NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Header Page 1 of 148.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THIÊN MINH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2014

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THIÊN MINH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU
2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM

Hà Nội - 2014

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa
Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ tạo điều
kiện cho tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên
trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông
nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ
môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian tôi
thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng
Vi sinh vật học phân tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và ủng hộ tôi trong quá trình thực

hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại
học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh.
Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị và
các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện
Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện
Công nghệ sinh học và Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ
của bạn bè trong và ngoài Viện đã dành cho tôi.
Hà Nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014

Lê Thiên Minh
Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng
tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực
và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.

Hà nội, ngày 23 tháng 6 năm 2014
Tác giả

Lê Thiên Minh

Footer Page 4 of 148.


Header Page 5 of 148.

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
ARN
EDTA
SDS-PAGE
TCA
v/p
v/v
vvm
w/v
X
WHO
Tm
FDA
TE
PCR
SDS
TLC

EtBr
dNTP
A. flavus
A. parasiticus
NOR
AVN
HAVN
OAVN
AVNN
AVF
VHA
VAL
VERB
VERA
DMST
DHDMST
ST
DHST
OMST
DHOMST
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2

Footer Page 5 of 148.

Axit deoxyribonucleic
Axit ribonucleic
Axit etylen diamin tetra axetic

Điện di trên gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate
Axit trichloroaxetic
vòng / phút
Thể tích/thể tích
thể tích/thể tích/phút
Trọng lượng /thể tích
Axit amin bất kỳ
Tổ chức Y tế thế giới
Nhiệt độ tan chảy
Cục quản lý Thực phNm và Dược phNm Hoa kỳ
Tris EDTA
Polymerase chain reaction
Sodium dodecyl sulfate
Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)
Ethydium bromit
Deoxiribonucleotit triphosphat
Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus
Norsolorinic acid
Averantin
5’ hydroxyaverantin
Oxoaverantin
Averufanin
Averufin
Versiconal hemiacetal acetate
Versiconal
Versicolorin B
Versicolorin A
Demethylsterigmatocystin
Dihydro demethylsterigmatocystin

Sterigmatocystin
Dihydro sterigmatocystin
O-methylsterigmatocystin
Dihydro-O-methylsterigmatocystin
Aflatoxin B1
Aflatoxin B2
Aflatoxin G1
Aflatoxin G2


Header Page 6 of 148.

iv

Danh môc c¸c b¶ng
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin

8

2

Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản thực ph m

12

3

Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò

12

4

Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

13

5

Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus

14

6

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A. flavus DA2

40

7

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng A. flavus từ ngô, lạc ở một số tỉnh Việt

44

Nam
8

Bảng 3.2 Khả năng tạo aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập từ ngô và

45

lạc
9

Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô
và lạc

47

10

Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu
ngô và lạc

48

11

Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các

49

mẫu ngô và lạc
12

Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các

50

mẫu ngô và lạc
13

Bảng 3.5 Khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus phân lập

52

14

Bảng 3.6 Hiệu quả giảm aflatoxin B1 của chủng A. flavus AF14 nuôi cấy trên

54

môi trường ngô bằng các chủng A. flavus không sinh aflatoxin
15

Bảng 3.7 Mật độ tế bào A. flavus DA2 và A. flavus AF14 khi nuôi hỗn hợp theo

55

tỉ lệ 1:1
16

Bảng 3.8 Trình tự các cặp mồi

58

17

Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả PCR với các mồi đã sử dụng

60

18

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của A. flavus DA2 đến trọng lượng cơ thể chuột

63

19

Bảng 3.11 Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 tạo được trên các môi

66

trường khác nhau

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.
20

v

Bảng 3.12 Khả năng tạo bào tử chủng A. flavus DA2 của nhiệt độ nuôi cấy

67

khác nhau
21

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của độ m môi trường đến khả năng tạo bào tử của

68

chủng A. flavus DA2
22

Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử của chủng A. flavus DA2

69

23

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A. flavus DA2

70

24

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A. flavus

71

DA2
25

Bảng 3.17 Mật độ bào tử A. flavus DA2 trong các chất mang ở các thời gian

72

bảo quản khác nhau
26

Bảng 3.18 Khả năng cạnh của chế ph m A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau

76

bằng sắc ký TLC
27

Bảng 3.19 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 khi bón vào đất ở các

77

tỷ lệ khác nhau
28

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sự phát triển

80

sinh khối của A.flavus DA2
29

Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô, lạc tại một số

82

tỉnh Việt Nam
30

Bảng 3.22 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin

84

trong đất trồng ngô sử dụng chế ph m AF
31

Bảng 3.23 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên

86

ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch
32

Bảng 3.24 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin của chế ph m AF trên

89

ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng

33

Bảng 3.25 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin

91

trong đất trồng lạc được bón chế ph m AF
34

Bảng 3.26 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên

92

lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch
35

Bảng 3.27 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
lạc sau thời gian bảo quản 6 tháng

Footer Page 7 of 148.

93


Header Page 8 of 148.

vi

Danh môc c¸c h×nh
STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin

6

2

Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền

9

3

Hình 1.3 Khu n lạc A.flavus

15

4

Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát dưới kính hiển vi

15

5

Hình 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin

17

6

Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin trên hạt bông giảm khi tỷ lệ AF36 tăng

29

7

Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo bởi chủng A. flavus AF14

52

8

Hình 3.2 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus

53

DA2
9

Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.flavus

54

nuôi cấy trên cơ chất ngô bằng sắc ký bản mỏng (TLC)
10

Hình 3.4 Chủng A. flavus DA2 cạnh tranh và lấn át chủng A. flavus AF14

56

trên đĩa thạch
11

Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số trên gen agarose 1,5%

59

12

Hình 3.6 Sản ph m multiplex PCR của chủng A.flavus DA2 và A. flavus

59

AF14
13

Hình 3.7 Khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15

61

thế hệ
14

Hình 3.8 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A.flavus

61

DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ
15

Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của chủng A.flavus DA2

65

16

Hình 3.10 Khả năng cạnh tranh của A.flavus DA2 ở các tỷ lệ khác nhau

75

17

Hình 3.11 Khả năng đối kháng của chế ph m A.flavus DA2 ở các thời điểm

78

cấy khác nhau
18

Hình 3.12 Khả năng đối kháng của chủng A.flavus DA2 khi có mặt của
thuốc bảo vệ thực vật

Footer Page 8 of 148.

81


Header Page 9 of 148.

vii

19

Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm trên đất trồng ngô

83

20

Hình 3.14 Khu n lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô

85

được bón chế ph m AF tại xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/20076/2008)
21

Hình 3.15 Khả năng kiểm soát aflatoxin trên ngô trước thu hoạch của chế

87

ph m AF
22

Hình 3.16 Bắp ngô ở ruộng sử dụng hai lần chế ph m AF

88

23

Hình 3.17 Bắp ngô ở ruộng không sử dụng chế ph m AF

88

24

Hình 3.18 Ngô sử dụng và không sử dụng chế ph m AF sau thời gian bảo

90

quản 6 tháng
25

Hình 3.19 Chủng A. flavus phát quang và không phát quang phân lập trên

92

đất trồng lạc
26

Hình 3.20 Lạc sử dụng và không sử dụng chế ph m AF sau thời gian bảo
quản 6 tháng

Footer Page 9 of 148.

94


Header Page 10 of 148.

CL C
Trang
L I

M

N………………………………………………………………………………….……i

L I CAM

OAN.……………………………………………………………………….…………ii

DANH M C CÁC KÝ HI U VÀ CH

VI T T T..………………………………..…………...iii

DANH M C CÁC B NG.………………………………………………………………………..iv
DANH M C CÁC HÌNH NH,

TH ……………………………………………………..…..vi

M

U……………………………………………………………………………………….…...4

CH

NG I. T NG QUAN TÀI LI U................................................................................ 6

1.1 T NG QUAN V AFLATOXIN ................................................................................... 6
1.1.1 C u t o.................................................................................................................... 6
1.1.2 Tính ch t hóa lý...................................................................................................... 7
1.1.3

c tính c a aflatoxin............................................................................................ 8

1.1.4 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c ............................................................. 9
1.1.5 Gi i h n aflatoxin cho phép trong nông s n th c ph m .................................. 11
1.2 ASPERGILLUS FLAVUS ......................................................................................... 13
1.2.1

c

m hình thái ............................................................................................... 13

1.2.2 Các y u t
1.2.3

nh h

ng

n s sinh tr

ng c a A. flavus ................................ 15

u ki n sinh aflatoxin ....................................................................................... 16

1.3 PHÒNG CH NG S

NHI M AFLATOXIN............................................................... 19

1.3.1 Bi n pháp canh tác nông nghi p ........................................................................ 19
1.3.2 Bi n pháp sau thu ho ch..................................................................................... 20
1.3.3 Bi n pháp sinh h c .............................................................................................. 21
1.4 PHÒNG CH NG AFLATOXIN B NG CH NG A.FLAVUS KHÔNG SINH
AFLATOXIN ................................................................................................................... 22
1.4.1 C ch ki m soát n m m c và aflatoxin b ng các ch ng A.flavus không sinh
aflatoxin......................................................................................................................... 22
1.4.2 Tuy n ch n các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân
i kháng
....................................................................................................................................... 24
1.5 NGHIÊN C U NG D NG CH PH M N M A. FLAVUS KHÔNG SINH
CT
TRONG PHÒNG CH NG AFLATOXIN ......................................................................... 26

Footer Page 10 of 148.

1


Header Page 11 of 148.
1.5.1 S n xu t ch ph m A. flavus không sinh aflatoxin ........................................... 26
1.5.2 ánh giá hi u qu c a ch ph m A. flavus không sinh aflatoxin

quy mô
phòng thí nghi m và nhà kính ..................................................................................... 27
1.5.2 ánh giá hi u qu c a ch ph m A. flavus không sinh aflatoxin
quy mô
ng ru ng.................................................................................................................... 28
1.5.3 ánh giá tác
1.5.4 Các y u t
CH

ng c a ch ph m ....................................................................... 30

nh h

ng

n hi u qu ch ph m................................................. 31

NG II. V T LI U VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U......................................... 33

2.1 V T LI U, HÓA CH T VÀ THI T B NGHIÊN C U................................................ 33
2.1.1 V t li u nghiên c u.............................................................................................. 33
2.1.2 Hóa ch t, d ng c nghiên c u............................................................................ 33
2.1.4 Môi tr
2.2 PH

ng nghiên c u ....................................................................................... 34

NG PHÁP NGHIÊN C U............................................................................... 34

2.2.1 Ph

ng pháp l y m u ......................................................................................... 34

2.2.2 Ph

ng pháp phân l p........................................................................................ 35

2.2.3 Sàng l c s

b

các ch ng sinh và không sinh aflatoxin b ng ph

ng pháp

phát quang .................................................................................................................... 36
2.2.4 Phân tích aflatoxin b ng s c ký

n m ng ........................................................ 36

2.2.5 Phân tích aflatoxin b ng s c ký l ng cao áp ..................................................... 36
2.2.6 Nuôi c y n m m c A. flavus cho vi c nghiên c u kh n ng t o aflatoxin ...... 36
2.2.6 Xác nh kh n ng c nh tranh c a các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin
i v i ch ng A. flavus sinh aflatoxin......................................................................... 37
2.2.7 Nghiên c u kh n ng t o bào t c a ch ng A. flavus DA2 các
u ki n nuôi
y khác nhau ............................................................................................................... 37
2.2.8 Quy trình nuôi c y n m m c A. flavus DA2

qui mô phòng thí nghi m......... 38

2.2.9 T o ch ph m ch a bào t

ch ng A. flavus DA2 (ch ph m AF)..................... 38

2.2.10

A. flavus trong ch ph m...................................... 38

nh l

2.2.11 Xác

ng m t
nh s

bào t

có m t c a m t s gen trong c m gen mã hóa cho các enzym

tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a các ch ng A. flavus b ng k
thu t multiplex PCR...................................................................................................... 38
2.2.12 Th nghi m tính an toàn c a ch ng A.flavus DA2 .......................................... 40
2.2.13 Xác

nh t l gi a ch ng sinh aflatoxin v i ch ng A.flavus DA2 không sinh

aflatoxin......................................................................................................................... 41

Footer Page 11 of 148.

2


Header Page 12 of 148.
2.2.14 Xác

nh th i

2.2.15 ánh giá nh h

ms

d ng ch ph m ............................................................ 41

ng c a m t s lo i thu c b o v th c v t.......................... 41

2.2.16 ánh giá s c nh tranh c a A.flavus DA2 trong

t tr ng ngô, l c............... 41

2.2.17 ánh giá hi u qu
ph m AF trên ngô giai

gi m m t
A.flavus sinh
c t và aflatoxin c a ch
n tr c và sau thu ho ch............................................. 42

2.2.18

gi m m t

ánh giá hi u qu

ph m AF trên l c
2.2.19 Ph
CH

giai

ng pháp x

n tr

A.flavus sinh

c t

và aflatoxin c a ch

c và sau thu ho ch .............................................. 43

lý th ng kê s li u: theo ph n m m Microsoft Excel............. 43

NG III. K T QU VÀ TH O LU N...................................................................... 44

3.1 PHÂN L P, TUY N CH N CH NG A. FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM

CH NG S N XU T CH PH M AF.............................................................................. 44
3.1.1 Phân l p các ch ng Aspergillus flavus trên ngô, l c ........................................ 44
3.1.2 Sàng l c các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin........................... 45
3.1.3 Phân lo i các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin phân l p

c 46

3.1.4 Tuy n ch n các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin ..................................... 51
3.1.5 ánh giá kh n ng c nh tranh c a các ch ng A. flavus không sinh aflatoxin 53
3.1.6 Ki m tra s có m t m t s gen trong c m gen mã hóa cho các enzym tham
gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a ch ng A. flavus DA2......................... 57
3.1.7 Tính n

nh v kh n ng không sinh aflatoxin c a ch ng A. flavus DA2 ...... 61

3.1.8 ánh giá tính an toàn c a ch ng A. flavus DA2 trên

ng v t thí nghi m ...... 62

3.2 NGHIÊN C U S N XU T CH PH M A. FLAVUS DA2 ........................................ 65
3.2.1 Nghiên c u công ngh nuôi c y b m t s n xu t bào t

ch ng A. flavus DA2

quy mô phòng thí nghi m ............................................................................................ 65
3.2.2 Nghiên c u s n xu t bào t

ch ng A.flavus DA2

quy mô pilot.................... 70

3.2.3 Nghiên c u hoàn thi n ch ph m AF t ch ng A.flavus DA2 .......................... 72
3.3 NGHIÊN C U

NG D NG CH PH M AF............................................................. 75

3.3.1 Nghiên c u

quy mô phòng thí nghi m ........................................................... 75

3.3.2 Nghiên c u

quy mô

ng ru ng ..................................................................... 82

T LU N VÀ KI N NGH ............................................................................................ 95
KI N NGH ..................................................................................................................... 95
TÀI LI U THAM KH O .................................................................................................. 96

Footer Page 12 of 148.

3


Header Page 13 of 148.

U
Aflatoxin là nh ng ch t chuy n hóa có
các loài n m m c Aspergillus. Các

nh ng làm gi m giá tr dinh d

c tính cao,

c t này t n t i trong nông s n th c ph m, không

ng c a th c ph m mà còn là m t trong nh ng nguyên nhân

gây nên nh ng c n b nh nguy hi m cho ng
gan, suy dinh d

ng

c sinh t ng h p ch y u b i

i và

ng v t nh viêm gan c p tính, ung th

tr em.

Vi c ki m soát hàm l

ng aflatoxin có m t trong nông s n th c ph m ã

nghiên c u t r t lâu v i nhi u bi n pháp khác nhau, m i bi n pháp
nh

c

m nh t

nh nh ng ch a có bi n pháp nào

t

c

u có nh ng u

c hi u qu nh mong

i. M t

bi n pháp truy n th ng nh x lý sau thu ho ch, ch n t o gi ng cây tr ng kháng n m
sinh aflatoxin… ch cho phép phát hi n n m m c
tri n sinh

n mu n, khi n m m c ã phát

c t và t n t i trong các s n ph m th c ph m. Nh ng n m g n ây, xu h

d ng chính nh ng ch ng n m

i kháng Aspergillus flavus không sinh

nh tranh cao làm tác nhân ki m soát ang
ph m n m Aspergillus flavus
ch ,

giai

ng

c t có tính

c phát tri n và t ra khá hi u qu . Ch

i kháng ã

c nghiên c u, ng d ng và c p b ng sáng

c s d ng r ng rãi trong nông nghi p

m t s qu c gia nh M ,

n

, Trung

Qu c... Ví d : ch ng NRRL 21882 và AF36 do các nhà khoa h c thu c b Nông nghi p
t o ra ã có tác d ng gi m trên 90% hàm l
thu nh n

c các ch ng A. flavus

ng aflatoxin trên ngô và bông.
i kháng không sinh

bi n pháp phân l p truy n th ng d a trên các

ph

ng pháp m i d a trên k thu t PCR ã

c

c t , bên c nh nh ng

m sinh lý, sinh hóa, còn có m t

c phát tri n

h tr cho công vi c sàng

c này. H u h t các gen trong c m gen tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a
mm c ã

c sáng t và trình t ADN c a chúng c ng ã

c r t thu n l i cho vi c áp d ng ph

c xác

nh là c s khoa

ng pháp này trong sàng l c các ch ng m c tiêu.

Vi t Nam n m trong mi n khí h u nhi t

i nóng, m là

u ki n r t thu n l i cho

các loài n m m c phát tri n, xâm nhi m vào cây tr ng ngay t giai

n canh tác, trong

su t quá trình b o qu n và ch bi n n u không có bi n pháp ki m soát nghiêm ng t. Cho
n nay,

Vi t Nam ch a có công trình nghiên c u nào v

A. flavus không sinh
khác, kh n ng

ct

phòng ch ng n m m c và

ng d ng các ch ng n m m c
c t aflatoxin trên ngô, l c. M t

i kháng c a các ch ng n m m c không sinh

c t th

ng thay

i theo

u ki n khí h u và h sinh thái t ng vùng nên vi c ng d ng các ch ph m n m
kháng

Footer Page 13 of 148.

c s n xu t

n

c ngoài trên

i

ng ru ng Vi t Nam không d dàng và em l i

4


Header Page 14 of 148.
hi u qu không cao. Do ó, vi c t o l p m t ch ph m n m A. flavus
ch ng phân l p

c trên các ngu n t nhiên b n

i kháng t nh ng

a ch c ch n s mang l i hi u qu gi m

thi u s nhi m aflatoxin.
Xu t phát t nh ng lý do trên, chúng tôi ã th c hi n

kháng c a Aspergillus flavus không sinh

ct

tài: Nghiên c u tính

i

phòng ch ng aflatoxin trên ngô và

c , v i các m c ích và n i dung nghiên c u chính sau ây:
c ích nghiên c u
Ki m soát s nhi m aflatoxin trên ngô, l c b ng ch ph m Aspergillus flavus không
sinh aflatoxin.
i dung nghiên c u
1. Phân l p, tuy n ch n các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có kh n ng
nh tranh cao và n

nh v i các ch ng A. flavus sinh aflatoxin.

2. Nghiên c u quy trình nuôi c y và t o ch ph m bào t t ch ng Aspergillus flavus
không sinh aflatoxin.
3. Nghiên c u ng d ng ch ph m Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nh m gi m
thi u s nhi m aflatoxin trên ngô, l c

quy mô phòng thí nghi m và trên

ng ru ng.

Nh ng óng góp m i c a lu n án

1. Là công trình nghiên c u

u tiên

Vi t Nam s d ng c ch c nh tranh sinh h c b ng

ch ng A. flavus không sinh aflatoxin trong ki m soát aflatoxin nhi m trên ngô và l c.
2. Lu n án nghiên c u s d ng k thu t multiplex PCR

làm sáng t b n ch t sinh h c

phân t c a ch ng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân l p t ngô (Vi t Nam). Ch ng
A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong c m gen sinh t ng h p aflatoxin.
3. Lu n án ã nghiên c u t o
ch ng A. flavus DA2

ts nl

c công ngh nuôi c y b m t cho s n xu t ch ph m bào
ng cao (109CFU/g) v i công ngh

n gi n, giá thành

. Ch ph m có tác d ng gi m s nhi m n m m c và aflatoxin trên ngô, l c
ng ru ng và trong quá trình b o qu n t 86,55%
a ra ng d ng

Footer Page 14 of 148.

quy mô l n.

5

n 97%,

giai

n

m b o tính kh thi cao khi


Header Page 15 of 148.

CH

NG I. T NG QUAN TÀI LI U

1.1 T NG QUAN V AFLATOXIN
1.1.1 C u t o
Aflatoxin là nhóm các h p ch t có nhân difuranocumarin, là s n ph m trao

i ch t

ch y u c a hai loài n m m c Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Theo Reddy
và Farid có kho ng 18 c u trúc hóa h c g n nhau c a aflatoxin ã
c tính lý hóa và tính

c khác nhau các aflatoxin

c xác

nh. D a trên

c chia thành nhi u nhóm: B ( B1 ,

B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1. Các lo i aflatoxin này khác bi t v hóa h c
không nhi u nh ng khác bi t v
ung th

c tính là r t l n. Aflatoxin B1 và G1 có kh n ng gây

cao h n nhi u so v i các lo i aflatoxin còn l i. Trong các lo i aflatoxin thì

aflatoxin B1 ph bi n nh t trong nông s n và gây tác h i nhi u nh t, ti p theo là G1, trong
khi ó B2 và G2 t n t i

n ng

th p h n [115].

Công th c c u t o c a m t s aflatoxin [11]:
O

O

O
O

O

O

O

OCH3

O

O

Aflatoxin B1

O
OH

OH

OCH3

O

O

Aflatoxin M2

O

O

O

O

OCH3

O

Aflatoxin M1

O
O

O

O

O

OCH3

O
Aflatoxin G2

Aflatoxin G1

Hình 1.1 Công th c c u t o c a m t s d ng aflatoxin

Footer Page 15 of 148.

O

O

O

O

O

OCH3

Aflatoxin B2

O

O

O

6

O

OCH3


Header Page 16 of 148.
1.1.2 Tính ch t hóa lý
Các aflatoxin

c hoà tan trong các dung môi phân c c nh nh chloroform,

methanol, acetone, acetonitrile và
trong n

c dao

c bi t

dimetylsulfoxit.

hòa tan c a aflatoxin

ng là 10-20mg/lít.

Aflatoxin tinh khi t r t b n v i nhi t. Tuy nhiên, s có m t
cao có th phá h y
trong d u n, trong
chi ti t nh ng d
Các aflatoxin t
tia t ngo i,

c aflatoxin sau m t th i gian nh t

c rang ho c trong dung

ng nh nhi t
ng

c và nhi t

nh nh s phá h y aflatoxin

ch có pH 7. M c dù ch a

c nghiên c u

cao ã m vòng lacton v i ph n ng decacboxyl hóa.

i không b n khi

c bi t

ah in

c

trong không khí d

các dung môi có

i ánh sáng m t tr i và

phân c c cao nên vi c kh nhi m aflatoxin

trong th c ph m s có nhi u bi n pháp h n [98, 99].
Các aflatoxin ít ho c không b phân h y trong
không b phân h y khi un n u
phút m i m t tác d ng

tc an mm ct

nhi t

thông th

u ki n làm nóng khi thanh trùng,
ng ( nhi t

120oC, ph i un 30

c). Do v y, nó có th t n t i trong th c ph m mà không c n s có
ng ng,

ng th i nó r t b n v i các men tiêu hóa. Tuy nhiên, các

aflatoxin có th b phá h y hoàn toàn v i vi c x lý b ng amoniac hay hypochlorit [98].
có m t c a vòng lacton
tr

ng ki m.

phân t aflatoxin làm chúng d b th y phân trong môi

c tính này là quan tr ng trong quá trình ch bi n th c ph m vì quá trình x

lý ki m làm gi m s nhi m aflatoxin c a các s n ph m. Tuy nhiên, n u x lý ki m là nh
thì vi c axit hóa s làm ph n ng ng

c tr l i

t o aflatoxin ban

o

cao (100 C), ph n ng decacboxyl m vòng lacton hóa
OCH3 c a vòng th m. Ph n ng

ng

y ra t

y ra d n

u [22, 11].

nhi t

n s m t nhóm -

ng t v i amoniac và các h p ch t amin

khác [101].
M t s tác nhân oxy hóa nh NaClO, KMnO4 , Cl, H2O2, O3... ph n
aflatoxin làm thay

i c u trúc phân t c a aflatoxin, c ch c a ph n ng ch a

nh, tuy nhiên s thay

i c u trúc phân t

ã

ng v i
c xác

c th hi n qua s m t tính ch t phát

quang [101].
Các aflatoxin phát quang m nh khi
cho phép phát hi n các h p ch t này
p
nh l

d

n ng

i ánh sáng c c tím sóng dài. Tính ch t này
th p ( 0,5 ng trên s c kí b n m ng). Nó cung

m c b n v m t th c hành cho t t c các ph

ng pháp hóa lý cho vi c phát hi n và

ng [6, 7]. M t s tính ch t lý, hóa c a các aflatoxin

[115].

Footer Page 16 of 148.

7

c trình bày theo b ng 1.1


Header Page 17 of 148.
ng 1.1
Aflatoxin

t s tính ch t lý, hóa c a các aflatoxin

Công th c

Kh i l

phân t

ng

Nhi t

nóng ch y

phân t

( C)

B1

C17H12O6

312

268-269

Xanh da tr i(B)

B2

C17H14O6

314

268-289

Xanh da tr i(B)

G1

C17H12O7

328

244-246

Xanh lá cây(G)

G2

C17H14O7

330

229-231

Xanh lá cây(G)

M1

C17H12O7

328

297-299

Xanh tím

M2

C17H14O7

330

293

Xanh tím

1.1.3

c tính c a aflatoxin
Aflatoxin là các ch t có kh n ng gây ung th , gây

gi m kh n ng mi n d ch. Ng
nhi m ho c n th t các
u

Màu hu nh quang

o

t bi n gen, là tác nhân làm

i có th b nhi m aflatoxin do n ph i các lo i ng c c b

ng v t

c nuôi b ng ng c c b nhi m aflatoxin. Các nghiên

nh ng vùng có t l ung th cao trên th gi i

u cho th y nhi m

c aflatoxin là

nguy c chính gây ung th gan [99]. Do c u trúc hóa h c có vòng dihydro-furan nên
aflatoxin B1 liên k t v i m t s enzym làm c n tr trao
aflatoxin B1 còn t

ng tác

u trúc di truy n d n

n t vong. Ngoài ra,

ng hóa tr v i v t ch t di truy n (DNA, RNA) làm r i lo n

n t n th

ng gan và ung th gan [95]. Cho

ch ng khoa h c công nh n kh n ng tác
sau: (1)

i ch t d n

n nay, các lu n

ng lên t bào gan c a aflatoxin qua 5 giai

n

c ch các polymerase là enzyme tham gia vào t ng h p DNA và RNA. (2) Làm

ch m ho c ng ng h n s t ng h p DNA. (3) Ng n c n c ch sinh t ng h p RNA thông
tin. (4) Bi n

i hình d ng nhân t bào. (5) H n ch quá trình sinh t ng h p protein [63].

ch tác

ng c a aflatoxin trong c th ng

nh rõ ràng. Các nghiên c u g n ây ch tìm th y s
ns

t bi n codon 249 c a gen p53. Hi n t

i nhi m
nh h

ng này d n

n nay v n ch a

ng c a các aflatoxin nhóm B
n nguy c gây ung th cao

do gen p53 là m t gen có tác d ng ch ng vi c t ng lên không bình th
hình thành nên các d ng u, b

Footer Page 17 of 148.

u trong c th [95].

8

c xác

ng c a các t bào,


Header Page 18 of 148.

Hình 1.2 Aflatoxin t

ng tác

ng hóa tr v i v t ch t di truy n

1.1.4 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c
1.1.4.1 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c c a các n
Theo ánh giá c a t ch c nông l

c trên th gi i

ng th gi i (FAO) hàng n m có t 25-50% nông

n sau thu ho ch b nhi m mycotoxin trong ó ch y u là aflatoxin. T l này còn cao h n
i v i các n

c n m trong vùng khí h u nhi t

i, có n i 80% ngô b nhi m mycotoxin.

Ngoài các nông s n th c ph m thì các lo i th c ph m có ngu n g c t
th b nhi m mycotoxin do s d ng các th c n có
Các

G1

c t [67].

u tra c a M v i trên 1500 m u ngô thu ho ch

1970, ch y u t các ngu n th

v mùa c a các n m 1969-

ng m i, ã cho th y t 2-3% m u nhi m aflatoxin B1 và

kho ng t 3-37 ppb. Trong nghiên c u ti p theo v i 60 m u t

aflatoxin B1 ã

c tìm th y trong 21 m u

ngô nghiên c u nhi m aflatoxin B1
nhi m là 40% v i hàm l
này là 97% v i hàm l

ng v t c ng có

i hàm l

m c t 6-308 ppb.

ông - nam c a M
Thái Lan, 35% m u

ng trung bình 400 ppb.

ng trung bình là 133 ppb.

c bi t

Uganda t l

o Sebu (Philippin), t l

ng trung bình là 213 ppb [131].

Theo Goto và công s , trong mùa m a n m 1984-1985
thu th p t các kho b o qu n ã nhi m aflatoxin B1 v i l

Thái Lan, 85% s m u ngô

ng 6,30-1310 ppb và 0,6 -767 ppb,

theo th t [74]. Trong kh o sát c a Makun và c ng s cho th y 29/50 m u

u thu nh n

Nigeria nhi m aflatoxin m c 63,5 - 106,2 g/kg, 54% các m u b t m ch bi n
nhi m

Footer Page 18 of 148.

c t v i hàm l

ng 102,9 - 198,4 g/kg [97].

9

các ch


Header Page 19 of 148.
Trong n m 1973, nghiên c u v l c bóc v
aflatoxin gi i h n t v t

n 50 µg/kg. Stoloff ã tìm th y aflatoxin

trong các s n ph m l c nh p vào
Các aflatoxin ã tìm th y

M cho th y 15% c a 361 m u có

an M ch làm th c n gia súc, m t m u có 3.465µg/kg.

41% c a 173 s m u l c

9% s m u có trên 1000 µg/kg.

86,5% c a 52 m u

Sudan, 16 m u có trên 250 µg/kg và

Philippin, t t c các m u b l c

c ki m tra n m 1967-

1969, có aflatoxin v i giá tr 155 µg/kg và giá tr trung bình 500 µg/kg [123].
1.1.4.2 Th c tr ng nhi m aflatoxin trên ngô, l c
Vi t Nam, ngô là cây l
quan tr ng nh t

c tr ng

Vi t Nam

ng th c quan tr ng th hai sau cây lúa và là cây màu

nhi u vùng sinh thái khác nhau, a d ng v mùa v gieo

tr ng và h th ng canh tác. Cây ngô không ch cung c p l
mà còn là cây tr ng xóa ói gi m nghèo t i các t nh có
xu t ngô c n

ng th c cho ng

i, v t nuôi

u ki n kinh t khó kh n. S n

c qua các n m không ng ng t ng v di n tích, n ng su t, s n l

2001 t ng di n tích ngô là 730.000 ha,
di n tích ngô c n

ng: n m

n n m 2005 ã t ng trên 1 tri u ha; n m 2010,

c 1126,9 nghìn ha, n ng su t 40,9 t /ha, s n l

Bên c nh ó, trong s các cây công nghi p ng n ngày ang

ng trên 4,6 tri u t n.

c tr ng

Vi t nam, l c là

cây th c ph m, cây có d u quan tr ng trong s các lo i cây có d u hàng n m trên th gi i,
n ph m l c có ngu n protein cao làm th c n cho ng

i và gia súc, làm nguyên li u cho

công nghi p ch bi n. N m 2012 di n tích gieo tr ng l c trong c n
ng

c

t 220.000ha, s n

t 470.600 t n. Hàng n m Vi t Nam xu t kh u kho ng 40.000-45.000 t n l c

t

kim ng ch xu t kh u 24-26 tri u USD [17].
n th t sau thu ho ch

i v i cây ngô, l c là khá l n, trung bình t 13 - 15%.

vi c s n xu t ngô, l c trong v Xuân th
qu n, s ch ngô, l c trong
u không
tr ng,
ch t l

ng g p r t nhi u khó kh n cho vi c thu ho ch, b o

u ki n m a kéo dài trong giai

n cu i v thu ho ch. Ngô, l c

c b o qu n ho c b o qu n không úng qui trình s gi m ch t l

c bi t s phát sinh các lo i n m Aspergillus sp. Sinh
ng c ng nh hi u qu kinh t

c bi t

ng nghiêm

c t aflatoxin làm gi m

ng th i gây b nh ung th gan cho ng

i và

ng

t.
n

c ta c ng ã có m t s tác gi nghiên c u v m c

nhi m n m m c và

aflatoxin trên ngô, l c. Nguy n Phùng Ti n và c ng s [9] ã nghiên c u m c
c trên ngô, k t qu là 38 m u b o qu n trong kho l

nhi m

ng th c c a thành ph Thanh Hóa

ã nhi m n m m c thu c các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium,
Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum. Tuy nhiên ch a có s li u v

Footer Page 19 of 148.

10


Header Page 20 of 148.
c nhi m mycotoxin trong công trình này.

u Ng c Hào và c ng s

ã nghiên c u m c

nhi m m c và aflatoxin trên ngô c a các t nh S n La và Thanh Hóa. K t qu phân tích c a
24 m u ngô h t và 24 m u ngô b t cho th y các m u này ã nhi m A.flavus v i

l cao,

50-80%. Trong ó, có 33% s m u ngô h t ã nhi m aflatoxin B1 t 10-40ppb, 8,3% s
u nhi m aflatoxin B2 t 10-20ppb, 72% s m u ngô b t ã nhi m aflatoxin B1 t 25250ppb, 9,5% s m u ngô nhi m aflatoxin B2 t 10-20ppb, 74,7% m u khô l c nhi m
aflatoxin[4]. Nguy n Thùy Châu và c ng s
aflatoxin trên ngô và g o

m ts

a ph

ã nghiên c u m c

nhi m n m m c và

ng cho th y t n xu t nhi m aflatoxin trên ngô

mi n Nam và mi n B c Vi t Nam là cao t 73,3% - 95,8% trong ó hàm l
trung bình là 63,8ppb [10, 11]. N m 1990-1995 Vi n Dinh D

ng aflatoxin

ng ã ki m tra 387 m u

ng th c th c ph m nh n th y có 73 m u (19%) b nhi m aflatoxin, trong ó có 68%
u l c và các s n ph m t l c c ng có ch a lo i

c t này [16]. Phan Th Kim và C ng

ã ti n hành kh o sát phân tích trên 243 m u ngô, l c và s n ph m ch bi n làm th c n
gia súc t i 03 xã thu c huy n Tân K Ngh An tháng 6/2002 ã phát hi n m c
nhi m Aflatoxin khá cao trên 90% s m u l y t i các h gia ình ang
nhi m aflatoxin, t l v

t gi i h n cho phép theo quy

nh gi i h n hàm l

và nguy

c b o qu n b
ng aflatoxin

có trong th c ph m c a B Y t là trên 23% (56/243m u) [14].
1.1.5 Gi i h n aflatoxin cho phép trong nông s n th c ph m
Tr

c th c tr ng nhi m aflatoxin trên m t s nông s n

c c a aflatoxin

i v i s c kh e con ng

m c

i và v t nuôi, gây thi t

v y, nhi u qu c gia trên th gi i ã có nh ng quy

cao c ng nh tính
i v kinh t . Chính vì

nh gi i h n aflatoxin nhi m trong

ng th c, th c ph m và th c n ch n nuôi. Theo tiêu chu n c a c quan qu n lý Th c
ph m và D
quy nh

c ph m M (FDA) gi i h n aflatoxin cho phép trong l c
m c 15 ppb (8 ppb cho B1), trong các lo i h t khác và qu khô

là 10 ppb (5 ppb cho B1).
ng

i v i ng c c, qu khô và các lo i h t dùng

i, tiêu chu n nghiêm ng t h n và quy

nh

ch bi n

c

ch bi n ti p
n ngay cho

m c 4 ppb (2 ppb cho B1) [67]. Codex

a ra tiêu chu n riêng cho aflatoxinB1 là 7,5-10,5 ppb [33]. Gi i h n aflatoxin cho phép
trên nông s n th c ph m

Footer Page 20 of 148.

c trình bày

b ng 1.2.

11


Header Page 21 of 148.
ng 1.2 Gi i h n aflatoxin cho phép trên nông s n th c ph m

Gi i h n aflatoxin t i

c

Lo i th c n

a cho phép (ppb)

t ngô s d ng làm th c n cho gia súc, gia

20

20

m

t t c các giai

Hàm l

n khác nhau

ng t i a cho phép trong th c n cho gia

súc, gia c m ho c trong nguyên li u b t ngô

Châu Âu

5

Th c ph m s d ng cho ng

i

Canada

15

Các s n ph m th c ph m ch bi n t l c

Úc

15

Th c ph m ch bi n t d u

10

Cho t t c các lo i th c ph m ch a B1

100

Nguyên li u ch bi n th c n ch n nuôi

ut

ng và l c

Nh t
Trung

5 – 20

Ng c c,

Qu c

10 – 50

Trong các lo i th c ph m khác

30

ut

t c các lo i l

ng và d u th c v t

ng th c, th c ph m

Châu Á
120

Trong các s n ph m t l c

i Vi t Nam, B Nông nghi p và phát tri n nông thôn c ng ã ra quy nh v hàm
ng t i a aflatoxin B1 và hàm l

ng t ng s các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) trong

th c n cho gia súc, gia c m theo quy t

nh S 104/2001/Q /BNN (b ng 1.4) và quy

chu n k thu t Qu c gia 2013/QCVN/BNNPTNT - Quy nh gi i h n t i a cho phép hàm
ng

c t n m m c trong th c n tinh

n h p cho bò (b ng 1.3).

ng 1.3 Gi i h n aflatoxin trong th c n tinh h n h p cho Bê và Bò

Hàm l
STT

1

Lo i

ng aflatoxin tính theo microgam/kg
(ppb) t i a cho phép

ct

Aflatoxin B1

Bê (<6 tháng tu i)

Bò th t (> 6 tháng tu i)

50

100

200

500

ng s các aflatoxin
2
( B1+B2+G1+G2 )

Footer Page 21 of 148.

12


Header Page 22 of 148.
ng 1.4 Gi i h n aflatoxin trong th c n ch n nuôi

Aflatoxin B1

Aflatoxin t ng s

(ppb)

(ppb)

Gà con t 1 – 28 ngày tu i

< 20

<30

Nhóm gà còn l i

<30

<50

Không có

<10

Nhóm v t còn l i

<10

<20

Heo con theo m t 1 – 20 ngày tu i

<10

<30

Nhóm heo còn l i

<100

<200

Bò nuôi l y s a

<20

<50

Lo i v t nuôi

t con t 1 – 28 ngày tu i

1.2 ASPERGILLUS FLAVUS
Aflatoxin

c t o ra t m t s ch ng n m m c thu c chi Aspergillus nh : A. flavus,

A. parasiticus, A. nomius, A. pseudotamarii, A. bombycis.... [106]. Trong ó, loài A. flavus
có kh n ng sinh aflatoxin m nh nh t trong môi tr

ng t nhiên và nhân t o. Theo s li u

a Schoroder và Boller, có t 20-98% các ch ng A. flavus phân l p có kh n ng t o
aflatoxin [119]. A. flavus phân b
ph m,

kh p n i trên trái

t: d

i

t, trên các nông s n th c

c bi t là trên l c và các s n ph m ch bi n t l c. Ngoài ra chúng còn

c th y

nhi u trên s i bông, nh t là trên h t bông và khô h t bông, th c n gia súc, d m bông, d i
th t và nhi u th c n khác…A. flavus xâm nh p vào nông s n, th c ph m qua các
p nh nh ng ch do côn trùng hu ho i gây ra. Tuy nhiên,

cây l c t

m ti p

i A. flavus khó

xâm nh p, mà chúng xâm nh p khi c l c ã già, nh t là sau khi thu ho ch. A. flavus xâm
nh p vào h t l c ch a 15-20% n
1.2.1

c

c, t c là vào th i gian

u c a vi c làm khô [2].

m hình thái

A. flavus có màu vàng xanh lá cây, trên môi tr

ng nuôi c y nhân t o (Czapeck hay

th ch Sabouraud) hình thái khu n l c sau 24h nuôi c y có màu vàng nh t

trung tâm, rìa

mép b có màu tr ng m n, sau 48h hình thành mi n bào t trung tâm, xu t hi n các kh i
bào t chín màu vàng nh t chuy n sang màu vàng, sau 72-96 gi khu n l c phát tri n c c
i.

ng kính khu n l c

hình thành vòng tròn

t 4-5cm sau 6-7 ngày nuôi c y

ng tâm

u

n, th

phòng, các bào t

ng có 5-6 vòng tròn màu xanh l c trên b m t

khu n l c [1, 114].

Footer Page 22 of 148.

nhi t

13

Header Page 23 of 148.
A. flavus có kh n ng sinh các lo i
Theo k t qu

c t B1, B2 và axit cyclopizoic (CPA) [1].

ã nghiên c u c a nhi u tác gi , không ph i t t c các lo i A. flavus

kh n ng sinh

c t aflatoxin.

Pháp 25% s ch ng A. flavus phân l p

u có

ct l

ng

th c, th c ph m và th c n gia súc t o aflatoxin. Các ch ng A. flavus t o aflatoxin trên l c
chi m 96%,

h t bông chi m 78%,

ch ng vùng nhi t

lúa m ch chi m 49% và

i có nhi u loài sinh

ki n cho r ng các ch ng sinh

g o chi m 35% [2]. Các

c t h n so v i các ch ng vùng ôn

c t bao gi c ng có

u bào t

ính màu xanh l c, ngay

các gi ng nuôi c y lâu ngày, có th bình 2 l p, cu ng bào t
nh ng ch ng sinh

i. M t s ý

ính có vách, có gai,

c t có s phình to m t ph n s i trên s i n m t o thành nh ng m t

nh [2]. Tuy nhiên ch d a vào

c

m hình thái s r t khó

xác

nh chính xác nh ng

ch ng A. flavus có kh n ng sinh hay không sinh aflatoxin.
ng 1.5

c

c

m hình thái c a A. flavus

m hình thái A. flavus

- D ng khu n l c

- B ng

B m t: D ng len

nh giá

Hình dáng: hình c u, trùy

Màu s c: màu vàng xanh lá cây

ng kính: 25 -45 (µm)

Màu m t sau: tím nh t, nâu h ng

- Cu ng th bình

Gi t ti t: Có ho c không có

Có m t: Có ho c không

S c t hoà tan quanh khu n l c: Không

Kích th

ng kính: 6 -8 (cm)

- Th bình
Hình d ng: Hình bình

- Giá bào t tr n
B m t: Ráp ho c nh n

Kích th

c: 6,5-12×3-6 (µm)

- Bào t tr n

Chi u dài: 500 -800 (µm)
ng kính: 15 – 20 (cm)

Hình d ng: C u, hình tr ng

- Kh i bào t tr n

B m t: Có gai

Hình d ng: Tia to tròn, c t

ng kính tr c l n: 3 – 6 (µm)

ng kính: 300 -500 (µm)
Chi u dài: 50-300 (µm)

Footer Page 23 of 148.

c: 5-10 × 3,5× 5,5 (µm)

14


Header Page 24 of 148.

Hình 1.3 Khu n l c A. flavus

1.2.2 Các y u t

nh h

Hình 1.4 H s i A. flavus quan sát d

ng

ns

sinh tr

i kính hi n vi

ng c a A. flavus

Ngu n cacbon: A. flavus có các enzyme th y phân tinh b t, nh ng ngu n
hydrocacbon thích h p nh t cho s sinh tr
glucose và sacharose. Môi tr
sacharose, th

ng

ng và phát tri n c a các lo i n m này là

ng Czapeck – Dox có ngu n th c n cacbon d

c s d ng làm môi tr

ng nuôi c y và phân lo i A. flavus.

Ngu n nit : Có nhi u lo i vi n m không phát tri n
amôn, do khi

+

ng hoá NH4 trong môi tr

làm h th p pH c a môi tr

c trên môi tr

ng ch a mu i

ng s tích lu các ion SO4 , HPO42- và Cl-…
2-

ng hoá NO3- môi tr

ng. Khi vi n m

cation K+, Na+ …do ó làm t ng pH môi tr

i d ng

ng. A. flavus có kh n ng

mu i amon và nitrat. Ngoài ra chúng còn có kh n ng s

ng s tích lu các
ng hoá các lo i

d ng axit glutamic, prolin,

trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine, methionine [1].
Nguyên t khoáng: Ngoài các ngu n dinh d
và phát tri n, A. flavus còn òi h i m t l
Mg, Ca), các nguyên t vi l

ng ch y u trên

m cho s t n t i

ng c n thi t các nguyên t

al

ng (P, K, S,

ng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…), các mu i MgSO4, K2SO4,

KCl, FeSO4…c ng r t c n thi t cho s phát tri n c a A .flavus [1].
Nhi t

: A. flavus là lo i n m m c a nhi t, có th sinh tr

20-60oC, toopt 25-35oC, d

nhi t

ng và phát tri n

i 12oC A. flavus không phát tri n

d i

c ho c phát tri n

t y u [2].
pH: A. flavus có th phát tri n

kho ng pH khá r ng (pH = 2 - 8) tu thu c vào loài.

Tuy nhiên pH t i u cho s phát tri n c a chúng là 4,5-6,5 [2].

Footer Page 24 of 148.

15


Header Page 25 of 148.
m:

m c a môi tr

ng c ng nh

nh s sinh tr

ng c a h s i n m và s s n sinh bào t .

quan tr ng quy t

mt

p cho s phát tri n h s i c a A. flavus dao

ng

i c a không khí là y u t

m thích

ng t 80-85%. A. flavus phát tri n t t trên

các lo i c ch t có d u nh các nông s n l c, ngô, g o, bông. Hàm l

ng n

c trong c

ch t thích h p cho s phát tri n c a chúng t 15-30% [2].
1.2.3

u ki n sinh aflatoxin
nl

ng aflatoxin th

y. Khi s l

ng t l v i tr ng l

ng h s i n m

t giá tr t i u thì s n l

gi m sút nhanh chóng khi h s i n m b t
ki n nuôi c y thông th
A.flavus và t ng d n
ng l n

ng b t

u

ính c a

n sinh bào t m nh m [90]. Th i gian nuôi c y có nh

ng aflatoxin c a A. flavus. K t qu nghiên c u
cho s n l

a Gunnel cho th y,

ng sinh kh i c ng nh s n

t cao nh t [32].

Các nhi t

i cho s t o aflatoxin là 12oC, 25 oC - 35oC

c c ti u, t i thích, và c c

và 40oC - 42oC theo th t . Kh n ng sinh
y chuy n trên môi tr

ct

ng thích h p và ng

chuy n liên ti p trên môi tr

a A. flavus có th t ng khi chúng
c

u ki n pH, nhi t

c

i, b m t ho t tính sau nhi u l n c y

ng không thích h p. Môi tr

ho c các axit amin cùng v i
28 oC) là

n nh t, nh ng

u t phân gi i. S s n sinh aflatoxin trong

sau 7 - 10 ngày nuôi c y b m t ch ng A. flavus
ng aflatoxin

ng aflatoxin là

u t lúc hình thành các c quan mang bào t

n giai

ns nl

ng và h s i n m t o thành khi nuôi

ng có b sung n m men, pepton

thích h p (pH = 5–5,4; nhi t

26–

u ki n t t nh t cho s t o aflatoxin.

Hàm m c a c ch t c ng là y u t quan tr ng nh h
30oC và

A.flavus và s t o aflatoxin. Theo Diener, nhi t
aflatoxin l n nh t
c nhân có hàm l
24-26% thì

ngô và
ng n

ng

n s phát tri n c a

m 25% cho s hình thành

m 83-88% cho s hình thành aflatoxin th p nh t [53].

c t 15-30%, trên ngô là 19-24% và trên g o c n l

ng n

c là

hình thành aflatoxin xu t hi n sau 2 ngày. Nh v y có th nói, s sinh t ng

p aflatoxin di n ra r t nhanh,

c bi t sau thu ho ch. C ch t có hàm l

th i gian làm khô kéo dài là nguyên nhân d n

ng n

c cao,

n nhi m aflatoxin [4]

Ngoài ra các vitamin nhóm B c ng có tác d ng kích thích s t o thành các afltoxin.
Ng

i ta ã xác

o ra

giai

nh

c khi A. flavus phát tri n trên h t lúa m thì hàm l

n phôi m m nhi u h n h n

giai

n phôi nh . Vi c thêm n

m lúa m , lipit hay các axit béo s kích thích t t s hình thành aflatoxin.
ng

ng afltoxin
c chi t t
u này khi n

i ta ngh r ng các ch t này có vai trò quan tr ng trong vi c sinh t ng h p aflatoxin vì

Footer Page 25 of 148.

16