Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng

Header Page 1 of 148.

LỜI CAM ĐOAN
Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài.“Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo
chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức
năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB của Bộ Công thương.
Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án
này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và
chưa từng được các tác giả khác công bố trong các công trình nghiên cứu nào và đã được
chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

GVHD 1

GVHD 2

Nghiên cứu sinh

GS.TS. Đặng Thị Thu

PGS.TS. Trƣơng Quốc Phong

Nguyễn Việt Phƣơng

Footer Page 1 of 148.

Header Page 2 of 148.

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu,
nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, PGS.TS
Trương Quốc Phong, Trưởng phòng Proteomic - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Vi
Sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử cùng các thầy giáo, cán bộ bộ môn Vi sinh – Hóa sinh
và Sinh học Phân tử, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cám ơn tới Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Công nghiệp
Thực Phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án
này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, vợ, con và các
anh chị em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu
tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3

1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10 ..................................................................................... 3
1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10 ............................................................................... 4
1.2.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................................... 4
1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật ...................................................................... 6
1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật .................................................................................. 6
1.3. CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT ....................... 7
1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS ........ 10
1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon ................................................ 10
1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ .......................................................... 11
1.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng ............................................................................... 12
1.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................................ 12
1.4.5. Ảnh hưởng của pH................................................................................................. 13
1.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan ..................................................................... 13
1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ........................... 14
1.5.1. Lên men gián đoạn ................................................................................................ 14
1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) .................................... 14
1.6. TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10 ................................................ 15
1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10 .................................................................................... 15
1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10...................................................................................... 17
1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10 ................................................................................. 18
1.7. CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ......... 21
1.7.1. Đột biến chủng ...................................................................................................... 21
1.7.2. Chủng tái tổ hợp .................................................................................................... 21
1.8. VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 ............................................. 29
1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10 ................................................................................... 29
1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10 .............................................................................. 31
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ.................................................................. 35
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid ................................................................................ 35
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................. 35

2.1.3. Thiết bị sử dụng ..................................................................................................... 36
2.1.4. Môi trường và các dung dịch sử dụng ................................................................... 37
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 38
2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................................. 38
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .............................................................................. 39
2.2.3. Phương pháp hóa lý, hóa sinh................................................................................ 46
2.2.4. Phương pháp toán học ........................................................................................... 52
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 55
3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP
COENZYME Q10 ............................................................................................................. 55
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 .................................. 55
3.1.2. Định tên chủng A. tumefaciens TT4 ...................................................................... 59
3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME
Q10 ...................................................................................................................................... 61
Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.
3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4 ................................................. 61
3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs ......................................................... 66
3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP
COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP............................................. 73
3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10.... 74
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đầu môi trường ....................................................................... 78
3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống .................................................................................... 78
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................................... 79
3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian ....................................................................................... 80
3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ
A. TUMEFACIENS............................................................................................................ 81
3.4.1. Chọn miền khảo sát ............................................................................................... 81

3.4.2. Thiết lập mô hình................................................................................................... 82
3.4.3. Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 84
3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH COENZYME Q10
TỪ CHỦNG A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP ............................................................. 85
3.5.1. Đánh giá các phương pháp phá vỡ tế bào .............................................................. 85
3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol ....................................................... 86
3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 ................................................................... 88
3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................... 93
3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 ................................. 95
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của Coenzyme Q10 ....................................... 95
3.6.2. Ảnh hưởng của pH tới độ bền của Coenzyme Q10 ............................................... 96
3.6.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới độ bền của Coenzyme Q10 ...................................... 97
3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 .......... 98
3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của Coenzyme Q10 ....................................................... 98
3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thư của Coenzyme Q10 ........................................... 99
3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG .................................................................. 101
3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin ........................... 101
3.8.2. Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin .................................... 102
3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 ................... 105
3.8.4. Phân tích, đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10 ........................................... 107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 113
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 114
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 115
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 124

Footer Page 4 of 148.


Header Page 5 of 148.

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên

Amp

Ampicilline

ATP

Adenosine triphosphate

Bp

Cặp base

Cfu

Colony forming unit

CoQ

Coenzyme Q

CoQ10

Coenzyme Q10

CoQ10H2

Coenzyme Q10 quinol

CSL

Corn steep Liquor

CSP

Corn steep Powder

DO

Dissolved oxygen

DNA

Deoxyribonucleic acid

DPS

Decaprenyl diphosphate synthase

DXS

1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase

DMAPP

Dimethylallyl diphosphate

EtBr

Ethidium bromide

FPP

Farnesyl phosphate

HPLC

High-performance liquid chromatography

IPP

Isopentenyl diphosphate

Kan

Kannamycine

kDa

Killo Dalton

LB

Luria-Bertani

MEP

2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate

MVA

Mevalonate

OD

Mật độ quang (độ hấp thụ)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase

Phba

p-hudroxybenzoic acid

v/w

Thể tích/khối lượng

v/v

Thể tích/thể tích

Footer Page 5 of 148.

Header Page 6 of 148.
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1 1. Các trạng thái khác nhau của CoQ10 .................................................................... 3
Hình 1 2. Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid .................................................................... 4
Hình 1.3. Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 ............. 5
Hình 1.4. Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 ............................................................ 7
Hình 1.5. Cấu tạo của β – cyclodextrin ............................................................................... 19
Hình 1.6. Chuỗi vận chuyển điện tử .................................................................................... 30
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps…………………………….…43
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dxs ................................................ 44
Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang đồng thời hai gene dps và dxs ................ 45
Hình 2.4. Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10 ...................................................... 48
Hình 2.5. Phương trình phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa ......... 50
Hình 3.1. Hình ảnh nhuộm Gram một số chủng phân lập (TT4, ML5), chủng chuẩn A.
tumefaciens ứng EHA và AA2.......……………………………………………………….55
Hình 3.2. Khả năng sinh 3-ketolactose của các chủng lựa chọn. A: Màu của khuẩn lạc khi
mới thêm thuốc thử Benedict. B: Màu của khuẩn lạc khi thêm thuốc thử Benedict sau 75
phút ...................................................................................................................................... 56
Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho
gene dps (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dps từ DNA tổng số chủng TT1,
TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR
trước và sau khi cắt bằng PstI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang
DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) .......................................................................................... 58
Hình 3 4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho
gene dxs (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dxs từ DNA tổng số chủng TT1,
TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR
trước và sau khi cắt bằng NdeI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M,
thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) ................................................................................ 58

Hình 3.5. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 các chủng A. tumefaciens phân lập ................ 59
Hình 3.6. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ A. tumefaciens TT4 ............................... 61
Hình 3.7. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số
của A. tumefaciensTT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) ................ 62
Hình 3. 8. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid
của các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6.
TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là
thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ........................................................... 63
Hình 3. 9. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng
số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid
chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và
BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp
(Thermo Scienctific, Mỹ) .................................................................................................... 63
Hình 3.10. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dps được tách dòng ........... 64
Hình 3.11. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dxs được tách dòng ........... 66
Hình 3. 12. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được
lựa chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản
phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+)
là sản phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là
thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ........................................................... 67
Hình 3.13. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được
lựa chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.
phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang
DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ..................................................................... 68
Hình 3.14. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi

DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ
khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC);
RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2)
............................................................................................................................................. 69
Hình 3.15. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) .......................................................... 70
Hình 3.16. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.
Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng
thời hai gen pCAM-dps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301 ................... 71
Hình 3.17. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang
cấu trúc pCAM-dps-dxs ...................................................................................................... 72
Hình 3.18. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B), sản phẩm cắt
enzyme hạn chế SacI/BamHI từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12 .................... 73
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.
tumefaciens .......................................................................................................................... 74
Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.
tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 75
Hình 3. 21. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.
tumefaciens .......................................................................................................................... 76
Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nồng độ cao ngô đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.
tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 77
Hình 3. 23. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ
hợp ....................................................................................................................................... 78
Hình 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.
tumefaciens .......................................................................................................................... 79
Hình 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.
tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 80
Hình 3. 26. Ảnh hưởng của thời gian đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens
............................................................................................................................................. 81
Hình 3.27. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CoQ10 ............................................................ 84
Hình 3.28. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A. tumefacienstái tổ hợp..... 84

Hình 3.29. Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10 ..................................... 85
Hình 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ ... 86
Hình 3.31. Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A.
tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 87
Hình 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái
tổ hợp ................................................................................................................................... 88
Hình 3.33. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ
hợp (B) ................................................................................................................................. 89
Hình 3.34. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10
từ sinh khối vi khuẩn, S dịch CoQ10 chuẩn ........................................................................ 90
Hình 3.35. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau .............................. 91
Hình 3.36. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết
CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch
CoQ10 chuẩn ....................................................................................................................... 92
Hình 3.37. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết
CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký
cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn ..................................................................................... 93

Footer Page 7 of 148.


Header Page 8 of 148.
Hình 3.38. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp................................. 94
Hình 3.39. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A.
tumefaciens .......................................................................................................................... 96
Hình 3.40. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens
............................................................................................................................................. 97
Hình 3.41. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A.
tumefaciens .......................................................................................................................... 97
Hình 3.42. Khả năng chống oxi hóa của CoQ10 ................................................................. 98

Hình 3.43. Phản ứng của CoQ10 các nồng độ khác nhau với DPPH (T-mẫu trắng) .......... 99
Hình 3.44. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B)
và tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20
và 80 µM CoQ10 ............................................................................................................... 100
Hình 3.45. Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn giữa CoQ10 với β-cyclodextrin
........................................................................................................................................... 102
Hình 3.46. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. CoQ10 tạo phức với
Cyclodextrin theo các tỷ lệ khác nhau ............................................................................... 103
Hình 3.47. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10......... 104
Hình 3.48. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 ....... 105
Hình 3.49. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10. 106
Hình 3.50. Viên nang thực phẩm chức năng bổ sung chứa CoQ10 .................................. 107

Footer Page 8 of 148.


Header Page 9 of 148.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 .............. 9
Bảng 1.2. Chủng chủ và hệ biểu hiện vi khuẩn được dùng để sinh tổng hợp CoQ10 ......... 26
Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng……………………………………………………………35
Bảng 2.2. Máy và thiết bị .................................................................................................... 36
Bảng 2.3. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dps ......................................... 40
Bảng 2.4. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dxs ......................................... 40
Bảng 2.5. Các biến số và khoảng chạy của chúng ............................................................... 52
Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm ........................................................................................... 53
Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập…………………………….57
Bảng 3.2. Mã số trình tự một số chủng A. tumfaciens trên ngân hàng gen ........................ 60
Bảng 3.3. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được . 82
Bảng 3.4. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình ....................................................... 83

Bảng 3 5. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. .................................... 102
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ hòa tan của phức β-CDQ10 ................................... 103
Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng ............................................ 107
Bảng 3.8. Kết quả đo độ rã ................................................................................................ 108
Bảng 3.9. Kết quả định lượng CoQ10 trong viên nang ..................................................... 109
Bảng 3.10. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 ............................ 110
Bảng 3.11. Bảng theo dõi trọng lượng chuột………………………………….................110

Footer Page 9 of 148.


Header Page 10 of 148.

MỞ ĐẦU
Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những coenzyme tham gia
vào chuỗi vận chuyển điện tử bám màng ở cả prokaryote và eukaryote, được cấu tạo bởi
vòng benzoquinone và chuỗi isoprenoid kị nước. CoQ10 có vai trò quan trọng trong việc
sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể. Do có tính chất chống oxy hóa
mạnh, trung hòa các gốc tự do nên CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực
phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một
chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn
ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn
dịch, giảm huyết áp...[5, 71, 72, 74].
Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để đáp
ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và
công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay CoQ10 được sản xuất
chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như Agrobacterium tumefaciens,
Escherichia. coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus
denitrificans...[34, 36, 43, 54, 67, 91, 102].
Để nâng cao hiệu quả sản xuất CoQ10, từ năm 1993 nhiều nghiên cứu trên thế giới đã

tập trung vào tối ưu hóa quá trình lên men chủng tự nhiên hoặc cải biến chủng. Việc cải
biến chủng được thực hiện bằng cách gây đột biến ngẫu nhiên hoặc tạo chủng tái tổ hợp.
Mặc dù các chủng đột biến có khả năng tổng hợp CoQ10 cao hơn so với chủng gốc, tuy
nhiên hàm lượng CoQ10 từ các chủng này vẫn chưa được như mong đợi.
Hiện nay nhiều nghiên cứu đã và đang tập trung vào việc tạo chủng E. coli tái tổ hợp
mang gen mã hóa một số enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp CoQ10 như dxs
và dps, song khả năng tổng hợp CoQ10 còn thấp so với các chủng đột biến. Ngoài ra, các
chủng E. coli tái tổ hợp không chỉ tổng hợp CoQ10 mà còn tổng hợp cả CoQ8 và CoQ9.
Đây là điều bất lợi cho việc tách tinh sạch thu CoQ10 đặc biệt là khi sản xuất ở quy mô
công nghiệp.
A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10
hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi
sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở
quy mô công nghiệp [16, 33, 34, 101]. Chiến lược sử dụng chính vi khuẩn A. tumefaciens
làm chủng chủ để cải biến gen tạo chủng tái tổ hợp có khả năng tổng hợp CoQ10 tăng lên
1
Footer Page 10 of 148.


Header Page 11 of 148.
là một giải pháp khả thi và đã bước đầu thành công bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc
năm 2008 [16]. Ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về hướng này mới chỉ là các nghiên
cứu về phân lập các chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 [2, 4].
Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp”
 Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10.
- Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10.
- Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng.
 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10.
- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10.
-

Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10 từ
chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.
 Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực
phẩm chức năng dưới dạng viên nang.
 Những đóng góp mới của luận án
- Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao.
- Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa
của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân lập ở VN và
tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất sinh tổng
hợp CoQ10 cao.
- Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng
dưới dạng viên nang.

2
Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10
Coenzyme Q10 (2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-1,4-benzoquinone) còn gọi là
(ubiquinone, ubidecarenone, CoQ10) lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick
Crane (USA) năm 1957 [21]. CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các
dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [60, 63].
Cấu trúc hóa học của coenzyme Q10 bao gồm một vòng quinone liên kết với chuỗi

mạch bên isoprene. Coenzyme Q10 có công thức phân tử C59H90O4, khối lượng mol:
863.34 g/ mol [63].
Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung
gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [24, 63].

Hình 1 1. Các trạng thái khác nhau của CoQ10

CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân
chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ. CoQ10H2 là một phân tử rất kỵ nước nằm ở
giữa lớp phospholipid kép.

3
Footer Page 12 of 148.


Header Page 13 of 148.
Coenzyme Q10 có cấu trúc một đầu quinone, nó có thể chuyển giao điện tử và đuôi là
một chuỗi isoprenoid dài bên trong màng ti thể hay màng tế bào chất của các sinh vật hô
hấp hiếu khí. Đuôi này giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp
màng lipid [63].

Hình 1 2. Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid [63]

1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10
CoQ10 được sản xuất từ ba phương pháp: lên men (tổng hợp sinh học), tổng hợp hóa
học hoặc tách chiết từ mô động vật, thực vật.
1.2.1. Tổng hợp hóa học
CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [51, 80, 100]. Trong số
đó sử dụng solanesol cho quá trình tổng hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn
xuất quinone là phương pháp đầy tiềm năng. Solanesol có thể dễ dàng thu được bằng cách

chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây. Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này ở
quy mô công nghiệp vẫn còn bị hạn chế bởi việc thiếu một phương pháp hiệu quả cho việc
tổng hợp các dẫn xuất quinone, là chìa khóa trung gian của CoQ10. Do đó, phương pháp
tổng hợp các dẫn xuất quinone một cách hiệu quả là rất cấp thiết.
Terao và Fujita đã chứng minh một quy trình hiệu quả để tổng hợp dẫn xuất quinone.
[30, 88]. Tuy nhiên quy trình tổng hợp phải trải qua nhiều bước phức tạp và tốn kém. Vì
vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trọng sản xuất công nghiệp.
Min và cộng sự (2003) đã đề xuất một phương pháp hiệu quả hơn cho quá trình tổng hợp
các chất trung gian quan trọng tổng hợp CoQ10 qua một loạt các phản ứng alkyl hóa
Friedel-Crafts bằng cách gắn thêm các mạch (–R) bất kì vào các vòng thơm [61]. Tuy
nhiên, thời gian phản ứng dài và hiệu suất thấp. Một số phương pháp mới để tổng hợp

4
Footer Page 13 of 148.


Header Page 14 of 148.
CoQ10 như chloromethyl mạch vòng CoQo với các ion, tuy nhiên những phương pháp này
vẫn không áp dụng được trong quy mô công nghiệp [13, 51, 76].
Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một
cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone. Hợp chất
này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi
với các bromide solanesyl. CoQ10 được tổng hợp bắt đầu từ toluenesulfonyl p- (TsCl)
với isoprene để có được (2E)-1-p-toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene bằng cách
kết hợp phương pháp este hóa và thủy phân. Tiếp theo với việc bổ sung 2,3,4,5tetramethoxytoluene (TeMT), đã kết hợp 2 thành phần thành (2‟E)-1-(3-methyl-4-ptoluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5 tetramethoxybenzene. Hợp chất này là chìa
khóa quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide
solanesyl [64].

Hình 1.3. Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 [64]
(1): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-chloride-2-butene; (2):

(2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-

methyl-4-acetoxy-2-butene; (3): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene; (4): (2'E)
-1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene.
(a): isoprene, copper (I) chloride (CuCl), triethylamine hydrochloride (Et3N·HCl), 90°C, 75.9%;
(b): NaOAc, glacial acetic acid, 120°C, 90.7%; (c): MeOH, 20% Na2CO3, 0°C, 68.8%; (d):
2,3,4,5-tetramethoxytoluene (TeMT), 1,2-dichloroethane, boron trifluoride etherate (BF3·OEt2),
80°C, 58.8%.

5
Footer Page 14 of 148.


Header Page 15 of 148.
1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật
CoQ10 hiện diện trong tự nhiên với số lượng nhỏ trong nhiều loại thực phẩm, nhưng
mức độ đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu
nành. CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957.
Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên có chứa hàm
lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [24, 63, 81, 85]. Hàm lượng CoQ10
trong thịt là 8 - 200 μg/g, gia cầm 17 - 21 μg/g, cá 4 - 64 μg/g [24]. Ngoài ra CoQ10 cũng
có trong trái cây, cây thuốc lá và rau nhưng với hàm lượng nhỏ [60, 95]. Mặc dù có thể thu
nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không
thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao. Đây là lí do chính
khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế.
1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật
1.2.3.1. Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc
Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp coenzyme Q10,
một số giống có hàm lượng CoQ10 cao như Cyptococcus,Trichosporon, Dexomyces,

Rhdoporium. Một số chủng vi sinh vật khác có sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng
thấp hơn như Bullera, Candida, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago [2, 4].
Schizosaccharomyces pombe cũng là một hệ thống phổ biến để sản xuất protein và CoQ10
[15]. Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất CoQ10
[66]. Trong một số loài nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng
sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [45].
1.2.3.2. Coenzyme Q10 từ vi khuẩn
CoQ10 từ vi khuẩn đã được hai nhà khoa học là Carr và Exell nghiên cứu từ năm
1965 [12]. Đặc biệt, các nghiên cứu chọn lọc các chủng dại sinh CoQ10 cao đã tìm được
các loài A. tumefaciens [19], Rhodopseudomonas spheroids và P. denitrificans [54].
CoQ10 cũng được tìm thấy ở một số vi khuẩn quang hợp như R sphaeroides, R.
sulfidophilus [91], Rhodospirillum rubrum [89]. Trong đó hàm lượng CoQ10 đạt cao nhất
trong R. Rubrum đạt 10 mg/l. Ngoài ra CoQ10 cũng được thu nhận từ vi khuẩn
Sphingomnas sp [106], Rhizobium radiobacter [84], P. dentrificans [99], P. seudomonas
Các loài A. tumefaciens, R. sphaeroides, P. denitrificans đã được sử dụng cho sản xuất
CoQ10 ở quy mô công nghiệp và đạt nồng độ từ 30 † 130 mg/l [34, 91].

6
Footer Page 15 of 148.


Header Page 16 of 148.
Trong số các chủng vi sinh vật thì vi khuẩn A. tumefaciens là một trong những vi
khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có
hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi
trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp [16, 33, 34].

1.3. CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT
Con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật bao gồm 3 phần (Hình 1.4): tổng hợp
mạch vòng quinonoid, tổng hợp mạch nhánh decaprenyl diphosphate, và biến đổi vòng

quinonoid [18, 41, 58]. Sơ đồ chi tiết con đường sinh tổng hợp được trình bày ở phụ lục 8.
Con đƣờng MEP
Con đƣờng MVA

Hình 1.4. Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật [41]



Tổng hợp vòng quinonoid (A)
Sự tạo thành 4-hydroxybenzoate (pHBA) từ chorismate là bước đầu tiên trong quá

trình sinh tổng hợp CoQ10. Phản ứng này, được xúc tác bởi enzym chorismate
pyruvatelyase được mã hóa bởi gen ubiC.
Ở E. coli, pHBA, tiền chất của vòng quinonoid thu được tạo thành từ con đường
shikimate, đây là con đường quan trọng để tổng hợp các axit amin thơm thông qua
chorismate. pHBA được sử dụng cho quá trình prenyl hóa và biến đổi vòng.
Ở động vật có vú, pHBA được tạo thành từ axit amin tyrosine do thiếu con đường
shikimate.

7
Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.
Ở nấm men pHBA được tổng hợp trực tiếp từ chorismate giống với E. coli hoặc từ
tyrosine giống với các vi sinh vật nhân chuẩn bậc cao [18, 41, 63].


Tổng hợp mạch nhánh (decaprenyl diphosphate) (B, C)

Isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó dimethylallyl diphosphate
(DMAPP) là một tiền chất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10. Để tổng hợp
IPP, có hai con đường: con đường mevalonate (MVA) (C) và con đường 2-C-methyl- Derythritol 4-phosphate (MEP) (non-MVA) (B).
Ở E. coli, tảo lục và có thể là hầu hết các vi khuẩn khác, IPP bắt đầu được tổng hợp từ
con đường MEP theo một phản ứng tổng hợp khởi đầu giữa pyruvate và glyceraldehyde-3phosphate (GA3P) để tạo ra IPP và DMAPP [25, 47]. Thực vật và Streptomycetes sử dụng
cả 2 con đường MVA và MEP.
Phản ứng đầu tiên của tổng hợp IPP của con đường MEP ở E. coli là hình thành 1deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP) dưới sự xúc tác của gen dxs. DXP sau đó bị khử
thành MEP dưới sự xúc tác của EXP reductoisomerase (DXR) được mã hóa bởi gen ispC
(dxr). Sau đó MEP chuyển hóa thành IPP dưới sự xúc tác của các enzym được mã hóa bởi
các gen ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE), và ispH (lytB) trong các phản
ứng tiếp và bị đồng phân hóa thành DMAPP bởi gen idi.
Vi sinh vật nhân chuẩn như nấm mốc và nấm men không có con đường MEP nên
tổng hợp IPP dựa vào con đường MVA[42]. Sinh tổng hợp IPP sử dụng con đường MVA
bắt đầu với sự chuyển 3 phân tử của acetyl-CoA thành MVA thông qua acetoacetyl-CoA
và HMG-CoA. MVA được chuyển thành MVA diphosphate bằng 2 quá trình phosphoryl
hóa nhờ xúc tác bởi lần lượt 2 enzym MVA kinase và phospho-MVA kinase. Sau đó,
MVA diphosphate trải qua quá trình dehydate hóa-decarboxyl hóa trong một phản ứng cần
ATP, tạo ra IPP. Enzym IPP isomerase xúc tác quá trình đồng phân hóa của IPP thành
DMAPP.
Ở bước tiếp theo của con đường này, farnesyl diphosphate (FPP) synthase xúc tác sự
bắt cặp 1‟-4 của IPP với DMAPP và geranyl diphosphate (GPP) dẫn đến sự hình thành lần
lượt GPP và FPP. Sản phẩm này được kéo dài bởi decaprenyl diphosphate synthase (DPS)
[41].


Biến đổi vòng quinonoid (D)
Bước đầu tiên trong quá trình biến đổi vòng là pHBA bị prenyl hóa bởi một enzyme

bám màng 4- hydroxybenzoate decaprenyltransferase, chuyển các loại decaprenyl
diphosphate [6, 59]. Các phản ứng sau đó bao gồm 1 phản ứng decarboxyl hóa, 3 phản ứng

hydroxyl hóa và 3 phản ứng methyl hóa xảy ra với các thứ tự khác nhau ở sinh vật nhân sơ
8
Footer Page 17 of 148.


Header Page 18 of 148.
và sinh vật nhân chuẩn [58]. CoQ cuối cùng được tổng hợp là kết quả của các phản ứng
biến đổi vòng. Ở nấm men, tiền chất chuỗi phụ được sử dụng cho prenyltransferase là
hexaprenyl diphosphate. Sản phẩm của phản ứng này, 3-hexa prenyl pHBA, trải qua các
phản ứng biến đổi vòng tiếp theo trong một thứ tự khác so với ở E. coli. Do đó, 3-hexa
prenyl pHBA trải qua hydroxyl hóa, methyl hóa, và decarboxyl hóa thành 2-polprenyl-6methoxyphenol. O-methylase được mã hóa bởi gen CoQ3 như UbiG chuyển 2-polyprenyl3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinol thành ubiquinol. Ở con đường sinh tổng
hợp CoQ này, pHBA:polyprenyl diphosphate transferase, chuyển chuỗi phụ isoprenoid
thành khung quinone. pHBA:polyprenyl diphosphate transferase có tính đặc hiệu cơ chất
rộng, và chiều dài của cơ chất isoprenoid không làm thay đổi hoạt tính chuyển đổi của nó.
Chiều dài của chuỗi phụ không được xác định bởi tính đặc hiệu cơ chất của pHBA:
polyprenyl diphosphate transferase, nhưng được xác định bởi tính chất của isoprenoids. Ở
E. coli, quá trình prenyl hóa của pHBA thành 3-octaprenyl pHBA được xảy ra bởi enzym
liên kết màng pHBA:octaprenyltransferase. Enzym này là không đặc hiệu và có thể sử
dụng nhiều prenyl diphosphate như là các tiền chất chuỗi phụ. Enzym này cũng không có
tính đặc hiệu đối với cơ chất thơm này. Chiều dài của chuỗi phụ prenyl là một hằng số đối
với mỗi sinh vật, điều này được quyết định bởi sự sẵn có của prenyl diphosphate trong tế
bào. 3-octaprenyl pHBA được decarboxyl hóa thành 2-octaprenylphenol bởi 3-octaprenyl
pHBA decarboxylase. 2-octaprenylphenol này trải qua 3 phản ứng hydroxyl hóa và 3 phản
ứng methyl hóa dẫn đến sự tạo thành ubiquinol và sau đó là CoQ10 [18, 41].
Bảng 1.1. Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 [41]

Gen

Enzym đƣợc mã hóa

phbA

Acetoacetyl-CoA thiolase (PhbA)

mvS

HMG-CoA synthase (MvaA)

mvaA

HMG-CoA reductase (MvaS)

mvaK1

Mevalonate kinase (MvaK1)

mvaK2

Phosphomevalonate kinase (MvaK2)

mvaD

Mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MvaD)

dxs

1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS)

dxr

1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR)

ispD

4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-D-erythritol synthase (IspD)

ispE

4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE)
9

Footer Page 18 of 148.


Header Page 19 of 148.
ispF

2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase

ispG

4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate synthase

ispH

4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase

idi

Isopentenyl pyrophosphate isomerase (Idi)

ispA

Farnesyl diphosphate synthase (IspA)

ispB

Polyprenyl diphosphate synthase (IspB) – CoQ1

ddsA

Decaprenyl diphosphate synthase (DdsA or DPS) – CoQ10

ubiA

pHB-polyprenyltransferase (UbiA) – CoQ2

ubiG

O-Methyltransferase (UbiG) – CoQ3

ubiE

C-Methyltransferase (UbiE) – CoQ5

ubiH

Monooxygenase (UbiH) – CoQ6

ubiF

Monooxygenase (UbiF) – CoQ7

ubiB

Monooxygenase (UbiB)

1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A.
TUMEFACIENS
Để sử dụng CoQ10 có hiệu quả hơn cho những ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và
hiểu rõ hơn những đặc tính của CoQ10, việc sản xuất CoQ10 với chi phí thấp là một yêu
cầu cần thiết. Giảm chi phí sản xuất CoQ10 bằng cách tối ưu trong quá trình lên men là các
nghiên cứu cơ bản để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. A. tumefaciens được coi là vi
khuẩn sản sinh CoQ10 đạt hiệu quả cao [16, 31, 99]. Do đó, đã có rất nhiều nghiên cứu về
ảnh hưởng của nguồn cacbon, nguồn nitơ và hàm lượng nitơ, pH và các điều kiện môi
trường khác đến sự sản xuất CoQ10.
1.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon
Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon trong môi trường đóng vai trò quan trọng để
sinh tổng hợp CoQ10. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là đến khả năng sinh
CoQ10 của A. tumefaciens, Ha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng sucrose là nguồn
cacbon có hiệu quả hơn so với fructose, glucose trong sản xuất CoQ10 của chủng đột biến
A. tumefaciens KCCM 10413. Sản phẩm CoQ10 đạt cao nhất (89,5 mg/l) khi sucrose được
sử dụng là nguồn cacbon [34]. Cheong (2008) cũng chứng minh sucrose là nguồn cacbon
hiệu quả nhất trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens KCCM10554 tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được khi tiến hành lên men theo mẻ có bổ sung
đường sucrose trong quá trình lên men tăng gấp 1,26 lần so với lên men theo mẻ gián đoạn
10
Footer Page 19 of 148.


Header Page 20 of 148.

đạt 352 mg/l [16]. Gu và cộng sự (2006) khi tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên
men theo mẻ có bổ sung nguồn cacbon là 15% đường sucrose kết hợp với 33% mật đường
mía của chủng A. tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l sau
96 giờ nuôi cấy tăng gấp 3,5 lần so với lên men gián đoạn [31]. Nhiều công trình nghiên
cứu cũng đã chứng minh đường sucrose là nguồn cacbon hiệu quả cho quá trình lên men
sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [90, 99].
Sử dụng nồng độ cacbon cao trong môi trường lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ vi
khuẩn có thể giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn nhưng có thể hạn chế sự tổng hợp CoQ10
trong canh trường do nồng độ cơ chất cao làm tăng độ nhớt của dịch lên men, giảm hàm
lượng oxy hòa tan trong môi trường. Để khắc phục hiện tượng này, trong môi trường lên
men có thể bổ sung nguồn sucrose ở nồng độ thấp rồi bổ sung dần trong quá trình lên men
đảm bảo đồng thời hai quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10.
1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ
Sinh tổng hợp CoQ10 không chỉ phụ thuộc vào nguồn nitơ mà còn phụ thuộc vào hàm
lượng nitơ được sử dụng. Hiện nay trong lên men sinh tổng hợp CoQ10, ta có thể cung cấp
nitơ bằng cách sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau. Có thể sử dụng nguồn nguyên
liệu nitơ vô cơ hay hữu cơ. Các nguồn nitơ bao gồm cao ngô, cao nấm men, peptone,
trypton, soytone, cao malt, (NH4)2SO4. Tuy nhiên trong quá trình lên men sinh tổng hợp
CoQ10 từ A. tumefaciens nguồn nitơ là cao ngô được đánh giá là có hiệu quả hơn cả. Ha và
cộng sự (2007) khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới hàm lượng CoQ10 của
chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 các nguồn nitơ được lựa chọn là (cao ngô,
cao nấm men, peptone, cao malt, casein, troytone và soytone). Kết quả cho thấy vi khuẩn
sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho hàm lượng CoQ10 và sinh khối tế bào cao nhất lần
lượt là (2,05 mg/ g sinh khối) và (41,8 g/l) so với các nguồn nitơ khác [16, 34]. Gu và cộng
sự (2006) đã sử dụng nguồn nitơ là 4% cao ngô trong quá trình lên men chủng A.
tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l [31]. Cũng có nhiều
công trình nghiên cứu sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho quá trình lên men sinh tổng
hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [90, 99, 101].
Nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 cũng được sử dụng trong nuôi cấy tổng hợp
CoQ10. Một số các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa các nguồn nitơ khác nhau trong

sinh tổng hợp CoQ10. Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, peptone, cao ngô
thì (NH4)2SO4 cũng được sử dụng là nguồn nitơ vô cơ kết hợp cho sinh tổng hợp CoQ10.

11
Footer Page 20 of 148.


Header Page 21 of 148.
Nuôi cấy trong điều kiện lên men gián đoạn 5 lít CoQ10 từ A. tumefaciens 1.2554 đạt
20,62 mg/l khi kết hợp cao ngô với (NH4)2SO4 [99, 101].
1.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn khoáng
Trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 sử dụng A. tumefaciens ta phải cung
cấp các nguyên tố đa lượng và vi lượng để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn. Các nguyên
tố đa lượng cho sinh tổng hợp CoQ10 trong vi khuẩn thường sử dụng là S, P, K, Ca, Mg.
Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của vi khuẩn. Phospho tham gia
cấu tạo nên nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào vi khuẩn. Lưu huỳnh tham gia
vào thành phần một số axit amin. Kali tham gia vào quá trình trao đổi gluxit. Mg2+ mang
tính chất là một cofactơ đối với nhiều enzyme, nó tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng
80 enzyme trong tế bào (enzyme thủy phân, enzyme oxy hóa khử...). Canxi chiếm khoảng
vài phần trăm trong phần khoáng của tế bào vi khuẩn. Canxi không tham gia vào thành
phần các chất hữu cơ nhưng nó đóng vai trò trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng
(như giữa các nucleotit, protein, axit nucleic). Trong nuôi cấy vi khuẩn để tổng hợp CoQ10
các nguyên tố khoáng đa lượng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng các muối
vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCO3...[16, 90, 99, 101].
1.4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Trong môi trường nuôi cấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp
CoQ10. Thông thường A. tumefaciens được nuôi cấy ở nhiệt độ 25o-35oC là nhiệt độ thích
hợp cho sinh tổng hợp CoQ10. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn 35oC hoặc thấp hơn 25oC
thì sinh trưởng chậm dẫn đến hàm lượng CoQ10 bị giảm [16, 34, 101].
Nhiệt độ tối ưu trong sự tổng hợp CoQ10 của chủng đột biến A. tumefaciens KCCM

10413 là 32oC. Khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ở 25oC, 28oC, 30oC, 32oC, 35oC, kết quả
cho thấy tại 32oC trọng lượng sinh khối tế bào, hàm lượng CoQ10, nồng độ CoQ10 cao
nhất tương ứng là (32,4 mg/l, 6,90 mg/ g sinh khối, 223 mg/l). Từ 25 – 32oC tế bào tăng
trưởng và hàm lượng CoQ10 được cải thiện đáng kể [34]. Cũng theo Cheong (2008) nhiệt
độ tối ưu trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens KCCM-10554
tái tổ hợp là 32oC hàm lượng CoQ10 thu được sau 96 giờ lên men gián đoạn đạt 280 mg/l
[16]. Tian (2010) trong quá trình nghiên cứu các phương pháp tách chiết CoQ10 đã tiến
hành lên men chủng A. tumefaciens 1.2554 trong điều kiện nhiệt độ 28oC [90, 101]. Theo
Yoshida (1998) nhiệt độ lên men chủng A. tumefaciens KY-3085 (ATCC4452) là 30oC
hàm lượng CoQ10 đạt 180 mg/l sau 58 giờ lên men gián đoạn [99].
12
Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.
1.4.5. Ảnh hƣởng của pH
Điều kiện pH có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở
A. tumefaciens. Hàm lượng CoQ10 thu được là lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy các chủng
A. tumefaciens trong điều kiện pH từ 7 – 7,5. Ha và cộng sự tiến hành nuôi cấy chủng đột
biến A. tumefaciens KCCM 10413 trong điều kiện pH từ 6 - 8 hàm lượng CoQ10 tại pH
7.0 (7,04 mg/ g sinh khối) cao hơn tại pH 7,5 (5,43 mg/g sinh khối). Tại pH 8,0 hàm lượng
CoQ10 giảm đi 4,11 mg/ g sinh khối. Tại pH 6,0 trọng lượng sinh khối và hàm lượng
CoQ10 giảm đi tương ứng là 24 g/l và 6.58 mg/g sinh khối. Sản phẩm CoQ10 cao nhất tại
pH 7,0 và giảm dần tại pH axit và pH kiềm [34]. Yoshida (1998) cũng tiến hành lên men
chủng A. tumefaciens KY-3085 (ATCC4452) tại pH 7,0. Trong khi đó, Tian (2010) và
Yuan (2012) đã tiến hành lên men chủng đột biến A. tumefaciens PK38 tại pH 7,2 [90,
101] .
1.4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ oxy hòa tan
Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan tới trọng lượng sinh khối tế bào và hàm lượng
CoQ10 của chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 được nghiên cứu thực hiện trong

96 giờ. Nồng độ oxy hòa tan được kiểm soát tại 0-10, 10-20, và 20-30% được điểu chỉnh
bằng tốc độ khuấy từ 500-900, 500-1,000 và 500-1,100 rpm. Kết quả cho thấy, ban đầu thì
nồng độ DO chưa được kiểm soát nhưng sau 24 giờ nuôi cấy, nồng độ DO được giới hạn
từ 0-10, 10-20, và 20-30% bằng cách điều chỉnh tốc độ khuấy. Trọng lượng sinh khối tế
bào của quá trình nuôi cấy khi chưa kiểm soát nồng độ DO là 36,5 g/l sau 24 giờ và không
tăng thêm nữa. Khi nồng độ DO tăng lên hàm lượng CoQ10 cũng tăng, tuy nhiên trọng
lượng sinh khối tế bào (48,4 g/l) và sản phẩm CoQ10 (320 mg/l) cao nhất tại nồng độ DO
từ 0-10% [34]. Cheong (2008) đã tiến hành nghiên cứu tốc độ khuấy và cấp khí ảnh hưởng
tới quá trình lên men chủng A. tumefaciens tái tổ hợp đã nhận thấy rằng tại tốc độ khuấy
500 (rpm), cấp khí 1.0 (vvm) hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt 250,4 mg/l [16].

13
Footer Page 22 of 148.


Header Page 23 of 148.

1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10
Lên men là quá trình phức tạp với nhiều yếu tố ảnh hưởng khác nhau, trong đó quá
trình sinh trưởng và quá trình hình thành sản phẩm không chỉ bị ảnh hưởng bởi các thông
số trong môi trường mà đặc biệt còn bị ảnh hưởng bởi kỹ thuật quá trình lên men, bao gồm
dạng thức lên men, chế độ cấp dinh dưỡng, tốc độ thông khí, tốc độ khuấy trộn...[57]
Có hai kỹ thuật lên men chính trong sinh tổng hợp CoQ10 ở vi khuẩn, đó là lên men
gián đoạn và lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng. Tùy theo đặc điểm từng quá trình,
nhằm kiểm soát tốt hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm.
1.5.1. Lên men gián đoạn
Quá trình lên men trên môi trường lỏng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm thành
phần môi trường, mức độ và hình thức thông khí, tốc độ khuấy, nồng độ oxy hòa tan, điều
kiện nuôi...
Hệ thống lên men gián đoạn là một hệ thống khép kín, tại đó các chất dinh dưỡng cần

thiết được cung cấp cho sự phát triển của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm ngay từ
đầu quá trình lên men. Vi sinh vật sau khi được cấy vào hệ thống lên men sẽ tăng trưởng
và phát triển. Hệ thống lên men có thể được kiểm soát các thông số như: nhiệt độ, oxy, pH.
Trong hệ thống lên men gián đoạn, mọi thông số của quá trình lên men đều biến động:
nồng độ cơ chất, nồng độ gam sinh khối, nồng độ sản phẩm...[57]. Tuy vậy, lên men gián
đoạn dễ kiểm soát và thường phải sử dụng khi quá trình yêu cầu phải tiệt trùng nghiêm
ngặt. Trong quá trình lên men gián đoạn chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 hàm
lượng CoQ10 thu nhận được là 320 mg/l, hiệu suất đạt 6,61 mg/g sinh khối [34]. Cheong
và cộng sự lên men gián đoạn chủng A. tumefaciens tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được
là 280,2 mg/l, hiệu suất đạt 5,47 mg/g sinh khối [16].
1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed – batch)
Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – bath) hay còn gọi là lên men bán
liên tục là dạng lên men nằm giữa lên men gián đoạn và lên men liên tục. Trong lên men
dạng này, quá trình lên men được khởi động tương tự như lên men gián đoạn, sau một thời
gian nhất định, chất dinh dưỡng sẽ được bổ sung vào trong hệ thống lên men. Fed-batch có
thể được thực hiện nhiều cách khác nhau: thay thế hoàn toàn môi trường dinh dưỡng của
canh trường (tiến hành lên men đạt đến mức độ nhất định-bao gồm dinh dưỡng trong môi
trường được tiêu thụ - môi trường cũ sẽ được rút ra và thay vào đó môi trường mới với đầy

14
Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.
đủ các chất dinh dưỡng mới; hoặc bổ sung thêm vào hệ thống lên men chất dinh dưỡng
mới nhằm mục đích giữ cho sinh khối của vi sinh vật trong hệ thống lên men ở trạng thái
ổn định khi sinh khối tế bào đạt đến một giới hạn nhất định nào đó. Chiến lược này cho
phép vi sinh vật phát triển với một tốc độ tăng trưởng như mong muốn, hạn chế tối đa sự
tạo thành các sản phẩm phụ không mong muốn, và cho phép đạt được mật độ tế bào cao và
nồng độ sản phẩm lớn. Trong quá trình lên men chủng đột biến A. tumefaciens KCCM

10413, đường sucrose được bổ sung trong lên men bán liên tục làm tăng hàm lượng
CoQ10 (458 mg/l) so với lên men gián đoạn là 320 mg/l [34]. Đối với A. tumefaciens tái
tổ hợp quá trình lên men fed-batch có bổ sung đường sucrose cho CoQ10 đạt 352,6 mg/l
gấp 1,25 lần so với quá trình lên men gián đoạn đạt 280,2 mg/l [16]. Trong khi đó chủng E.
coli tái tổ hợp có chứa gen dps mã hóa cho decaprenyl diphosphatte synthase từ
Gluconobacter suboxydans trong quá trình lên men gián đoạn có bổ sụng đường glucose
cho hàm lượng CoQ10 vượt trội so với lên men gián đoạn (25,5 mg/l so với 0,97 mg/l)
[73].
Vì vậy, lên men fed-batch vượt trội hơn so với lên men gián đoạn, vì nó cho phép duy
trì được mật độ tế bào mong muốn và sản xuất sản phẩm lớn mà không tạo ra các sản phẩm
ức chế cho quá trình lên men.

1.6. TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10
1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10
1.6.1.1. Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác
nhân cơ học
 Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm
Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng A. tumefaciens 1.2554 theo quy
trình: sinh khối sau ly tâm bổ sung đệm 2mM Tris HCl (pH 7.5), tiến hành siêu âm (12
giây on, 10 giây off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút. Thể
tích nước sử dụng là 40 mL/g sinh khối. Bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha
trên, lặp lại bước chiết 2 lần. Tiến hành làm khô, hòa tan CoQ10 trong 100% ethanol [90].
 Phá vỡ tế bào bằng hạt thủy tinh
Yoshida cũng tiến hành thu nhận CoQ10 từ 3 chủng vi khuẩn A. tumefaciens Y3085 (ATCC4452), P. denitrificans KY-3940 (ATCC19367) và R. sphaeroides KY-4113
(FERM-P4675) bằng phương pháp như sau: 5 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật bổ sung 6 ml n15
Footer Page 24 of 148.


Header Page 25 of 148.
propanol, 10 ml n-hexane và 5 g hạt thủy tinh được khuấy trộn 15,000 rpm trong 5 phút để

chiết xuất CoQ10 từ tế bào. Chiết xuất 2 lần bằng 3 ml hexane, làm khô và hòa tan trong
dioxane [99].
1.6.1.2. Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào không bằng
tác nhân cơ học


Tách chiết bằng dung môi
Prafull Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng

Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490. 20 ml dịch nuôi được ly tâm 1000 vòng/phút trong
20 phút để thu sinh khối. Để chiết CoQ10, sinh khối được bổ sung 20 ml 100% ethanol lắc
trong nước 60oC trong 3 giờ. Tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch,
ethanol được chiết lại với 20 ml n-hexane. Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc
tới 1 ml và đưa vào sắc ký để định lượng [75].
Narendra và cộng sự tiến hành thu nhận CoQ10 từ S. cerevisiae như sau: sinh khối
ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ lệ (1:5) ở 60oC trong 1 giờ. Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng nhexane [66].
Theo Kiên (2010) CoQ10 từ R. sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương
pháp sau: 10 g sinh khối ướt được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55oC trong 5 phút. Bổ sung
140 ml chloroform và khuấy ở 30oC trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc (Whatman
no.1). Bổ sung NaCl (0.58%, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịch lọc. Dịch lọc và dung dịch
muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới, làm khô và hòa tan lại trong ethanol [67].


Tách chiết bằng axit kết hợp với dung môi
CoQ10 được tách chiết từ S. pombe theo phương pháp biến đổi của Cheng và cộng

sự. Các tế bào được xử lý với 3M HCl, khuấy ở 90oC trong 80 phút. Sau khi bổ sung dung
dịch NaOH để duy trì pH 7, tế bào được chiết ở nhiệt độ phòng trong 2,5 giờ với acetone.
Hỗn hợp này được ly tâm và thu pha trên, làm khô bằng bay hơi chân không ở 30oC. Hòa
tan CoQ10 trong petroleum ether [15].

Tian (2010) cũng tiến hành nghiên cứu phá vỡ tế bào bằng axit HCl. Thí nghiệm
được thực hiện như sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung axit HCl 3M với tỷ lệ 10.8 ml/g sinh
khối, ủ 85oC trong 35 phút. Bổ sung petroleum ether (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), vortex thu
pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần. Tiến hành làm khô, hòa tan CoQ10 trong ethanol [90].

16
Footer Page 25 of 148.