Báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm ĐH Bách Khoa TP.HCM

Bài 1:
KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY
1. Mục đích bài:
- Xác định đƣợc môi trƣờng cần chuẩn bị cho các đối tƣợng vi sinh vật phù hợp với
mục đích của thí nghiệm.
- Thực hiện đƣợc kỹ thuật chuẩn bị các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau.
- Sử dụng thành thạo các dụng cụ thiết bị trong thí nghiệm.
- Các phƣơng pháp bao gói cho từng dụng cụ cụ thể.
2. Sơ lượt về lý thuyết:
2.1 Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh
2.1.1 Các yêu cầu về phòng về phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm vi sinh:
Mỗi nơi khác nhau về mức độ vệ sinh để không nhiễm chéo.
Không khí, ánh sáng, gió chừng mực thông thoáng chừng mực, di chuyển không làm
xáo động không khí.
Phòng kiểm nghiệm thƣờng đƣợc chia thành các khu vực riêng biệt nhƣ:
-

Khu nhận thu mẫu và lƣu mẫu.
Khu rửa, khử trùng dụng cụ, tủ ấm.
Khu bảo quản hoá chất.
Khu chuẩn bị môi trƣờng.
Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu.
Khu vực thao tác, xử lý mẫu vi sinh vật

Hạn chế hoặc không sử dụng quạt trong phòng. Tránh để các hoá chất, môi trƣờng tiếp
xúc trực tiếp ánh sáng mặt trời. Khu pha chế hoá chất riêng biệt sẽ tốt hơn.
2.1.2 Sổ nhật ký thí nghiệm:
Ghi nhận lại sau mỗi lần kiểm nghiệm, thí nghiệm để theo dõi kết quả và theo dõi mẫu
thí nghiệm:
-

Ngày tháng tiến hành, ngày kết thúc.
Tên thí nghiệm, tên mẫu.
Đối tƣợng thí nghiệm.
Phƣơng pháp lựa chọn tiến hành.
Kết quả thu đƣợc.
Tên loài vi sinh vật.
1


-

Tên ngƣời thực hiện, theo dõi.

2.1.3 Lƣu ý về quy cách an toàn thí nghiệm:
Cần tuân thủ 1 số điểu nhƣ sau:
-

Mặc đồ bảo hộ: áo blouse, khẩu trang, bao tay, mắt kính,… khi làm việc với vi sinh
vật có hại.
Không ăn uống trong phòng thí nghiệm.
Bề mặt làm việc cần sát trùng bằng khăn giấy tẩm cồn 70o , hoặc bằng dung dịch
sát khuẩn lysol 5%, amphyl 10% , chlorox 10%, để khô.
Sát khuẩn tay tƣơng tự
Sử dụng đèn cồn hoặc đèn Busen để tiệt trùng không khí, không gian thao tác thí
nghiệm và dụng cụ thí nghiệm.
Ghi thông tin cần thiết lên ống nghiệm, petri, bình nuôi cấy
Khi bị đổ, nhiễm vi sinh vật thì thực hiện lau, sát trùng lại bề mặt làm việc.
Không dùng mũi ngửi, hít các mẫu vi sinh vật trong đĩa petri.
Đầu tóc cần gọn gàng khi thực hiện thí nghiệm.

2.1.4 Dụng cụ, thiết bị:
Dụng cụ và thiết bị cần thiết: tủ sấy, nồi tiệt trùng, tủ ấm, cân, pH kế, nhiệt kế, kính
hiển vi, máy cất nƣớc, máy đếm, máy lắc vortex, bể điều nhiệt.
Tủ cấy vô trùng cần đƣợc tiệt trùng. Các cách đẻ tiệt trùng tủ cấy là bằng hoá chất, đèn
tử ngoại UV, bơm khử trùng qua màng lọc.
Dụng cụ: que cấy, đèn cồn hoặc đèn Busen, đĩa petri, ống nghiệm, lame kính và
lamelle, buồng đếm khuẩn lạc, máy đếm khuẩn lạc.
2.2 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc:
Các phƣơng pháp tiệt trùng :
-

-

Nhiệt: chế độ 170oC – 2 giờ dành cho vi sinh vật ƣa nhiệt, vi sinh vật ƣa ấm thì chế
độ nhiệt 63oC – 30 phút hoặc 72oC – 20 phút. Tiệt Trùng ở 121oC – 30 phút thì cả
bào tử và tế bào sinh dƣỡng đều chết.
Quang học: tia X, Gamma, tử ngoại.
Sử dụng vi lọc: chỉ dùng cho vi sinh vật kích thƣớc <0,2µm.
Sử dụng các chất hoá học.
2.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.3.1 Khái niệm:
Môi trƣờng dinh dƣỡng là 1 hỗn hợp các chất dinh dƣỡng (những chất tham gia vào
quá trình nội bào), và những chất này có thể duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu
của tế bào và sự ổn định pH trong môi trƣờng.
2


-

-

-

-

-

2.3.2 Phân loại:
Phân loại theo trạng thái lý hóa:
 Môi trƣờng lỏng: thƣờng dùng để nhân giống, nghiên cứu, tổng hợp vi sinh vật,
môi trƣờng này không chứa agar hay gelatin…
 Môi trƣờng rắn(môi trƣờng đặc): cho một lƣợng agar (1.5-2%) hay gelatin(1020%) vào môi trƣờng lỏng để làm đặc môi trƣờng, thƣờng dùng để nghiên cứu
đặc điểm hình thái, sinh lý vi sinh vật..
 Môi trƣờng bán rắn: hàm lƣợng chất tạo độ đặc ít hơn môi trƣờng rắn (0.3-0.7%
agar), thƣờng dùng cho việc xác định khả năng chuyển động của vi sinh vật…
Phân loại theo thành phần:
 Môi trƣờng tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần đƣợc xác định và
định lƣợng một cách cụ thể và chính xác…
 Môi trƣờng tự nhiên: thành phần hóa học của môi trƣờng không đƣợc xác định
chính xác do sự không ổn định của các sản phẩm tự nhiên. Môi trƣờng có độ lặp
lài tùy thuộc nhà sản xuất. Một số môi trƣờng: pepton, cao thịt…
 Môi trƣờng hòa tan chuẩn bị sắn: môi trƣờng do nhà sản xuất pha sẵn dƣới dạng
bột, chỉ cần hòa tan với một hàm lƣợng nƣớc nhất định là có thể sử dụng.
Phân loại theo công dụng:
 Môi trƣờng cơ bản
 Môi trƣờng chọn lọc
 Môi trƣờng kiểm định
2.3.3 Nguyên tắc tạo môi trƣờng dinh dƣỡng:
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dƣỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh

dƣỡng của từng loại vi sinh vật.
Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trƣờng và tế bào vi sinh vật
nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trƣờng.
Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
2.3.4 Yêu cầu môi trƣờng dinh dƣỡng:
Có đầy đủ các chất dinh dƣỡng cần thiết.
Có pH thích hợp.
Không chứa các yếu tố độc hại.
Có độ nhớt nhất định.
Tuyệt đối vô trùng.

3


3. Tiến hành thí nghiệm:
3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Hansen dùng cho phân lập, nuôi cấy nấm
men
Công thức pha chế môi trƣờng Hansen:
-

Glucose: 50g
Peptone: 10g
KH2PO4: 3g
Agar: 20g
H2O: đủ 1L
MgSO4.7H2O: 2g
pH: 6.00
3.2 Các bước tiến hành
Cân, đong các thành phần môi trƣờng

Cho vào bình erlen có nút
bông, lắc đều

Đặt vào lò microwave điều chỉnh nhiệt độ
thời gian 30 giây - 1 phút

Rót môi trƣờng vào ống nghiệm có nút bông
(ống nghiêng – ¼ ống, ống đứng – ½ ống)

Đặt các ống nghiệm vào bao chịu nhiệt

Tiệt trùng bằng nồi Autoclave ở 121oC – 15 (20) phút

Để nguội . ống thạch nghiêng thì để nằm nghiêng sao cho
đỉnh thạch cách bông 1,5 – 2 cm, đặt ống nghiệm đứng vào
giá để định hình.
4


4. Kết quả và nhận xét
Nhận xét:
Khi pha môi trƣờng, cần phải khuấy đều cho agar tan hoàn toàn để tránh việc môi
trƣờng không đông đặc lại.
5. Ứng dụng
Bao gói dụng cụ:
Nguyên tắc:
- Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô.
- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô
trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.

Yêu cầu đối với làm nút bông:
- Nút có kích thƣớc, độ chặt vừa phải.
- Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm.
- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng.
Yêu cầu đối với bao gói:
- Phần giấy bao gói phải chặt kín.
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng.
- Với các dụng cụ nhƣ pipet, đĩa petri phải dùng giấy bao kín toàn bộ.

5


Bài 2:
KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT
1. Mục tiêu:
- Thực hành kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật. Đối tƣợng cụ thể thực hành là nấm men.
- Kỹ thuật cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: Cấy ria từ ống
giống sang ống môi trƣờng thạch nghiêng.
2. Sơ lượt lý thuyết:
2.1 Gieo cấy vi sinh vật
 Khái niệm:
Gieo cấy là quá trình đƣa các vật liệu nghiên cứu vào môi trƣờng thức ăn với mục
đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trƣờng cần
thiết cho nghiên cứu. Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trƣờng vi sinh vật từ
môi trƣờng này sang môi trƣờng khác với mục đích nhận giống và giữ giống.
Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa
đèn cồn hay tủ cấy.
 Mục đích :dùng cho việc nuôi cấy, giữ giống và phân lập giống vi sinh vật.
Cấy chuyền từ canh trƣờng lỏng sang ống chứa môi trƣờng lỏng cần khảo sát nhằm
mục đích nhân giống.

Cấy chuyền từ canh trƣờng lỏng sang môi trƣờng đặc nhằm mục đích giữ giống.
Cấy chuyền từ canh trƣờng đặc sang môi trƣờng đặc để giữ giống nghiên cứu đặc
tính vi sinh vật.
 Nguyên lý:
Vi sinh vật đƣợc cấy từ môi trƣờng này sang môi trƣờng khác, đảm bảo trong khi
cấy chuyền không làm nhiễm vi sinh vật đang mong muốn với các loại vi sinh vật
không mong muốn từ bên ngoài.
 Các dung dich gieo cấy:
Loại rắn – lỏng, rắn, lỏng hoặc bán rắn
 Dụng cụ thí nghiệm cần thiết:
Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn hoặc đèn busen.

6


2.2 Các dụng cụ

-

2.2.1 Các loại que cấy
Que cấy thẳng: có đầu nhọn, dùng để cấy điểm. thƣờng dùng cho nhóm vi sinh vật
yếm khí.
Que cấy móc: có đầu vuông góc dùng để cấy mốc (vi sinh vật có hệ khuẩn ty)
Que cấy đầu tròn: dùng đế cấy vi sinh vật từ môi trƣờng rắn lên môi trƣờng rắn
trên đĩa petri, thạch nghiêng.

2.2.2 Dụng cụ bằng thuỷ tinh:
Que trang: dùng để trải chủng vi sinh vật từ môi trƣờng rắn, lỏng sang môi trƣờng
rắn trên hộp petri.
2.2.3 Dụng cụ khác:

Tăm bông, pipet, micropipette.
2.3 Các phương pháp cấy chuyền
2.3.1 Phƣơng pháp cấy trên thạch nghiêng:
Mục đích: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng que cấy đầu tròn thao tác
Ống thạch nghiêng đƣợc chuẩn bị trƣớc, có gắn bông, nút giấy, đƣợc hấp tiệt trùng.

7


-

2.3.2 Phƣơng pháp cấy trên thạch đứng:
Mục đích: dùng để cấy các vi sinh kỵ khí.
Sử dụng que cấy đầu kim để thao tác.
Ống thạch đứng đƣợc chuẩn bị trƣớc, có gắn bông, nút giấy, đƣợc hấp tiệt
trùng.

2.4 Các thao tác cần lưu ý:
- Trƣớc và sau khi thao tác phải tiệt trùng que cấy, miệng ống nghiệm, đầu bông
bằng ngọn lửa đèn cồn. Tiệt trùng bàn tay bằng cồn 70o
- Que cấy đun nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, đầu cấy cách tâm ngọn lửa 2/3,
tạo 1 góc 75o với mặt phẳng ngang..
- Nút bông chỉ hơ gần ngọn lửa, không quá gần vì gây cháy bông.
- Cách làm nguội đầu que cấy khi lấy sinh khối: ở cuối ống nghiệm giống sẽ có
1 ít nƣớc do vi sinh vật thải, đƣa đầu que cấy vào giọt nƣớc đó để làm nguội.
3. Thực hành:
Cấy nấm men ống thạch nghiêng theo hình chữ chi
Hình vẽ các bƣớc thao tác cấy ống thạch nghiêng:

8


9


a. Tay trái cầm 2
ống nghiệm giống
và ống môi trƣờng

b. Tay phải cầm que cấy,
nung đỏ đầu que cấy trên
ngọn lửa, sau đó hơ hết đến
phần kim loại
c. Dùng ngón út và áp út lấy nút
bông. Có thể hơ nút bông gần
ngọn lửa đèn cồn

d. Hơ miệng ống nghiệm qua
ngọn lửa đèn cồn
e. Đƣa đầu que cấy vào cuối ống
giống, làm ngƣời bằng giọt nƣớc
ngƣng, gạt 1 ít sinh khối nấm men

f. Chuyển đầu que cấy sang ống thạch
nghiêng, từ cuối đáy ống, quệt sinh khối
theo hình chữ chi trên bề mặt thạch.

g. Hơ miệng ống nghiệm
trên ngọn lửa đèn cồn

h. Hơ nút bông gần ngọn lửa
đèn cồn và gắn lại vào miệng 2
ống nghiệm

i. Tiệt trùng lại que cấy
tƣơng tự bƣớc b.
10


4. Kết quả thí nghiệm và nhận xét
Mẫu ống nghiêng cấy nấm men không bị nhiễm. Trong 2 ống có 1 ống sinh khối
nấm men theo hình chữ chi đều hơn, ống còn lại có 1 chút đứt đoạn.
Nhận xét:
-

Do thao tác cấy hình chữ chi ông thứ 2 hơi chệch hơn so với ống thứ 1.
Thao tác vô trùng không tốt nên để tạp nhiễm trong quá trình phân lập.
Cấy đều tay để thu đƣợc vết cấy đều và đẹp.
Mọi thao tác cần nhanh, gọn và phải thực hiện ngay trên ngọn lửa đèn cồn để tránh
nhiễm tạp.
Tránh làm rách bề mặt thạch trong quá trình gieo cấy và phân lập.

11


Bài 3:
KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VÂT
1. Mục đích:
1.1 Mục đích của phân lập:

Tạo ra khuẩn lạc riêng biệt thuần khiết của 1 chủng vi sinh vật. Từ đó phục vụ cho
mục đích quan sát, nhân giống.

-

1.2 Mục đích của định lượng vi sinh vật:
Xác định số vi sinh vật/1 đơn vị khối lƣợng canh trƣờng.
Kiểm nghiệm vi sinh vật gây nhiễm, độc
Chuẩn bị cho các quá trình trong sản xuất
Kiểm tra các canh trƣờng trong quá trình sản xuất

2. Sơ lượt lý thuyết:
2.1 Phương pháp phân lập:
2.1.1 Khái niệm
Phân lập là quá trình phân tách vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các khuẩn
lạc riêng lẻ, có hoạt tính cao.
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên môi trƣờng
dinh dƣỡng đặc trƣng để cho khuẩn lạc riêng lẽ, cách biệt nhau.
2.1.2 Phân loại
Phương pháp trực tiếp: từ canh trƣờng  pha loãng  tạo khuẩn lạc  soi kính
hiển vi.
Phương pháp gián tiếp: từ canh trƣờng  gieo cấy môi trƣờng mới  phân lập
đĩa petri , tạo khuẩn lạc riêng biệttạo tiêu bản  soi kính hiển vi.
2.1.3 Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật:
Phương pháp đổ đĩa:
Nguyên lý: 1 lƣợng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng trộn đều với môi trƣờng agar
nóng chảy, đổ vào hộp petri vô khuẩn. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, sẽ xuất hiện
các khuẩn lac riêng lẽ, thuần chủng.
Phương pháp trải đĩa:

12


Nguyên lý: 1 lƣợng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng đƣợc dàn trải đều trên bề mặt
petri có môi trƣờng thích hợp
Phương pháp cấy ria:
Nguyên lý: 1 lƣợng sinh khối đƣợc ria nhiều lần trên bề mặt thạch hộp petri. Sau
mỗi lần ria, các sinh khối vi sinh vật sẽ dần hình thành các khuẩn lạc riêng lẽ.
2.2 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường
thạch:
2.2.1 Khái niệm:
Định lƣợng vi sinh vật là quá trình pha loãng mẫu sau đó cấy chuyền mẫu qua một
môi trƣờng mới nhằm mục đích hình thành các tế bào riêng rẽ, và cuối cùng là đếm số
tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu.
2.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng:
Định lƣợng trực tiếp:
- Là phƣơng pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu.
- Ƣu điểm: cho kết quả nhanh chóng.
- Nhƣợc điểm: không phân biệt đƣợc tế bào sống và tế bào chết nên độ chính xác
kém.
-

2.2.3 Một số phƣơng pháp định lƣợng trực tiếp:
Phƣơng pháp dùng buồng đếm hồng cầu.
Phƣơng pháp Brit.
Phƣơng pháp Vinogratxki-Sungina.

Định lƣợng gián tiếp:
- Là phƣơng pháp định lƣợng bằng cách gieo cấy một lƣợng nhất định mẫu lên
một môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp và nuôi cấy trong vòng 36-48 giờ, sau đó

đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào trong một đơn vị mẫu ban đầu.
- Ƣu điểm: chỉ đếm những tế bào còn sống nên kết quả chính xác hơn.
- Nhƣợc điểm: Tốn thời gian, công sức, không có loại môi trƣờng dinh dƣỡng
nào cho phép đồng thời tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển, độ pha
loãng chênh lệch nhau 10 lần nhƣng số lƣơng vi sinh vật không lệch nhau 10
lần.
-

2.2.4 Một số phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp:
Đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng thạch.
Phƣơng pháp lắng của Omelianxki.

13


3. Thực hành:
3.1

Phân lập bằng phương pháp trải đĩa

14


Pha loãng mẫu
(5ml mẫu + 95ml nƣớc vô khuẩn trong erlen vô khuẩn)

Pha loãng từng mẫu theo độ
loãng: 10-1, 10-2 , 10-3 , 10-4

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt

.

Tháo bao petri vô khuẩn,
hơ quanh hộp petri trên
ngọn lửa đèn cồn.
Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp
petri
Xoay đều. Để thạch đông lại

Dùng pipet cho 0,2 mL ở ống nghiệm 10-3 (10-4) vào giữa đĩa.

Tiệt trùng que trang bằng cồn 70o, đốt nóng, để nguội

Dàn đều mẫu trên bề mặt thạch

Để ổn định trong 5 phút

Lật ngƣợc hộp petri, bao gói.

Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp
(28-300C), trong vòng 48-72
giờ
15


3.2 Phương pháp cấy ria trên hộp petri:
Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một vòng hỗn hợp vsv cần phân
lập
Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy rạch
đƣờng song song ở một phần tƣ hộp petri.

Kéo di que cấy từ phần tƣ thứ
nhất sang phần thứ hai và tiếp
tục rạch những đƣờng song
song

Tiếp tục thao tác trên với
phần tƣ thứ ba và thứ tƣ.

Lật ngƣợc, bao gói hộp petri và nuôi tủ ấm trong 48
giờ

16


Lƣu ý:
-

Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn.

-

Hơ nóng que cấy sau mỗi lần kéo di ở những phần tƣ khác nhau.

3.3 Phương pháp đổ đĩa:

Lƣu ý:
-

Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn.

-

5 ống nghiệm chứa 9mL + bông + giấy và erlen 95mL nƣớc cất sau đó hấp tiệt
trùng 121o C vào khoảng 15-20 phút.

17


Pha loãng mẫu
(5ml mẫu + 95ml nƣớc vô khuẩn trong erlen vô khuẩn)

Pha loãng từng mẫu theo độ
loãng: 10-1, 10-2 , 10-3 , 10-4

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt
.
Tháo bao petri vô khuẩn,
hơ quanh hộp petri trên
ngọn lửa đèn cồn.
Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp
petri
Xoay đều. Để thạch đông lại

Dùng pipet cho 1mL ở ống nghiệm 10-3 (10-4) vào petri

Để ổn định trong 5 phút
Lật ngƣợc hộp petri, bao gói.

Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp

(28-300C), trong vòng 48-72
giờ

18


4. Kết quả và nhận xét:
Phần phân lập do thao tác vô trùng không tốt nên bị nhiễm. Tuy nhiên khuẩn lạc
lên đều, đẹp, không dính vào nhau. Khi cấy thực hiện đúng kỹ thuật, vô trùng tốt và tắt
quạt.
Phƣơng pháp cấy nghiêng đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên nó chỉ thích hợp
trong thí nghiệm, nghiên cứu với quy mô nhỏ. Muốn cấy với một số lƣợng lớn ta có
thể dùng phƣơng pháp cấy trộn trên đĩa Petri
Trong thực hành, do mẫu với độ pha loãng 10-5 quá ít vi sinh vật nên chỉ thực hiện
phân lập với độ pha loãng 10-3 và 10-4.
Định lượng số lượng vi sinh vật
Hộp petri có số khuẩn lạc nằm trong khoản 25-250 khuẩn lạc để tính kết quả theo công
thức:
Hộp có độ pha loãng 10-3: 147 khuẩn lạc
Hộp có độ pha loãng 10-4: 35 khuẩn lạc
X=(

)

=(

)

= 165454 (tổng số vsv/ml)

Trong đó:
⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn.
n1, n2, n3: số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp.
d: hệ số pha loãng của độ pha loãng đầu.
5. Ứng dụng:
Gieo cấy thƣờng đƣợc sử dụng trong bảo quản và giữ giống. Tiến hành nuôi cấy
một số chủng vi sinh vật hữu ích nhƣ B.thuringiensis, Rhizobium để quan sát khả năng
phát triển tốt của các loài vi sinh vật này trên môi trƣờng bùn thải của nhà máy bia
(với nồng độ của bùn thải là 20 g MLSS/L) nhằm tận dụng nguồn môi trƣờng từ bùn
thải sinh học từ các nhà máy.
Phân lập để nghiên cứu tính chất và ứng dụng của vi sinh vật. Ví dụ: Phân lập và
xác định 10 chủng vi khuẩn B.subtilis sau đó khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nuôi
cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ)
đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn B.subtilis thì xác định chế
độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn.

19


Hay phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh acid lactic cao
từ các sản phẩm lên men.

20


Bài 4:
QUAN SÁT VI SINH VẬT
1.
-

Mục tiêu:
Sử dụng kính hiển vi để quan sát tế bào vi sinh vật
Làm tiêu bản sống để quan sát trên kính hiển vi
Quan sát hình thái vi sinh vật
Mô tả cấu tạo, chức năng mỗi bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi.

2. Sơ lược về lý thuyết:
Có 2 loại tiêu bản dùng cho quan sát trên kính hiển vi: Tiêu bản sống và tiêu bản chết.
2.1 Tiêu bản sống:
Tiêu bản sống dùng cho quan sát tế bào nấm men, vi khuẩn, nấm mốc.
Ưu điểm: Quan sát đƣợc hình thái TB vi sinh vật, chất lƣợng, hình thái sinh sản của
loài vi sinh vật không chuyển động. Phân biệt đƣợc tế bào sống chết nên chính xác hơn
về kết quả.
Nhược điểm: Không phân biệt đƣợc bào tử và tế bào sinh dƣỡng.
Tiêu bản sống có 2 dạng là tiêu bản sống kiểu giọt ép và kiểu giọt treo.

-

2.1.1 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt ép:
Lame kính đem nhúng sát trùng bằng cồn và đốt ở ngọn lửa ở cồn 70oC
Lá kính sát trùng bằng cồn 70oC, làm nguội gần vùng nóng của đèn cồn (không đốt
trực tiếp bằng lửa cồn vì sẽ gây vỡ)
Nhỏ 1 giọt dịch canh trùng vi sinh vật lên lame kính.
Đăt lá kính xuống lame kính theo 1 góc 45o, tránh tạo bọt khí
Sử dụng giấy thấm để hút nƣớc làm khô phần rìa của các lá kính
 Mục đích: quan sát hình dạng, xác định kích thƣớc của tế bào vi sinh vật.
 Ưu điểm: nhanh, gọn, dễ quan sát.
 Nhược điểm: không quan sát đƣợc trong thời gian lâu. (<15 - 20 phút).

21

2.1.2 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt treo:

Dùng một phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa, bôi vasellin quanh phần lõm
của lam kính, cho 1 giọt canh trƣờng lên giữa lam men, Thận trọng xoay ngƣợc lam
kính cho giọt canh trƣờng xuống phía dƣới rồi đặt lam men lên lam kính sao cho giọt
canh trƣờng “treo” trong không gian lõm của phiến kính. Không để giọt canh trƣờng
lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của lam kính.
 Mục đích: dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động
và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học.
 Ưu điểm: tiêu bản giữ đƣợc lâu hơn, quan sát dễ dàng hơn, nhờ đó có thể quan
sát phƣơng thức chuyển động của vi sinh vật.
 Nhược điểm: khó làm.

22


2.2 Tiêu bản chết:
Dùng quan sát các vi sinh gây bệnh.
 Ưu điểm: Tƣơng đối an toàn cho ngƣời thực hiện quan sát trên kính hiển vi.
 Nhược điểm: Không quan sát đƣợc hình thức sinh sản của vi sinh vật.
Ví dụ về 3 loài vi sinh vật gây bệnh đƣợc sử dụng tiêu bản chết để quan sát là E.coli,
Salmonella, Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao)
2.3

Cấu tạo, chức năng từng bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi:

2.3.1 Kính hiển vi điện tử

23


Thao tác sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát:
1) Làm tiêu bản (lame và lamelle).
2) Cắm điện, bật công tắc, nhìn vào thị kính, điều chỉnh khẩu độ để ánh sáng chiếu
đều thị trƣờng.
3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thƣớc kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng
tâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trƣớc.
4) Nhìn dƣới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame.
Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõ
hình ảnh mẫu vật.
5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đƣa phần muốn xem vào giữa thị trƣờng.
Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho không
đụng lame là đƣợc. Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉ
dùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh.
6) Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại x90, x100 nên sử dụng vật kính dầu để giảm
sự tán sắc của ánh sáng khi đi qua lame và lamelle để vào vật kính. Dùng vật kính
có độ phóng đại nhỏ để xác định vị trí cần tìm trên tiêu bản nhƣ phần trên. Nhỏ một
giọt dầu cede lên tiêu bản. Đổi vật kính sang độ phóng đại lớn (x90, x100). Nhúng
đầu vật kính chìm vào giọt dầu. Điều chỉnh ốc vi chỉnh nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnh
của mẫu vật khi vật kính vẫn chìm trong giọt dầu.
7) Độ phóng đại = thị kính (x10 = const) * vật kính (soi thô: x10, x40 hay soi dầu:
x90, x100).

2.3.2 Kính hiển vi quang học dùng gƣơng:

24

Hình vẽ cấu tạo của kính hiển vi quang học dùng gƣơng
Thao tác sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát:
1) Làm tiêu bản
2) Quay gƣơng về phía nguồn sáng mạnh nhất đã chọn (dùng mặt phẳng của gƣơng
nếu ánh sáng mạnh, dùng mặt lõm của gƣơng nếu ánh sáng yếu) ,mắt nhìn qua lỗ
trên mâm kính nếu thấy trên hộp tụ quang có 1 chùm sánh sáng mạnh là đạt yêu
cầu. Xoay vật kính 10, nhìn vào thị kính thấy vi trƣờng sáng tròn đều là đƣợc. Nếu
chƣa tròn đều thì dùng tay điều khiển gƣơng sao cho vi trƣờng sáng tròn đều.
3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thƣớc kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng
tâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trƣớc.
4) Nhìn dƣới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame.
Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõ
hình ảnh mẫu vật.
5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đƣa phần muốn xem vào giữa thị trƣờng.
Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho không
đụng lame là đƣợc. Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉ
dùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh.
6) Ngoài ra, kính hiển vi quang học còn có dạng dùng nguồn sáng là từ bóng đèn, vì
thế kính hiển vi sẽ có thêm các bộ phận nhƣ phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch
điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cƣờng độ chiếu sáng.

25