiệt độ thấp 12-15oC , khả năng chịu lạnh tốt và chống chịu bệnh cao, năng
suất cao, thời gian sinh trƣởng: 120-150 ngày.
KC25 là giống nhập nội từ Hàn Quốc mang QTL/gen tăng số hạt trên bông
đƣợc sử dụng làm giống cho QTL/gen.
1.2. Cơ sở khoa học của việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
1.2.1. Chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử (genertic markers) đƣợc hiểu đơn giản là các điểm mốc
(landmarks) trên nhiễm sắc thể và hoạt động nhƣ các điểm tham chiếu (reference
points) vị trí của các gen quan tâm trên bản đồ di truyền. Hay nói cách khác chỉ
thị phân tử là một đoạn ADN có liên quan đến một vị trí cụ thể trong hệ gen ( Lê
Huy Hàm. 2015) [4].
Chỉ thị phân tử có thể tƣơng quan hoặc không tƣơng quan với biểu hiện
kiểu hình của một tính trạng cụ thể. Chỉ thị phân tử rất phong phú, đa dạng và
7

có tính ổn định cao, có thể nghiên cứu ở bất kì giai đoạn phát triển nào của cá
thể do có thể đánh giá luôn ở giai đoạn mới sinh trƣởng ở cây trồng mà không bị
ảnh hƣởng bởi điều kiện môi trƣờng và các hiệu ứng át chế gen.
Mục đích nghiên cứu chỉ thị phân tử là phát hiện các chỉ thị phân tử có mức
độ đa hình cao và thao tác tiện lợi. Chỉ thị phân tử rất hữu ích trong việc nghiên
cứu, thừa kế những dấu hiệu di truyền và sự biến đổi của chúng trong quần thể.
Vì thế chúng đƣợc sử dụng trong nhận dạng cá thể, đa dạng di truyền, phân loại
học, bản đồ di truyền...Đặc biệt những chỉ thị liên quan đến tính trạng nông sinh
học có lợi cho con ngƣời đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng tiện trợ giúp đắc lực cho
công tác chọn giống.
Một chỉ thị phân tử cần đáp ứng một số yêu cầu sau:
+ Thể hiện tính đa hình và mức dộ phân bố đều trên toàn bộ hệ gen.
+ Cung cấp đầy đủ độ phân giải khác biệt di truyền.
+ Tạo ra nhiều chỉ thị độc lập và đáng tin cậy.
+ Đơn giản, thực hiện nhanh chóng và rẻ tiền.
+ Yêu cầu một số lƣợng nhỏ ADN.
+ Có mối liên kết với các kiểu hình riêng biệt,
+ Có thể không cần thông tin trƣớc về bộ gen của vật liệu nghiên cứu
Tuy nhiên gần nhƣ không thể tìm thấy một chỉ thị phân tử nào có thể thỏa
mãn tất cả những yêu cầu trên. Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà ngƣời ta
sử dụng một số chỉ thị thỏa mãn một số điều kiện ( Nguyễn Duy Bảy và cộng sự,
2001) [1].
Phân loại kỹ thuật chỉ thị phân tử đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thập kỷ qua
đƣợc tóm tắt trong bảng 1.3.

8


Bảng 1.3. Một số chỉ thị phân tử phổ biến, đặc điểm và tiềm năng ứng dụng
Kỹ

Loại chỉ Cần

thuật

thị

có Kiểu di Mức độ Ứng

thông tin truyền

đa hình

về trình

dụng

Ngƣời
phát hiện

chính

tự
Kỹ

Menden, Thấp

Lập bản

Bostein

thuật

Đồng

đồ liên

và

dựa trên

trội

kết, bản

1980

RFLP

Có

cs.

đồ vật lý

nguyên
lý AND
Kỹ

Menden, Trung

In dấu

William

thuật

Đồng

vân tay

s và cs.

dựa trên

trội

RAPD

Không

bình

cho quần 1990

nguyên

thể gắn

lý PCR

thẻ gen,
xác định
cây lai
AFLP

Không

Menden, Cao

Lập bản

Vos và

Đồng

đồ liên

cs. 1995

trội

kết, gắn
thẻ gen,
nghiên
cứu quần
thể

SSR

Có

Menden, Cao

Lập bản

Litt và

Đồng

đồ liên

Lutti,

9


trội

kết, gắn

1989

thẻ gen,
nghiên
cứu quần
thể

VNTR

Không

Menden, Cao

In vân

Jeffrey,

Đồng

tay ADN 1985

trội

cho
nghiên
cứu quần
thể

SNP

Có

Menden, Cao

Lập bản

Ching

Đồng

đồ liên

và cs,

trội

kết,

2002

nghiên
cứu quần
thể
Trong số các loại chỉ thị trên thì chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu di truyền học, sinh
thái học, phân loại và di truyền học tiến hóa, chọn giống. Chỉ thị SSR có nhiều
ƣu điểm là đơn giản, dễ sử dụng với kỹ thuật PCR, điện di gel biến tính để xác
định kích thƣớc alen, số lƣợng alen trên locus lớn do đó cung cấp nhiều thông
tin hơn.

10


1.2.2. Những ưu điểm và ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống
cây trồng
1.2.2.1. Tính ưu việt của chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
Mackill và Collard (2006) đã đƣa ra khái niệm chọn giống lúa dựa trên
chỉ thị phân tử là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt chẽ với các locus mục
tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN (ADN

marker) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy [22].
Cũng theo Markill và cs (2006) [23]: CTPT đƣợc ứng dụng trong chọn
tạo giống lúa có những ƣu điểm nổi bật:
1. Đặc biệt với các tính trạng khó đánh giá, thanh lọc dựa trên kiểu hình.
2. Tiết kiệm thời và nguồn lực trong quá trình chọn lọc.
3. Rất quan trọng đối với tính trạng quy định chất lƣợng hạt.
4. Có thể chọn lọc ở giai đoạn đầu, trƣớc khi gieo trồng, có thể chọn ngay
ở thế hệ phân ly F1.
5. Không bị ảnh hƣởng từ tác động của điều kiện môi trƣờng.
6. Có thể phân biệt giữa đồng hợp tử và dị hợp tử và chọn lọc từng cá thể.
Chọn lọc lúa nhờ ứng dụng chỉ thị phân tử cần thiết phải đánh giá nguồn
vật liệu di truyền trƣớc khi thực hiện chƣơng trình lai giống. Trong một số
trƣờng hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có
thể đạt mục tiêu của mình (Acquaah, 2012) [13].
1.2.2.2. Những ứng dụng của chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử có thể đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu di truyền,
biến dị trong hệ gen, tiến hóa và chọn lọc liên kết giữa alen- alen và alen với
tính trạng kiểu hình. Ứng dụng của chỉ thị di truyền tùy thuộc vào đặc tính vật lý
và vị trí trong hệ gen, các chi phí liên quan, mức độ dễ sử dụng và khả năng tự
động hóa. Chỉ thị phân tử đã đƣợc ứng dụng thành công trong khoa học cây
trồng đối với việc lập bản đồ di truyền và bản đồ vật lý của hệ gen, xác định các
gen kiểm soát kiểu hình (tính trạng liên kết), đa dạng di truyền, phân tích tiến
11


hóa và cải tiến gống cây trồng. Trƣớc đây vị trí vật lí của mỗi chỉ thị phân tử
thƣờng không rõ ràng và không cần thiết cho các mục đích phân tích đa dạng và
tiến hóa cũng nhƣ ứng dụng trong chọn giống. Với những tiến bộ vƣợt bậc
trong trong công nghệ giải trình tự hệ gen, các chỉ thị di truyền, với vị trí đƣợc
xác định trong hệ gen và những ứng dụng công nghệ đánh giá kiểu gen thông

lƣợng cao đã có những thành công đáng kể trong công tác chọn tạo và cải thiện
giống cây trồng. Chỉ thị dựa trên cơ sở ADN đã có thể xác định một số lƣợng
lớn biến dị với độ phân giải cao, và đặc biệt hữu dụng trong việc xác định các
chỉ thị hoàn hảo (đa hình ADN liên kết với các tính trạng quan tâm, cũng nhƣ
khám phá và phân tích hệ gen).
Những cá thể trong phạm vi một quần thể sẽ có mức độ biến dị di truyền
trong hệ gen khác nhau do đột biến thêm đoạn hoặc mất đoạn, đảo đoạn, lặp
đoạn hay chuyển đoạn. Các biến dị nhƣ vậy có thể đƣợc xác định và sàng lọc
bằng kỹ thuật phân tử, chỉ thị di truyền. Bởi vậy, chỉ thị phân tử là các locus di
truyền có thể dễ dàng theo dõi và có thể định lƣợng đƣợc trong một quần thể
liên kết với một gen hoặc tính trạng quan tâm.
* Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại( MABC)
MABC là phƣơng pháp chính xác và hiệu quả để chuyển một locus đơn
kiểm soát một tính trạng quan tâm trong khi vẫn duy trì đƣợc đặc tính cần thiết
của cây nhận gen. MABC là rất hiệu quả đối với các gen hoặc các tính trạng số
lƣợng (QTL) trong quần thể biến dị kiểu hình lớn. MABC là công nghệ sử dụng
các chỉ thị để chọn lọc các locus mục tiêu và đẩy nhanh việc khôi phục lại nền di
truyền của cây nhận gen trong các thế hệ lai. Mục đích chính của MABC là
chuyển một gen mục tiêu từ cây cho gen vào d ng/giống ƣu tú.
MABC là phƣơng pháp chính xác và hiệu quả so với phƣơng pháp lai trở
lại truyền thống. Chọn lọc nền di truyền có thể đẩy nhanh chƣơng trình lai trở lại
so với phƣơng pháp lai trở lại truyền thống. Phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng
rộng rãi để cải tiến một số tính trạng mà các giống lúa trồng phổ biến không có.
12


MABC là bƣớc phát triển liên tục các thế hệ lai trở lại nhằm loại bỏ nền di
truyền của giống cho gen trong khi đó lại duy trì đƣợc bộ gen của cây nhận gen
trong thời gian ngắn nhất. MABC với các chỉ thị dựa trên sàng lọc hệ gen cho
phép lấy lại hệ gen của d ng tái tục trong một vài thế hệ lai tạo.

Có thể nói tóm tắt ƣu điểm của MABC so với phƣơng pháp lai trở lại
truyền thống ở ba điểm chính:
+ Chọn lọc hiệu quả các locus mục tiêu
+ Giảm thiểu những liên kết kéo theo
+ Lấy lại nhanh chóng nền di truyền của giống nhận gen trong chu kỳ chọn
lọc
Tính hiệu quả của chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại phụ
thuộc vào một số nhân tố, bao gồm kích thƣớc quần thể của mỗi thế hệ lai trở
lại, khoảng cách các chỉ thị từ locus mục tiêu và số lƣợng chỉ thị để sàng lọc nền
di truyền. Chọn lọc MABC có ba bƣớc khi áp dụng:
* Bƣớc thứ nhất: Sử dụng để chọn lọc trực tiếp locus tính trạng mục tiêu,
những tính trạng rất khó chọn lọc dựa trên kiểu hình hoặc những tính trạng quy
định bởi gen lặn.
* Bƣớc thứ hai: Chọn lọc các chỉ thị nằm về hai phía của gen mục tiêu để
giảm tối thiểu các gen không mong muốn kéo theo, bƣớc này c n gọi là chọn
lọc tái tổ hợp (recombinant selection).
* Bƣớc thứ ba: Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử trên các nhiễm sắc thể khác
trên các thế hệ con cái lai trở lại đã chọn lọc tính trạng mục tiêu. Nhƣ vậy chọn
lọc lai trở lại nhờ sử dụng chỉ thị phân tử có thể giảm ít nhất là 2 nhƣng có thể 3
thậm chí là 4 thế hệ lai trở lại so với chọn lọc lai trở lại truyền thống.
Trên thế giới có nhiều nƣớc ứng dụng phƣơng pháp MABC trong chọn
giống cây trồng. Tại Thái Lan, một số dự án lớn đã và đang đƣợc thực hiện để
đƣa những gen kháng bệnh vào giống lúa Jasmine là một giống lúa thơm có
thƣơng hiệu, nhằm tạo ra giống mới Super Jasmine (Theerayut. 2013) [30].
13


IRRI đã thành công trong việc đƣa một số gen chống chịu ở các giống lúa hoang
dại vào giống lúa trồng, đã lập bản đồ chính xác QTL liên kết với tính trạng chịu
ngập (Sub1) nằm trên nhiễm sắc thể số 9, và đã thành công đƣa vào 6 giống lúa

cho vùng ngập bằng phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại.
Sáu giống lúa đƣợc chuyển gen Sub1 là những giống phổ biến đƣợc nông dân
trồng ở Nam và Đông Nam châu Á: Swarna, Sambha Mahsuri, IR64, BR11,
TDK1 và CR1009, những giống này đã đƣợc trồng với diện tích hàng triệu ha,
đạt năng suất từ 1-3,5 tấn/ha trong điều kiện ngập hoàn toàn trong giai đoạn lúa
con gái. Phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC)
cũng đã thành công trong việc chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng việc chuyển
QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 1 và đã thành công
trên ba giống lúa trồng đại trà BR11, BRRI dhan28 và IR64.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.3.1. Trên thế giới
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ
thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen. Với sự ra đời của hàng loạt
các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên kết đến các
tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất. Nghiên cứu xác định chỉ
thị phân tử và lập bản đồ QTL/gen điều khiển một tính trạng năng suất hay yếu
tố cấu thành năng suất là một việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành
năng suất là tổ hợp tính trạng số lƣợng nhƣ: số hạt chắc trên bông, số bông trên
khóm, khối lƣợng nghìn hạt. Những năm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính
trạng cấu thành năng suất đã đƣợc xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ
hợp lai giữa giống hay các loài phụ. QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành
năng suất đƣợc xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa. Ở đây chúng tôi
tập hợp lại những kết quả xác định QTL/gen liên kết năng suất và yếu tố cấu
thành năng suất trên cây lúa.
Trên nhiễm sắc thể số 1: Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định đƣợc
nhiều tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 nhƣ: Ba QTLs
14


quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283RM259 (Thomson et al. 2010) [31], RG690-RM212 (Hittalmani và cs. 2003)

[18], và RG810-RG331 (Septiningsih và cs,..2003) [28]. Một QTL liên kết tính
trạng số hoa trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490 (Thomson và cs..
2003) [31].
Nhiễm sắc thể số 2: QTL quy định khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định tại
vị trí chỉ thị phân tử RM240-RM266 (Ishimaru và cs. 2001) [21]. Ba QTL liên
kết tính trạng tổng số hạt trên khóm, tại các vị trí gần tâm động (Cui và cs. 2003)
[16], vị trí chỉ thị RM 263 (Zhuang và cs. 2002) [37].
Nhiễm sắc thể số 3: Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng
khối lƣợng nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3. Một trong số đó là QTL đƣợc xác
định tại vị trí tâm động (Hua và cs. 2002) [20], tác giả Li và cs năm 2004 đã lập
bản đồ QTL liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt với khoảng cách 98kb. QTL
thứ hai đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 3 tại vị trí chỉ thị phân tử RM16RM168 (Cui và cs. 2003) [16].
Nhiễm sắc thể số 4: Ba QTLs/gen liên kết với tính trạng khối lƣợng nghìn
hạt đƣợc các nhà khoa học xác định hai QTLs tại vị trí gần chỉ thị phân tử
CDO244-RG864 (Zhuang và cs. 2002) [37] và một tại vị trí RG143 (Brondani
và cs. 2002) [14].
Nhiễm sắc thể số 5: Ba QTLs quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định
trên nhiễm sắc thể số 5 tại vị trí R1674-RG360 (Hua và cs. 2003) [19], và gần
tâm động liên kết chỉ thị RZ296 (Zhuang và cs. 1997) [36] và RM26 - C147
(Hua và cs. 2002) [19]. Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên
kết chỉ thị phân tử RG360-R3166 trên cánh tay đ n ngắn (Cui và cs. 2002) [15]
và tại RG13-RG470 (Hua và cs. 2002) [19].
Nhiễm sắc thể số 6: Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác
định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6, liên kết với chỉ thị phân tử
R2869 (Cui và cs. 2003) [16], và RG138-RM253 (Cui và cs. 2003), và G122R2549 (Nagatavà cs. 2002) [25].
Nhiễm sắc thể số 7: Bốn QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây
15


đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RG128-RG528 (Cui và cs. 2002) [15],

C1023-R1440 gần tâm động (Xing và cs. 2003) [35], RM336-R1245 (Xing và
cs. 2003), và RM234-R1789 (Xing và cs. 2003).
Nhiễm sắc thể số 8: QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên
kết chỉ thị phân tử RM223 – RZ28 (Cui và cs. 2003) [16]. QTLs quy định số hạt
chắc trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM210-RZ66 (Thomson
và cs. 2003).
Nhiễm sắc thể số 9: Một QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên
kết chỉ thị phân tử RM257-RG667 (Cui và cs. 2003) [16]. Một QTL quy định tính
trạng tổng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RM422-RM215
(Thomson và cs. 2003). QTLs quy định tính trạng hạt chắc trên bông đƣợc xác
định tại vị trí RM215 (Thomson và cs. 2003).
Nhiễm sắc thể số 10: Bốn QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt
liên kết chỉ thị phân tử C153A-RM222 trên vai ngắn nhiễm sắc thể 10 (Hua và
cs. 2003) [19], RG257-RM311 (Ishimaru, 2001) [21], RG241-RZ500
(Hittalmani và cs. 2003) [18], và RM561-C371 (Hua và cs. 2002) [19]. Hai
QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RM239RZ561 (Cui và sc. 2002) [15], C405-C371 trên cánh tay đ n dài (Xiao và cs.
1996) [31].
Nhiễm sắc thể số 11: Ba QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên
kết chỉ thị phân tử RM20B-RM167 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 11 (Brondani
và cs. 2002) [14], G44-G257 (Moncada và cs. 2001) [24] và RG103-RZ536
(Moncada và cs. 2001).
Nhiễm sắc thể số 12: Hai QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt
liên kết chỉ thị phân tử R887-G1128a (Hua et al. 2002) [19], RM235 (Thomson
et al. 2010) [32]. Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định
liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B (Hua và cs. 2003) [19], RG869
(Thomson et al. 2010) [32], CDO459-RG235 (Xiao et al. 1998) [33].

16

Hình 2.1. QTL/gen và chỉ thị phân tử liên kết với yếu tố cấu thành năng
suất đƣợc xác định trong 10 năm qua.

17