Xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.31 MB, 43 trang )
I H C QU CăGIAăHÀăN I
TR
NGă
I H C KHOA H C T
NHIểN
=======
NGUY N TH NHUNG
XỄCă
NHă
NG TH I M T S
CT
GỂYăLI TăC
TRONG NHUY N TH HAI M NH V
PH
NGăPHỄPăS CăKụăL NG KH I PH
B NG
LC-MS/MS
Chuyên ngƠnh: Hóa phơn tích
Mƣ s : 60440118
LU NăV NăTH CăS ăKHOAăH C
Ng
iăh
ng d n khoa h c:
PGS.TS.ăLêăTh H ng H o
HÀăN I - 2016
L I C Mă N
B n khóa lu n nƠy đ
c th c hi n vƠ hoƠn thƠnh t i Vi n Ki m nghi m
An toƠn v sinh th c ph m Qu c Gia v i s h
ng d n c a PGS.TS. LêăTh ă
H ngăH o.
V i lòng kính tr ng vƠ bi t n sơu s c, tôi xin chơn thƠnh c m n PGS.
TSăLêăTh ăH ngăH o đƣ đ nh h
ng nghiên c u, h
ng d n vƠ góp ý giúp
em hoƠn thƠnh khóa lu n nƠy. Tôi xin g i l i c m n t i ThS.ăNguy năTh ă
HƠăBình đƣ h
ng d n vƠ giúp đ tôi hoƠn thƠnh khóa lu n nƠy.
Tôi xin bƠy t lòng bi t n t i Ban lƣnh đ o Vi n Ki m nghi m An
toƠn v sinh th c ph m Qu c gia, TS. Tr năCaoăS n vƠ các cán b khoa
c
h c d nguyên, Vi n Ki m nghi m an toƠn v sinh th c ph m Qu c gia đƣ t o
đi u ki n giúp tôi hoƠn thƠnh đ tƠi.
Tôi xin bƠy t lòng bi t n t i các th y cô giáo gi ng d y t i khoa Hoá,
đ c bi t lƠ các th y cô trong b môn Hoá Phơn tích, đƣ cho tôi nh ng ki n
th c quý giá trong quá trình h c t p vƠ th c hi n đ tƠi nƠy.
Tôi c ng xin g i l i c m n các anh ch , b n bè c a t p th l p cao h c
hoá K24, đ c bi t lƠ nh ng ng
i b n trong nhóm hoá phơn tích K24 đƣ giúp đ ,
chia s nh ng khó kh n trong su t quá trình tôi h c t p vƠ th c hi n đ tƠi nƠy.
Cu i cùng, tôi xin g i l i bi t n sơu s c t i gia đình, b n bè đƣ luôn
bên tôi, chia s khó kh n, đ ng viên vƠ giúp đ tôi trong h c t p vƠ trong
cu c s ng.
Do th i gian th c hi n đ tƠi có h n nên không tránh nh ng thi u sót.
Tôi r t mong nh n đ
c ý ki n đóng góp c a th y cô vƠ các b n sinh viên.
Hà N i, ngày 07 tháng 11 n m 2016
Nguy n Th Nhung
Nguy n Th Nhung
Tr
ng HKH T Nhiên
M CL C
TV N
CH
..........................................................................................................1
NG I: T NG QUAN ...................................................................................2
1.1. Gi i thi u v đ c t nhuy n th gơy li t c ..................................................2
1.1.1 Gi i thi u v STX ...................................................................................4
1.1.2 Gi i thi u v NEO ...................................................................................4
1.1.3 Gi i thi u v GTX-1 ............................................................................... 5
1.1.4 Gi i h n t i đa cho phép (ML) ...............................................................6
1.1.5 Nh ng tác h i c a đ c t nhuy n th gơy li t c ....................................7
1.2. Các ph
ng pháp xác đ nh đ c t gơy li t c trong nhuy n th hai m nh
v ..........................................................................................................................9
1.2.1. Các ph
ng pháp th sinh h c ...............................................................9
1.2.2. Ph
ng pháp xét nghi m mi n d ch ELISA ........................................10
1.2.3. Ph
ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) ................................ 11
1.2.4 K thu t đi n di .....................................................................................13
1.2.5 Ph
CH
ng pháp s c ký l ng kh i ph (LC-MS), (LC-MS/MS) ...............13
NG 2:
2.1.
it
IT
NG VÀ PH
NG PHÁP NGHIÊN C U ....................16
ng vƠ n i dung nghiên c u ..............................................................16
2.1.1.
it
ng nghiên c u ..........................................................................16
2.1.2. N i dung nghiên c u ............................................................................16
2.2. Ph
ng pháp nghiên c u .............................................................................16
2.2.1 Ph
ng pháp chu n b m u ...................................................................16
2.2.2 Ph
ng pháps c ký l ng kh i ph (LC-MS/MS) .................................17
2.2.3. Th m đ nh ph
Nguy n Th Nhung
ng pháp ......................................................................23
Tr
ng HKH T Nhiên
2.2.4. Ph
2.3. Ph
ng pháp x lý s li u ....................................................................26
ng ti n nghiên c u ..............................................................................26
2.3.1. Thi t b , d ng c
..................................................................................26
2.3.2. Dung môi, hóa ch t ..............................................................................27
CH
NG 3: K T QU VÀ TH O LU N ............. Error! Bookmark not defined.
3.1 T i u hóa các đi u ki n ch y thi t b LC-MS/MS Error! Bookmark not defined.
3.1.1 T i u hóa các đi u ki n ch y c a thi t b kh i ph MS/MS Error! Bookmark not d
3.1.2 T i u hóa các đi u ki n ch y s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) Error! Bookmark
3.2 Kh o sát quy trình x lý m u ....................... Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Ch n qui trình x lí m u ....................... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Kh o sát nh h
ng c a nhi t đ lên quá trình chi t m u Error! Bookmark not def
3.2.3 Kh o sát quá trình pha loƣng d ch chi t Error! Bookmark not defined.
3.2.4. Kh o sát th tích dung môi chi t .......... Error! Bookmark not defined.
3.3 Th m đ nh ph
ng pháp phơn tích .............. Error! Bookmark not defined.
3.3.1 Tính đ c hi u / ch n l c ........................ Error! Bookmark not defined.
3.3.2 Gi i h n phát hi n (LOD), gi i h n đ nh l
ng (LOQ) Error! Bookmark not define
3.3.3 Xác đ nh kho ng tuy n tính .................. Error! Bookmark not defined.
3.3.4
chính xác (accuracy) c a ph
ng pháp phơn tích (đ đúng vƠ đ
ch m) .............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.4 Áp d ng phơn tích m u th c t ................... Error! Bookmark not defined.
K T LU N VÀ KI N NGH .................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LI U THAM KH O .......................................... Error! Bookmark not defined.
PH L C ...................................................................................................................
Nguy n Th Nhung
Tr
ng HKH T Nhiên
DANHăSACHăBANGăBIểU
B ng 1.1: C uătrúcăhóaăh căvƠăđ cătínhăc a m tăvƠiăđ c t PSP
B ng 1.2: M t s n
các PSP
3
căđƣăđ aăraăquiăđ nh gi i h n t iăđaăchoăphépă(ML)ăc a
6
B ng 1.3: M t s nghiênăc u s d ng ph
ngăphápăHPLC-FLDăđ xácăđ nh
PSP 11
B ng 2.1: B ng pha dung d ch chu nălamăviêc
Error!
Bookmark
not
defined.
B ng 3.1: Ion m c a t ng ch t Error! Bookmark not defined.
B ngă3.2:ă i u ki n t i u cho ESI-MS/MS
Error! Bookmark not defined.
B ngă3.3:ăCácăthôngăs t i u MS/MS. Error! Bookmark not defined.
B ng 3.4: Ch
ngătrìnhăgradient
Error! Bookmark not defined.
B ng 3.5: L a ch năquyătrìnhăchi t m u
B ng 3.6: Kh oă sátă nh h
Error! Bookmark not defined.
ng c a nhi tă đ
lênă quáă trìnhă chi t m u
Error! Bookmark not defined.
B ng 3.7: Kh oăsátăquáătrìnhăphaăloƣngăd ch chi t Error!
Bookmark
not
defined.
B ng 3.8: Kh oăsátăth tíchădungămôiăchi t
Error! Bookmark not defined.
B ng 3.9: Ion m vƠăionăconăc a STX, GTX-1, NEO Error!
Bookmark
not
Bookmark
not
defined.
B ng 3.10:ăLODăvƠăLOQăc a STX, GTX-1, NEO
Error!
defined.
Nguy n Th Nhung
Tr
ng HKH T Nhiên
B ng 3.11: S
ph
thu c c a di nă tíchă pică vƠoă n ngă đ
c aă cácă PSP
Error! Bookmark not defined.
B ng 3.12:
l p l iă vƠă đ thu h i c a STX, GTX-1,ă NEOă trênă n n m u
Ngao Error! Bookmark not defined.
B ngă 3.13:ă
l p l iă vƠă đ thu h i c a STX, GTX-1,ă NEOă trênă n n m u
HƠu Error! Bookmark not defined.
B ng 3.14: K t qu phơnătíchăm u th c t trênăđ aăbƠnăHƠăN i
Error!
Bookmark not defined.
Nguy n Th Nhung
Tr
ng HKH T Nhiên
DANHăSACHăHINH
Hìnhă1.1:ăCôngăth c c u t o t ngăquátăc aăcácăđ c t PSP 3
Hìnhă1.2:ăCôngăth c c u t o c a STX 4
Hìnhă1.3:ăCôngăth c c u t o c a Neo 5
Hìnhă1.4:ăCôngăth c c u t o c a GTX-1
5
Hìnhă2.1:ăS đ đ n gi n c a h th ng s căkýăl ng 18
Hìnhă2.2:ăB k t n iăphunăđi n t
Hìnhă2.3:ăB phơnătíchăt c c
20
22
Hìnhă2.4:ăB phơnătíchăkh i ba t c c 22
Hìnhă3.1:ăS căkíăđ mix PSP chu n 100 ng/mL ch y ch
ngătrìnhăgradientă4
Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.2:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 1Ti năhƠnhăx lýăm uătheoăquyătrìnhă2
theoătácăgi Van De Riet Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.3:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 2 Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.4:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 3 Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.5:S căkíăđ cácăPSPă100 ng/mL trongăquyătrìnhă3
Error!
Bookmark
not defined.
Hìnhă3.6:ăS căkíăđ quyătrìnhăkhôngăgiaănhi tăkhiăthêmăchu n mix PSP 100
ng/mL
Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.7:ăS căkíăđ quyătrìnhăgiaănhi tăkhiăthêmăchu n mix PSP 100 ng/mL
Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.8:ă
th kh oăsátăs
Nguy n Th Nhung
nh h
ng c aăquáătrìnhăphaăloƣngăđ n hi u su t
Tr
ng HKH T Nhiên
thu h i
Hìnhă3.9:ă
h i
Error! Bookmark not defined.
th kh oăsátăs
nh h
ng c a th tíchăchi tăđ n hi u su t thu
Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.10:ăQuyătrìnhăx líăm u t i u Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.11:ăPh kh i c aăcácăPSP
Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.12: S căđ m u tr ngăkhôngăcoătốnăhiêuăchơtăphơnătốch.
Error!
Bookmark not defined.
Hìnhă3.13: S căđ m u chu n
m c 200 ng/mL
Error!
Bookmark
not
defined.
Hìnhă3.14: S căđ m u tr ngăthêmăchu n
m c 200 ng/mL
Error!
Bookmark not defined.
Hìnhă3.15:ăS căkíăđ STX t i LOD 10 ng/mL (t
ngăđ
ngă100ăµg/kgătrênă
ngăđ
ngă150ăµg/kgătrênă
ngăđ
ngă150ăµg/kgătrênă
m u) Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.16:ăS căkíăđ NEO t i LOD 15 ng/mL (t
m u) Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.17:ăS căkíăđ GTX-1 t i LOD 15 ng/mL (t
m u) Error! Bookmark not defined.
Hìnhă3.18:ă
ngăchuơnăSTXătheoădiênătốchăpic
Error!
Bookmark
not
ngăchuơnăGTX-1 theoădiênătốchăpic Error!
Bookmark
not
defined.
Hìnhă3.19:ă
defined.
Nguy n Th Nhung
Tr
ng HKH T Nhiên
Hìnhă3.20:ă
ng chu năNEOătheoădiênătốchăpic
Error!
Bookmark
defined.
Nguy n Th Nhung
Tr
ng HKH T Nhiên
not
DANH M CăCỄCăCH
Kýăhi u
CAN
AOAC
VI T T T
Ti ng Anh
Acetonitrile
Association of Official
Analytical Communities
Ti ng Vi t
Acetonitril
Hi p h i các nhƠ phơn tích chính
c t nhuy n th gơy m t trí
ASP
Amnesic Shellfish Poisoning
CAD
Collision Gas Pressure
Áp su t khí va ch m
CE
Collision Energy
N ng l
CUR
Curtain Gas
Khí mƠng
CXP
Collision Cell Exit Potential
Th đ u ra
DP
Declustering Potential
Th phơn m nh
DSP
Diarrhetic Shellfish Poisoning
d-SPE
Dispersive solid phase
extraction
nh
ng va ch m
c t nhuy n th gơy tiêu ch y
Chi t phơn tán pha r n
Eq
Equivalents
T
ESI
Electronspray ionization
Ion hóa phun đi n t
FLD
Fluoroscence detector
Detector hu nh quang
GCB
Graphitized carbon black
Than ho t tính
GS1
Ion Source Gas 1
Khí ngu n ion 1
GS2
Ion Source Gas 2
Khí ngu n ion 2
GTX-1
Gonyautoxins-1
HPLC
High performance liquid
chromatography
Nguy n Th Nhung
ng đ
ng
c t gonyautoxins-1
S c ký l ng hi u n ng cao
Tr
ng HKH T Nhiên
HILIC
IS
LC-MS/MS
Hydrophilic interaction liquid
chromatography
Ionspray Voltage
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry
S c kí l ng t
ng tác thơn n
c
Th phun ion
S c ký l ng ghép kh i ph 2 l n
LOD
Limit of detection
Gi i h n phát hi n
LOQ
Limit of quantification
Gi i h n đ nh l
MBA
Mouse bioassay
Th nghi m sinh h c trên chu t
ML
Maximum level
Gi i h n t i đa cho phép
MS
Mass spectrometry
Kh i ph
NEO
Neosaxitoxin
c t neosaxitoxin
PSP
Paralytic Shellfish poisoning
c t nhuy n th gơy li t c
R(%)
Recovery
RSD(%)
Relative standard deviation
l ch chu n t
SD
Standard Deviation
l ch chu n
SPE
Solid phase extraction
STX
Saxitoxin
TEM
Ion source temperature
Nguy n Th Nhung
ng
Hi u su t thu h i
ng đ i
Chi t pha r n
c t saxitoxin
Nhi t đ ngu n
Tr
ng HKH T Nhiên
TV N
Trong nh ng n m g n đơy vi c nuôi tr ng th y s n nói chung vƠ vi c nuôi
các loƠi hai m nh v nói riêng đƣ vƠ đang phát tri n r m r
ven bi n n
c ta.
nhi u đ a ph
ng
i u nƠy đƣ góp ph n vƠo vi c phát tri n ngƠnh kinh t bi n,
ph c v cho nhu c u th tr
ng tiêu th trong vƠ ngoƠi n
c, t ng thêm thu nh p,
c i thi n đ i s ng cho nhi u h dơn c ven bi n.
ô th hóa, ô nhi m môi tr
ng lƠm môi tr
ng bi n ngƠy cƠng b suy
thoái t o đi u ki n cho s xu t hi n vƠ bùng n c a các loƠi vi t o bi n đ c h i.
Các loƠi thơn m m hai m nh v lƠ đ i t
t
ng ng đ c
ng
ng trung gian chính đ gơy ra hi n
i vƠ các sinh v t b c cao nh chim bi n, thú bi n.
c bi t
s có m t các nhóm đ c t đ c t gơy li t c PSP (Paralytic Shellfish Poisoning).
Chính vì v y, nghien c u phát hi n các đ c t c n đ
c
nh h
c quan tơm đ gi m nguy
ng đ n s c kh e c ng nh tính m ng c a con ng
i.
Trong đ tƠi nƠy t p trung nghiên c u nhóm đ c t nhuy n th gơy li t c
PSP (Paralytic Shellfish Poisoning).
tính m ng con ng
c t nƠy gơy nguy hi m đ n s c kho vƠ
i lƠ do đ ng v t nhy n th b nhi m vƠ tích l y đ c t PSP do
n ph i t o đ c nhóm Dinoflagellates bao g m loƠi Dinophysis spp, Aurocentum,
prorocentrumlima.Vi c xác đ nh m t s đ c t nhuy n th gơy liêt c lƠ r t c n
thi t, lƠ công c r t t t ph c v cho công tác thanh tra, ki m tra an toƠn th c ph m.
Do đó, chúng tôi ti n hƠnh nghiên c u phát tri n ph
ng pháp “Xác đ nh đ ng
th i m t s đ c t gây li t c trong nhuy n th hai m nh v b ng s c ký l ng kh i
ph LC-MS/MS”. Ph
ng pháp hi n đ i, có đ tin c y vƠ chính xác cao.
M c tiêu c a th c hi n đ tƠi lu n v n lƠ:
- Xơy d ng ph
ng pháp xác đ nh đ ng th i m t s đ c t gơy li t c trong
nhuy n th hai m nh v b ng ph
-S à
à
à
à
ts
ng pháp s c ký l ng kh i ph LC - MS/MS.
ct
à
à
à
à
n th hai m nh v
t i H àN i.
Nguy n Th Nhung
1
Tr
ng HKH T Nhiên
CH
NG I: T NG QUAN
1.1. Gi iăthi uăv ăđ căt ănhuy năth ăgơyăli tăc
c t nhuy n th gơy li t c (PSP) lƠ m t nhóm các alkaloid gơy đ c
trên th n kinh. STX lƠ đ c t PSP đ
t đó đ n nay đƣ có 57 d n xu t đ
c phát hi n s m nh t vƠo n m 1957, vƠ k
c mô t [28].
c t PSP lƠ nh ng đ c t thơn n
c vƠ ch u đ
c nhi t đ cao nên khó
có th b phá h y khi n u n hay đun nóng [15], [18]. Chúng có th đ
c chia
thƠnh 4 phơn nhóm chính [8], [22], [28]:
c t
nhóm carbamate g m: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO),
gonyautoxins (GTX1-4) có đ c tính m nh nh t.
c t
nhóm decarbamoyl g m: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX),
decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có đ c tính trung bình, đ
xu t hi n trong m t vƠi đ ng v t hai m nh v , nh ng ít đ
c báo cáo
c tìm th y trong các
loƠi t o đ c.
Các đ c t nhóm N-sulfocarbamoyl nh : B1 [GTX5], B2 [GTX6] and C14 ít m nh h n.
Nhóm th 4 lƠ nhóm deoxycarbamoyl nh ng đ c tính c a nó ch a đ
c
xác đ nh 1 cách rõ rƠng [12].
STX lƠ đ c t m nh nh t trong nhóm PSP.
c tính c a các PSP khác đ
xác đ nh d a trên đ c tính c a STX b i Oshima đ
c trình bƠy b ng 1.1 [24].
Nguy n Th Nhung
2
Tr
ng HKH T Nhiên
c
Hìnhă1.1:ăCôngăth c c u t o t ngăquátăc aăcácăđ c t PSP
B ng 1.1: C u trúcăhóaăh căvƠăđ cătínhăc a m tăvƠiăđ c t PSP
H s đ c
M
-H
1
299
-H
-H
0,92
315
- OH
-H
-OSO3-
0,99
411
GTX-2
-H
-H
-OSO3-
0,36
395
GTX-3
-H
-OSO3- -H
0,64
395
GTX-4
- OH
-OSO3- -H
0,73
411
ct
R1
R2
R3
STX
-H
-H
NEO
-OH
GTX-1
R4
O
NH2
O
- Ngu n g c: Sinh ra b i vi sinh v t s ng c ng sinh trên m t sinh v t khác, g m
các t o dinoflagellates Gonyaulax catenella vƠ G. Tamarensi, tìm th y
nhuy n th
các loƠi
vùng Alaska, Saxidomus giganteus vƠ các loƠi, Mytilus-
californianeus.
c t
có th
s n sinh riêng bi t b i S. giganteus hay M.
californianeus.
- Lý hóa tính: Các đ c t PSP không b phơn h y b i nhi t
nh ng không b n v ng vƠ d b oxy hóa trong môi tr
môi tr
ngacid
ng ki m.
- Tác h i: Các tri u ch ng nhi m đ c PSP có th xu t hi n sau khi n vƠi phút
cho đ n 10 gi . Tri u ch ng bao g m c m giác tê
môi, c , m t, cùng c m th y
nh có ki n bò trong các ngón tay vƠ ngón chơn, nh c đ u, chóng m t vƠ bu n
nôn, nói n ng không còn m ch l c, m ch đ p nhanh, th khó... Tr
ng h p n ng
có th d n đ n t vong do suy hô h p.
- H s đ c: Trong nhóm các đ c t nhuy n th gơy li t c thì STX lƠ đ c t
Nguy n Th Nhung
3
Tr
ng HKH T Nhiên
m nh nh t vƠ ta quy
c nó có h s cao nh t lƠ 1.
GTX-1 vƠ đ n NEO.
c t ít gơy đ c nh t lƠ đ c t GTX-2.
- Xơm nh p: qua đ
c t có đ m nh th hai lƠ
ng n u ng, hít th .
- C ch tác d ng: Saxitoxin vƠ các d n ch t khác phong b kênh Na+ c a các t
bƠo th n kinh do đó chúng gơy nh h
ng đ n ho t c ho t đ ng th n kinh vƠ các
ph n ng c a h c .
1.1.1 Gi i thi u v STX
- Danh pháp th
ng: Saxitoxin
- Danh pháp qu c t :
(3aS-(3a- ,4- ,10aR*))-2,6-diamino-4-(((amino-carbonyl)oxy)methyl)3a,4,8,9-tetrahydro-1H,10H-pyrrolo(1,2-c)purine-10,10-diol
- Công th c c u t o:
Hình 1.2: Công th c c u t o c a STX
- Công th c thu g n: C10H17N7O4
-
Kh i l
ng mol phơn t
: 299.29 g/mol
1.1.2 Gi i thi u v NEO
- Danh pháp th
ng: Neosaxitoxin
- Danh pháp qu c t :
Nguy n Th Nhung
4
Tr
ng HKH T Nhiên
[(3aS,4R,10aS)-5,10,10-Trihydroxy-2,6-diiminooctahydro-1H,8Hpyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate
- Công th c c u t o:
Hình 1.3: Công th c c u t o c a Neo
- Công th c thu g n: C10H17N7O5
-
Kh i l
ng mol phơn t
: 315.286 g/mol.
1.1.3 Gi i thi u v GTX-1
- Danh pháp th
ng: Gonyautoxins-1
- Danh pháp qu c t : {4-[(carbamoyloxy)methyl]-5,10,10-trihydroxy-2,6diimino-decahydropyrrolo[1,2-c]purin-9-yl}oxidanesulfonic acid
- Công th c c u t o:
Hình 1.4: Công th c c u t o c a GTX-1
Nguy n Th Nhung
5
Tr
ng HKH T Nhiên
- Công th c thu g n: C10H17N7O9S
-
Kh i l
ng mol phơn t
: 411.34848g/mol.
1.1.4 Gi i h n t iăđaăchoăphépă(ML)
- M c t i đa cho phép (ML) lƠ gi i h n c a đ c t PSP , đ
m t pháp lí ho c xem nh có th ch p nh n đ
v , mƠ không gơy h i cho ng
B ng 1.2: M t s n
c
c phép t n t i v
trong nhuy n th hai m nh
i s d ng.
căđƣăđ aăraăquiăđ nh gi i h n t iăđaăchoă
phépă(ML)ăc aăcácăPSPănh ăsauă[13]:
tn
c/
Vùng lƣnh th
Australia
S n ph m
ng v t có v
ct
M c cho phep
Saxitoxin
80 µg/100g
Canada
Nhuyên thê
PSP
<80µg/100g
Chơu Âu
Nhuyên thê
PSP
80µg/100g
Guatemala
Nhuyên thê
Saxitoxin
400 MU/100g
HongKong
ng v t có v
PSP
400 MU/100g
Nhơt
Nhuyên thê
PSP
400 MU/100g
HƠn Qu c
Nhuyên thê
Gonyautoxins
400 MU/100g
́c
ng v t có v
PSP, NSP, DSP,
ASP
40-80 µg/100g
Na Uy
Tơt ca
PSP
40-80 µg/100g
Panama
Nhuyên thê
PSP
400 MU/100g
Singapore
Nhuyên thê
Saxitoxin
80 µg/100g
M
Nhuyên thê
PSP
80 µg/100g
Nguy n Th Nhung
6
Tr
ng HKH T Nhiên
Nh n xét: Hi n nay Vi t Nam ch a đ a ra qui đ nh gi i h n t i đa cho phép
(ML) c a các PSP. V y chúng tôi ch p nh n giá tr ML b ng 80 µg/100g lƠ giá tr
ML c a M vƠ nhi u n
c khác.
1.1.5 Nh ngătácăh i c aăđ c t nhuy n th gơyăli tăc
nh h
ng đ n đ ng v t giáp xác thơn m m.
Th y tri u đ lƠ tên g i khi vùng bi n có hi n t
Khi t o n hoa gơy nh h
ng n hoa bùng phát c a t o.
ng x u đ n hƠng lo t đ ng v t giáp xác thơn m m
nh nghêu, trai, sò v m, hƠu. Nh ng đ t bùng phát t o n hoa x y ra
c a sông,
m t bi n nhanh chóng tích t nh ng đám hoa. S n hoa c a t o có khi lƠm n
c
bi n có mƠu đ , có khi mƠu xanh, mƠu xám… a s các loƠi t o n hoa lƠm môi
tr
ng x u đi, lƠm gi m l
ng oxi hòa tan trong n
c lƠm cho đ ng v t bi n ch t
hƠng lo t [14].
Vi t Nam, hi n t
ng th y tri u đ xu t hi n ch y u
Nam Trung B . Trong đó Bình Thu n lƠ n i hi n t
khu v c vùng bi n
ng nƠy x y ra th
ng xuyên,
hƠng n m t tháng 3 đ n tháng 9. G n đơy, trong kho ng tháng 3-6/2012
Cát
BƠ H i Phòng c ng đƣ xu t “th y tri u đ ”, tuy nhiên lo i t o nƠy có tên
Noctiluca scintillans không sinh đ c t , nên không có nguy c gơy đ c cho ng
i
[11].
nh h
ng c a t o đ c trong ao tôm.
Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon vƠ P. orientalis
Qu c vƠ Malaysia có nhi u gi ng t o n hoa do môi tr
Ơi Loan, Trung
ng giƠu ding d
ng bao
g m: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp,
chúng gơy ra tình tr ng thi u oxy máu, ti t ra đ c t PSP, ASP lƠm gi m sinh
tr
ng
tôm, gơy b nh, ho c tr c ti p gơy ch t tôm.
Vi t Nam, t o đ c Noctiluca scintillans n hoa
khu v c Vơn Phong thu c
vùng bi n Khánh Hòa đƣ lƠm ch t kho ng 20 t n tôm hùm v i thi t h i
Nguy n Th Nhung
7
Tr
c tính
ng HKH T Nhiên
kho ng 6 t đ ng.
ng
nh h
ng x u đ n s c kh e con ng
i.
i, nhi m đ c t nhuy n th gơy li t c (PSP) lƠ do n ph i nhuy n th
ch a đ c t nƠy. Nhuy n th b nhi m vƠ tích l y các lo i đ c t nƠy lƠ do n t o
đ c.
D u hi u đ u tiên c a s nhi m đ c trên ng
i xu t hi n kho ng 5-30 phút sau
khi n nhuy n th b nhi m v i các tri u ch ng: c m giác kim chơm ho c tê nh
đ n li t c hô h p hoƠn toƠn. Trong tr
ng h p n ng có th t vong do li t c hô
h p, x y ra trong vòng t 2-12h sau khi n th c ph m nhi m đ c PSP.
M i n m, các tr
ng h p ng đ c do PSP v n đ
T n m 1970 có kho ng 1.600 tr
bi t lƠ
c ghi nhơn trên toƠn th gi i.
ng h p ng đ c do PSP đƣ đ
c báo cáo, d c
B c M vƠ Chơu Âu. Bên c nh đó, có thêm kho ng 900 tr
đ c PSP đ
c ghi nh n
các vùng trên th gi i mƠ tr
ng h p ng
c đó PSP ch a đ
c bi t
đ n.
Nh t, tr
ng h p ng đ c đ u tiên đ
c ghi nh n vƠo cu i nh ng n m 1960.
Malaysia, Philippin vƠ Indonesia, các ca ng đ c đ u tiên đ
c báo cáo vƠo
nh ng n m 1970 vƠ đ u nh ng n m 1980. Trong su t 20 n m qua, d
ng nh có
s gia t ng các v ng đ c PSP do vi c nuôi vƠ tiêu th nhuy n th đ
cm
r ng.
Nhóm nhuy n th đ
c xác đ nh trong nh ng v ng đ c PSP g m ch
y u đ ng v t thơn m m hai m nh v g m v m, ngao, hƠu, đi p vƠ sò. C n chú ý:
do PSP tích l y trong nhuy n th nên chúng có th gơy ng đ c cho ng
không có hi n t
i c khi
ng th y tri u đ . Tác d ng đ c lên đ ng v t.
PSP có th gơy đ c lên nhi u đ ng v t khác nh cá, chim, ch, gƠ, chu t, th , chó
mèo. Trong các thí nghi m trên đ ng v t, PSP lƠm ch t thú th nghi m do gơy
li t h th ng hô h p. NgoƠi ra, PSP th hi n tác d ng đ c lên h th n kinh c , h
th n kinh trung
ng, h th ng tim m ch vƠ
Nguy n Th Nhung
8
li u 1 µg/kg tr ng l
Tr
ng c th đƣ
ng HKH T Nhiên
gơy t ng huy t áp.
H p th vƠ th i các đ c t PSP trong c th th y s n.
Trong quá trình l c th c n, các t bƠo vƠ bƠo t c a t o giáp đƣ chuy n vƠo th c
qu n d dƠy c a nhuy n th hai m nh v . N i t ng c a nhuy n th ch chi m
30% t ng kh i l
ng c a mô m m nh ng l i ch a đ n 96% t ng đ c t . Trong
c th đ ng v t nhuy n th , các đ c t t p trung nhanh chóng trong n i t ng vƠ
sau gi m d n. ThƠnh ph n các đ c t không gi ng nhau mƠ bi n đ i theo th i
gian vƠ v trí trong đ ng v t. C khép v không tích l y đ c t mƠ th c t cho
th y đƣ lƠm b t ho t đ c t . ng tiêu hóa, mƠng, tuy n sinh d c vƠ mô mang gi
l i đ c t v i tr ng l
ng khác nhau gi a các mô vƠ gi các loƠi. Sau khi h p th
vƠ phơn b , các đ c t có th b bi n đ i. Các loƠi hai m nh v có cách x lý vƠ
ph n ng v i PSP khác nhau vƠ s nh y c m c a chúng v i đ c ch t nƠy c ng
khác nhau, ví d : v m tích l y các đ c t PSP nhi u h n hƠu trong cùng hoƠn
c nh. Các nghiên c u nuôi trong phòng thí nghi m cho th y v m h p th d dƠng
các đ c t c a t o giáp nh ng v i l
ng đ c t t
ng đ
ng nh th thì hƠu
ng ng l c.
1.2. Cácăph
ngăphápăxácăđ nhăđ căt ăgơyăli tăc ătrongănhuy năth ă
haiăm nhăv
Có hai nhóm ph
ng pháp chính đ xác đ nh các đ c t sinh h c bi n
trong nhuy n th hai m nh v bao g m nhóm ph
ph
ng pháp sinh h c vƠ nhóm
ng pháp hoá h c:
1.2.1.ăCácăph
ngăphápăth sinh h c
Th nghi m sinh h c trên chu t (MBA) v n lƠ ph
chính trong h u h t các ch
ng pháp th nghi m
ng trình giám sát ng đ c th y s n. MBA đ
d ng ph bi n trên th gi i trong h n 50 n m qua vƠ lƠ ph
cs
ng pháp chính th c
c a AOAC.
Nguy n Th Nhung
9
Tr
ng HKH T Nhiên
PSP trong m u đ
c chi t tách b ng dung d ch HCl 0,1N, d ch chi t đ
c
tiêm vƠo chu t theo t l 1 mL d ch/20 g chu t, quan sát bi u hi n c a chu t
trong vòng 60 phút vƠ xác đ nh th i gian ch t c a chu t. D a vƠo th i gian ch t
c a chu t tra b ng Sommer s xác đ nh đ
tính đ
c giá tr đ n v chu t (MU), t đó
c n ng đ đ c t PSP trong m u [23], [30].
Tác gi
Ơo Vi t HƠ ậ Vi n H i D
ng H c Nha Trang [1] đƣ ti n hƠnh
th nghi m sinh h c trên chu t (MBA.AOAC 1990) đ xác đ nh hƠm l
ng đ c
t PSP trong nghêu Meretrix lyrata t i m t s vùng nuôi tr ng đi m khu v c C n
Gi . Tác gi đƣ ti n hƠnh tiêm phúc m c chu t nh t tr ng (Swiss wiss) (có tr ng
l
ng 20g ́ 2g) 1 mL d ch chi t thô, sau đó theo dõi tri u ch ng vƠ th i gian
ch t c a chu t (n u x y ra). Tính toán đ c l c t ng d a theo ph
AOAC, 1990. K t qu cho th y, hƠm l
m c đ phát hi n c a ph
-
ng đ c t PSP
ng pháp
t t c các m u đ u d
i
ng pháp MBA (36 µg/100g, v i h s CF = 0.18).
u đi m: th i gian th c hi n nhanh, có kh n ng đánh giá đ
c t ng các
đ c t vƠ không đòi h i trang thi t b ph c t p.
-
Nh
c đi m lƠ đ nh y th p, không th t đ ng hóa, không đ nh danh
chính xác lo i ch t đ c, b nh h
ng b i các đ c tính đ ng v t vƠ đ c bi t lƠ v n
đ đ o đ c [22], [23]. Do đó, nhóm ph
ng đ
c nhu c u vƠ d n đ
1.2.2.ăPh
ng pháp nƠy hi n nay không còn đáp
c thay th b ng các ph
ng pháp hoá h c .
ngăphápăxétănghi m mi n d ch ELISA
ELISA (Enzym-linked immunosorbent assay) lƠ m t k thu t sinh hóa đ
phát hi n kháng nguyên hay kháng th trong m u xét nghi m, vƠ th
ng đ
c
quan sát b i s thay đ i mƠu s c. Usleber vƠ c ng s b ng cách s d ng các
kháng th đa dòng đƣ phát tri n thƠnh công kit th nghi m cho STX. Gi i h n
phát hi n lƠ 4 ng/g mô nhuy n th [26].
-
u đi m: D th c hi n vƠ th i gian phơn tích ng n.
Nguy n Th Nhung
10
Tr
ng HKH T Nhiên
-
Nh
c đi m: chi phí mua kit th đ t, không có kh n ng đ nh danh vƠ
phơn lo i các thƠnh ph n c a đ c t PSP. Do đó, khi phát hi n m u th d
tính ph i dùng ph
1.2.3.ăPh
ng
ng pháp s c ký đ ki m tra [23].
ngăphápăs căkýăl ng hi uăn ngăcaoă(HPLC)
Ph
ng pháp s c kí l ng hi u n ng cao s d ng detector hu nh quang
(HPLC-FLD) lƠ ph
ng pháp đ
c s d ng nhi u nh t trong phơn tích các PSP
vƠ AOAC 2005:06.
u đi m c a ph
Nh
ng pháp lƠ có đ chính xác, đ nh y vƠ đ ch n l c cao.
c đi m lƠ t n th i gian vì các PSP ph i đ
c d n xu t hóa tr
cc t
ho c sau c t đ phơn tích b ng detector hu nh quang. NgoƠi ra, vi c xác đ nh
PSP ph c t p h n do s ch ng chéo các s n ph m oxi hóa các ch t t
trong tr
ng h p oxi hóa tr
ng t PSP
c c t.
B ng 1.3: M t s nghiên c u s d ng ph
ng pháp HPLC-FLD đ xác
đ nh PSP
TLTK vƠ
N n m u vƠ đi u ki n phơn tích
Tác gi
K t qu
- N n m u: sinh kh i t o khô
- i u ki n s c kí
LOD =
+ C t C18
+ Kênh
Etheridge
A:
acid
heptanesulfonic
[12]
6
octanesulfonic
mmol/L,
vƠ
ammonium
photphat 48 mmol/mL vƠ tetrahydrofuran
0,75% trong n
+ Kênh
B:
(µg/g)
LOQ =
0,07
c
acid
heptanesulfonic
0,035
7
octanesulfonic
mmol/L,
vƠ
(µg/g)
ammonium
photphat 48 mmol/mL, tetrahydrofuran 1% vƠ
Nguy n Th Nhung
11
Tr
ng HKH T Nhiên
ACN 10% trong n
+ Oxi hóa tr
c
cc t
+ T c đ dòng 1 mL/phút
+ B
c sóng kích thích: 330 nm
+ B
c sóng phát x : 390 nm.
- N n m u: Trai, nghêu, sò, hƠu
LOD =
- i u ki n s c kí
+ C t Angilent Zorbax Bonus RP (3,5 µm; 4,7 x
0,017
µg/g
150 mm)
+ Kênh A: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 5,5
Wiberg
[27]
mM trong n
0,051
c (pH = 7,1)
+ Kênh B: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 16,5
mM, methylnitril 11,5% trong n
LOQ =
c (pH = 7,1)
µg/g
thu
+ Oxi hóa sau c t
h i: 88%
+ T c đ dòng 0,8 mL/phút
ậ 113%
+ B
c sóng kích thích vƠ phát x : 330 nm vƠ 390
nm
- N n m u: HƠu, sò, h n
- i u ki n s c kí
LOD =
+ C t Supelcosil LC-18 (5 µm; 4,6 x 15 mm)
+ Kênh A : ammonium formate 0,1 M
Llewellyn
LOQ =
+ Kênh B : ammonium forrmate 0,1 M trong 5%
[20]
ACN/H2O (pH = 6)
+ Oxi hóa tr
h i: 70 ậ
+ T c đ dòng 2 mL/phút
c sóng kích thích: 330 nm
+ B
c sóng phát x : 390 nm
Nguy n Th Nhung
12
0,06 µg/g
thu
cc t
+ B
0,02 µg/g
104%
Tr
ng HKH T Nhiên
1.2.4 K thu tăđi n di
i n di mao qu n (CE) lƠ m t k thu t t
vƠ ng d ng trong l nh v c phơn tích đ c t
ng đ i m i đƣ đ
c phát tri n
iên di mao quan la môt ky thuơt
.
tách các ch t trong dung d ch l ng d a trên s di chuy n khác nhau c a các phơn
t chơt mang điên tốch trong côt mao quan d
i anh h
ng cua điên tr
ng tao
b i điên ap cao thê (15 ậ 30 kV) đ t vao hai đơu mao quan . Các đ c t nƠy di
chuy n qua c t khi đi n áp cao đ
c áp vao vƠ có th
đ
c phát hi n khi chúng
đi qua m t detector UV ho c hu nh quang. K thu t nƠy đ
c áp d ng cho các
h p ch t mang điên , vƠ th m chí khi không có đi n tích nó có th h p ch t b y
trong mixen mƠ sau đó s di chuy n.
Wright va công s
(1989) [29] áp d ng m t h th ng CE cùng v i m t
máy dò hu nh quang đ xác đ nh STX. K thu t nƠy cho phép phát hi n các STX
c p µg /kg. M c dù kh i l
ng tiêm lƠ nh t thi t ph i nh (1-10 nL), gi i h n
phát hi n lý thuy t cho các m u n m trong kho ng pg/kg. Nh ng nh
hi n nay v i k thu t la không xac đinh đ
c đi m
c đ c t h n h p.
Thibault va công s (1991) đƣ áp d ng m t ph
sinh v t bi n. S phơn tach c a Neo vƠ STX đƣ đ t đ
ng pháp CE cho các m u
c vƠ s d ng phép đo ph
UV v i gi i h n phát hi n c 1,5 µg/mL. Các tác gi cho r ng k thu t CE-UV
có th áp d ng cho vi c ki m tra th
ng xuyên các ch t đ c trong các chi t xu t
t nhiên, nh ng gi i h n phát hi n hi n nay la quá cao đ
các ch
có th s d ng trong
ng trình giám sát.
1.2.5ăPh
ngăphápăs căkýăl ng kh i ph (LC-MS), (LC-MS/MS)
G n đơy ph
ng pháp s c kí l ng t
ng tác a n
c k t h p v i detector
2 l n kh i ph cho đ nh y, đ đ c hi u cao khi phơn tích các PSP (HILICMS/MS).
Liyang Zuo [31] đa s d ng k thu t QuEChERS (nhanh, d dƠng, giá r ,
hi u qu , b n vƠ an toƠn) cho vi c tách chi t, lƠm s ch vƠ phát hi n 10 đ c t
PSP trong th c ph m bi n b ng HILIC-MS/MS
Nguy n Th Nhung
13
chê đô ESI d
Tr
ng.
ng HKH T Nhiên
-
N n m u: nhuy n th + cá.
-
Dung môi chi t: ACN/H2O (90:10, v/v).
-
LƠm s ch: d-SPE (ch t h p ph HLB vƠ than ho t tính GCB).
-
i u ki n s c kí:
+ C t: TSK-gel Amide-80® (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: HCOOH 0,1% trong ammonium formate 2 mmol/L.
+ Kênh B: HCOOH 0,1% trong ACN.
+ Ch y theo ch
ng trình gradient.
K t qu : Các nghiên c u
ba m c thêm chu n PSP trong kho ng 8,1-
225,5 µg/kg cho đ thu h i trung bình t 71,3% đ n 104,6% v i đ l ch chu n
t
ng đ i (RSD) ≤ 15,8%.
Mattarozzi [21] đƣ t i
u hóa ph
QuEchERS đ phơn tích đ c t PSP b ng ph
ng pháp x
lý m u b ng k thu t
ng pháp HILIC-MS/MS.
-
N n m u: trai.
-
Dung môi chi t: HCOOH 0,1%.
-
LƠm s ch: d-SPE (ch t h p ph polymeric ABS Elut ậ NEXUS).
-
i u ki n s c kí:
+ C t: TSK-gel Amide-80 (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: acetonitril 95% v i 5% lƠ amoni format 20 mM va acid
formic 26 mM (pH = 3,2).
+ Kênh B: 95% n
c va 5% lƠ amoni format 20 mM va acid formic
26 mM (pH = 3,2).
+ Ch y theo ch
K t qu : Ph
gi i h n đ nh l
ng trình gradient.
ng phap cho gi i han phat hiên cua cac PSP lƠ
ng lƠ 7 µg/kg; hiêu suơt thu hôi trong khoang t
m c thêm chuơn LOQ va m c gi a đ
3 µg/kg,
98 ậ 109% t i
ng chuơn xơy d ng .
Aversano [10] đƣ ti n hƠnh phơn tích các đ c t PSP b ng ph
ng pháp
HILIC-MS. Nhóm tác gi đƣ ti n hƠnh kh o sát dung môi pha đ ng vƠ l a ch n
Nguy n Th Nhung
14
Tr
ng HKH T Nhiên
