Khảo sát và phân tích sự bài thải của chramphenicol bằng kỹ thuật LC MS MS trên tôm (penaeus monodon) được nuôi trong điều kiện thí nghiệm

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH
BAN CHẤP HÀNH TP. HỒ CHÍ MINH

CÔNG TRÌNH Dự THI
GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN cứu KHOA HOC - EURE’KA
LẦN THỨ 11 NĂM 2009

KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH sự BÀI THẢI CHLORAMPHENICOL
BẰNG KỸ THUẬT LC/MS/MS TRÊN TÔM sú (Penaeus monodon)
ĐƯỢC NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

LĨNH Vực NGHIÊN CỨU: Tự NHIÊN
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH TÁC
GIẢ: Nguyễn Minh Triết

Mẽi lò' eớnạ trình :


1

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC................................................................................................................................1
DANH SÁCH CÁC

CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................3

DANH SÁCH CÁC

BẢNG ...............................................................................................4

DANH SÁCH CÁC

HÌNH .................................................................................................5

Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................................6
Chương 2 MỤC TIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu ............................................... 8
2.1.

Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................... 8

2.2.

Thời gian, địa điểm và phương pháp tiến hành .......................................................... 9

2.2.1.

Thời gian ....................................................................................................................9

2.2.2.

Địa điểm ....................................................................................................................9

2.3. Vật liệu .............................................................................................................................9
2.3.1.

Mẩu tôm ....................................................................................................................9

2.3.2.

Hóa chất.................................................................................................................... 12

2.3.3.

Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................................12

2.4. Phương pháp phân tích LC/MS/MS .............................................................................. 12
2.4.1.

Cách chuẩn bị mẫu phân tích .................................................................................. 12

2.4.2.

Điều kiện phân tích ..................................................................................................13

2.4.3.

Pha các dung dịch chuẩn .......................................................................................... 14

2.4.4. .........................................................................................................................
Nguyên tắc định lượng CAP ................................................................................................ 15
2.4.5.

Công thức tính toán nồng độ CAP có trong mẫu .................................................... 15

2.4.6.

Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết mẫu ............................................................... 16

2.4.7.

LOD và LOQ của phương pháp .............................................................................. 16

Chương 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 18
31. Trọng lượng của mẫu tôm sú s au quá trình nuôi thí nghiệm ......................................... 18
3.2.

Xây dựng đường chuẩn CAP ...................................................................................... 19

3.3. ............................................................................................................................ Đánh
giá hiệu quả thu hồi của quy ữình chiết mẫu ......................................................................... 21
3.4.

LOQ của phương pháp.................................................................................................23


2

3.5.

Xác định thòi gian bài thải của CAP trên tôm sú ....................................................... 23

3.6.

Khảo sát nhỏ về tình hình nhiễm CAP trên tôm ở khu vực huyện Thủ Đức .............. 26

Chương 4 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 31
4.1.

Kết luận ....................................................................................................................... 27

4.2.

Đề nghị ....................................................................................................................... 27

TÀI LỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 29
PHỤC LỤC


3

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CAP
CLX

Chloramphenicol
Chợ Linh Xuân

CTD

Chợ Thủ Đức

DC

Đối Chứng

H

Giờ

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

GC/MS

Gas Chromatography/Mass Spectrometry

LC/MS/MS

Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry

LOD

Limit of Detection

LOQ
MRPL

Limit of Quantitation
Minimum Require Performance Limit

MeOH

Methanol

MS

Mass Spectrometry

ppm

ppb

part per million
part per billion

Rt

Retention time

ITC

Total ion Chromatography


4

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Tốc độ dòng của pha động trong quá trình sắc ký kháng sinh CAP ..........................13
Bảng 3.1 Trọng lượng tôm được thu ở các thời điểm khác nhau sau khi nuôi .........................18
Bảng 3.2 Thời gian lưu và cường độ lon m/z 151,9 của các nồng độ chuẩn ............................19
Bảng 3.3 Cường độ của lon m/z 151,9 của các mẫu đã thêm chuẩn .........................................21
Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết tách CAP từ mẫu tôm ......................................22
Bảng 3.5 Nồng độ ữung bình của CAP ưên tôm ......................................................................24
Bảng 3.6 Kết quả phân tích CAP của 25 mẫu tôm ở địa bàn quận Thủ Đức ............................26


5

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ sơ ĐỒ

Trang
Hình 2.1 Ao dùng để nuôi tôm toong thí nghiệm ................................................................ 11
Hình 2.2 lon m/z 151,9 và lon m/z 256,9 .............................................................................. 15
Hình 3.1 Phổ đồ lon định lượng m/z 151,9 của nồng độ chuẩn 0,1 ppb ............................... 19
Hình 3.2 Đường chuẩn CAP ................................................................................................ 20
Hình 3.3 Phổ đồ lon định lượng m/z 151,9 của mẫu thêm chuẩn 0,1 ppb ............................. 21
Hình 3.4 Đường chuẩn c AP của các mẫu tôm được thêm chuẩn CAP ................................ 22
Hình 3.5 Tỷ lệ S/N của chuẩn 0,1 ppb .................................................................................. 23
Hình 3.6 Ln nồng độ CAP (ppb) theo thời gian ................................................................... 24
Sơ đồ 2.1 Quy trình nuôi tôm dùng làm mẫu thí nghiệm ..................................................... 11


6

Chương 1
ĐẶT VẤN ĐÈ
Kháng sinh Chloramphenicol trước đây được trộn một lượng nhỏ vào trong thức ăn cho tôm
với mục đích kích thích khả năng sinh trưởng của tôm nuôi. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh này
đã để lại sự tồn dư toong cơ thịt của tôm. Qua hàng chục năm nghiên cứu các nhà khoa học đã khẳng
định khi người tiêu dùng tiêu thụ sản phẩm tôm có tồn dư CAP thì có sự tích lũy tồn dư kháng sinh
này cao, chính điều này sẽ gây ra những độc hại mãn tính cho người sử dụng. Do đó, các cơ quan
quản lý an toàn thực phẩm của Mỹ, Châu Âu và ngay cả của Việt Nam cũng đã liệt CAP vào danh
sách cấm sử dụng toong nuôi trồng, chế biến và bảo quản tôm. Tuy nhiên cũng cần phải thấy rằng
ờ Việt Nam quy định này chỉ khắt khe cho hàng xuất khẩu, còn với hàng tiêu thụ nội địa thì việc
kiểm tra quy trình nuôi, chế biến và bảo quản vẫn còn bỏ ngỏ.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành:
Xây dựng quy trình định lượng dư lượng CAP
Kiểm toa chất lượng của 25 mẫu tôm trên địa bàn Thủ Đức
Khảo sát sự bài thải tồn dư CAP nhằm xác định được thời gian bài thải bán rã của CAP (tj/2
CAP) toong tôm tù đó làm cơ sở cho các nhà quản lý và người chăn nuôi toong quản lý, sử dụng

kháng sinh họrp lý.
Sự bài thải của Chloramphenicol được khảo sát trên cơ thịt tôm (Penaeus monodon) sau khi
ngưng cho ăn kháng sinh và được thực hiện trong điều kiện nuôi thí nghiệm có kiểm soát. Tôm được
nuôi trong bốn ao: 2 ao đối chứng và 2 ao cho ăn thức ăn có trộn CAP với nồng độ tính toán là 2000
mg/kg. Mầu tôm được thu ở các thời điểm khác nhau:l giờ , 5 giờ, 10 giờ, 20 giờ, 30 giờ, 60 giờ,
120 giờ) sau lần cuối cho ăn thức ăn có chúa kháng sinh.
Kết quả đạt được:
Quy trình phân tích dư lượng CAP đạt được giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,03
ng/g đáp ứng tốt hơn giới hạn phát hiện của các thị trường nhập khẩu Mỹ-EU-Nhật (0.3 ng/g). Quy
trình này được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS.


7

Thăm dò sơ bộ cho thấy tôm tiêu thụ trên địa bàn Quận Thủ Đức không hoàn toàn sạch
kháng sinh Chloramphenicol (2/25 mẫu). Các mẫu được phát hiện ở nồng độ thấp (0,68 ppb 0,87
ppb ).
Sau 60 giờ kể tù khi ngưng cho ăn kháng sinh thì nồng độ CAP là không xác định (<0,3
ppb) trong cơ thịt tôm. Thời gian bài thài bán rã của CAP (t1/2 CAP) trong tôm nuôi là 13,5 giờ.


8

Chương 2
MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Mục tiêu
Tôm là mặt hàng xuất khẩu đem lại giá trị kinh tế lớn cho nuớc ta toong những năm qua
cũng như đem lại lợi ích kinh tế rất lớn cho người nuôi tôm. Mật độ và diện tích nuôi tôm ngày
càng gia tăng, cùng với đó là tình trạng gia tăng sử dụng của các loại thuốc và hóa chất trong việc
nuôi trồng, chế biến và bảo quản sản phẩm. Việc sử dụng thường xuyên và không tuân thủ nghiêm

các quy định sẽ dẫn đến lạm dụng thuốc, gây ra tồn dư các loại thuốc và hóa chất trên các sản phẩm
tôm. Các nghiên cứu về tôm ở Việt Nam hiện nay nhiều nhưng chủ yếu tập trung vào khía cạnh kỹ
thuật nuôi, dinh dưỡng và thức ăn, về sản xuất giống, về bệnh tôm nuôi trong ao. Các nghiên cứu
về độ tồn lưu, sự bài thải các kháng sinh thường sử dụng phổ biến trong tôm nuôi chưa được chú
trọng nghiên cứu nhiều. Trong khi đó, các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này hiện rất quan
trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện tính bền vững toong nuôi tôm theo định hướng bảo vệ môi
trường và sản xuất sản phẩm chất lượng cao và an toàn.
Chloramphenicol là một toong số các hóa chất và kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng,
chế biến và bảo quản các sản phẩm tôm (Theo Quyết định của châu Âu số 2001/699/EC ngày
19/09/2001 cũng như chỉ thị 07/2001/CT-BTS ngày 24/09/2001 của Bộ thủy sàn Việt Nam) do các
tác hại mãn tính của nó đối với sức khỏe của con người. Vì vậy, để có thể xuất khẩu sang các thị
trường lớn như Mỹ, Châu Âu, Nhật và cho tiêu dùng toong nước, các mặt hàng tôm phải đảm bảo
không phát hiện CAP với giới hạn phát hiện là 0,3 ng/g theo quy đinh của các thị trường này. Tuy
nhiên cũng cần phải thấy rằng ở Việt Nam quy định này chỉ khắt khe cho hàng xuất khẩu, còn với
hàng tiêu thụ nội địa thì việc kiểm tra quy trình nuôi, chế biến và bảo quản vẫn còn bỏ ngỏ. Trong
khi đó, các loại kháng sinh khác thuộc nhóm Phenicols như Thiamphenicol và Horphenicol theo
một số nghiên cứu cũng có tính độc hại không kém CAP chỉ bị hạn chế sử dụng trong nuôi thủy
sản (Theo quyết định 2002/657, 2377/90, 508/1999, 1181/2002 của Cộng đồng Chung Châu Âu về
việc cho phép dư lượng tối đa của kháng sinh


9

Thiamphenicol trong thực phẩm, kể cả các sản phẩm thủy sản là 50 ppb và Florfenicol là 500 ppb).
Do đó nghiên cứu sự bài thải của CAP sẽ làm tiền đề cho việc nghiên cứu sự bài thải Thiamphenicol
và Florphenicol nhằm giúp cho các nhà quản lý và người chăn nuôi trong quản lý và sử dụng kháng
sinh hợp lý để tránh ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng.
Đề tài được thực hiện nhằm xây dựng được phương pháp tối ưu để có thể xác định hàm
lượng của chất kháng sinh CAP trong tôm sú nuôi. Phương pháp này phải đảm bảo độ chính xác và
có độ nhạy cao để có thể phát hiện được nồng độ chloramphenicol ở mức độ định lượng có thể đạt

tiêu chuẩn xuất khẩu của những thị trường có các tiêu chuẩn an toàn cao như Nhật, Mỹ, Châu Âu
(LOQ của phương pháp tương đương 0,3 ppb). Đồng thời đề tài cũng tìm thời gian bài thải của
chloramphenicol trong cơ thịt tôm nhằm giúp cho công tác quản lý trong nuôi tôm.
2.2 Thời gian, địa điểm và phương pháp tiến hành
2.2.1.

Thòi gian
Đe tài được thực hiện tù tháng 2 đến tháng 7 năm 2009

2.2.2.

Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường - trường Đại Học

Nông Lâm và tại huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai.
2.3.
2.3.1.

Vật liệu
Mầu tôm
Đe tạo được nguồn mẫu tôm phù hợp với nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thiết kế bốn

ao nuôi tôm. Việc thiết kế ao nuôi sẽ giúp chủng tôi có thể kiểm soát được môi trường nước trong
ao nuôi, nhằm tránh các yếu tố bất lợi có thể ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm. Ao nuôi tôm
được thiết kế theo quy ữình như sau:
Tiến hành đào bốn ao, mỗi ao có kích thước 2 m X 1 m X 0,7 m.
Phủ một lớp vài bạc dưới đáy mỗi ao.
Phủ một lớp cát dày 2 cm dưới đáy mỗi ao.
Xử lý đáy ao bằng 1 kg vôi bột (rãi đều khắp đáy ao)

10

Sau đó cho nước vào mỗi ao, mực nước cho vào có độ sâu là 0,6 m (tương đương
1,2 m3 nước). Chúng tôi cho lắng ao trong một tuần.
Quanh 4 ao có rào một lớp lưới mùng nhằm ngăn sự thấm nước ra môi trường và
ngăn sự xâm nhập của các loài sinh vật khác vào môi trường ao thí nghiệm.
Sau khi đã thiết kế xong ao nuôi, chúng tôi sẽ thực hiện quá ữình nuôi tôm. Loại tôm được
nuôi là tôm sú (Penaeus monodorì), đây là loài tôm có giá trị trên thị trường hiện nay. Chúng tôi lấy
mẫu tôm đang nuôi được 50 ngày, đây là giai đoạn sinh ữưởng, phát triển và trao đổi chất mạnh nhất
của tôm nên thích hợp cho việc nuôi thí nghiệm. Tôm được nuôi như sau:
Tôm được nuôi trong bốn ao đã thiết kế, mỗi ao cho vào 50 tôm. Tôm được cho ăn
3 lần trong ngày vào lúc 6 giờ, 11 giờ 30 và 18 giờ.
Việc chuyển tôm từ môi trường ao nuôi tự nhiên sang ao nuôi thí nghiệm có thể
xảy ra hiện tượng sốc tôm do thay đổi môi ữường đột ngột. Do đó ữong 3 ngày đầu, cả bốn ao đều
được cho ăn thức ăn công nghiệp của cơ sở Hải Long nhằm giúp tôm thích nghi với điều kiện của
môi trường nuôi thí nghiệm.
Sau khi tôm đã thích nghi với môi trường thí nghiệm chúng tôi thực hiện việc
ngưng cho tôm ăn thức ăn công nghiệp trong một ngày. Mục đính của việc làm này nhằm đào thải
phần thức ăn còn lại trong tôm mà có thể ảnh hường đến kết quả của quá ừính thí nghiệm.
Tiếp theo đó là hai ngày cho tôm ăn thức ăn có chứa kháng sinh CAP với nồng độ
2000 ppm ờ hai ao. Hai ao còn lại dùng làm ao đối chứng, ở hai ao này vẫn cho tôm ăn thức ăn
không có chứa kháng sinh CAP.
Sau lần cuối cho tôm ăn thức ăn có chứa kháng sinh CAP thì bắt đầu tiến hành thu
mẫu. Thời gian thu mẫu là 1 giờ, 5 giờ, 10 giờ, 20 giờ, 30 giờ, 60 giờ, 120 giờ sau lần cho ăn cuối ở
hai ao có cho ăn thức ăn có chứa CAP. Ở mỗi thời điểm thu mẫu, chúng tôi tiến hành thu 5 tôm ngẫu
nhiên ở ao đối chứng và ao có cho ăn thức ăn kháng sinh với nồng độ 2000 ppm. Mẩu sau khi thu sẽ
được bảo quản ở - 20°c đến khi tiến hành phân tích.

11

Hình 2.1 Ao dùng đế nuôi tôm trong thí nghiệm, (xã
Phước An, huyện Nhem trạch, tinh Đồng Nai)
íử4eí

^ôcB*

íoí
p

**c

*p

ử

*o*p

'p o »p

’

o*oe

**ọ*p

Bpp
ủpo

"• o

pp

Mỗi ao nuôi 50 tôm, nuôi
trong 3 ngày cho thích nghi với
môi trường

Không cho tôm ăn trong
một ngày

Cho ăn thức ăn có chứa
CAP trong 2 ngày
ĐC

ĐC

ĐC

ĐC

CAP

2000 ppm

CAP

2000 ppm

CAP

2000 ppm

CAP

2000 pp
Tiến hành thu mẫu sau 1 giờ, 5
giờ, 10 giờ, 20 giờ, 30 giờ, 60
giờ và 120 giờ sau lần cho ăn
cuối cùng có chứa CAP

Sữ đồ 2.1 Quy trình nuôi tôm dùng làm mẫu thí nghiệm.


12

2.3.2. Hóa chất
Kháng sinh CAP được sử dụng là Chloramphenicol VETRANAL. Đây là chuẩn dừng trong
phân tích CAP bằng phương pháp sắc ký của nhà sản xuất Sigma-Aldrich. Ngoài ra, trong phân tích
chứng tôi cũng sử dụng một số hóa chất tinh khiết khác thường được sử dụng trong phân tích sắc ký
như nước cất 2 lần, methanol, acetonitrile, ethyl acetate, n-hexan, sodium sulphate anhydrous.
2.3.3. Dụng cụ và thiết bị
Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi đã dùng các dụng cụ thường dùng toong phân tích
sắc ký như ống falcon polypropylene nhựa có nắp (15ml), pipetteman (lOpl, 100^1, lOOOpl), pipette
pasteur, kim tiêm lml, cốc thủy tinh (Becher), bình tam giác (Erlen), bình định mức 10 ml (loại A),
eppendorl 1,5 ml.
Thiết bị được sử dụng là hệ thống máy LC/MS/MS gồm thiết bị sắc ký lỏng (Dionex
Ultimate 3000) kết nối với đầu dò khối phổ ba tứ cực (Bioapplied System Qtrap 4000). Ngoài ra
trong thí nghiệm chúng tôi cũng sử dụng một số thiết bị khác như máy lắc, máy ly tâm, hệ thống

làm khô bằng N2, cân phân tích độ chính xác 0,000lg, máy vortex, hệ thống lọc dung môi với màng
lọc có kích thước lỗ 0,2 pm.
2.4. Phương pháp phân tíchLC/MS/MS
2.4.1. Cách chuẩn bị mẫu phân tích
Trước tiên, tôm được lột bỏ phần đầu, vỏ, đuôi, chỉ lấy phần thịt tôm. Cân lg (+/- 0.05 g)
mẫu cho vào ống Polypropylene 15 ml. Sau khi cân mẫu, chủng tôi thực hiện việc lg sodium sulphate
anhydrous và 7 ml ethyl acetate vào ống nghiệm. Mục đích của việc thêm hai hóa chất trên nhằm
mục đích chiết tách CAP có trong cơ thịt tôm. Lắc đều hỗn hợp toong 20 phút bằng máy lắc, sau đó
ly tâm (15 phút, 2000 rpm, nhiệt độ phòng)
Sau quá trình ly tâm, chuyển phần dung dịch có được sang ống mới và tiếp tục thêm tiếp
7ml acetate vào phần chất rắn còn lại (đậy nắp và lắc mạnh hỗn hợp bằng vortex để làm tan rã phần
chất rắn, lắc đều hỗn hợp trong 20 phút bằng máy lắc và đem ly tâm ờ nhiệt độ phòng trong 15 phút).
Chuyển phần dung dịch tiếp tục sang kết hợp với ống đang chúa ở phần đầu tiên.


13

Sau khi có được dịch chiết từ mẫu tôm, tiến hành làm khô ethyl acetate dưới dòng khí N2 Ở
40°c. Kế tiếp sẽ thực hiện việc loại béo trong dung dịch mẫu bằng cách thêm lml acetoniưile và 1,5
ml n hexan vào dung dịch mẫu. Sau đó đem đi vortex 1 phút, khi đó dung dịch sẻ tách thành 2 lớp.
Chứng ta sẽ loại bỏ phần n - hexan ở phía trên và lặp lại bước loại béo này thêm 2 lần.
Cuối cùng là quá trình làm khô acetonitril và thêm pha động cho quá trình chạy mẫu. Việc
làm kho acetonitril được thực hiện bằng cách dùng khí N2 ở 40°c thổi cho khô dịch chiết. Sau đó
thêm lml MeOH/H20 (10/90) vào trong ống nghiệm, đem đi vortex 15 giây, lọc qua phễu lọc và bơm
vào dụng cụ chứa mẫu. Mầu sau khi đã chuẩn bị sẽ được trữ mẫu ờ 2 - 8°c cho đến khi phân tích.
2.4.2. Điều kiện phân tích
Điều kiện sắc ký lỏng cao áp (HPLC): Cột sắc ký được sử dụng ữong phân tích là cột
Phenomenex Aqua 5u C18 125A, 50x2 mm. Tốc độ dòng được điều chỉnh từ 0,35-0,4 ml/phút tùy
theo từng thời điểm của quá trình phân tích. Pha động được sử dụng là H20/MeOH theo tỷ lệ 90/10.
Nhiệt độ cột được thiết lập không đổi là 25°c và thể tích của mỗi lần bơm mẫu là 20 pl.

Bảng 2.1 Tốc độ dòng của pha động trong quá trình sắc ký CAP
%A
%B
Thời gian (phút)
Tốc độ dòng
(H2o)
(MeOH)
(pl/phút)
90
350
0
10
2,5

90

10

350

7,5

10

90

400

10,0

90

400

12,0

10
90

10

350

15,0

90

10

350

Điều kiện đầu dò khối phổi liên hoàn (MS/MS): nguồn ion được sử dụng là nguồn
Turbolonspray với chế độ ion âm và nhiệt độ của nguồn khoảng 500° c. Đối với kháng sinh CAP,
ion nguyên tử được xác định có khối lượng m/z 321 và có hai ion xác nhận là


14

m/z 151,9 và m/z 256,9. Trong hai ion xác nhận trên thì ion m/z 151,9 có độ nhạy cao hom nên được

sử dụng làm ion định lượng.

2.4.3.

Pha các dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc CAP 1000 ppm: Cân chính xác 50 mg ± 0,5 mg chuẩn CAP bằng cân

phân tích chuyển vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 30 ml methanol đặt vào bể siêu âm cho
đến khi CAP tan hoàn toàn, để trở lại nhiệt độ phòng, định mức tới vạch bằng methanol đậy chặt
nắp và ữộn đều.
Dung dịch chuẩn CAP trung gian 10 ppm: Hút chính xác 0,5 ml chuẩn gốc 1000 ppm vào
bình định mức 50 ml và định mức bằng methanol đến vạch. Đậy nắp, ữộn đều.
Dung dịch chuẩn CAP lOOppb: Hút chính xác 0,lml dung dịch chuẩn trung gian lOppm vào
bình định mức lOml và định mức đến vạch bằng methanol. Đậy nắp, trộn đều.
Dung dịch chuẩn CAP chuẩn bị làm việc 10 ppb: Hút chính xác 1 ml chuẩn CAP 100 ppb
vào bình định 10 ml và mức đến vạch bằng methanol. Đậy nắp và trộn đều.
Dung dịch chuẩn 5 ppb: Hút chính xác 50 pl chuẩn CAP 10 ppb và hút chính xác 50 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.
Dung dịch chuẩn 1 ppb: Hút chính xác 20 pl chuẩn CAP 5 ppb và hút chính xác 80 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.
Dung dịch chuẩn 0,5 ppb: Hút chính xác 10 pl chuẩn CAP 5 ppb và hút chính xác 90 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.
Dung dịch chuẩn 0,4 ppb: Hút chính xác 8 pl chuẩn CAP 5 ppb và hút chính xác 92 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.
Dung dịch chuẩn 0,3 ppb: Hút chính xác 6 pl chuẩn CAP 5 ppb và hút chính xác 94 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.
Dung dịch chuẩn 0,2 ppb: Hút chính xác 4 pl chuẩn CAP 5 ppb và hút chính xác 96 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.
Dung dịch chuẩn 0,1 ppb: Hút chính xác 2 pl chuẩn CAP 5 ppb và hút chính xác 98 pl
methanol vào eppendorl 1,5 ml, sau đó trộn đều.

15

2.4.4. Nguyên tẳc đính lượng CAP

Theo quyết định 2000/657/EC của Châu Âu, để xác nhậu chất phân tích cần có 1 mảnh
ỉon ban đầu và 2 mảnh ion con hội đủ 4 điểm cần thiết (lmảnh ion ban đầu được cho 1 điểm, 1
mảnh ion con cho 1,5 điểm). Trong phuong pháp phân tích của chủng tôi đáp ứng đúng yêu
cầu trên, phân tử CAP có khối lượng là 322. Trước hết trong quá trình ỉon hóa CAP ta được
mảnh ỉon ban đầu là m/z 321. Ion này được gợi là ỉon nguyên tủ. Từ lon nguyên tử này sẽ xảy
ra hiện tượng phân mảnh tiếp theo. Thực tế khỉ ỉon m/z 321 phân mảnh sẽ tạo ra rất nhiều ion
con khác, trong đó 2 ỉon m/z 151,9 và m/z 256,9 cỗ độ ển định cao nhất nên được sủ dụng làm
ỉon xác nhận. Trong đó ỉon m/z 151,9 dùng để định lượng vì phân mảnh này luôn ổn định và
có cường độ cao.

2.4.5. Công thức tỉnh nồng độ CAP cỗ trong mẫu

Nồng độ CAP có trong mẫu được tính theo công thức:
(C0xl)
C=

----------------m X 100

Xp


16

Trong đó:

C: nồng độ CAP trong mẫu, tính theo ppb
c0: nồng độ CAP có trong dịch chiết tù đường chuẩn (ppb)
P: độ tinh khiết của chất chuẩn (%)
m: khối lượng hay thể tích của mẫu thô ban đầu (g hay ml)
2.4.6. Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết mẫu
Để đánh giá hiệu quà thu hồi của quy trình phân tích, chúng tôi đã thực hiện việc thêm các
nồng độ chuẩn 0,1 ppb, 0,2 ppb, 0,3 ppb, 0,4 ppb, 0,5 ppb vào các mẫu trắng. Mẩu trắng này là mẫu
tôm được mua từ chợ Linh Xuân, sử dụng quy trình ly trích mẫu ở phần 2.4.1 và thực hiện việc chạy
sắc ký theo các điều kiện ở phần 2.4.2. Ket quả cho thấy mẫu ờ chợ Linh Xuân là hoàn toàn không
có CAP và mẫu này được dùng như mẫu trắng cho các thí nghiệm về sau.
Sau khi có mẫu trắng (mẫu không có chứa kháng sinh CAP) chúng tôi tiến hành việc thêm
chuẩn vào mẫu bằng cách cân lần lượt 5 mẫu trắng có khối lượng 1 g ± 0,05 g vào ống Polypropylene
15 ml. Sau đó bổ xung dung dịch chuẩn CAP với nống độ 10 ppb lần lươt vào các ống. Thể tích của
được thêm vào lần lượt là 10 pl, 20 pl, 30 |il, 40 |il, 50 |il. Với cách làm trên, chúng tôi có được các
mẫu thêm chuẩn với các nồng độ lần lượt là 0,1 ppb, 0,2 ppb, 0,3 ppb, 0,4 ppb, 0,5 ppb dùng cho
việc xác định hệ số thu hồi của quy trình chiết mẫu.
2.4.7. LOD và LOQ của phương pháp
LOD (Limit of Detection) là cực tiểu phát hiện của thiết bị, đó là nồng độ tối thiểu của một
chất mà thiết bị có thể phát hiện được. LOD được đo bằng cách chuẩn bị một dung dịch chất chuẩn
toong một dung môi tinh khiết và bơm vào một thể tích xác định V (|il). Lấy sắc ký đồ và đo S/N
(tín hiệu so với độ nhiễu), trên nguyên tắc LOD là nồng độ tương ứng với S/N = 3 (Chu Phạm Ngọc
Sơn, 2008)
LOQ (Limit of Quantitation) là cực tiểu định lượng của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu
của một chất toong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng. Một cách đom giản, có thể
tính LOQ theo công thức của Chu Phạm Ngọc Sơn (2008):


17

LOQ = l O x L O D

Theo các tiêu chuẩn của châu Âu, Mỹ, Nhật, EU thì LOQ của phương pháp phân tích CAP
phải đạt được giá trị 0,3 ppb hoặc thấp hơn thì mới có thể được chấp nhận sử dụng trong các kiểm
nghiệm về CAP trong các sản phẩm thủy hải sàn.


18

Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Trọng lượng của mẫu tôm sú sau quá trình nuôi thí nghiệm
Sau khi tiến hành nuôi và thu mẫu như ở phần 2.3.1, chúng tôi có được nguồn mẫu dùng
cho phân tích sự bài thải của CAP trên tôm.

Bảng 3.1 Trọng lượng tôm được thu ờ các thời điểm khác nhau sau khi nuôi.
Tôm 1 (g) Tôm 2 (g) Tôm 3 (g) Tôm 4 (g) TSm 5 (g)
2000

2000

ĐC

2000

4,69

ppm
5,93 5,00

ppm
5,46

5 giờ 5,73

6,73

5,75 4,84

10 giờ 4,60

5,21

20 giờ 5,14

ĐC

2000

4,07

ppm
6,36

5,52

5,36

7,24 6,46

6,75

6,02

7,39 8,52

30 giờ 5,92
60 giờ 5,24

4,92
5,24

120 giờ 6,66

7,66

1 giờ

ppm
5,69

ĐC

ĐC

2000

ĐC

3,49

ppm

4,39

6,86

5,35

4,8

6,44

6,12

4,80

4,84

5,01

5,46

5,01

4,58

5,14

5,55

6,75

5,39

4,81

5,47 4,58
6,46 6,46

6,83
5,39

4,18
5,68

5,52
6,3

5,93
5,46

5,47
6,54

6,75
6,66

6,89 4,47

5,35

4,69

4,55

6,36

5,82

4,24

Qua bảng 3.1 cho thấy, sau quá ữình nuôi tôm, trọng lượng tôm trung bình đạt tù 4 - 7 g. Tôm
thí nghiệm của chủng tôi có trọng lượng thấp hơn so với tiêu chuẩn Việt Nam về nuôi tôm sú thâm
canh (5 - 10 g). Việc trọng lượng tôm giảm do nguyên nhân nguồn thức ăn không phong phú như
ao nuôi công nghiệp và số lần cho ăn cũng không nhiều như nuôi thâm canh. Tuy nhiên, trọng lượng
tôm không làm ảnh hưởng nhiều đến phân tích của chúng tôi do tôm sinh trưởng và phát triển bình
thường trong môi trường thí nghiêm đồng thời cũng không có dấu hiệu nhiễm một số bệnh trên tôm
như đốm ữắng, đầu vàng, đỏ thân.


19

3.2. Xây dựng đường chuẩn CÂP
Đường chuẩn đuợc xây dựng dựa trên 7 điểm chuẩn với các nồng độ 0,1 ppb, 0,2 ppb,
0,3 ppb, 0,4 ppb, 0,5 ppb, 1 ppb, 5 ppb.

■
GAP (J J p|>b
Rt-4.41
IỈ1Z - IM .9

H»

M r

m

m

m
i j j

m
BT

___ ___ - ! N . —iảlll
IL

Hình 3.1 Phồ đồ lon định lượng m/z 151,9 của nông độ chuẩn 0,1 ppb.
Hình 3.1 cho thấy các cường độ ion định lượng (m/z = 151,9) của CAP ờ các nồng độ
chuẩn 0,1 ppb có thời gian lưu là 4,41 phút. Thực tế khỉ chứng tôi chạy sắc ký 7 nồng độ chuẩn
từ 0,1 ppb đến 5 ppb cũng sẽ cho ra các phổ đồ lon với củng thời gian lưu là 4,41 phứt và cường
độ lon m/z 151,9 gia tăng tuyến tỉnh theo từng nầng độ và có hệ sấ tương quan R2 = 0,9998.
Đồng thời không cỗ các peak nhiễu ở cùng thời điểm ttên. (Xem thêm phần phụ lục)
Bảng 3.2 Thời gian lưu và cưởng độ lon m/z 151,9 của các nồng độ chuẩn CAP
oa

0,3

0*4

0,5

1

5

4,41

4,41

4,41

4,41

4,41

4,41

4,41

3467,84

6148,30

8634,43

9734,18

c (ppb)

0,1

Rt
Cường độ lon
m/z 151,9

13874

24751

116290


20

Bàng 3.2 cho thấy sự gia tăng tuyến tính của 7 nồng độ chuẩn mà chúng tôi đã thực
hiện. Tù cường độ của các lon m/z 151,9 của 7 nồng độ chuẩn đã thực hiện, chúng tôi dựng
được đường chuẩn như ở hình 3.2

Phương trình đường chuẩn y = 22968x+ 1520,1
Đồng thời hệ số tương quang là R2 = 0.9998.
Tù phương trình đường chuẩn ta có thể suy ra nồng độ CAP của các dịch chiết tù
mẫu. Ta thay các nồng độ có tù dịch chiết của mẫu vào công thức ở phần 2.4.5, từ đó suy ra
được nồng độ CAP thực có trong mẫu.
3.3. Đánh giá hiệu quả thu hồi của quy trình phân tích

Sau khi có được các mẫu đã thêm chuẩn, tiến hành ly ữích CAP theo quy ữình đã
trình bày ở phần 3.3.1. Tù đó chứng tôi có được cường độ lon m/z 15,9 của các mẫu đã
thêm chuẩn 0,1 ppb, 0,2 ppb, 0,3 ppb, 0,4 ppb, 0,5 ppb.


21

Hình 3.3 cho chóng ta thấy phẩ đồ lon định lượng của mẫu đã thêm chuẩn 0,1 ppb có
thời gian lưu củng thòi gian lưu của chuẩn và không có peak nhiễu ở củng thời điểm trên. Các
mẫu đã thêm chuẩn này cũng gia tăng tuyến tính về cưởng độ lon m/z 151,9.
Bẵng 3.3 Cường độ cửa Ion m/z 151,9 cửa các mẫu dã thêm chuẩn
Nồng đ$ chuẩn CÂP (ppb)

Cưởng độ lon m/z

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

3392,89

5977,19

7111,15

11326,00

15356,00

151,9

Khỉ tiến hành so sánh kết quả cưởng độ Ion m/z 151,9 của các mẫu thêm chuẩn vởỉ
cường độ lon m/z 151,9 của các chuẩn mà chung tôi đã thục hiện ở phần 3.2 sẽ cho thấy hiệu
suất thu hầỉ của quy ưỉnh chiết mẫu.


22

Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết tách CAP từ mẫu tôm
Nong độ
chuẩn
(ppb)

Cường độ lon m/z 151,9 Cường độ lon m/z
trung bình khi cho

151,9 khi chạy

chuẩn vào mẫu trắng chuẩn với methanol

Hiệu suất thu
hồi trung bình
(n=3)

0,1

3232,68

3467,81

93,22 %

0,2

5405,98

6148,30

87,93 %

0,3
0,4

7793,12
11369,66

8634,43
9734,18

90,26 %
116,80 %

0,5

14562

13874

104,96 %

Như bảng 3.4 cho thấy, hệ số thu hồi của các nồng độ là tù 87,93% đến 116, 80 %, từ

đó cho thấy quy trình ly trích mẫu đảm bảo độ tin cậy.

Đường chuẩn này có phương trình đường chuẩn là y’ = 29275x’ - 149,86
Hệ số tương quan của phương trình là R’ = 0,9599


23

3.4. LOQ của phương pháp

Như đã trình bày ở phần 2.4.7, để xác định được LOQ của phuong pháp, tnrởc hết
chóng tôi càn xác định LOD của thiết bị. Việc xác định LOD của thiết bị được tiến hành bằng
cách dùng nồng độ chuẩn 0,1 ppb để tìm tỷ lệ S/N = 3

Hình 3.5 Tỷ lệ S/N của chuẩn 0,1 ppb.

Như ttên hình 3.5, chóng ta có thể thấy tỷ lệ S/N của thiết bị là 88 ở nông độ là 0,1
ppb. Đê đạt được S/N = 3 thì nồng độ này là 0,0034 ppb.
LOQ = 10 X LOD = 0,03 ppb
Vậy LOQ của phương pháp đạt 0,03 ppb, giới hạn này đạt được các yêu cầu phân
tỉch của các nước như châu Âu, Mỹ (LOQ = 0,3 ppb)
3.5. Xác định sự bài thải của CAP trong tôm sủ.

Sau khỉ cỗ được các mẫu tôm vào lúc 1 giở , 5 giờ, 10 giở, 20 giở, 30 giờ, 60 giở, 120
giở sau lần cho ăn cuổỉ có chứa kháng sinh CAP, Thực hiện ly trích như ở phần 2.4.1 và chạy
sắc ký như ở phần 2.4.2. Kết quả nồng độ CAP trong cơ thịt tôm sau thời gian thỉ nghiệm được
thể hiện ở bảng 3.5.


24

Bảng 3.5 Nồng độ trung bình của CAP trên tôm
Thời gian sau lần cho ăn cuối (giờ)
1

Nồng độ
CAP
(n=6)

7,3 ± 1,1

5 10 20

4,4 ±2,1 2,9+ 0,6 1,6 ±0,3

30

0,6 ± 0,4

60 120

0,3 ± 0,2 <0,1

Bảng 3.5 í thể hiện
độ CAP giảm dần theo

nồng độ CAP trong thịt tôm ở các điểm thu mẫu khác nhau. Nồng
thời gian. Tốc độ bài thải của CAP diễn ra theo
chiều hướng
giảm

rất nhanh. Một giờ sau
khi cho ăn có chứa CAP , nồng độ CAP trong tôm đã đạt mức rất
cao (7,31 ± 1,12 ppb), sau đó sẽ giảm dần theo thời gian và đến 60 giờ thì hầu như thấp hom
giới hạn định lượng.
Sau khi kiểm tra được sự suy giảm của CAP trong tôm theo thời gian, tù đó tính toán
thời gian bán rã của CAP trên tôm dựa theo công thức của Wang Weifen và ctv (2004):
t ] /2 = Ln2/p
Với :

+ ti/2 là thời gian bán rã
+ p là hệ số góc của phương trình Ln nồng độ CAP theo thời gian

Hình 3.6 Ln nồng độ CAP (ppb) theo thời gian.