Nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối tượng cây Xoan ta (Melia azedazach L.) bằng công nghệ gen thực vật

Header Page 1 of 148.

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Biến đổi khí hậu ngày càng diễn ra mạnh mẽ là nguyên nhân làm tăng những
bất lợi từ môi trƣờng, ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nhiều loài cây
trồng. Do sự thay đổi khí quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm
dần lên, băng tan ở hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp. Lũ lụt, hạn hán và
sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến phát triển
nông lâm nghiệp. Để thích ứng với những biến đổi khí hậu và những hệ quả của
chúng, chiến lƣợc chung của ngành nông lâm nghiệp là ƣu tiên tạo ra những giống
cây trồng chống chịu đƣợc khô hạn, mặn, ngập úng, lạnh và chống chịu với đất có
vấn đề nhƣ acid, thiếu lân, ngộ độc sắt, ngộ độc nhôm.
Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập
úng, nhiệt độ cực đoan thƣờng làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh
hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của nhiều loài cây trồng (Linhui
et al., 2012). Một trong những phản ứng thƣờng gặp nhất khi cây gặp các điều kiện
bất lợi về nƣớc đó là tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa nhƣ các
loại đƣờng tan, axít amin, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu cho tế bào. Proline
và glycine betaine đƣợc biết đến là một trong những chất đóng vài trò quan trọng
trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các
điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, mặn, lạnh (Sávio et al., 2012). Trong tế bào thực vật,
glycine betaine (GB) đƣợc tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tiếp
đƣợc xúc tác bởi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde
dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al., 1997). Cũng giống nhƣ thực vật
bậc cao, ở vi khuẩn E. coli và ở một số động vật, con đƣờng sinh tổng hợp GB cũng
trải qua hai bƣớc là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine
aldehyde thành GB (Takabe et al., 1998). Ngƣợc lại, con đƣờng sinh tổng hợp GB ở
vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens lại rất đơn giản, từ

choline chuyển hóa thành sản phẩm trực tiếp là GB chỉ cần xúc tác bởi choline
oxydase (COD) (Ikuta et al., 1977). Sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể
đƣợc thực hiện qua hai con đƣờng hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine. Con đƣờng
sinh tổng hợp proline từ glutamate đƣợc chứng minh đầu tiên ở vi khuẩn bởi
Leisinger (Leisinger, 1987) và sau đó là ở nhiều loài sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.

2

khác nhau. Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ đƣợc xác định sau khi các nhà
khoa học thành công trong việc phân lập đƣợc đoạn cDNA của gen mã hóa cho
enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992). P5CS là một
enzyme giữ hai chức năng, thứ nhất enzyme hoạt hóa glutamate trở thành dạng hoạt
động là glutamic semialdehyde và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra
pyrroline-5-carboxylate. Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi
enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo proline.
Từ những hiểu biết sâu sắc về con đƣờng sinh tổng hợp glycine betaine và
proline ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc
biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các
gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR
từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng
hợp GB và proline. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc
hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến
đổi gen tăng cƣờng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng (Amudha
& Balasubramani, 2011). Các kết quả công bố cho thấ y : Cây Arabidopsis thaliana
chuyể n gen codA,COX, GSMT/SDMT tăng cƣờng khả năng chiụ la ̣nh , nhiê ̣t đô ̣ cao,

chịu mă ̣n và băng giá (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998;
Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000), cây cải be ̣ (Brassica juncea) chuyể n gen
codA có khả năng chiụ mă ̣n tố t hơn cây đố i chƣ́ng (Waditee et al., 2005). Tƣơng tự,
cây lúa (Oriza sativa) chuyển gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hồng,
cây bạch đàn chuyể n gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chiụ la ̣nh , hạn, mă ̣n và
oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et
al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al., 2009). Cây thuốc
lá chuyển gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998;
Yang et al., 2008), cây cà rốt chuyển gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và
ngô chuyển gen betA (Lv et al., 2007; Quan et al., 2004a, 2004b) cũng đã đƣợc
chứng minh là chống chịu tốt hơn với các điều kiện cực đoan của môi trƣờng. Kết
quả nghiên cứu chuyển gen P5CS, P5CR,  -OAT tham gia sinh tổng hợp proline
vào cây thuốc lá, lúa nƣớc, lúa mì, cà rốt, chanh, đậu tƣơng, Arabidopsis cho thấy
cây chuyển gen chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trƣờng sống bị mặn, hạn, oxy
hóa, nhiệt cao và băng giá (Kavi Kishor et al., 1995; Zhu et al., 1998; Hong et al.,

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

3

2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han &
Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al., 2004).
Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của việc biến
đổi khí hậu, do đó hạn hán và đất nhiễm mặn hoang hóa đang ngày một gia tăng,
đây sẽ là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lƣợng cây
trồng nông lâm nghiệp và thu hẹp diện tích đất canh tác. Vì vậy, viê ̣c triể n khai các
nghiên cƣ́u nhằ m ta ̣o ra đƣơ ̣c các giố ng cây trồ ng nông lâm nghiệp có khả năng

chố ng chiụ đƣơ ̣c các điề u kiê ̣n bấ t lơ ̣i của môi trƣờng nhƣng vẫn đảm bảo đƣơ ̣c
năng suấ t và chấ t lƣơ ̣ng tố t đang là vấ n đề cấ p bách và cầ n thiế t nhấ t hiê ̣n nay. Trên
thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng chống chịu các điều
kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập chung vào nhóm cây nông nghiệp, còn nhóm
cây lâm nghiệp (cây gỗ) mới chỉ có một vài công trình công bố (Yu et al., 2009, Yu
et al., 2010). Trong lâm nghiệp, cây dƣơng (Populus sp.) đƣợc sử dụng nhƣ là cây
mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen. Tuy nhiên, hạn chế duy nhất của loài cây
này đó là khó sinh trƣởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam. Vì vậy, việc tìm
kiếm một loài cây dễ thích ứng và phổ biến ở Việt Nam để làm cây mô hình cho các
nghiên cứu theo hƣớng quan tâm trên đối tƣợng cây lâm nghiệp trở nên rất cần thiết.
Cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến
lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Nó có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp,
trong đó 3 vùng: Vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam
Trung bộ Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển
theo quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ trƣởng Bộ
NN&PTNT. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu trong việc xây dựng
phƣơng pháp chuyển gen ở đối tƣợng cây Xoan ta là rất có triển vọng (Bui Van
Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010)
cho phép các nhà khoa học có thể tiến hành các nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt
là nâng cao tính chống chịu của loài cây này và có thể sử dụng nhƣ một loài cây mô
hình cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam. Xuấ t phát tƣ̀
nhƣ̃ng lý do nêu trên, chúng tôi đã tiế n hành thƣ̣c hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu tăng
cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trên đối
tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật”.

Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

4

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2.1. Mục tiêu chung:
Thông qua công nghệ chuyển gen để nghiên cứu khả năng tăng cƣờng tính
chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi trên đối tƣợng cây Xoan ta nhằm bổ
sung thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tạo giống cây trồng lâm nghiệp có
khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng bất lợi.
2.2. Mục tiêu cụ thể:
(1) Xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao để làm
công cụ nghiên cứu;
(2) Đánh giá đƣợc hoạt động của promoter rd29A cảm ứng hạn ở các dòng Xoan ta
chuyển gen;
(3) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen P5CS đột
biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngƣợc (P5CSm);
(4) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn, mặn của các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển
gen codA.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta thông qua
Agrobacterium tumefaciens;
(2) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A::gus intron và đánh
giá hoạt động của promoter rd29A điều khiển biểu hiện gen gus trong điều kiện bình
thƣờng và xử lý hạn nhân tạo;
(3) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A:: P5CSm và đánh
giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý
hạn nhân tạo;

Footer Page 4 of 148.

Header Page 5 of 148.

5

(4) Tạo các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen 35S::TPcodA/35S::codA và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển
gen trong điều kiện xử lý hạn, mặn nhân tạo.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới xây dựng
đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua
Agrobacterium tumefaciens. Luận án là công trình đầu tiên tạo đƣợc các dòng cây
Xoan ta chuyển gen P5CSm/codA và chứng minh đƣợc khả năng tăng cƣờng tính
chịu hạn và chịu mặn ở các dòng cây chuyển gen. Luận án cũng là công trình đầu
tiên sử dụng gen codA đã đƣợc thích ứng mã di truyền ở thực vật để chuyển vào cây
thuốc lá và cây Xoan ta, kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy
hàm lƣợng glycine betaine cao hơn rất nhiều lần so với các công trình công bố trƣớc
đây. Luận án đã góp phần bổ sung thêm cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng
dụng công nghệ chuyển gen trong tạo giống cây trồng nông lâm nghiệp nói chung
và cây Xoan ta nói riêng chống chịu tốt với các điều kiện môi trƣờng bất lợi.

Footer Page 5 of 148.


Header Page 6 of 148.

6

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÁC ĐỘNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI ĐẾN CÂY TRỒNG
Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tại

một chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trình
phát triển. Do đó, khác với động vật, thực vật thƣờng xuyên đối mặt trực tiếp với
các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trƣởng và phát triển.
Những tác động bất lợi từ môi trƣờng có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh
và hình thái; từ đó ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng cây trồng.
1.1.1. Tác hại của hạn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lƣợng
sản phẩm của cây trồng. Khi môi trƣờng hạn hán cây bị stress mất nƣớc dẫn đến
nhiều hậu quả nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013): (i)
Gây nên hiện tƣợng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co nguyên sinh chất
xảy ra khi tế bào bị stress nƣớc làm cho nƣớc trong tế bào thất thoát ra ngoài nên
khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi cây sống
trong môi trƣờng thiếu nƣớc kéo dài, tế bào mất nƣớc dẫn đến các mô trở nên mềm
yếu và sự héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhƣng cũng có thể vĩnh viễn nếu
sự thiếu nƣớc xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trƣờng sống bị
khô hạn cản trở sự vận chuyển nƣớc trong mạch gỗ. Khi thiếu nƣớc do khô hạn sự
cung cấp nƣớc cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nƣớc ban
ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thƣơng lớp ngoài vùng vỏ bị phủ chất sáp
(suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hƣởng đến đẩy cột nƣớc lên cao trong mạch
gỗ. Đặc biệt khi thiếu nƣớc sẽ hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá
vỡ tính liên tục của cột nƣớc nên cột nƣớc trong mạch gỗ không đƣợc đẩy lên liên
tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nƣớc qua
biểu bì. (iv) Sự thiếu nƣớc làm giảm cƣờng độ quang hợp. Khi hàm lƣợng nƣớc

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.

7

trong lá còn khoảng 40 -50% quang hợp của lá bị đình trệ. (v) Đặc biệt, hạn hán cản
trở sự sinh trƣởng của cây trồng. Thiếu nƣớc ảnh hƣởng đến các hoạt động sinh lý,
nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trƣởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng.
1.1.2. Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Đất mặn là loại đất chứa hàm lƣợng muối cao (>0,2%) có nhiều ion độc. Nếu
hàm lƣợng muối trong đất cao, áp suất thẩm thấu của dung dịch đất rất cao, có thể
đạt 200 - 300 atm. Do đất nhiễm mặn có áp suất thẩm thấu cao nên cây không thể
hút đƣợc nƣớc từ môi trƣờng gây nên hiện tƣợng hạn sinh lý. Cây bình thƣờng
không thể sống trong môi trƣờng có áp suất thẩm thấu trên 40 atm. Ngoài ra, trong
đất nhiễm mặn còn chứa nhiều ion độc. Các ion này cạnh tranh với chất dinh dƣỡng
trong quá trình hút của rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dƣỡng dẫn đến cây trồng
sinh trƣởng chậm và giảm năng suất mạnh. Trong đất nhiễm mặn có các muối
NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2,, v.v. các muối này có hàm lƣợng cao trong
đất đều gây độc cho cây. Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây ra rối loạn
các quá trình trao đổi chất của tế bào. Các ion độc sẽ ức chế hoạt động của các
enzyme, các chất điều hòa sinh trƣởng dẫn đến làm rối loạn các quá trình trao đổi
chất và các hoạt động sinh lý bình thƣờng của tế bào. Các ion độc còn làm ảnh
hƣởng bất lợi đến nguyên sinh chất, làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm của nguyên
sinh chất làm cho tế bào mất chất dinh dƣỡng. Các hoạt động sinh lý của tế bào
cũng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng khi cây bị tác động của muối mặn. Quá trình
quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố quang hợp ít do các chất độc ức
chế quá trình tổng hợp các sắc tố quang hợp. Quá trình hô hấp tăng mạnh, các cơ
chất bị phân hủy mạnh nhƣng hiệu quả tạo năng lƣợng thấp do phần lớn năng lƣợng
của các quá trình dị hóa bị thải ra dƣới dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu năng lƣợng
ATP để duy trì các hoạt động bình thƣờng. Phân hủy mạnh, tổng hợp lại yếu nên
không bù đủ lƣợng vật chất do hô hấp phân hủy, dẫn đến các chất dự trữ bị hao hụt
mạnh, do đó cây không sinh trƣởng hoặc sinh trƣởng chậm, còi cọc và năng suất

Footer Page 7 of 148.

Header Page 8 of 148.

8

thấp. Cây sẽ bị chết nếu bị tác động của môi trƣờng nhiễm mặn cao hay nhiễm mặn
trong thời gian dài (Jouyban, 2012).
1.1.3. Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Thực vật là sinh vật biến nhiệt nên nhiệt độ môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến
hoạt động sống của cây. Biên độ nhiệt độ sinh lý của cây khoảng 1 – 45oC. Stress
nhiệt do nhiệt độ môi trƣờng xung quanh cao là một mối đe dọa nghiêm trọng đối
với cây trồng sản xuất trên toàn thế giới (Hall, 2001; Harrison et al., 2011). Nhiệt độ
cao gián đoạn hoặc liên tục là nguyên nhân gây ra một loạt thay đổi về hình thái giải
phẫu, sinh lý và sinh hóa ở thực vật, ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng và phát triển của
thực vật và có thể dẫn đến suy giảm sản lƣợng.
Sự tiếp xúc của thực vật tới nhiệt độ cao, hạt giống có thể đẩy nhanh quá trình
lão hóa, làm giảm sự đậu quả, trọng lƣợng hạt giống và làm giảm năng suất. Điều
này là do thực vật có xu hƣớng chuyển hƣớng các nguồn năng lƣợng để chống lại
stress do nhiệt và do đó hạn chế sinh trƣởng và sinh sản. Một ảnh hƣởng khác của
stress do nhiệt cao cho nhiều loài thực vật là gây ra vô sinh khi nhiệt cao tác dụng
ngay trƣớc hoặc trong khi nở hoa. Cây họ đậu đặc biệt nhạy cảm với stress do nhiệt
ở giai đoạn nở hoa, chỉ có một vài ngày tiếp xúc với nhiệt độ cao (30 – 35oC) có thể
gây ra tổn thất nặng cho năng suất thông qua giảm lƣợng hoa hoặc tình trạng không
phát triển đầy đủ của vỏ quả. Ở nhiệt độ rất cao gây tổn thƣơng tế bào nghiêm trọng
và thậm chí làm cho tế bào bị chết trong vòng vài phút, dẫn đến sự sụp đổ nhanh
chóng của các tổ chức tế bào (Schoffl et al., 1999). Ở nhiệt độ cao vừa phải, tổn
thƣơng hoặc chết chỉ có thể xảy ra sau khi tiếp xúc lâu dài. Tổn thƣơng trực tiếp do
nhiệt độ cao bao gồm sự biến tính protein và sự kết tụ, tăng tính lƣu động của màng
lipid. Tổn thƣơng gián tiếp hoặc tổn thƣơng nhiệt chậm hơn bao gồm bất hoạt các

enzyme trong lục lạp và ty thể, ức chế tổng hợp protein, suy thoái protein và màng
tế bào mất tính linh hoạt (Howarth, 2005).

Footer Page 8 of 148.


Header Page 9 of 148.

9

Stress nhiệt cao cũng ảnh hƣởng đến tổ chức của các cấu trúc vi ống bằng
cách chia tách và/hoặc kéo dài của chúng, hình thành các thể sao hình ống trong các
tế bào phân bào và kéo dài của vi ống hạt vách. Tổn thƣơng này cuối cùng dẫn tới
ức chế sự tăng trƣởng, giảm dòng ion, tạo ra hợp chất độc hại và các loại ôxy phản
ứng (reactive oxygen species = ROS) gây độc cho tế bào (Howarth, 2005).
Sinh trƣởng của cây trồng giảm sút là kết quả chính của việc cây sinh trƣởng
trong điều kiện nhiệt độ cao. Nguyên nhân chủ yếu là do nhiệt độ cao làm giảm
năng suất quang hợp, năng lƣợng tạo ra giảm sút nghiêm trọng. Có giả thiết cho
rằng trong các phản ứng của pha sáng, nhiệt độ của lá tăng lên do việc tổng hợp
ATP liên tục (bằng quá trình vận chuyển điện tử có tính chu trình) cho đến khi cân
bằng với lƣợng ATP tiêu thụ (Bukhov et al., 1999). Trong các phản ứng pha tối của
quá trình quang hợp, sự hoạt hóa Rubisco trong chu trình Calvin đã đƣợc xác định
nhƣ là bƣớc trung gian, sự hoạt hóa này bị ức chế ở 35–40◦C dẫn đến việc giảm tiêu
thụ CO2 và giảm tạo ra các carbohydrates (Dubey, 2005; Wahid et al., 2007). Trong
ty thể, điều kiện bất lợi thông thƣờng sẽ là nguyên nhân phá hủy NAD+, ATP tiêu
thụ vƣợt trội và việc hô hấp sẽ tăng lên. Việc phá vỡ NAD+ một phần do nguyên
nhân của việc tăng cƣờng hoạt động của poly(ADP-ribose) polymerase (PARP),
chất sử dụng NAD+ nhƣ là cơ chất để tổng hợp ADP-ribose. Quá trình poly(ADP)
ribosyl hóa này là quá trình điều hòa sau dịch mã của các protein nhân, là bƣớc
đƣợc khởi đầu bởi sự oxi hóa và các dạng khác của việc phá hỏng DNA. Sự suy yếu

gây ra bởi điều kiện bất lợi mang lại sự suy yếu của năng lƣợng khi mà các phân tử
ATP đòi hỏi để tái tổng hợp NAD+ (Zidenga, 2005). Cuối cùng, có thể nói rằng
việc chống chịu nhiệt độ của cây là một quá trình tiêu tốn nhiều năng lƣợng nội bào
đáng kể để đối phó nhiệt độ cao. Nói chung các phản ứng đó làm suy yếu năng
lƣợng và tăng cƣờng sản xuất ROS, rốt cuộc có thể gây chết tế bào, mô và cả cơ thể
(De Block et al., 2005).

Footer Page 9 of 148.


Header Page 10 of 148.

10

1.1.4. Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng
Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trƣờng vẫn đủ nƣớc do nhiệt
độ thấp ức chế sự hút nƣớc của hệ rễ và sự vận chuyển nƣớc của hệ mạch. Nhiệt độ
thấp cũng gây ức chế quá trình quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế các quá
trình tổng hợp nhất là tổng hợp các phân tử protein do các enzyme hoạt động yếu. Ở
nhiệt độ thấp làm cho màng nguyên sinh chất bị tổn thƣơng dẫn đến tăng tính ngoại
thấm nên thất thoát chất dinh dƣỡng của tế bào ra bên ngoài. Nhiệt độ thấp ảnh
hƣởng đến cấu trúc và chức năng của hệ rễ. Sự hút nƣớc và chất khoáng bị giảm
mạnh làm cho cây thiếu nƣớc và chất dinh dƣỡng. Nhiệt độ thấp còn làm tổn hại
màng lục lạp, ty thể dẫn đến ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các quá trình sinh lý của
cây nhƣ quá trình quang hợp, hô hấp. Nói chung nhiệt độ thấp làm giảm mạnh sinh
trƣởng, năng suất và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng (Gulzar et al., 2011).
1.1.5. Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện môi trƣờng bất lợi
Các yếu tố cực đoan nhƣ nhiệt độ cao, băng giá, ánh sáng, oxy hóa,v.v.
thƣờng tác động lên lá. Hạn, úng và mặn muối thƣờng tác động lên bộ rễ. Các yếu
tố cực đoan thƣờng gây ra diện rộng về các phản ứng của thực vật, từ việc thay đổi

biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến
tốc độ sinh trƣởng và năng suất cây trồng. Những biến đổi lớn liên quan đến mức độ
sinh trƣởng và trao đổi chất khi gặp các yếu tố cực đoan của môi trƣờng sẽ làm thay
đổi sự biểu hiện của gen. Điều đó bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào,
lan truyền tín hiệu này trong tế bào và tiếp sau đó lan truyền khắp cơ thể sinh vật.
Sự biểu hiện của các gen phản ứng đối với các yếu tố cực đoan thể hiện đầu tiên là
ở mức độ tế bào, sau đó đến mức độ toàn bộ cơ thể, tiếp theo là sự thay đổi về hình
thái, sinh trƣởng, phát triển và cuối cùng làm ảnh hƣởng đến khả năng tạo năng suất
và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010).
Sự biểu hiện các gen phản ứng với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ
thuộc vào khả năng nhận biết chúng. Bằng chứng là tăng cƣờng các chất điều khiển

Footer Page 10 of 148.


Header Page 11 of 148.

11

những phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan nhƣ xuất hiện abscisic
acid (ABA), jasmonic acid (JA), ethylene, sau đó xuất hiện các phản ứng thứ cấp
nhƣ xuất hiện Ca2+ (Shinozaki et al., 2007). Mức độ biểu hiện của một số gen tăng
hẳn lên, một số khác yếu hẳn đi. Điều hòa việc biểu hiện các gen này khi gặp các
yếu tố cực đoan của môi trƣờng đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm
nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trƣớc khi phiên mã, sau phiên mã, dịch mã,
sau dịch mã và từng bƣớc làm sáng tỏ dần cơ chế phân tử liên quan đến tích chống
chịu các điều kiện cực đoạn của thực vật. Nhƣ vậy, khi gặp các yếu tố cực đoan đột
ngột, thực vật phải điều chỉnh để thích ứng với sự thay đổi môi trƣờng sống nhằm
kéo dài khả năng tồn tại, sinh trƣởng và phát triển. Phản ứng của thực vật khi gặp
điều kiện nhƣ hạn, mặn, v.v. gây mất nƣớc tế bào, chúng thƣờng tăng cƣờng biểu

hiện các gen liên quan đến tổng hợp các chất thứ cấp nhƣ các loại đƣờng tan,
proline, glycine betaine, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào (Khan et
al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009) hoặc biểu hiện các gen mã hóa cho các
protein chịu hạn, mặn nhƣ protein LEA (Porcel et al., 2005). Đối với hiện tƣợng
nhiệt độ cao, chúng sẽ tăng cƣờng mức độ biểu hiện các gen mã hóa cho các protein
sốc nhiệt (Hsp – heat shock protein) (Simões-Araújo et al., 2003).
Thời gian, mức độ khốc liệt của các yếu tố cực đoan ảnh hƣởng khác nhau đến
khả năng phản ứng của cây trồng. Hiện tƣợng mất nƣớc cục bộ chỉ gây thiệt hại cho
một nhóm nhỏ, nhƣng hạn hán, nhiễm mặn kéo dài sẽ gây thiệt hại cho nhiều loài cây
trồng trên một vùng rộng lớn, ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm cây
trồng (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Ngoài ra, các cơ quan, các mô tế bào khác nhau
sẽ phản ứng với các yếu tố cực đoan không giống nhau. Các loài thực vật khác nhau
sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ
thuộc vào bản chất di truyền (hệ gen) của chúng. Vì vậy, khi đối mặt trực tiếp với các
yếu tố bất lợi của môi trƣờng có loài cây có thể chống chịu đƣợc để tồn tại, sinh
trƣởng và phát triển, có loài cây sẽ bị chết. Ngay trong cùng một loài cây, các cá thể
khác nhau cũng có mức độ phản ứng khác nhau với yếu tố cực đoan của môi trƣờng
(Buchanan et al., 2000).

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.

12

1.2. TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI CỦA
THỰC VẬT
1.2.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi
Điều kiện bất lợi từ môi trƣờng sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học

nhƣ mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về
hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hƣởng xấu đến sự sinh
trƣởng và phát triển của thực vật. Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn, nhiều loài
thực vật có các chiến lƣợc đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Sự
phản ứng của cơ thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng loài, kiểu
gen, thời gian tác động và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn
phát triển, dạng đặc thù của các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng.
Khi bị tác động bởi các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, thực vật sẽ tạo ra một số chất
kích thích, protein giải độc hoặc hoormon giúp chúng có khả năng thích ứng.
Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi
trƣờng ở thực vật đang đƣợc tập trung vào hƣớng nghiên cứu làm tăng cƣờng các
chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nƣớc. Sự
tăng cƣờng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đƣợc phát hiện trong nhiều
trƣờng hợp môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn hán, muối mặn và lạnh giá (Khan et al.,
2009; Szabados & Savoure´, 2009). Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một
đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nƣớc do lạnh, muối hoặc hạn. Những
thực vật sống trong môi trƣờng thiếu nƣớc bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu
trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó.
Một trong những phƣơng thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp
suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự
xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan tƣơng tích, protein hoặc các axít amin đặc
hiệu (Ashraf et al., 2009). Hiện tƣợng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nƣớc.
Sự tích lũy các chất này không làm ảnh hƣởng đến hoạt động bình thƣờng của các
enzyme nội bào. Ngƣợc lại, sự tích lũy lƣợng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ
điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và
lấy nƣớc vào tế bào. Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản
ứng hóa sinh, tƣơng tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy
màng tế bào và các phức hệ protein. Về mặt hóa học, chúng thƣờng là những phân

Footer Page 12 of 148.

Header Page 13 of 148.

13

tử trung hòa về điện, có kích thƣớc rất nhỏ, đóng vai trò quan trọng giúp các phân
tử protein và màng tế bào chống lại sự biến tính dƣới tác động của các điều kiện bất
lợi phi sinh học (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Chất bảo vệ áp suất thẩm thấu hay
các chất hòa tan tƣơng thích đƣợc chia làm 4 nhóm chất sau đây: (1) glycine betaine
(là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của axít amin), (2) proline và ectoine (axít amin),
(3) polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đƣờng) và (4) các loại
đƣờng tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol.
Glycine betaine, proline và các nhóm đƣờng thực hiện chức năng nhƣ các
chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất nƣớc. Quá trình này
liên quan đến một số enzyme chức năng đã đƣợc phân lập và phân tích về mặt sinh
hóa nhƣ các enzyme chủ chốt tham gia sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất điều
hòa áp suất thẩm thấu, các enzyme giải độc và các loại protease khác. Protein vận
chuyển nƣớc qua màng, chất vận chuyển các đƣờng đơn, proline và glycine betaine
đƣợc xem nhƣ có chức năng chuyển nƣớc, proline, glycine betaine, các chất đƣờng
đơn qua màng nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu
khi gặp điều kiện môi trƣờng cực đoan.
1.2.2. Cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi
Dƣới tác động của yếu tố cực đoạn của môi trƣờng, đầu tiên tế bào thực vật sẽ
nhận biết tín hiệu, cảm ứng với điều kiện môi trƣờng, tiếp đến tổng hợp các hormone
nhƣ ABA, sau đó hoạt hóa các yếu tố phiên mã – TF (transcrition factor). Phần lớn các
protein cảm ứng với ABA đƣợc xếp vào nhóm RAB. Tuy nhiên, có một số gen có thể
biểu hiện trong điều kiện thiếu ABA. Đa số các gen cảm ứng điều kiện môi trƣờng bất
lợi đều đáp ứng với xử lý ABA ngoại sinh, một số khác thì không (Ingram & Barttels,
1996; Shinozaki et al., 1997). Vì vậy, sự biểu hiện gen liên quan đến các đặc tính

chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi không chỉ có các con đƣờng phụ thuộc ABA
mà còn có cả các con đƣờng độc lập ABA (không phụ thuộc ABA).
ABA là một hormone thực vật, điều chỉnh sự phát triển cây trồng, hạt giống
ngủ, nảy mầm, phân chia tế bào và phản ứng của tế bào với các áp lực môi trƣờng
nhƣ hạn hán, mặn muối, lạnh giá, các tác nhân gây bệnh và bức xạ UV (Ueno, 1998;
Albinsky et al., 1999). ABA thƣờng thấy trong các loài thực vật bậc thấp và bậc cao.
Con đƣờng sinh tổng hợp và dị hóa của ABA đã đƣợc làm sáng tỏ (Zeevaart, 1999).
ABA hoạt động để thực hiện các thay đổi trên nhiều quá trình sinh lý, ví dụ nhƣ

Footer Page 13 of 148.


Header Page 14 of 148.

14

nhanh chóng gây đóng các lỗ khí khổng bằng việc bơm các ion từ tế bào bảo vệ, do
đó hạn chế sự mất nƣớc thông qua sự thoát hơi nƣớc (Hetherington et al., 1998;
Assmann & Shimazaki, 1999) và bằng cách kích hoạt sự biểu hiện gen, đƣợc cho là
để tái lập trình các tế bào để chống chịu đƣợc áp lực do mất nƣớc gây ra (Ingram &
Bartels, 1996; Leung & Giraudat, 1998). Hạt trong giai đoạn phát triển, ABA đạt mức
cao nhất trong giai đoạn phôi muộn khi các protein lƣu trữ và dự trữ dinh dƣỡng, sau
đó giảm dần (Rock & Quatrano, 1995). Khi mô thực vật bị stress (hạn, mặn,v.v.),
mức ABA tăng gấp nhiều, có thể đến 40 lần trong vài giờ và giảm dần sau khi đƣợc
bù nƣớc (Zeevaart, 1999). Các bằng chứng hiện có cho thấy, quá trình này ít nhất là
do sự điều khiển phiên mã của các gen sinh tổng hợp và dị hóa ABA (Cutler et al.,
1997; Qin & Zeevaart, 1999).
Khi gặp điều kiện cực đoan, các gen liên quan đến tính chống chịu thƣờng
biểu hiện với tốc độ nhanh. Bởi vậy, vấn đề khởi động phiên mã cũng nhƣ cấu trúc
của promoter và các protein tham gia vào điều khiển sự biểu hiện gen thông qua

việc nhận biết và hoạt hóa quá trình khởi động đƣợc đặc biệt quan tâm. Trong quá
trình này, có thể đồng thời tham gia của nhiều gen tổng hợp cùng một lúc nhiều loại
protein điều hòa phiên mã cũng nhƣ các protein/enzyme liên quan đến tính chống
chịu. Phần lớn các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn đều cảm ứng với các điều
kiện lạnh, mặn (điều kiện mất nƣớc sinh lý). Sự điều hòa biểu hiện gen đƣợc điều
khiển ở nhiều bƣớc khác nhau, từ trƣớc phiên mã, sau phiên mã và dịch mã. Nhƣng
nhìn chung, kiểu điều hòa cơ bản nhất là ở giai đoạn khởi đầu phiên mã. Gen đƣợc
biểu hiện khi RNA-polymerase có thể liên kết vào vùng promoter (trình tự khởi
động) của nó và tiến hành tổng hợp bản phiên mã mRNA chứa vùng mã hóa của
gen. Mức độ biểu hiện của gen trong tế bào đƣợc xác định bằng mức gắn kết (ái
lực) của RNA-polymerase và các yếu tố phiên mã với promoter.
Promoter hay vùng gen khởi động là trình tự DNA rất cần thiết để biểu hiện
gen. Phần lớn các gen đều đƣợc biểu hiện mạnh hay yếu dƣới sự điều khiển của các
yếu tố phiên mã – TF (transcription factor). TF là các protein có khả năng nhận biết
các trình tự cis đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã. Các đoạn trình tự
cis – yếu tố cis còn đƣợc gọi là các yếu tố điều hòa (regulatory element).
Yếu tố điều hòa phiên mã – TF có rất nhiều loại khác nhau thích hợp với
nhiều loại đoạn trình tự cis, các nghiên cứu ở cây đậu tƣơng cho thấy có trên

Footer Page 14 of 148.


Header Page 15 of 148.

15

1.200 loại TF đặc hiệu cho các loại mô và trong các điều kiện ngoại cảnh môi
trƣờng khác nhau. Trong đó, biết đến có trên 180 loại TF đặc hiệu ở mô rễ liên
quan đến tính chịu hạn, mặn, v.v.. Khoảng 5,9% hệ gen của cây Arabidopsis
mã hóa cho trên 1.500 loại TF (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Các protein tham

gia điều khiển biểu hiện gen có thể có chức năng trong việc phản ứng với các
điều kiện cực đoan nhƣ là protein kinase và các TF. TF có các motif có khả
năng gắn với trình tự DNA nhƣ bZIP (ABI5, ABF và ABREB), MYB, MYC,
CBF4, DREB2, v.v. (Choi, 2000). Các yếu tố cực đoan của môi trƣờng tác
động lên các TF, tiếp theo các TF hoạt hóa khả năng phát hiện và gắn với trình
tự cis trên promoter của gen tạo thành đƣờng truyền tín hiệu phức tạp. Từ sự
nhận biết, cảm ứng với điều kiện môi trƣờng đến việc tổng hợp hormone nhƣ
ABA, sau đó hoạt hóa các TF. Phần lớn các protein cảm ứng với ABA đƣợc
xếp vào nhóm RAB (Choi, 2000). Tuy nhiên, có một số gen có thể biểu hiện
trong điều kiện thiếu ABA. Phụ thuộc vào phản ứng với ABA, những yếu tố
điều hòa trên promoter có thể chia thành 2 loại (hình 1.1): Các yếu tố điều hòa
phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA (Shinozaki et al., 2007).

Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế biểu hiện gen khi thực vật bị tác động bởi điều kiện môi trƣờng bất
lợi (Shinozaki et al., 2007).

Footer Page 15 of 148.


Header Page 16 of 148.

16

1.2.3. Vai trò của proline và con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật
1.2.3.1. Proline đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật
Proline là một trong những axít amin đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất đối
với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật. Ở nhiều loài thực vật khác
nhau hàm lƣợng proline tăng lên rất cao khi gặp các điều kiện môi trƣờng bất lợi nhƣ
hạn, mặn, lạnh, nóng, nồng độ chất kim loại cao, nhiễm các loại bệnh, thiếu dinh
dƣỡng và bị chiếu tia tử ngoại (Hare & Cress, 1997; Saradhi et al., 1995;

Siripornadulsi et al., 2002). Mức độ tích lũy proline ở các loài thực vật khác nhau là
khác nhau và có thể cao hơn 100 lần so với cây sống trong điều kiện bình thƣờng.
Chính vì vậy, sự tích lũy proline đƣợc khẳng định là có vai trò rất quan trọng trong các
cơ chế chống chịu với các điều kiện môi trƣờng bất lợi của thực vật. Proline đƣợc cho
là phản ứng nhƣ một loại chất trao đổi thích ứng và là chất để cây dự trữ nguồn carbon
và nitơ (Hare & Cress, 1997). Proline còn là một chất có chức năng khử các gốc oxy
phản ứng sinh ra trong tế bào khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi oxy hóa (oxidative
stress) (Smirnoff & Cumbes, 1989). Ngoài ra, proline cũng giữ chức năng trong quá
trình ổn định các cấu trúc protein và tạo ra trạng thái cân bằng pH và oxy hóa khử của
tế bào. Với những chức năng của proline nêu trên, nó đƣợc xem là tham gia vào cơ
chế truyền tín hiệu của tế bào trong các đáp ứng thích ứng (Maggio et al., 2002).
Ngoài những chức năng nêu trên, proline còn đóng vai trò quan trọng trong
quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trồng mặc dù proline không phải là một
trong những axít amin không thay thế. Sự tích lũy proline đƣợc xác nhận ở các loại
mô và cơ quan sinh sản của khá nhiều loài cây, bởi vậy proline còn có vai trò trong
quá trình phát triển các loại cơ quan sinh sản ở thực vật. Hai quá trình phát triển đã
đƣợc chứng minh đó là proline tham gia vào quá trình kéo dài cuống hoa và thời
gian nở hoa (Mattioli et al., 2009).
Proline đƣợc xem là một chất thẩm thấu có vai trò bảo vệ các cấu trúc nội
bào và các đại phân tử (DNA, protein) khi tế bào bị tác động bởi các điều kiện bất

Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.

17

lợi về áp suất thẩm thấu (Szabados & Savoure, 2009). Tuy nhiên, sự tích lũy proline
trong tế bào có thể ảnh hƣởng đến khă năng chống chịu của cơ thể thực vật theo

nhiều con đƣờng khác nhau. Hình 1.2 khái quát về vai trò của proline đối với đặc
tính chống chịu ở thực vật.

Hình 1.2: Vai trò của proline ở thực vât (Szabados & Savoure, 2009)

Vai trò của proline nhƣ là một chất định hình phân tử trong việc bảo vệ các
cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính xúc tác của nhiều loại enzyme khác nhau.
Nhƣ là, proline có vai trò ổn định hoạt tính của enzyme M4 lactate dehydrogenase
khi tế bào bị các tác động bất lợi về nhiệt độ; Proline bảo vệ enzyme nitrate
reductase khi tế bào bị các tác động bất lợi về áp suất thẩm thấu và kim loại nặng;
Proline cũng có vai trò ổn định hoạt tính của enzyme ribonuclease và protease
trong điều kiện tế bào bị tác động bởi nồng độ arsen bên ngoài môi trƣờng tăng
cao (Sharma & Dubey, 2005; Mishra & Dubey, 2006). Một số các công trình
nghiên cứu đã chứng minh rằng proline có vai trò nhƣ một chất chống oxy hóa,
với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và làm bất hoạt các gốc oxy tự do
(Matysik et al., 2002). Khi nuôi tế bào nấm men trên môi trƣờng bổ sung proline
cho thấy rằng nồng độ các gốc oxy phản ứng giảm mạnh, nên làm chậm quá trình
gây chết theo chƣơng trình định sẵn của tế bào (Chen & Dickman, 2005). Proline
có thể bảo vệ các tế bào ngƣời chống lại stress oxy hóa gây ung thƣ (Krishnan et

Footer Page 17 of 148.


Header Page 18 of 148.

18

al., 2008) và đối với các tế bào tảo nuôi cấy ở các điều kiện có nồng độ kim loại
nặng cao thì proline có thể làm giảm quá trình phân giải các hợp chất béo (Mehta
& Gaur, 1999). Nghiên cứu ở cây lúa cho thấy proline có vai trò làm giảm độc

tính của thủy ngân thông qua quá trình phân cắt các gốc oxy phản ứng nhƣ
hydroperoxide (Wang et al., 2009). Khi nghiên cứu trên hệ màng thylakoid cũng
nhận thấy rằng proline có vai trò ức chế hiệu ứng phá hủy của các gốc oxy tự do
tới bộ máy quang hợp II (Alia & Mohanty, 1997). Tác động tiêu cực của tia phóng
xạ đến các tế bào tảo và cây thuốc lá chuyển gen P5CS tăng cƣờng sinh tổng hợp
và tích lũy proline cũng bị giảm mạnh (Hong et al., 2000; Siripornadulsil et al.,
2002).
Mặc dù những dẫn chứng về vai trò bảo vệ và phân cắt các gốc oxy tự do
trong tế bào của proline là khá đầy đủ, ngƣợc lại những bằng chứng về khả năng
duy trình sự ổn định trạng thái cân bằng nội bào còn rất hạn chế. Sự tích lũy của các
enzyme P5CS1 và P5CR trong lục lạp cho thấy, trong các điều kiện khắc nghiệt của
môi trƣờng, quá trình sinh tổng hợp proline tăng lên ở lạp thể (Székely et al., 2008).
Khi cây gặp các điều kiện bất lợi thì tốc độ chu trình Calvin giảm đi nhằm mục đích
giảm thiểu quá trình oxy hóa NADPH và dự trữ NAPD+. Khi kết hợp với ánh sáng,
dòng điện tử trong chuỗi vận chuyển điện tử bị ức chế bởi không đủ lƣợng NADP+,
điều này dẫn đến sự tăng cƣờng sản xuất các gốc oxy tự do ở trung tâm hệ quang
hợp I và tích lũy các gốc oxy phản ứng (ROS) (Chaves et al., 2009). Vì quá trình
sinh tổng hợp proline là quá trình khử và cần có NADPH để khử glutamate thành
P5C và từ P5C thành proline, nên quá trình này sẽ tạo ra nhiều phân tử NADP+.
Bên cạnh đó, quá trình phosphoryl hóa glutamate thành glutamic semialdehyde tiêu
thụ ATP và tạo ra ADP, các phân tử ADP này sau đó có thể làm cơ chất cho quá
trình sinh tổng hợp ATP thông qua quá trình quang hợp. Chính vì vậy nếu tăng
cƣờng tốc độ sinh tổng hợp proline trong lục lạp khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi
có thể giúp duy trì trạng thái cân bằng của NADPH:NADP+, do đó ổn định dòng
điện tử, trạng thái oxy hóa khử và ngăn ngừa những hƣ tổn đến bộ máy quang hợp
(Hare et al., 1997). Ở các dòng đậu tƣơng chuyển gen đối mã với P5CR cho thấy

Footer Page 18 of 148.

Header Page 19 of 148.

19

khi ức chế quá trình sinh tổng hợp proline và phản ứng chuyển hóa NADPH NADP+ thì các dòng chuyển gen này trở nên nhạy cảm hơn với các điều kiện hạn,
nhƣng khi tăng cƣờng hoạt động của gen P5CR thì các dòng chuyển gen có tính
kháng tốt hơn đối với hạn, kết quả này cho thấy khẳng định rằng quá trình sinh tổng
hợp proline rất quan trọng đối với việc duy trì hàm lƣợng NADP+ ở trong tế bào khi
cây gặp các điều kiện bất lợi (De Ronde et al., 2004).
Trong ty thể, proline có những chức năng bảo vệ rất riêng biệt. Sau khi cây
gặp phải các điều kiện môi trƣờng bất lợi, sự tích lũy proline cung cấp thế năng khử
cho ty thể thông qua quá trình oxy hóa proline bởi 2 enzyme PDH và P5CDH, cung
cấp điện tử cho chuỗi phản ứng hô hấp và do đó cung cấp năng lƣợng để cây phục
hồi quá trình sinh trƣởng. Proline cũng giữ chức năng bảo vệ phức hệ phản ứng II
của chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể trong điều kiện mặn và do đó ổn định các
phản ứng hô hấp của ty thể. Những phát hiện gần đây về chu trình P5C-proline cho
thấy trong một vài điều kiện đặc biệt chu trình này có thể cung cấp điện tử cho
chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể mà không tạo ra glutamate. Quá trình dị hóa
proline cũng còn đƣợc xem là nhân tố điều hòa quan trọng đối với trạng thái cân
bằng các gốc oxy phản ứng của tế bào và có thể ảnh hƣởng đến nhiều quá trình điều
hoàn khác của ty thể (Szabados & Savoure, 2009).
Sinh tổng hợp và tích lũy proline đã đƣợc chứng minh rằng là có tính đặc
hiệu cho mỗi loài. Tuy nhiên, liệu sự khác nhau này có liên quan đến tính thích ứng
của mỗi loài hay không vẫn còn là câu hỏi đối với các nhà khoa học. Hai loài cây
chịu mặn Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium tích lũy proline nhiều
hơn hẳn so với cây Arabidopsis ở trong điều kiện mặn, mặc dù chúng có họ hàng
với nhau. Sự tích lũy proline ở cây Thellungiella halophila là kết quả của sự tăng
cƣờng hoạt động của gen P5CS và giảm hoạt động của gen PDH (Taji et al., 2004).
Nghiên cứu cho thấy rằng, ở loài cây ƣa mặn Pancratium maritimum có hàm lƣợng
proline tích lũy cao trong tế bào đã cải thiện tính chịu mặn thông qua khả năng ổn

định hoạt động của các enzyme khử độc, bộ máy vận chuyển protein và kích thích

Footer Page 19 of 148.


Header Page 20 of 148.

20

sự tích lũy các protein có chức năng bảo vệ. Ở các loài cây ƣa mặn khác nhƣ
Camphorosma annua và Limonium spp hàm lƣợng proline tích lũy không cao
nhƣng thay vào đó ở các loài cây này lại tích lũy mạnh nhiều chất thẩm thấu khác
nhƣ các loại carbohydrate hay các chất tổng hợp từ betain (Murakeözy et al., 2003).
Các nghiên cứu này cho thấy rằng, sự tích lũy proline trong tế bào thƣờng đi kèm
với những đặc tính chống chịu ở các loài cây bởi vậy có thể cho rằng quá trình tích
lũy proline là để giúp cây tăng cƣờng tính chống chịu với điều kiện môi trƣờng bất
lợi. Tuy nhiên, sự tích lũy proline không phải là một yếu tố quá cần thiết cho sự
thích ứng của các loài thực vật khác nhau khi sống trong điều kiện môi trƣờng bất
lợi (Szabados & Savoure, 2009).
1.2.3.2. Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật

Hình 1.3: Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao (Delauney & Verma, 1993)

Con đƣờng sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể đƣợc thực hiện
qua hai con đƣờng hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine (hình 1.3). Proline đƣợc sinh
tổng hợp từ tiền chất glutamate đƣợc coi là một trong những chu trình sinh tổng hợp
quan trọng nhất của thực vật ở những điều kiện sinh lý nhất định, khi thực vật bị

Footer Page 20 of 148.

Header Page 21 of 148.

21

giới hạn về nguồn nitơ hoặc sống trong môi trƣờng bất lợi về áp suất thẩm thấu.
Ngƣợc lại, con đƣờng sinh tổng hợp proline thông qua tiền chất ornithine thƣờng
xảy ra khi thực vật sống trong điều kiện môi trƣờng thừa nitơ (Delauney & Verma,
1993). Con đƣờng sinh tổng hợp proline từ tiền chất glutamate đƣợc chứng minh
đầu tiên ở vi khuẩn (Leisinger, 1987). Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ đƣợc
xác định sau khi các nhà khoa học thành công trong việc phân lập đƣợc đoạn
cDNA của gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS)
(Hu et al., 1992). P5CS là một enzyme giữ hai chức năng chính, thứ nhất enzyme
hoạt hóa tiền chất glutamate trở thành dạng hoạt động của nó là glutamic-semialdehyde (GSA) và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5carboxylate (P5C). Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi
enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo L-proline.
Ở thực vật, proline không chỉ đƣợc tổng hợp từ glutamate mà còn từ
ornithine. Trong quá trình sinh tổng hợp này gốc amin của ornithine có thể đƣợc
chuyển thành glutamic-semi-aldehyde bởi sự xúc tác của enzyme ornithine-
aminotransferase (-OAT) hoặc thành α-keto-aminovalerate (KAV) bởi sự xúc tác
của enzyme -OAT. Theo con đƣờng thứ nhất glutamic-semi-aldehyde sẽ đƣợc
đóng vòng để tạo pyrroline-5-carboxylate do hoạt tính của enzyme pyrroline-5carboxylate reductase. Ở con đƣờng thứ hai α-keto-aminovalerate đƣợc đóng vòng
tạo pyrroline-2-carboxylate (P2C) do hoạt tính của enzyme pyrroline-2-carboxylate
reductase (P2CR) (Delauney và Verma, 1993). Các phân tích về sự biểu hiện của
gen -OAT ở cây đậu cho thấy gen này biểu hiện rất yếu trong điều kiện môi
trƣờng bình thƣờng và điều kiện môi trƣờng bất lợi, nhƣng trong điều kiện môi
trƣờng thừa nitơ thì gen này lại biểu hiện rất mạnh (Armengaud et al., 2004). Bởi
vậy, quá trình tổng hợp proline từ tiền chất ornithine đƣợc cho là diễn ra trong các
điều kiện môi trƣờng sống thừa nitơ. Trong một số trƣờng hợp đặc biệt nhƣ ở cây
cỏ ngọt và cây Arabidopsis gen -OAT biểu hiện rất mạnh, lƣợng mARN tăng cao
ở các điều kiện môi trƣờng bất lợi về áp suất thẩm thấu. Bởi vậy, các nhà khoa học

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.

22

cũng cho rằng sự tích lũy proline theo con đƣờng sinh tổng hợp từ ornithine có vai
trò đối với tính chống chịu của một số loài thực vật khi gặp các điều kiện môi
trƣờng bất lợi về áp suất thẩm thấu (Trovato et al., 2008).
1.2.3.3. Sự điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật
Việc nghiên cứu về quá trình trao đổi proline ở thực vật đã đƣợc thực hiện
nhiều, nhƣng đến nay kiến thức về cơ chế điều hòa quá trình trao đổi proline vẫn
còn rất hạn chế. Sơ đồ hình 1.4 mô tả cơ chế và các tác nhân có vai trò trong quá
trình điều hòa trao đổi proline ở thực vật. Quá trình sinh tổng hợp proline đƣợc hoạt
hóa và quá trình dị hóa proline bị hạn chế khi cây trồng bị xử lý hạn. Khi cung cấp
đủ nƣớc trở lại cho cây trồng sau xử lý hạn thì các quá trình này sẽ hoạt động theo
hƣớng ngƣợc lại, nghĩa là quá trình di hóa proline đƣợc hoạt hóa mạnh và quá trình
tổng hợp bị hạn chế (Xue et al., 2009).

Hình 1.4: Cơ chế điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật (Szabados & Savoure,
2009). Đường màu xanh lá cây là tổng hợp và đường màu đỏ là dị hóa proline.

Quá trình sinh tổng hợp proline đƣợc kiểm soát chính bởi sử biểu hiện của 2
gen (P5CS1, P5CS2) mã hóa cho enzyme P5CS. Hai gen này có độ tƣơng đồng rất
cao về trình tự mã hóa nhƣng biểu hiện gen lại rất khác nhau trong những điều kiện

Footer Page 22 of 148.

Header Page 23 of 148.

23

môi trƣờng khác nhau (Armengaud et al., 2004). Các nghiên cứu cho thấy ở cây
Arabidopsis, gen P5CS2 là một gen chủ chốt, hoạt động của gen P5CS2 chủ yếu ở
các mô phân sinh, nhƣ: đỉnh chồi, chóp rễ, ở hoa và các tế bào nuôi cấy (Székely et
al., 2008). Hai gen P5CS đều biểu hiện ở các mô phân sinh của hoa nhằm cung cấp
proline cho quá trình phát triển của hoa (Mattioli et al., 2009). Ở cây Arabidopsis gen
P5CS1 biểu hiện rất mạnh khi đƣợc cảm ứng bởi các yếu tố bất lợi về thẩm thấu và
cũng đƣợc cảm ứng bởi acid abscisic (ABA). Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy
sử biểu hiện của gen P5CS1 và sự tích lũy proline cũng bị kích thích bởi ánh sáng và
bị ức chế bởi các hợp chất brassinosteroid (Hayashi et al., 2000; Abrahám et al.,
2003). Cây sống trong điều kiện môi trƣờng bình thƣờng, enzyme phospholipase D
(PLD) giữ chức năng nhƣ một chất tham gia vào quá trình điều hòa tích lũy proline.
Còn khi cây sống trong môi trƣờng bất lợi về mặn, Ca2+ và enzyme phospholipase C
(PLC) kích thích quá trình phiên mã của gen P5CS để tham gia sinh tổng hợp và tích
lũy proline (Thiery et al., 2004). Ngƣợc lại, kết quả nghiên cứu của Knight và đtg
(1997) ở cây Thellungiella halophila chịu mặn cho thấy, PLD lại là một chất điều hòa
có tác dụng kích thích sinh tổng hợp và tích lũy proline, còn PLC đƣợc cho là chất
điều hòa có tác dụng bất hoạt sự tích lũy proline. Ca2+ có chức năng nhƣ một chất
truyền tín hiệu tƣơng tác với nhân tố phiên mã MYB2 để hoạt hóa sự biểu hiện của
gen P5CS1 khi cây bị stress về muối (Szabados & Savoure, 2009).
Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp và tích lũy proline không chỉ thông qua quá
trình điều hòa sự biểu hiện của các gen P5CS, mà hoạt tính của enzyme P5CS cũng
đƣợc kiểm soát bởi quá trình trao đổi proline. Zhang và đtg (1995) nghiên cứu cho
thấy, khi hàm lƣợng proline tích lũy trong tế bào tăng cao sẽ dẫn đến sự ức chế phản
hồi ngƣợc hoạt tính của enzyme P5CS. Còn khi enzyme P5CS không bị ức chế phản
hồi ngƣợc bởi proline thì sự tích lũy axít amin này sẽ tăng rất mạnh trong tế bào.

Quá trình chuyển hóa tiền chất pyrroline-5-carboxylate (P5C) thành proline không
phải là bƣớc giới hạn trong chu trình sinh tổng hợp proline. Bởi vậy, sự điều hòa
hoạt tính của enzyme P5CR cho thấy sự phức tạp trong cơ chế điều hòa sự biểu hiện
của gen P5CR. Kết quả phân tích trình tự đoạn promoter điều khiển hoạt động của

Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.

24

gen P5CR phân lập từ cây Arabidopsis đã xác định đƣợc một đoạn trình tự có chiều
dài 69 bp quy định hoạt động đặc hiệu mô của gen này. Đến nay, các nhà khoa học
vẫn chƣa xác định đƣợc các nhân tố tác động dạng trans liên kết đặc hiệu với đoạn
trình tự cis này (Hua et al., 1999).
Quá trình sinh tổng hợp proline ở thực vật bị kích hoạt bởi ánh sáng và các
yếu tố bất lợi về áp suất thẩm thấu (hạn, mặn). Ngƣợc lại, quá trình dị hóa proline
lại đƣợc hoạt hóa trong điều kiện môi trƣờng sống không có ánh sáng và điều kiện
môi trƣờng bình thƣờng. Quá trình di hóa proline đƣợc kiểm soát bởi hai enzyme là
proline dehydrogenase (PDH) và pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase (P5CDH)
(hình 1.4). Quá trình biểu hiện của gen PDH mã hóa cho enzyme PDH đƣợc hoạt
hóa bởi chính proline khi cây đƣợc cung cấp đủ nƣớc sau khi bị hạn. Sự phiên mã
của gen PDH lại bị ức chế khi cây bị stress nƣớc do đó đảm bảo proline không bị
phân giải khi cây sống trong môi trƣờng bị stress nƣớc. Sự biểu hiện của gen PDH
bị ức chế vào ban ngày nhƣng lại đƣợc hoạt hóa vào buổi tối do đó hoạt động của
gen này ngƣợc với hoạt động của gen P5CS1. Kết quả phân tích promoter điều
khiển hoạt động của gen PDH đã xác định đƣợc nhân tố cảm ứng với trạng thái
thẩm thấu và proline, là nhân tố giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình hoạt hóa
của gen này (Satoh et al., 2002). Yếu tố phiên mã liên kết với promoter điều khiển

biểu hiện gen PDH là họ protein giàu leucine. Kết quả phân tích hoạt động của gen
P5CDH ở các mô của cây Arabidopsis cho thấy gen này biểu hiện rất yếu và khi bổ
sung proline vào môi trƣờng thì sự biểu hiện của gen này tăng lên. Phân tích đoạn
promoter của gen P5CDH phân lập từ cây lúa và Arabidopsis cũng xác định đƣợc
các trình tự đặc trƣng tƣơng tự trên promoter của gen PDH. Borsani và đtg (2005)
khi phân tích cơ chế điều hòa sau phiên mã của gen P5CDH cho thấy tồn tại các
đoạn đối mã trong tự nhiên tạo ra các cấu trúc ức chế RNA nhỏ (24 nucleotides và
21 nucleotides siRNA) hoạt hóa cho quá trình cắt các phân tử RNA thông tin của
gen P5CDH, nên làm giảm mức độ biểu hiện của gen này khi cây gặp các điều kiện
bất lợi từ môi trƣờng. Kết quả này cho thấy rằng, cơ chế ức chế hoạt động biểu hiện
của gen ở mức độ sau phiên mã là rất quan trọng trong việc điều khiển hoạt động

Footer Page 24 of 148.


Header Page 25 of 148.

25

của gen P5CDH ở thực vật. Ở cây lanh (Linum usitatissimum) gen FIS1 mã hóa cho
enzyme P5CDH đƣợc hoạt hóa khi cây nhiễm virus hoặc bị tổn thƣơng (Ayliffe et
al., 2002).
1.2.4. Vai trò của glycine betaine (GB) và con đƣờng sinh tổng hợp GB ở sinh vật
1.2.4.1. Glycine betaine đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật
Glycine betaine (GB) một hợp chất amoni bậc bốn, là một trong những chất
hòa tan tƣơng thích hiệu quả nhất và đƣợc tìm thấy trong một phạm vi rộng của
các loài động vật, vi khuẩn và một số loài thực vật hạt kín chịu hạn hán và chịu
mặn (Chen & Murata, 2002). Trƣớc đây GB đã đƣợc đề xuất, tăng tích lũy các
betaine trong các loài thực vật đóng một vai trò sinh lý quan trọng làm giảm bớt
căng thẳng thẩm thấu (Wyn Jones, 1984). Trong tự nhiên, rau bina, ngô, củ cải

đƣờng và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy GB xảy ra trong quá trình cây bị căng
thẳng (stress) với muối, hạn hán và nhiệt độ thấp (Bohnert et al., 1995). GB bảo vệ
cây bằng cách hoạt động nhƣ một chất hữu cơ có ảnh hƣởng đến thẩm thấu
(osmolyte), duy trì cân bằng nƣớc giữa các tế bào thực vật và môi trƣờng, ổn định
các đại phân tử dƣới điều kiện khô hạn và nồng độ muối cao (Papageorgiou &
Murata, 1995).
GB tích lũy ở nồng độ cao không gây cản trở chức năng của tế bào chất và
có tác dụng đảm bảo tính ổn định cấu trúc và chức năng của các đại phân tử. GB
xuất hiện nhƣ một yếu tố quyết định tới khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở cây
trồng. Chất này có hiệu quả lớn và liên quan mật thiết đến khả năng sinh trƣởng của
cây trồng trong điều kiện môi trƣờng hạn hán và nhiễm mặn. Mức độ tích lũy GB
tƣơng quan với khả năng chống chịu điều kiện bất lợi. GB đƣợc tích lũy chủ yếu
trong lục lạp, nó đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh và duy trì màng thylacoid,
do đó duy trì hiệu quả quang hợp (Yang et al., 2003).
Trong nhiều loài cây trồng, sự tích lũy tự nhiên của GB đủ để cải thiện tác
động tiêu cực của tình trạng mất nƣớc gây ra bởi những vấn đề môi trƣờng khác
nhau. Bên cạnh đó, một số loài cây trồng nhƣ lúa, khoai tây, cà chua, thuốc lá, v.v.

Footer Page 25 of 148.