quy chình xác định shighella

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NHÓM: 10

Quy trình định tính Shigella
GVHD:


Danh sách sinh viên:
1. Trần Thị Diễm Kiều

2005140251

2. Nguyễn Phương Hồng Thúy

2005140591

3. Võ Thị Thu

2006140329

4.Nguyễn Hồng Ngọc

2006140213

5.Nguyễn Thị Ánh tuyết

2006140393

1.Tình hình ngộ độc TP

2. Đặc điểm vi khuẩn Shigella

NỘI DUNG CHÍNH

3. Nguyên tắc
4. Môi trường và hóa chất

5. Quy trình phân tích

6. Bước tiến hành


I. Tình hình ngộ độc Thực phẩm

•
•
•

Lỵ do Shigella là một bệnh phổ biển, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao.
Hàng năm có 165 triệu đợt lỵ trong đó : 99% ở các nước đang phát triển, 69% ở trẻ em dưới 5 tuổi.
Trong 1,1 triệu người bị tử vong do Shigella ở các nước đang phát triển thì 60% là trẻ dưới 5 tuổi

Theo nhóm huyết thanh:

•
•


Ở các nước đang phát triển: S.flexnerie; S.sonnei; S.dysenteriae và S.boydii
Ở các nước phát triển: S.sonnei; S.flexnerie; S.dysenteriae và S.boydii
Theo tuyp huyết thanh: Các địa dư khác nhau thì phân phó theo các tuyp huyết thanh khác nhau.


II. Đặc điểm vi khuẩn Shigella
 

- Những trực khuẩn gram âm dài 1-3 m

-

Không sinh nha bào, không di động
hiếu khí kỵ khí tuỳ nghi. Thuộc họ enterobacteriaceae.

-

0
o
0
Topt 37 C nhưng có thể phát triển ở T 8-40 C

-

pHopt là 7,8 nhưng phát triển được ở pH 6,6 -8, 8

-

Các Shigella đều

có

nội

độc

tố

và

một

số

có

ngoại

độc

tố.

+ Nội độc tố: Nội độc tố có tính độc mạnh, là một kháng nguyên yếu tác dụng chủ yếu là gây phản
ứng

trong

ruột.

+ Ngoại độc tố: Ngoại độc tố có tính độc cao, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh trung ương.


 Hình thể và tính chất bắt màu

•  Shigelia có dạng hình que thẳng dài 1-3 m, không có lông, không di động, không
có vỏ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm.

. Shigella flexneri

Shigella dưới kính hiển vi


Đặc điểm sinh hóa khác



Hầu hết các loài không lên men và tạo axit từ lactose, saccarose (trừ S.
sonnei lên men chậm sau 48 giờ)



Không có enzym lysine decarboxylase => Có phản ứng LDC âm tính

Lên men đường mannitol (trừ S. dysenteria).
 Lên men đường glucose không sinh hơi (trừ S.Flexneri 6,
S. Boydii 14 sinh hơi yếu).

Không có khả năng sử dụng citrate và molonate. Không sinh indol
Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có các tính chất

chung của họ này là oxydase (-), glucose (+).

 Không làm lỏng gelatin.



PHÂN LOẠI
Shigella

− Shigella có kháng nguyên thân O, không có kháng nguyên H. Dựa vào kháng nguyên O

Nhóm A:

Nhóm B:

Nhóm C:

Nhóm D:

S. dysenteria (có 10 typ huyết

S. flexneri (có 6 typ huyết thanh

S. boydii (có 15 typ huyết thanh).

S. soinnei (chi có 1 typ huyết

thanh; S.shiga có 1 typ huyết

chính và 6 typ huyết thanh phụ).

và tính chất sinh hoá,
Shigella được chia thành 4 nhóm với nhiều typ huyết thanh:
chính và 6 typ huyết thanh phụ).

+

thanh).

Nhóm A: S.dysenteriae: có 15 typ huyết thanh, đáng chú ý là S.dysenteriae typ 1
(Sh.shiga).

+
+
+

thanh).

Nhóm B: S.flexneri (có 8 typ huyết thanh).
Nhóm C: S.boydii (có 19 typ huyết thanh).
Nhóm D: S.sonnei (có 1 typ huyết thanh).


III. Nguyên tắc xác định Shigella


Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc
o
Phần mẫu thử được cấy vào canh thang Shigella có chứa novobioxin 0,5 µg/ml, rồi được ủ kỵ khí ở 41,5 C ± 1 oC trong 16h-20h.



Đổ đĩa và nhận biết các khuẩn lạc
Cấy các dịch cấy tăng sinh thu được vào ba môi trường phân biệt chọn lọc: thạch MacConkey agar có tính chọn lọc thấp; thạch XLD

o
agar có tính chọn lọc trung bình và thạch Hektoen enteric agar có độ nhạy cao nhất. Tất cả các đĩa này được ủ ở 37 C trong 20h-24h.



Khẳng định bằng thử ngiệm sinh hóa và kháng huyết thanh
Sau thời gian ủ, những khuẩn lạc điển hình và nghi ngờ trong mỗi môi trường từ ba môi trường thạch chọn lọc sẽ được kiểm tra

khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh


IV. Môi trường và hóa chất

-

Canh thang shigella broth
Môi trường MacConkey (MAC)
Thạch deoxycolat lysin xyloza (thạch XLD)
Thạch Hektoen (HE)
Nutrient Agar (NA)
TSI
Urea
LDC
Thạch dinh dưỡng nửa đặc
kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá A, B, C, D

5. Quy trình phân tích

Tăng sinh chọn lọc
Bước tiến hành
phân tích

Phân lập
Phục hồi

Test sinh hóa + kháng huyết thanh


Quy trình phân tích

 Bước 1: Tăng sinh chọn lọc

 

Đồng nhất 25g mẫu trong 225 mL TSA hay canh thang shigella, bổ
sung novobioxin 0,5g/ml, pH=7,2.

o
Ủ 41,5 C, 16 - 20h

 Bước 2: Phân lập
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt
( MAC, XLD,HE,…)

Ủ 37oC, 20h-24h

 Bước

3: Phục hồi trên môi

trường dinh dưỡng NA/TSA

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Shigella, cấy sang NA hay TSA, ủ qua
o
đêm ở 37 C


 Bước 4:
Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

-

KIA hoặc TSI: đỏ/vàng/H2S(-)/gas(-)
Di động trong thạch mềm, không di động

Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

Kết luận: Shigella dương tính/âm tính trong 25g mẫu

Thử nghiệm sinh hóa chuyên biệt và thực hiện ngưng kết huyết thanh để phân
loại

6.1. Tăng sinh chọn lọc
Môi trường canh thang shigella
- Dịch thủy phân casein bằng enzym

20,0 g

Lấy
Lấy 25g
25g mẫu
mẫu cho
cho vào
vào túi
túi dập
dập mẫu,
mẫu, thêm
thêm 225ml
225ml canh
canh thang
thang shigella
shigella bổ
bổ
- Kalihydrophosphat (khan)

sung
sung thêm
thêm 5ml
5ml Novobioxin
Novobioxin

2,0 g

- Kali dihydrophosphat (khan)

2,0 g

- Natri clorua

5,0 g

- D (+)-GlucozaĐồng nhất mẫu (không quá 2 phút), đo và chỉnh pH về 7± 0,2.

1,0 g

- Polyoxyetylensorbitan monooleat (Tween 80)

1,5 ml

- Nước
- Novobioxin

1 000 ml

o

Buộc chặt túi và đem ủ ở 47 C trong 16- 20 giờ.

5ml

6.2. Phân lập

Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc
như : XLD agar, Hektoen enteric agar và MacConkey agar

o
Sau khi cấy,lật ngược đĩa, ủ các đĩa ở 37 C trong 24h lấy ra xem

Kết quả


MÔI TRƯỜNG MAC



Thạch MacConkey

- Dịch thủy phân casein
và mô động vật bằng enzym
a

Shigella sonnei

20,0 g

Không màu đến

hồng nhạt,

trong mờ, lactoza âm tính

10,0 g

- Lactoza

Lactoza

1,5 g

Muối mật

5,0 g

- Muối mật

- Natri clorua

- Đỏ trung tính

Shigella, các loài khác

- Tím
thể tính
Đỏtinh
trung
- Thạch
Tím tinh thể
- Nước

Không màu, trong 0,03
mờ,g lactoza

âm tính

0,001 g
9 g đến 18 g
1 000 ml

a


MÔI TRƯỜNG XLD

 Thạch XLD
- Chất chiết nấm men

3,0 g

5,0 g
Trong hồng trong suốt,màu giống

- L-lysin HCl
- Xyloza

thạch không có tâm đen

- Lactoza

- Sacaroza
- Natri clorua
- Natri deoxycholat
- Natri thiosulfat

- Sắt (III) amoni xitrat
- Đỏ phenol

Đỏ phenol
- Thạch
- Nước

3,75 g
7,5 g
7,5 g
5,0 g
1,0 g
6,8 g
0,8 g
0,08 g
9 g đến 18 g
1 000 ml

a


MÔI TRƯỜNG HE

 Thạch HE
Sản phẩm thủy phân thịt

12,0 g

bằng enzym

Màu xanh và các khuẩn lạc tăng ẩm ướt

- Chất chiết nấm men

12,0 g

- Lactoza

Lactoza

- Sacaroza

9,0 g

- Muối mật

5,0 g

- Natri clorua
- Natri thiosulfat
- Sắt (III) amoni xitrat

Sắt (III) amoni xitrat

- Axit fucxin

- Xanh bromothymol

- Nước

12,0 g
2,0 g

- Salixin

- Thạch

3,0 g

Xanh bromothymol

5,0 g
1,5 g
0,1 g
0,065 g
12 g đến 18 g
1 000 ml

a


6.3. Phục hồi

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc cấy trên môi trường không chọn
lọc (NA/TSA)

TH1: từ mỗi đĩa thử 1 khuẩn lạc đặc
trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm
sinh hóa phù hợp thid kết luận phát hiện
Shigella trong mẫu

Nếu không có khuẩn lạc điển hình ủ thêm 24h

Chọn ủ trong môi trường không chọn lọc NA/TSA

TH2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả
sinh hóa không phù hợp. Tiến hành thử
các khuẩn lạc còn lại

Test sinh hóa


6.4. Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Vùng cấy

Biểu hiện

Cho thấy

 Thạch sắt ba đường (thạch nghiêng TSI)
Màu
không
- Cấy đâm sâu và
cấyvàng
vạch
trêncóbềmàu
mặtđen
thạch nghiêng.

Lên men glucoza: dương tính

o và không rạn
đâmđĩa
sâutrong
không
-Cấy
Ủ các
tủ ở bọt
37 khí
C trong 24h đếnkhông
48h. Sinh khí
nứt

Diễn giải các thay đổi trong môi trường như sau

Cấy bề mặt
nghiêng

:

Màu đỏ hoặc không đổi màu Không sử dụng lactoza và sacaroza:
âm tính


dinh dưỡng nửa đặc để dùng cho các phép thử
Thạch
tính di động

•

•
•
•

Dùng kim cấy cấy đâm sâu một khuẩn lạc vào thạch dinh
dưỡng nửa đặc.
Ủ trong tủ ở 37 oC ± 1 oC trong 18 h đến 24 h.
Kiểm tra đường cấy về sự phát triển lan rộng. Các vi sinh vật
không di động sẽ cho đường rời rạc; các chủng di động sẽ phát
triển phân tán xung quanh đường cấy.
Tất cả các loài Shigella là không di động.


6.4. Test sinh hóa + kháng huyết thanh

 Thạch ure
- Cấy ria trên bề mặt thạch.

- Ủ trong tủ ở 37 oC trong 24 h ± 3 h.
- Thuốc thử: phenol red
Nếu ure bị thủy phân thì sẽ có màu hồng đến hồng đậm
do giải phóng amoniac từ việc phân hủy ure với sự đổi
màu của chất chỉ thị pH. Khi không có sự đổi màu của
thạch chứng tỏ phản ứng âm tính.
Các loài Shigella không thủy phân ure.=> âm tính


 Môi trường L-Lysin decacboxylaza (LDC)
 Cấy ngay phía dưới bề mặt của canh thang.
 Thuốc thử: bromocresol đỏ tía

 Ủ trong tủ ở 37 oC trong 24 h
 Sau thời gian ủ:
– Thấy đục và đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính.
– Màu vàng là phản ứng âm tính.
 Các loài Shigella không khử nhóm carboxyl của lysin
CHÚ THÍCH: Sử dụng parafin phủ lên trên các ống có thể đảm
bảo được các điều kiện kỵ khí.


6.4. Test sinh hóa + kháng huyết thanh

Loại trừ chủng tự ngưng kết:
Nhỏ 1 giọt NaCl 0,85% lên lam kính
Dùng que cấy lấy một ít Khuẩn lạc lên lam kính
Lắc nhẹ trong 30-60 giây
Nếu thấy có hạt ngưng kết thì không tiếp tục thử tiếp