Nghiên cứu khả năng nhân giống cây bình vôi stephania rotunda lour bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI KHÁNH LY
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI
(Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Thái Nguyên, năm 2016

Thái Nguyên, 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI KHÁNH LY
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI
(Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VTRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa
: CNSH-CNTP
Lớp
: 44-CNSH
Khóa học
: 2012-2016
Giảng viên hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình
Bộ khoa học và công nghệ
2.ThS. Nguyễn Thị Tình
Khoa CNSH-CNTP - Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã
tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên khả năng nhân giống cây Bình Vôi
(Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp in vitro”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh họcCông nghệ Thực phẩm, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt đƣợc kết
quả nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu
Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh
học-Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện cho
em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, ThS. Nguyễn
Thị Tình và ThS. Ma Thị Hoàn đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong
thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể
và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn bè đã giúp
đỡ em trong thời gian vừa qua.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những
thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn
để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Bùi Khánh Ly


ii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2] ................................4
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất....................................................................25
Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến khả

năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro sau 7 ngày .....................................27
Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi cây
Bình Vôi sau 20 ngày theo dõi. .................................................................................28
Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với GA3 đến khả năng tái
sinh chồi của cây Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy ....................................................28
Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp BA đến khả năng nhân nhanh chồi của
cây Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy. ..........................................................................29
Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hƣởng của Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi của
cây Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy. ..........................................................................29
Bảng 3.7: Nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA và than hoạt tính (0,5 g/l) đến khả năng
ra rễ cây Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy. ................................................................30
Bảng 3.8: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IBA và than hoạt tính (0,5 g/l) đến khả năng
ra rễ cây Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy. ................................................................30
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ và thời gian sử dụng chất khử
trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro. (sau 7 ngày)
...................................................................................................................................32
Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh
chồi cây Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy ...................................................................35
Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với
Bảng 4.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi Bình vôi sau 30 ngày nuôi cấy ..........................................................................39
Bảng 4.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ Kinetine đến khả năng nhân
nhanh chồi Bình vôi sau 30 ngày muôi cấy ..............................................................41


iii
DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 2.1: Cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) .....................................................5

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến
khả năng nhân giống invitro cây Bình Vôi. ..............................................................26
Biểu đồ 4.1: Biểu diễn ảnh hƣởng nồng độ, thời gian khử trùng của HgCl2 đến khả
năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro. (sau 7 ngày) .................................34
Biểu đồ 2: Biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi của cây
Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy .................................................................................36
Hình 4.1: Chồi cây Bình Vôi trong MT bổ sung nồng độ BA kết hợp với các nồng
độ GA3 khác nhau sau 20 ngày nuôi cấy...................................................................38
Hình 4.2: Chồi cây Bình Vôi trong MT bổ sung tổ hợp BA với các nồng độ khác
nhau đến khả năng nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy. .............................................40
Hình 4.3: Chồi cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung nồng độ Kinetine khác nhau
đến khả năng nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy. ......................................................42
Hình 4.4: Rễ cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và NAA ở
các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. ..........................................................44
Hình 4.5: Rễ cây Bình Vôi trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và IBA ở
các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. ..........................................................46


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA

: 6-Benzylaminopurine

GA3

: Gibberellic Acid

IBA

: Indole butyric acid

MS

: Murashige & Skoog (1962)

CS

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/c

: Đối chứng

LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trƣờng

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization


v
MỤC LỤC
Trang
Phần 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .............................................................................2
1.2.1. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu đề tài ....................................................................................................3
1.3. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................3
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học: ....................................................................................3
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn: ....................................................................................3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4
2.1. Giới thiệu chung về chi Bình vôi .........................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc .........................................................................................................4
2.1.2. Phân loại Chi .....................................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm hình thái và phân bố ..........................................................................4

2.2. Giá trị của cây Bình Vôi.......................................................................................6
2.2.1. Giá trị về kinh tế ................................................................................................6
2.2.2. Giá trị về dƣợc liệu............................................................................................6
2.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới. ..............................................9
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ....................................................................9
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam.................................................................10
2.4. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật .........................11
2.4.1. Khái niệm ........................................................................................................11
2.4.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật ...........................................12
2.5. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro ...................................................12
2.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ..........................................................................................12
2.5.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy .....................................................................................13
2.5.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi ..............................................................................13
2.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh .........................................................................................14


vi
2.5.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên .............................................14
2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật ................15
2.6.1. Vật liệu nuôi cấy .............................................................................................15
2.6.2. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................15
2.6.3. Môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật .........................................................16
2.7. Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình Vôi ..................................................22
2.7.1. Nhân giống bằng phƣơng pháp hữu tính .........................................................23
2.7.2. Phƣơng pháp nhân giống vô tính ....................................................................23
2.7.3. Phƣơng pháp nhân giống in vitro. ...................................................................23
2.7.4. Phƣơng pháp chế biến và sử dụng. .................................................................24
Phần 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............25
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................25
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................25

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................25
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................25
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................25
3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................26
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................26
3.5.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy invitro .............................................................26
3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................26
3.5.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................27
3.5.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm........................................................................30
3.6. Xử lí số liệu ........................................................................................................31
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................32
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ và thời gian sử dụng chất khử trùng
HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro. ..............................32
4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của Cytokinine và Gibbererllin đến khả năng tái sinh
chồi cây Bình Vôi ......................................................................................................34


vii
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi
cây Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ. ..............................................................34
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với GA 3 đến khả
năng tái sinh chồi cây Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ ..................................36
4.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số cytokinine đến khả năng nhân nhanh chồi
cây Bình Vôi. ............................................................................................................39
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Bình Vôi .....................................................................................................39
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ Kinetine đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Bình Vôi ..........................................................................................41
4.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng một số Auxin đến khả năng ra rễ của cây Bình Vôi.....43
4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

cây Bình Vôi .............................................................................................................43
4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ cây Bình
Vôi .............................................................................................................................45
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................47
5.1. Kết luận ..............................................................................................................47
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................47


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
PGS, TS Lê Xuân Cảnh (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) cho biết:
năm 1992, trung tâm giám sát bảo tồn thế giới xếp Việt Nam là một trong 16 quốc
gia có đa dạng sinh học cao nhất thế giới. Theo số liệu báo cáo quốc gia về đa dạng
sinh học (năm 2011) cho thấy, tại Việt Nam ghi nhận đƣợc khoảng hơn 49 nghìn
loài sinh vật, bao gồm: khoảng 7.500 loài/chủng vi sinh vật; 20 nghìn loài thực vật
trên cạn và dƣới nƣớc; 10.500 loài động vật trên cạn; hơn 11 nghìn sinh vật
biển...[44]. Nguồn dƣợc liệu của Việt Nam cũng rất phong phú, đa dạng và đƣợc sử
dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa trị nhiều bệnh khác nhau. Theo kết quả điều
tra nguồn tài nguyên dƣợc liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001 – 2005 của Viện dƣợc
liệu (2006) cho biết Việt Nam có khoảng 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và
nấm lớn đƣợc dùng làm thuốc [45]. Một trong số cây thuốc đƣợc sử dụng nhiều là
cây Bình Vôi.
Trong củ Bình Vôi có chứa alkaloid bao gồm L-tetrahydropalmatin
(rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Ngoài ra còn có tinh bột, đƣờng khử
oxygen, acid malic, men oxydase [22]. Trong đó quan trọng nhất là Ltetrahydropalmatin (rotundin) và roemerin và cepharanthin. Rotundin có tác dụng
giảm đau, an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hòa hô hấp và điều hòa tốt đối với tim
mạch [12]. Hàm lƣợng hoạt chất này có trong củ Bình Vôi tƣơi khoảng 0,12 –

0,3%. Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp.
Cepharanthin đƣợc coi là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm
nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thƣ. Ngoài ra,
Bun Sok-Siya và cs (2009) đã chiết xuất cepharanthin có tác dụng ức chế 2 dòng tế
bào ung thƣ đại trực tràng và ung thƣ gan [40]. Mặt khác, còn ức chế sự phát triển
của trực khuẩn lao. Ngoài công dụng điều trị bệnh, củ Bình Vôi còn dùng làm vật
trang trí đẹp và đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng [5].


2

Ở Việt Nam củ Bình Vôi đƣợc tìm thấy ở những vùng có núi đá nhƣ: Hà
Giang, Tuyên Quang, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nam, Hải Phòng, Cao
Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thanh Hóa. Tuy nhiên giá trị dƣợc liệu của củ Bình vôi
lại phụ thuộc rất nhiều vào vùng phân bố và điều kiện sinh thái.
Hiện nay, nguồn củ Bình vôi chủ yếu đƣợc khai thác từ tự nhiên mà ít có các
nghiên cứu về trồng trọt và nhân giống. Bình vôi nhân giống bằng hạt đƣợc tạo ra từ
quá trình thụ phấn giữa hoa đực và hoa cái [5]. Tuy nhiên cây cho hoa đực và cây
cho hoa cái nằm khác gốc vì vậy việc thụ phấn gặp nhiều khó khăn [46]. Với
phƣơng pháp cắt phần củ thành từng mảnh đem trồng không đem lại hiệu quả cao
do điều kiện thời tiết nóng ẩm mƣa nhiều của nƣớc ta, vi sinh vật hoạt động mạnh
dẫn đến thối củ. Vì vậy hiện nay củ Bình vôi đang rất khan hiếm trong tự nhiên và
đã đƣợc đƣa vào danh mục cần bảo tồn. Theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày
30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, trong danh mục “Thực vật rừng nguy cấp, quý
hiếm” thì các loài Bình vôi (Stephania sp.) đƣợc xếp trong nhóm IIA (Thực vật
rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại) [5].
Phƣơng pháp nhân giống in vitro với những ƣu điểm là tạo ra những giống
cây trồng sạch bệnh, chất lƣợng tốt, đồng đều và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn.
Nhận thức đƣợc việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý tiềm năng, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Bình Vôi

(Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp in vitro”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu đề tài
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng nồng độ và thời gian khử trùng của chất khử
trùng dến khả năng tạo vật liệu vô trùng trong nuôi cấy cây Bình Vôi bằng phƣơng
pháp in vitro.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả
năng tái sinh, nhân nhanh chồi, ra rễ từ đoạn thân mang chồi ngủ cây Bình Vôi bằng
phƣơng pháp in vitro.


3

1.2.2. Yêu cầu đề tài
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến
khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vtiro.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả
năng tái sinh chồi cây Bình Vôi.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến
khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích thích sinh trƣởng đến khả
năng ra rễ cây Bình Vôi.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học:
+ Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của một số chất kích
thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ từ đoạn thân mang
chồi ngủ của cây Bình Vôi.
+ Cung cấp tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh viên hoàn
thiện cả về kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn.
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn:

Góp phần nhân nhanh tạo số lƣợng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo tồn
loài dƣợc liệu quý theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006
của Chính phủ, đảm bảo nguồn nguyên liệu chất lƣợng cung cấp cho ngành y dƣợc.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về chi Bình vôi
2.1.1. Nguồn gốc
Chi Bình vôi (Stephania) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) có nguồn
gốc ở miền Đông, Nam Châu Á và Australia [16]. Ở Việt Nam, cây mọc hoang
tại nhiều vùng rừng núi.
2.1.2. Phân loại Chi
Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2]
Giới (regnum)

Plantae

Ngành

Magloliophyta

Phân lớp

Magloliosida (Dicotyedones)

Bộ (ordo)

Ranunculales

Họ (familia)

Menispermaceae

Chi (genus)

Stephania

Loài (Species)

Rotunda

Chi Bình Vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania
spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát
(Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê). Một số loài công bố ở Việt Nam:
Stephania glabra (Roxb) Miers, S. kuinanensis, S. Pierrei Diels, S. Sinica Diels,
S.rotunda Lour,…[42]. Trên thế giới, chi Bình vôi có hơn 40 loài. Ở Việt Nam,
chi Bình vôi có 13 loài với 4 loài đã có tên trong “Sách đỏ Việt Nam” [20].
2.1.3. Đặc điểm hình thái và phân bố
Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi
Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae). Ở Việt Nam còn có các tên gọi khác
nhƣ là: cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,…


5

Hình 2.1: Cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour)
Bình vôi là cây mọc hoang dại, thích hợp ở nhiệt độ trung běnh năm 21-230C,

lƣợng mƣa 2000 – 2500 mm, ƣa đất nhiều mùn, thoát nƣớc, độ pH = 6,5-7.
Các loại Bình vôi có đặc điểm chung nhƣ sau: dây leo, thân nhẵn hơi xoắn vặn,
thƣờng xanh, sống lâu năm. Rễ củ đa dạng, có thể rất to và nặng tới gần 20kg, vỏ ngoài xù
xì màu nâu - nâu đen. Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3;
phiến lá mỏng, hình tim, gần hình tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá
xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dƣới lá. Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ
lá hoặc những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài xếp
thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thƣờng là 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh
hoa; bầu hình trứng. Quả hạch hơi dẹt, mọng nƣớc màu đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình
móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang 4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa
có lỗ thủng hoặc không. Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [11],[26].
Đặc điểm hình thái của một số loài Bình vôi [26], [43]:
Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dƣới đất một
nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ
biến ở các rừng thƣa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,…
Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích
thƣớc nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa.
S. hainanensis H.S. Lo et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu
trắng hoặc vàng nhạt.


6

S. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác.
S. dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau
có màu tím hay tím hồng.
S. excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ
lệch một bên.
S. cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ.
S. sinica Diels: Giá noãn không có lỗ.

Stepphania viridiflavens H.S.Lo et Yang: Lá có phiến hình tam giác, cuống
lá bằng hoặc dài hơn phiến lá.
Các loại Bình vôi ở nƣớc ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền Bắc,
Trung, Nam. Thƣờng tập trung ở vùng núi đá vôi nhƣ Tuyên Quang, Cao Bằng,
Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa Vũng Tàu. Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh học.
2.2. Giá trị của cây Bình Vôi
2.2.1. Giá trị về kinh tế
Cây Bình Vôi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của
nƣớc ta, là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt
Nam. Nó có thể phát triển tốt khi đƣợc trồng trong đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát
nƣớc mà không cần tốn công chăm sóc hay kỹ thuật canh tác cao nhƣng lại mang
giá trị kinh tế cao cho ngƣời trồng.
Cây Bình Vôi đƣợc coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của ngƣời dân tộc
vùng cao. Bên cạnh đó, cây Bình Vôi còn là cây có tiềm năng lớn trong y học, là
nguồn nguyên liệu cho ngành dƣợc.
Tuy nhiên, trƣớc việc khai thác ồ ạt của ngƣời dân thì loại cây quý này đang
dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên.

2.2.2. Giá trị về dược liệu


7

Cây Bình Vôi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt
chất có giá trị về dƣợc liệu. Cây bình vôi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc. hoạt
chất đƣợc các nhà khoa học quan tâm và chiết suất nhiều từ cây bình vôi là
rotundin - một hoạt chất rất cần trong y học. Nhiều thí nghiệm lâm sàng trên chuột
cống trắng cho thấy Bình Vôi có tác dụng an thần, gây ngủ.
Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình Vôi đƣợc dùng dƣới dạng
thuốc sắc hay ngâm rƣợu để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng,…

Liều dùng: 3 - 6 g/ngày. Thuốc ngâm rƣợu gồm bột Bình Vôi (1 phần) với rƣợu 40°
(5 phần); mỗi ngày uống 5 - 15 ml, có thể thêm đƣờng cho dễ uống. Để tránh bị ngộ
độc, chỉ nên sử dụng với liều nhỏ: Ngƣời lớn ngày uống 3 – 6g. Trẻ nhỏ dùng với
liều lƣợng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 – 0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi
[28]… Trong y học hiện đại, rotundin đƣợc dùng làm thuốc an thần, giảm đau, điều
trị một số trƣờng hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh,
mất ngủ dai dẳng do nguyên nhân tâm thần [10]. Liều dùng: 0,05 - 0,10g/ngày, dƣới
dạng viên L - tetrahydropalmatin clorhydrat, mỗi viên 0,05g [28], [41].
Trong củ bình vôi chứa một lƣợng chất alkaloid bao gồm Ltetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này
đƣợc sử dụng nhiều để điều chế thuốc, đặc biệt là thuốc an thần. Chất quan trọng
nhất là rotundin.
Các công trình khẳng định vai trò của Rotundin trong củ Bình vôi đã đƣợc
công bố nhƣ sau:
Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với GS.TS Đỗ Tất Lợi, Bonnet và
Bùi Đình Sang đã chiết xuất từ củ bình vôi Stephania. Rotunda một hợp chất thuộc
nhóm alcaloid và đặt tên là rotundin. Năm 1965, chất này đƣợc xác định là L.
tetrahydropalmatin. Đƣa Việt Nam trở thành nƣớc đầu tiên trên thế giới chiết xuất
đƣợc rotundin.
Năm 1962, Fakhrutdinov Sf xác định roemerin gây tê niêm mạc và phong bế.
Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp,
với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trƣơng. Roemerin đối kháng với tác


8

dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine. Đối với hệ thần kinh trung ƣơng với liều
thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến
tử vong. Roemerin còn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp [37].
Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka và cs (1984), Cepharanthin có tác
dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hoàn, tăng cƣờng sinh sản kháng thể nên

có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do
chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thƣ, sự biến động số lƣợng hồng cầu hoặc
sắc tố máu hầu nhƣ không có thay đổi khi dùng cepharanthin. Tác dụng phụ do uống
cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện [31].
Năm 1999, tác giả Nguyễn Tiến Vững đã tổng kết các loài trong chi
Stephania trên thế giới gồm 164 hợp chất thuộc 8 nhóm hóa học khác nhau
(benzylisoquinolin, bis - benzylisoquinolin, protoberberin, aporphin, proaporphin,
hasubanan, morphinan, dibenzazonin) [41].
Năm 1999, theo Ngô Đại Quang tác đụng dƣợc lý của rotundin đã đƣợc
nghiên cứu ở nƣớc ta từ thời Pháp thuộc. Rotundin đƣợc áp dụng từ năm 1944 và
suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã đƣợc dùng để điều trị có kết quả một
số trƣờng hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và
an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ƣu điểm nổi bật nhƣ độc tính thấp,
sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và
không gây nhức đầu nhƣ các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [16].
Phạm Thị Kim và cs bộ khoa học khác ở Viện Dinh dƣỡng và Học viện
Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tƣơng
đƣơng với 7,5g dùng cho ngƣời lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dƣợc
điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định đƣợc
LD50 đƣờng uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn của chế phẩm cao. Rotundin ít
độc, khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất
thời nhƣng lại khỏi sau 1-2 ngày. Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và
60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg),


9

dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá
tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v...[28], [41].
2.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới.

2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhu cầu sử dụng thuốc cho điều trị bệnh trên thế giới ngày càng tăng. Theo
thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số thế giới
dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, trong đó
chủ yếu là thuốc từ cây cỏ. Thế giới hiện nay có hơn 35000 loài thực vật dùng làm
thuốc, trong đó có khoảng 2500 cây thuốc đƣợc buôn bán trên thế giới. Ở Châu Âu, có
ít nhất 2000 cây thuốc đƣợc sử dụng. Ở Châu Á, có khoảng 5000 loài ở Trung Quốc,
1700 loài ở Ấn Độ, trong đó có đến 90% thảo dƣợc thu hái hoang dại [1].
Năm 1944, Kondo (Nhật) đƣa ra công thức khai triển của rotudin với công
thức thô là C13H19(OCH3)3CH3N.
Năm 1950 và 1952 Qiaudry G. R và Siddiqui (Ấn Độ) đã nghiên cứu và
chiết từ củ cây Stephania Glabra (Roxb). Miers nhiều alkaloit và đặt tên là
hyndarin C23H25O4N, Stefarin C18H9O3N và cyckanin C 38H42O6N trong đó
hyndarin chiếm thành phần chủ yếu (chừng 30% hyndarin, 15-18% stefarin và
rất ít cyckanin). Nghiên cứu cấu tạo hyndarin ngƣời ta thấy rằng hyndarin thực ra
cũng chỉ là một alkaloit đã biết có tên là tetrahydropanmatin [11].
Trƣớc năm 1965, ngƣời ta vẫn cho rằng hyndarin và rotundin là hai alkaloit
khác nhau vì chiết từ hai cây khác nhau, mọc tại hai nƣớc khác nhau. Nhƣng đến
năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn liên bang Xô Viết cũ
(VILAR) có dịp so sánh hai cây, một di thực từ Ấn Độ, một di thực từ Việt Nam,
thấy rằng hai cây chỉ là một loài nên đã kiểm tra lại tính chất của rotundin và đã xác
định rotundin và hyndarin chỉ là một chất và có cấu tạo của tetrahydropanmatin.
Năm 1965 tại Liên Xô cũ, Phan Quốc Kính và cs cũng chiết từ củ Bình vôi
mang từ Việt Nam sang một số alkaloit và đặt tên là alkaloit A, alkaloit C và D với
tỷ lệ 0,08% mỗi thứ (Hoá học các hợp chất thiên nhiên, 6-1965) [11].


10

2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi mọc ở Việt Nam các
chất tinh bột, đƣờng khử oxy, axít malic, men oxydaza và một alkaloit với tỉ lệ
1,2-1,5% (tính trên củ tƣơi), đƣợc Bùi Đình Sang đặt tên là rotudin [11].
Năm 1964, tại Bộ môn dƣợc liệu (Trƣờng Đại học Dƣợc khoa, Hà Nội) Ngô
Văn Thu còn chiết từ củ Bình vôi Việt Nam một ancaloit mới là roemerin. Từ rễ củ
loài S.pierei Diels thu hái ở vùng ven biển Bình Định, Ngô Thị Tâm đã phân lập
đƣợc cepharantin (1%).
Năm 1886, Ngô Vân Thu và Trần Hùng tiến hành nghiên cứu khảo sát các
cây mang tên Bình Vôi [7].
Năm 1988 Ngô Vân Thu và Trần Hùng tiến hành bƣớc đầu nghiên cứu cây
Bình Vôi Biển [8].
Năm 1997 Phạm Thanh Kỳ chiết từ rễ củ của loài S.brachyandra có:
isocorydin (1,5%), tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin (0,3%) ,sinomenin (0,1%),
corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%), isoboldin
(0,004%), dihydrosalutaridin (0,001%) và N-metyllaurotetanin (0,006%). Trong rễ
củ loài S.kwangsiensis có: tetrahydropalmatin, capaurin, isocorydin, roemerin,
dihydroromerin, dehydrostephanin, stephanin, dihydropalmatin và palmatin [10].
Trong rễ củ loài S.sinica có alkaloid chính là Rotundin (1,2-1,5%).Từ rễ củ loài
S.cepharantha đã phân lập đƣợc alkaloid chính là cepharanthin và những alkaloid phụ
khác: isotetrandin, berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin, crebanin, o-nornuciferin,
stesakin, palmatin, cepharamin.Trong rễ củ loài S.dielsiana có: crebanin (0,3%), sinoacutin
(0,2%), stephanin(0,2%), tetrahydropalmatin (0,1%) và dehydrostephanin.
Năm 2003, Nguyễn Viết Thân , hàm lƣợng alcaloid toàn phần thu đƣợc trong
dƣợc liệu ít nhất là 2% tính theo dƣợc liệu khô [22].
Theo Bùi Thị Bằng (2006), hàm lƣợng rotundin đạt tới 3,55% ở loài
S.brachyandra Diels (thu ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài S.sinica Diels (thu ở Hà
Nam Ninh), 1,30% ở loài S.kwangsiensis H.S.Lo (thu đƣợc ở Quảng Ninh), 0,72%
ở loài S.hainanensis H.S.Lo et Y.TSoong (thu ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài

11

S.cambodia Gagnep (thu ở Lâm Đồng), 0,29% ở loài S.cepharantha (thu ở Hà Sơn
Bình), 0,21% ở loài S.peirrei Diels (thu đƣợc ở Tây Nguyên) [4].
Năm 2007, Thủ tƣớng chính phủ ra quyết định phê duyệt "Chƣơng trình
nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá
dƣợc đến năm 2020" nhiệm vụ đề ra trong Lĩnh vực 1: Kế thừa và phát huy các kết
quả nghiên cứu khoa học công nghệ trƣớc đây để sản xuất các hoạt chất thiên nhiên
từ thanh hao hoa vàng, hoa hoè, chè xanh, gấc,...Chiết tách, bán tổng hợp một số
hoạt chất chính sau đây để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, có đề cập tới Nội dung :
Sản xuất L-rotundin và L-rotundin sulfat từ củ Bình Vôi (stephania rotunda) và
D,L-rotundin sulfat từ palmatin hydrochlorid chiết xuất từ cây hoằng đằng
(Fibraurea tinctoria) [29]
Năm 2010, Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh đã tiến hành nghiên cứu
nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất anlkaloid rotudine từ cây Bình vôi
(Stephania rotunda Lour) [15].
Nghiên cứu bảo tồn và phát triển cây dƣợc liệu tạo ra các sản phẩm hàng
hóa có sức cạnh tranh trên thị trƣờng. Phát triển các giống cây đẳng sâm, hoàng
đằng, thạch hộc, kê huyết đằng, cẩu tích, sa nhân, thiên niên kiện, thổ phục linh, lan
kim tuyến, trà hoa vàng, cây mật nhân, Sâm Cau, Bình Vôi, Gấc [3].
2.4. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
2.4.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi
cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trƣờng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [14].
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thƣờng sử dụng cho việc
ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận
khác nhau của thực vật với kích thƣớc nhỏ [14].
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thƣờng dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và
nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phƣơng thức
nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau [15].

12

2.4.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
2.4.2.1. Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào
Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu
tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm
của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân
hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi
gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [21].
2.4.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sang tế bào chuyên hoá
để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh
để thực hiện chức năng phân chia.
Hoạt động của các quá trình này đƣợc điều khiển bởi các chất điều hòa
sinh trƣởng thực vật, cũng nhƣ các yếu tố nhiệt độ, môi trƣờng, ánh sáng.
2.5. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro
Trịnh Đình Đạt (2007) [6]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:
2.5.1. Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục
đích là phải tạo đƣợc nguyên liệu vô trùng để đƣa vào nuôi cấy. Có thể vô trùng mẫu nuôi
cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn nhƣ: NaOCl, CaOCl2, HgCl2,…[6].
Mẫu đƣa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao;
tốc độ sinh trƣởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy
mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thƣờng đƣợc chọn và đƣa

vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trƣởng, chồi nách, đoạn thân…
Sharma G.J. (2005) [36] đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây
địa liền và cây ngải máu. Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl 2 0,2% trong 15


13

phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu. Dƣơng Tấn Nhựt và cs (2011) [33]
tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng cồn 70% trong 30 giây và HgCl2
trong 5 phút thu đƣợc tỷ lệ mẫu sạch cao.
2.5.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trƣởng tốt.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mô đƣợc đƣa vào nuôi cấy. Quá trình này
đƣợc điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trƣởng (tỷ lệ
auxin/cytokinin) đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Nayak S. và cs (2011) [32]
nghiên cứu nhân giống cây riềng in vitro cho thấy: Khi thử nồng độ BA từ 1 - 3
mg/l đến khả năng bật chồi thì cho thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt
nhất. Behera K.K. và cs (2010) [30] sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để
cảm ứng chồi cây nghệ vàng. Bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu
đem vào nuôi cấy. Thƣờng các mô non, chƣa phân hoá có khả năng tái sinh cao
hơn những mô đã chuyển hoá.
2.5.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lƣợng
thông qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Để tăng hệ số nhân chồi
ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy các chất điều h ̣a sinh trƣởng
(auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm
mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy
thƣờng là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cƣờng độ ánh sáng 2000 - 4000

lux. Tuỳ thuộc vào đối tƣợng nuôi cấy, ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng cách
kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát
triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính. Theo
Jala A. và cs (2012) [38] nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp
BA 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau
80 ngày nuôi cấy.


14

2.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt đƣợc kích thƣớc nhất định các chồi đƣợc chuyển sang môi trƣờng
ra rễ. Thƣờng sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn
chỉnh. Ở giai đoại này ngƣời ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các chất điều
hoà sinh trƣởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormon thực vật quan trọng có chức
năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4D đƣợc nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi. Nguyễn Thị Liễu
và cs (2011) [13] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của 2,4-D đến khả năng tạo rễ bất
định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định sâm
Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/l trong môi trƣờng MS bổ sung sucrose 50 mg/l.
2.5.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai đoạn
chuyển cây từ môi trƣờng dị dƣỡng sang môi trƣờng tự dƣỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vƣờn ƣơm cũng nhƣ trong ruộng sản xuất. Sen A. và cs (2010) [34] khi
chuyển cây nghệ in vitro sang đất vƣờn và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây
vi giống sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng trong môi trƣờng tự nhiên.
Shahinozzaman M. (2013) [35] chuyển cây con tái sinh in vitro sang chậu nhựa
có chứa hỗn hợp đất vƣờn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và đƣợc làm thích nghi. Kết
quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao.

Theo Goer (1993) để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm với tỉ lệ sống
cao, cây sinh trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nƣớc.
- Phải chủ động điều chỉnh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng của vƣờn ƣơm cũng
nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp.


15

2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.6.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay
bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm,
trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [24].
Tuy mang cùng lƣợng thông tin di truyền nhƣng các cấu trúc mô khác nhau trên
cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc
lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lƣợng
cây lấy mẫu, kích thƣớc và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [24].
Mẫu nuôi cấy trƣớc khi đƣa vào nuôi cấy phải đƣợc vô trùng. Phƣơng pháp
phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật. Hóa chất đƣợc lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:
Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vô
trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật
của hóa chất. Một số hóa chất thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là:
Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân
clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) [24].
2.6.2. Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác với
mẫu cấy đƣợc tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống màng lọc
giúp lọc vi sinh vật, có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật trong không
khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy. Để khử trùng dụng cụ và môi
trƣờng nuôi cấy có thể sử dụng các phƣơng pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử
trùng ƣớt (hấp vô trùng), màng lọc [24].
- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong phòng ổn định
về ánh sáng và nhiệt độ [24].


16

2.6.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trƣờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.6.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a) Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều
kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trƣờng hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô
trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [23].
Phƣơng pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.
Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ
mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thƣờng hay sử dụng một số
hoá chất nhƣ: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để khử trùng.
b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH
- Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hƣởng từ các yếu tố nhƣ:
thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng. Thời gian chiếu

sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [23].
Cƣờng độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Theo Ammirato (1986): Cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trƣởng
của mô sẹo. Ngƣợc lại, cƣờng độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra
chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật
in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vƣơn cao nhƣng lại có
ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí