Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể BC3F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25 mang QTL gen tăng số hạt trên bông

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGÔ THỊ THANH

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
CHỌN LỌC CÁ THỂ BC3F1 CỦA TỔ HỢP
LAI KD18 x KC25 MANG QTL/GEN
TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. TRẦN ĐĂNG KHÁNH

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2, các thầy, cô giáo khoa Sinh – KTNN đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập tại trƣờng và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo – TS. Trần
Đăng Khánh, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên
cứu và hoàn thành khóa luận này. Đồng cảm ơn các anh chị Bộ môn Kĩ thuật
Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành
thực nghiệm thành công.
Trong quá trình nghiên cứu không tránh khỏi những thiếu sót và hạn

chế, kính mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến của thầy giáo, cô giáo và toàn
thể bạn đọc để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên thực hiện

Ngô Thị Thanh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, các số
liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và không trùng
lặp với các đề tài khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này
đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận này đã đƣợc ghi rõ
nguồn gốc.

Tác giả

Ngô Thị Thanh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4

1.1. Nguồn gốc cây lúa................................................................................... 4
1.2. Phân loại cây lúa ..................................................................................... 4
1.3. Giới thiệu về QTL ................................................................................... 5
1.4. Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống .... 6
1.4.1.Chỉ thị phân tử ............................................................................. 6
1.4.2.Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống ................. 12
1.5. Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .......... 15
1.5.1.Trên Thế giới ............................................................................. 15
1.5.2.Tại Việt Nam ............................................................................. 19
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 21
2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu ......................................................... 21
2.1.2. Mồi ADN ................................................................................. 22
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 22
2.3.1. Phƣơng pháp lai hữu tính – lai trở lại giữa giống ...................... 22
2.3.2.Phƣơng pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm ............................... 25
2.3.3. Phƣơng pháp xử lí số liệu ......................................................... 31


Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 32
3.1. Kết quả .................................................................................................. 32
3.1.1. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ .......................................... 32
3.1.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN .............................................. 32
3.1.3. Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể
BC3F1 ................................................................................................ 33
3.2. Thảo luận............................................................................................... 36
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 37
4.1. Kết luận ................................................................................................. 37
4.2. Kiến nghị ............................................................................................... 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 40


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AND

:

Axit Deoxyribonucleic

AFLP

:

Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều
dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc

RAPD

:

Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình
ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiên

RFLP

:

Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình
chiều dài mảnh phân cắt giới hạn

STS

:

Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã đƣợc
đánh dấu

RGA

:

Resistance Gene Analog – Vùng tƣơng đồng gen kháng

SNP

:

Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn

SSR

:

Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

Bp

:

Base pair – Cặp bazơ nitơ

cDNA

:

Complementary DNA – Thƣ viện ADN bổ trợ

Cs

:

Cộng sự

CTPT

:

Chỉ thị phân tử

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate

MABC

:

Marker Assisted Backcrossing – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân
tử kết hợp lai trở lại

MAS

:

Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

NST

:

Nhiễm sắc thể

PCR

:

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/ QTLs :

Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lƣợng

TBE

Tris-Boric Acid-EDTA

:


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

BẢNG
Bảng 2.1. Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 x KC25 tại vị trí
QTL/gen .......................................................................................... 22
Bảng 2.2. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR 27với mồi
SSR.................................................................................................. 27
Bảng 2.3. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR ......................................... 27

HÌNH
Hình 1.1. Một số QTL/gen đã đƣợc phát hiện ở 12 NST lúa trên Thế giới ... 18
Hình 3.1. Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% ...................................... 33
Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose 0,8% ............................................ 34
Hình 3.3. Hình ảnh điện di trên Polyacrylamide 4,5% BC3F1 với chỉ thị
RM445 ........................................................................................ 35
Hình 3.4. Kết quả chạy điện di trên gel Polyacrylamide 4,5% với chỉ thị
RM21615 ........................................................................................
Hình 3.5. Kết quả chạy điện di trên gel Polyacrylamide 4,5% với chỉ thị
RM500 ........................................................................................ 35


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây lúa (Oryza sativa L.) là nguồn thức ăn chính cho khoảng 2/3 dân
số thế giới và là một trong những cây lƣơng thực quan trọng nhất ở Việt Nam.
Việt Nam là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo đứng hàng đầu trên thế

giới, đây là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu. Theo
số liệu thống kê năm 2014, Việt Nam với diện tích khoảng 7,8 triệu ha sản
xuất đƣợc 44,84 triệu tấn thóc, không những đảm bảo an ninh lƣơng thực
Quốc gia mà còn xuất khẩu đƣợc 6,52 triệu tấn (Bộ Nông nghiệp và PTNT,
2014) [2]. Tuy nhiên, trong những năm gần đây quá trình đô thị hóa, công
nghiệp hóa diễn ra nhanh chóng, diện tích đất trồng lúa ngày càng bị thu hẹp
và chịu những ảnh hƣởng cực đoan từ biến đổi khí hậu làm năng suất lúa bị
sụt giảm rõ rệt, bên cạnh đó áp lực dân số ngày càng tăng đòi hỏi nguồn cung
lƣơng thực ngày càng vô cùng lớn. Việc phát triển nguồn giống cho năng suất
cao, chất lƣợng tốt là yếu tố quan trọng, cấp bách và có ý nghĩa cho an toàn
lƣơng thực, đảm bảo sản lƣợng lúa, tăng thu nhập cho ngƣời dân.
Phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS-Marker assisted
selection) và lai trở lại (MABC – Marker Asissted Backcrossing) đã đƣợc ứng
dụng rộng rãi và đã thành công tại nhiều nƣớc trên Thế giới. Trong đó, Viện
Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) đã thành công trong việc quy tụ QLT/gen chịu
ngập và chịu mặn vào một số giống lúa trồng phổ biến ở các nƣớc Đông Nam
châu Á nhƣ: Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, Băng-la-đét. Phƣơng pháp chọn giống nhờ
chỉ thị phân tử là phƣơng pháp thiết thực, hiệu quả trong việc quy tụ locus gen
quy định tính trạng di truyền số lƣợng (QTL) hay gen vào giống mới cho phép
rút ngắn quá trình chọn lọc, chọn lọc đƣợc những tính trạng khó hay nhiều gen
cùng một lúc. Chọn giống bằng phƣơng pháp MAS, MABC sẽ giảm đƣợc giá
thành, thời gian và cho hiệu quả cao hơn so với phƣơng pháp chọn giống

1


truyền thống. Phƣơng pháp này cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá
thể trong quần thể. Việc ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại từ 2 đến 3
thế hệ có thể thu đƣợc con lai mang gen quan tâm. Các dòng này tự thụ, thu hạt
để thử nghiệm phát triển trên đồng ruộng.

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên kết hợp phƣơng pháp chọn giống
nhờ chỉ thị phân tử và chọn giống truyền thống để tạo ra dòng/giống lúa có
năng suất cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Ứng dụng chỉ thị phân
tử chọn lọc cá thể BC3F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25 mang QTL/gen tăng
số hạt trên bông”.
2. Mục đích nghiên cứu
Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định sự có mặt của QTL/gen tăng số hạt
trên bông của các cá thể trong quần thể BC3F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25.
3. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc ứng dụng phƣơng pháp
MABC chọn lọc cá thể BC3F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông phục vụ
cho công tác chọn tạo giống lúa cao sản.
- Thời gian thực hiện đề tài thực hiện: tháng 6/2015 đến tháng 05/2016.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp phƣơng pháp lai trở lại để chọn lọc
nhanh và chính xác các cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông, nhằm rút
ngắn thời gian, công sức chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lƣợng lớn cá thể
gieo trồng hàng vụ và khắc phục đƣợc một số hạn chế của phƣơng pháp
truyền thống.
- Ý nghĩa thực tiễn
Những thành công bƣớc đầu trong lai chuyển QTL/gen tăng số hạt trên
bông nhờ sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi

2


trong công tác chọn giống nói chung, không chỉ đối với tính trạng năng suất
mà còn với nhiều đặc tính nông học quan trọng khác đáp ứng nhu cầu lƣơng
thực cho con ngƣời.

Những cá thể trong quần thể BC3F1 triển vọng đƣợc chọn lọc trong đề tài
này sẽ đƣợc trồng thử nghiệm và tiếp tục đánh giá, chọn tạo ra các dòng/giống
lúa có tiềm năng năng suất cao, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn gốc cây lúa
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra nhiều ý kiến khác nhau về
nguồn gốc cây lúa nhƣ sau:
Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan,…
thì cây lúa đã có mặt từ 3000 - 2000 năm trƣớc công nguyên. Từ các trung tâm
khởi nguyên là Trung Quốc và Ấn Độ, cây lúa đã phát triển theo hƣớng Đông
Tây và đến nay có mặt khắp thế giới. Vùng phân bố của cây lúa trên thế giới
tƣơng đối rộng, từ 50 vĩ độ Bắc (Trung Quốc) đến 35 vĩ độ Nam (Châu Úc).
Nhiều dẫn liệu khảo cổ học đã chứng minh tổ tiên của cây lúa là ở
Đông Nam Á (Việt Nam, Thái Lan,…). Vì Đông Nam Á là một vùng có diện
tích trồng luá tập trung và lớn nhất trên thế giới, có khí hậu nóng ẩm, thích
hợp với sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa. Ngoài ra, các tài liệu lịch sử,
các di tích khảo cổ ở nhiều nƣớc thuộc vùng này đều nói về cây lúa cũng nhƣ
nghề trồng lúa.Ví dụ: Roscleviez đã tìm thấy những hạt gạo cháy, vỏ trấu ở
Đông Nam Á. Theo Candalle (1886). Cây lúa có nguồn gốc ở Ấn Độ. Theo
Sampath (1973) xác định có vết tích của cây lúa ở Thái Lan.
Những các quan điểm trên đều có điểm thống nhất chung là: nguồn gốc
cây lúa ở Đông Nam Á. Ngƣời Đông Nam Á đã tạo ra cây lúa nƣớc nổi tiếng
và tích lũy đƣợc vốn kỹ thuật trồng lúa khá phong phú. Từ đây, cây lúa và kỹ
thuật trồng lúa mới đƣợc lan tràn tới các vùng khác trên thế giới.

1.2. Phân loại cây lúa
- Phân loại theo đặc điểm sinh học.
Lúa trồng (Oryza satiza) có bộ NST 2n=24 đƣợc thuần hóa từ cây lúa
dại thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza.

4


Chi Oryza phân bố rộng khắp thế giới với 19 loài (Hội nghị Di truyền
Quốc tế - 1963), có loài sống một năm, có loài sống nhiều năm. Trong số đó
có hai loài lúa trồng là:
Oryza sativa L. đƣợc trồng phổ biến trên thế giới.
Oryza sativa L. glaberrima trồng phổ biến ở một số nƣớc Châu Phi.
Việc phân loại Oryza sativa cũng có nhiều quan điểm khác nhau:
Theo Kikawa và Kota (1931): Oryza sativa L. đƣợc chia làm 2 loài phụ:
Oryza sativa sub.sp.Japonica Kato (lúa tiên): Loài phụ Nhật Bản.
Oryza sativa sub.sp.Indiaca Kato (lúa cánh): Loài phụ Ấn Độ.
Theo Hoàng Thị Sản (1999) có 2 loài:
Oryza sativa L.var.UtilissimaA.Camus: Lúa tẻ.
Oryza sativa L.var.Glutinosa Tanaka: Lúa nếp.
Theo chất lƣợng và hình dạng hạt chia thành: lúa tẻ, lúa nếp, lúa hạt
dài, lúa hạt tròn [7].
1.3. Giới thiệu về QTL
Tính trạng số lƣợng (QTL) là tính trạng thể hiện sự phân bố chuẩn liên
tục trong quần thể lớn và chƣa qua một chọn lọc nào. Tính trạng số lƣợng nói
chung đƣợc thể hiện rõ nhƣ là một tính trạng với sự biến đổi liên tục. Tính
trạng đƣợc quan tâm điều khiển bởi nhiều gen và mỗi gen đều có tác động
nhỏ đối với tính trạng mục tiêu. Sự xác định các vị trí của nhiễm sắc thể đơn
nơi xảy ra biến đổi gen đƣợc biểu hiện rõ gọi là QTL. Bản đồ QTL
(Quantitative Trait Loci) đƣợc áp dụng trong trƣờng hợp những tính trạng

mục tiêu do đa gen điều khiển. Di truyền tính trạng số lƣợng truyền thống
không thể phát hiệnQTL trên những locut riêng biệt gắn với tính trạng số
lƣợng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với
những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lƣợng marker
phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong genome cây trồng sẽ cung cấp cho chúng

5


ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lƣợng phức tạp,
định vị gen trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết
với gen khác [13].
Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những
tính trạng số lƣợng bằng cách xác định số lƣợng, vị trí, những ảnh hƣởng của
gen và hoạt động của những locut bao gồm tƣơng tác gen và tƣơng tác giữa
QTL với môi trƣờng. Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những
marker mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho
việc áp dụng MAS trở nên có hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn giống chống
chịu khô hạn, chóng chịu mặn,…
1.4. Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống
1.4.1. Chỉ thị phân tử
Để chọn đƣợc một giống cây trồng với tính trạng mong muốn dùng
phƣơng pháp lai và chọn giống dựa theo tính trạng đòi hỏi tốn nhiều thời gian
và tốn kém. Các dòng cây trong quá trình chọn lọc cần phải đạt đến độ trƣởng
thành thì mới đánh giá đƣợc bƣớc thí nghiệm lai trƣớc đó có thành công hay
không. Các giống càng phức tạp thì đòi hỏi càng nhiều thời gian và nhiều cố
gắng thì mới có thể đạt đƣợc kết quả mong muốn. Đó là với phƣơng pháp
chọn giống truyền thống.
Đối với chọn giống bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử đem lại lợi ích
nhƣ sau:

- Đơn giản hơn so với chọn lọc dựa trên kiểu hình.
- Đặc biệt đối với các tính trạng mà phải cần nhiều lao động trong quá
trình chọn lọc, có thể tiết kiệm thời gian và tiết kiệm diện tích đồng ruộng
thí nghiệm.
- Có thể chọn lọc ở giai đoạn cây non, rất quan trọng cho các tính trạng
nhƣ chất lƣợng hạt, có thể chọn lọc trƣớc khi cấy ở cây lúa.

6


- Tăng độ tin cậy, không bị ảnh hƣởng của môi trƣờng, có thể phân biệt
đƣợc dạng đồng hợp tử và dị hợp tử và chọn lọc đƣợc từng cá thể đơn lẻ.
- Lợi ích tiềm tàng của chọn giống bằng chỉ thị phân tử: chính xác và
hiệu quả hơn trong việc chọn lọc các kiểu gen đặc trƣng, nhờ đó có thể đẩy
nhanh việc phát triển các giống mới, sử dụng hiệu quả hơn các phƣơng tiện
thí nghiệm đặc biệt là ruộng thử nghiệm [5].
Khái niệm về chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assisted
Breeding-MAS) đã đƣợc đề cập cách đây hơn hai thập kỷ bởi Smith và
Simpson (1986) và Soller và Beckmann (1983). Chỉ thị phân tử (molecular
marker) là “những đặc tính sinh học đƣợc xác định bằng dạng hình alen gen
hoặc locus gen và có thể đƣợc truyền từ một thế hệ này sang thế hệ khác”, do
đó chúng có thể đƣợc sử dụng nhƣ một thiết bị dò để theo dõi một cá thể, mô,
tế bào, nhân, nhiễm sắc thể, hoặc một gen.
Một kỹ thuật chỉ thị phân tử lý tƣởng cần đáp ứng một số yêu cầu sau:
1. Thể hiện tính đa hình và mức độ phân bố đều trên toàn bộ hệ gen.
2. Cung cấp đầy đủ độ phân giải khác biệt di truyền.
3. Tạo ra nhiều chỉ thị độc lập và đáng tin cậy.
4. Đơn giản, thực hiện nhanh chóng và rẻ tiền.
5. Yêu cầu một số lƣợng nhỏ ADN.
6. Có mối liên kết với các kiểu hình riêng biệt.

7. Có thể không cần thông tin trƣớc về bộ gen của vật liệu nghiên cứu.
Chỉ thị phân tử đƣợc chia ra làm hai loại: chỉ thị cổ điển và chỉ thị
ADN [20].
Chỉ thị cổ điển bao gồm: chỉ thị hình thái, chỉ thị tế bào và chỉ thị
hóa sinh.

7


Chỉ thị phân tử gồm 3 loại chính: chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN, chỉ thị
dựa trên cơ sở nhân bản ADN, chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự
lặp lại.
 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
* Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình
chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)
Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RFLP là sau khi tách chiết, ADN genome
đƣợc cắt bằng enzim cắt hạn chế, các phân đoạn ADN sau đó đƣợc phân tách
bằng điện di gel agarose rồi đƣợc thấm truyền bằng bằng phƣơng pháp
Southern lên màng nylon và đƣợc lai với các đoạn dò đƣợc đánh dấu bằng
phóng xạ hoặc huỳnh quang, cuối cùng là hiện trên phim.
Chỉ thị RFLP có mức đa hình cao, đồng trội nên có thể phân biệt đƣợc
các thể đồng hợp tử và các cá thể dị hợp tử và khả năng lặp lại cao. Kĩ thuật
cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu. Đây là đặc điểm ƣu việt của chỉ thị
RFLP. Tuy nhiên kỹ thuật này không đƣợc sử dụng rộng rãi vì một số hạn chế
nhƣ: cần nhiều ADN chất lƣợng cao, phải phát triển thƣ viện đoạn dò cho
từng loài, cần thông tin về trình tự đồng hóa, mức dộ đa hình và số lƣợng
locus trên lần phân tích thấp, đòi hỏi nhiều thời gian, tốn kém. RFLP là một
trong những chỉ thị hình thành sớm nhất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đa
hình di truyền. Năm 1992, Wangz đã sử dụng chỉ thị RFLP để thiết kế sơ đồ
cây chủng loại phát sinh ở lúa [15].

 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN
Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cs đƣa
ra năm 1985. Phản ứng kéo dài chuỗi (PCR) nhân bản các vùng ADN đƣợc
xác định có biên giới là các trình tự có thể kết hợp bổ sung. Cần thiết phải có
ADN khuôn mẫu, Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq), các đoạn
mồi, dNTPs và Mg2+.

8


* Chỉ thị RAPD (RADNomly Amplified Polymorphic ADNs – Đa hình
các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên)
Cơ sở của kỹ thuật là sự nhân bản của ADN genome bằng phản ứng
PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình ADN do sự tái sắp xếp hoặc
mất nucleotide ở vị trí bắt mồi. Đây là loại chỉ thị di truyền đƣợc tạo ra dựa
trên cơ sở của phản ứng PCR, sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên dài 10
nucleotit và quá trình nhân bội ngẫu nhiên.
Sản phẩm nhân bội có thể đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose
hoặc polyacrylamide và có thể quan sát đƣợc sau khi gel đƣợc nhuộm với các
hóa chất đặc trƣng. Nó là loại chỉ thị di truyền trội. Sự khác biệt giữa 2 cá thể
có thể nhận biết bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của những băng RAPD đặc
trƣng. Phƣơng pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng. Tuy vậy, độ chính xác
còn tùy thuộc vào máy PCR và thao tác cá nhân. Sự đa hình phát hiện đƣợc
khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ nucleotit ở vị trí gắn
mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuếch đại [16].
* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình
chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Chỉ thị AFLP đƣợc tạo ra bằng cách nhân lên một cách chọn lọc AND
hệ gen đã đƣợc cắt bằng enzym giới hạn bằng máy PCR. Khi xử lý enzym giới
hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thƣớc khác nhau. Mỗi mảnh cắt,

đều biết trƣớc trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở
hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối
các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta
thiết kế mồi PCR. Với mồi thiết kế nhƣ vậy thì chỉ có những đoạn ADN có
trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới đƣợc nhân bản.Ƣu điểm là
lƣợng ADN sử dụng cho nghiên cứu ít, băng ADN ổn định. AFLP còn cung
cấp một lƣợng đa hình ADN lý tƣởng từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào từ đơn

9


giản đến phức tạp. Chỉ thị này đƣợc sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm,
tuy nhiên chỉ thị này là di truyền trội, khi sử dụng giá thành tƣơng đối cao.
* Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã
được đánh dấu)
STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000 bp có thể đƣợc phát
hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí đƣợc đánh dấu
bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trƣớc của ADN trong
genome. STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locus đã biết bằng việc sử
dụng cặp mồi PCR. Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính
đặc hiệu cao với PCR. Ở cây lúa, các STS đƣợc coi nhƣ là mốc chuẩn và
ngƣời ta sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết
nhƣ STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa [9].
* Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)
Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN đƣợc xây dựng dựa
vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng”
ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã đƣợc dùng
để tách, lập bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền.
* Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các
nucleotit đơn)

SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN đƣợc tìm thấy với tần
suất cao nhất trong genome ngƣời. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của
những phần nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều
giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 5001000 bp. Một cặp base ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể
có tính chất phổ biến, và một cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng
một vị trí. Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể,
ngƣời ta gọi vị trí cặp base đó là một SNP.

10


 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại
Chuỗi lặp lại có trật tự (TADNemly Repeated Sequence) là những trình
tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thƣờng đƣợc
gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lƣợng bản sao
của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi.
* Tiểu vệ tinh (Minisatellite)
Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6
nucleotid trở lên, bao phủ một vùng từ 0,5-3kb. Không giống nhƣ ADN vệ
tinh, tiểu vệ tinh đƣợc tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thƣờng thay đổi
rất nhiều về kích thƣớc. Có 2 loại ADN tiểu vệ tinh. Đó là ADN đầu mút NST
và ADN tiểu vệ tinh siêu biến. ADN đầu mút NST nằm ở vai NST, gồm một
vài kilobase.
* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản)
Trong các chỉ thị trên, chỉ thị SSR đáp ứng đƣợc hầu hết các yêu cầu
của một chỉ thị phân tử, và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu di truyền học, sinh thái học, di truyền tiến hóa, và chọn giống. Chỉ
thị SSR do Litt và Lutty phát hiện năm 1989, chỉ thị cần có thông tin về trình
tự, dựa trên nguyên tắc PCR, nên chỉ cần một lƣợng mẫu ADN nhỏ, kiểu di
truyền của Menden, đồng trội, có mức đa hình cao, và ứng dụng chỉ thị này

trong lập bản đồ liên kết, gắn thẻ gen, nghiên cứu quần thể [5].
Chỉ thị SSR còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh, là loại chỉ thị lặp lại trình tự
ADN ở hầu hết hệ gen thực vật. Chỉ thị có tính đa hình cao và đƣợc sử dụng
để nhận biết các alen biến dị trong quần thể nghiên cứu. Chỉ thị SSR ứng
dụng rộng rãi trong nhiều giống cây trồng nhƣ: lúa, lúa mì, đậu tƣơng, dƣa
chuột, lạc,... chỉ thị cũng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa hệ gen, và
SSR cũng đã chứng minh tiện ích trong nghiên cứu chọn lọc nhờ chỉ thị và lập
bản đồ di truyền số lƣợng. SSR là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật

11


tự, gồm những đơn vị có chiều dài từ 1 - 6 nucleotide lặp lại (hay kiểu lặp lại
ngắn) đƣợc gọi là Microsatellites. Hiện tƣợng tồn tại các SSR trong cơ thể
sinh vật nhân thật là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lƣợng nucleotide trong
mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lƣợng đơn vị lặp
lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn [7]. Chỉ thị
có ƣu điểm là đơn giản, dễ sử dụng với ký thuật PCR, điện di trên gel biến
tính để xác định kích thƣớc alen, số lƣợng alen trên locus lớn do đó cung cấp
nhiều thông tin hơn. Chỉ thị còn rất hữu dụng cho nghiên cứu về đa dạng chức
năng giữa các loài có liên quan chặt chẽ, liên quan tới những thay đổi về tính
thích nghi.
1.4.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống
Trong nghiên cứu sử dụng chỉ thị ADN đƣợc ứng dụng để phân tích đa
dạng di truyền rút ngắn thời gian chọn lọc đói với các tính trạng không hoặc
khó đánh giá thông qua kiểu hình. Giúp xác định mối quan hệ di truyền các cá
thể trong cùng loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dƣới loài,
phát hiện loài mới và mối quan hệ giữa các loài. Hơn nữa, nghiên cứu đa dạng
di truyền có thể tiên đoán giúp khả năng cho ƣu thế lai giữa các cặp bố mẹ.
Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen, chỉ thị ADN cũng cho

phép các nhà chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử.
Bản đồ với tính trạng số lƣợng (QTL) thƣờng có ít thông tin về sự kiểm soát
gen. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để quy tụ gen khắc
phục nhƣợc điểm trong chọn giống truyền thống, gặp nhiều khó khăn [7].
Yếu tố quan trọng nhất đối với chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử là
mối liên kết hay sự tƣơng quan giữa các chỉ thị và tính trạng quan tâm.
Mackill và Collard (2006) đã đƣa ra khái niệm chọn giống lúa dựa trên chỉ thị
phân tử, là sử dụng các chỉ thị ADN liên kết chặt chẽ với locus mục tiêu để
thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình. Chọn giống nhờ ứng dụng chỉ thị cần

12


thiết phải đánh giá nguồn vật liệu di truyền trƣớc khi thực hiện một chƣơng
trình lai giống. Cũng theo Mackill và cs (2006) MAS ứng dụng trong chọn tạo
giống lúa có những ƣu điểm nổi bật là:
Đặc biệt với các tính trạng khó đánh giá, thanh lọc dựa trên kiểu hình,
tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc, rất quan trọng đối
với tính trạng quy định chất lƣợng hạt, có thể chọn lọc ở giai đoạn đầu, trƣớc
khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3, không bị ảnh
hƣởng từ tác động của điều kiện môi trƣờng, có thể phân biệt giữa đồng hợp
tử và dị hợp tử và chọn lọc từng cá thể.
Với mục đích chính của chỉ thị phân tử là nâng cao hiệu quả của công
tác chọn giống, làm giảm bớt thời gian và chi phí cần thiết để tạo đƣợc các
giống cây trồng mới với tính trạng mong muốn.
Một số hƣớng trong sử dụng chỉ thị phân tử vào chọn giống
1. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai ngƣợc (Marker-assisted
backcrossing)
2. Tập hợp gen hay tính trạng tốt (Pyramiding)
3. Chọn lọc từ các thế hệ ban đầu

4. Sử dụng tổng hợp các biện pháp
Chọn giống nhờ chit thị kết hợp lai trở lại (MABC) là phƣơng pháp
đƣợc sử dụng rộng rãi và thành công nhất trong chọn tạo giống phân tử thực
tế. Mục đích của MABC là chuyển một hoặc một vài QTL/gen quan tâm từ
một nguồn vật liệu di truyền vào các dòng/giống lúa ƣu tú để cải tiến tính
trạng mục tiêu. Không giống phƣơng pháp lai trở lại truyền thống, MABC
đƣợc dựa trên các chỉ thị alen có mối quan hệ hoặc liên kết với QTL/gen quan
tâm thay vì đánh giá kiểu hình tính trạng mục tiêu. Các bƣớc MABC đƣợc
thực hiện theo các trình tự sau:

13


Chọn lọc các bố mẹ cặp bố mẹ cho mục đích lai tạo, bố hoặc mẹ là
giống đặc trƣng thích ứng dụng, đƣợc sử dụng nhƣ cây tái tục hay cây nhận
gen và các giống mang khác mang QTL/gen quan tâm đƣợc sử dụng nhƣ cây
cho gen, trong đó cần có hoặc xác định các tính trạng mong muốn cần chuyển
và các alen chỉ thị ADN liên quan với gen tính trạng.
Phát triển quần thể cây F1 và xác định sự có mặt của các alen chỉ thị ở
giai đoạn đầu phát triển nhằm loại bỏ những con lai không phù hợp và thực
hiện lai trở lại với các con lai F1 mang gen với cây nhận gen.
Phát triển quần thể lai trở lại BC1F1, sàng lọc các cá thể bằng các chỉ thị ở
gian đoạn đầu phát triển, và lai trở lại với các cá thể mang gen mong muốn (dị
hợp tử) với cây nhận gen. Lặp lại bƣớc này ở các mùa vụ tiếp theo từ 2 đén 4
thế hệ, phụ thuộc vào các yêu cầu thực tế nghiên cứu.
Phát triển quần thể lai trở lại cuối cùng, và sàng lọc các cá thể với các
chỉ thị cho tính trạng mục tiêu và loại bỏ các cá thể mang alen đồng hợp tử từ
cây nhận gen. Có các cá thể với chỉ thị alen yêu cầu cho tự thụ và thu mẫu.
Phát triển thế hệ con cái của dòng lai tự thụ xác định các chỉ thị và thu các cá
thể đồng hợp tử với cây nhận gen của tính trạng mục tiêu cho mục đích đánh

giá sau này và phát triển giống.
Ƣu điểm của MABC so với phƣơng pháp lai trở lại truyền thống thể hiện
ở ba điểm chính sau:
+ Chọn lọc hiệu quả các locus mục tiêu
+ Giảm thiểu những liên kết kéo theo
+ Lấy lại nhanh chóng nền di truyền của giống nhận gen trong chu kỳ
chọn lọc
+ Hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính trạng di truyền số
lƣợng (QTL) hay gen vào giống mới và rút ngắn quá trình chọn lọc.

14


Phƣơng pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại là hết sức
quan trọng, hỗ trợ cho chọn giống truyền thống và quyết định sự thành công
trong quá trình chọn tạo giống [5].
1.5. Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.5.1. Trên Thế giới
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ
thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen. Với sự ra đời của hàng
loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định các QTL liên kết đến các
tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu hành năng suất. Nghiên cứu xác định chỉ
thị phân tử và lập bản đồ QTL/ gen điều khiển môt tính trạng năng suất là một
việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di tryền
số lƣợng, nó là tổ hợp tính trạng nhƣ: số hạt chắc trên bông, số bông trên khóm,
khối lƣợng nghìn hạt. Những năm gần đây, nhiều QTL /gen quy định tính trạng
cấu thành năng suất đã đƣợc xác định trên rất nhiều quần thể từ các tổ hợp lai
giữa giống hay các loài phụ. QTL/gen năng suất và các yếu tố cấu thành năng
suất đƣợc xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa.
Trên nhiễm sắc thể số 1:

Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định đƣợc nhiều tính trạng liên
quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 nhƣ: Ba QTLs quy định tính trạng
khối lƣợng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283-RM259 [14]. Một
QTL liên kết tính trạng số hạt trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490
[11]. Một QTL liên kết tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM265-RM315 [14].
Nhiễm sắc thể số 2:
QTL quy định khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định tại vị trí chỉ thị
phân tử RM240-RM266 [15]. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt
đƣợc xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RZ123-RZ446 trên vai dài của nhiễm
sắc thể số 2 [17].

15


Nhiễm sắc thể số 3:
Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt
trên nhiễm sắc thể số 3. Một trong số đó là QTL đƣợc xác định tại vị trí tâm
động [18]. QTL thứ ba đƣợc xác định trên vai ngắn. Hai QTLs liên kết tổng
số hạt trên bông trên vai dài của nhiễm sắc thể 3. Một QTL liên kết số hạt trên
bông. Gần chỉ thị phân tử RM282, một QTL cho số hạt chắc trên bông cũng
đƣợc xác định [16].
Nhiễm sắc thể số 4:
Ba QTLs/gen liên kết với tính trạng khối lƣợng nghìn hạt đƣợc các nhà
khoa học xác định hai QTLs tại vị trí gần chỉ thị phântử CDO244-RG864 [19].
Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động.Hai QTL quy
định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động [19].
Nhiễm sắc thể số 5:
Ba QTLs quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định trên nhiễm sắc
thể số 5 tại vị trí R1674-RG360 [18], và gần tâm động liên kết chỉ thị RZ296.
Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử

RG360-R3166 trên vai ngắn và tại RG13-RG470 [17].
Nhiễm sắc thể số 6:
Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định một tại vị
trí R2869-C226, một tại C751A-RZ667 và một tại R2549-C962. Ba QTLs quy
định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm
sắc thể số 6 [12].
Nhiễm sắc thể số 7:
Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng 1000 hạt liên kết chỉ thị phân tử
RG128-C1023 trên vai ngắn, RM125 gần tâm động, và -RZ626.Ghd7 là gen
quy định tính trạng tăng số hạt trên bông đã đƣợc phát hiện từ giống lúa
Minghui 63. Ghd7 nằm gần tâm động, trên nhiễm sắc thể số 7 [15].

16


Nhiễm sắc thể số 8:
QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử
C1121-RZ562 gần tâm động.Bốn QTLs quy định số hạt chắc trên bông đƣợc
xác định liên kết chỉ thị phân tử RG333-C1121, RM25-RG978, RM210RZ66, và CDO99 [17].
Nhiễm sắc thể số 9:
Một QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân
tử RM257-RG667 [12].Ba QTLs quy định tính trạng năng suất liên kết chỉ thị
phân tử C1232-R1164 và RM219-RZ698 [12].
Nhiễm sắc thể số 10:
Bốn QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị
phân tử C153A-RM222 trên vai ngắn nhiễm sắc thể 10 [12]. Hai QTLs quy
định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RM239-RZ56,
C405-C371 trên vai dài [13].
Nhiễm sắc thể số 11:
Ba QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân

tử RM20B-RM167 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 11, G44-G257 và RG103RZ536. Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông liên kết chỉ thị phân tử
RM20-C104, RZ537-RZ900, và RM254-C950 [13].
Nhiễm sắc thể số 12:
Hai QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân
tử RG574và RG341 hay RG869 [19]. Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên
bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B, RG869,
CDO459-RG235 [17].

17


Hình 1.1. Một số QTL/gen đã đƣợc phát hiện ở 12 NST lúa trên Thế giới

18