Báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm Đại Học Bách Khoa TP.HCM

MỤC LỤC
Bài 1: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY

Bài 1:
KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
1. Mục đích bài:
- Xác định được môi trường cần chuẩn bị cho các đối tượng vi sinh vật phù hợp với
mục đích của thí nghiệm.
- Thực hiện được kỹ thuật chuẩn bị các loại môi trường nuôi cấy khác nhau.
- Sử dụng thành thạo các dụng cụ thiết bị trong thí nghiệm.
- Các phương pháp bao gói cho từng dụng cụ cụ thể.
2. Sơ lượt về lý thuyết:
2.1 Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh
2.1.1 Các yêu cầu về phòng về phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm vi sinh:
Mỗi nơi khác nhau về mức độ vệ sinh để không nhiễm chéo.
Không khí, ánh sáng, gió chừng mực thông thoáng chừng mực, di chuyển không làm
xáo động không khí.
Phòng kiểm nghiệm thường được chia thành các khu vực riêng biệt như:


-

Khu nhận thu mẫu và lưu mẫu.
Khu rửa, khử trùng dụng cụ, tủ ấm.
Khu bảo quản hoá chất.
Khu chuẩn bị môi trường.
Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu.
Khu vực thao tác, xử lý mẫu vi sinh vật

Hạn chế hoặc không sử dụng quạt trong phòng. Tránh để các hoá chất, môi trường tiếp

xúc trực tiếp ánh sáng mặt trời. Khu pha chế hoá chất riêng biệt sẽ tốt hơn.
2.1.2 Sổ nhật ký thí nghiệm:
Ghi nhận lại sau mỗi lần kiểm nghiệm, thí nghiệm để theo dõi kết quả và theo dõi mẫu
thí nghiệm:
-

Ngày tháng tiến hành, ngày kết thúc.
Tên thí nghiệm, tên mẫu.
Đối tượng thí nghiệm.
Phương pháp lựa chọn tiến hành.
Kết quả thu được.
Tên loài vi sinh vật.
Tên người thực hiện, theo dõi.

2.1.3 Lưu ý về quy cách an toàn thí nghiệm:
Cần tuân thủ 1 số điểu như sau:
-

Mặc đồ bảo hộ: áo blouse, khẩu trang, bao tay, mắt kính,… khi làm việc với vi sinh
vật có hại.
Không ăn uống trong phòng thí nghiệm.
Bề mặt làm việc cần sát trùng bằng khăn giấy tẩm cồn 70 o , hoặc bằng dung dịch
sát khuẩn lysol 5%, amphyl 10% , chlorox 10%, để khô.
Sát khuẩn tay tương tự
Sử dụng đèn cồn hoặc đèn Busen để tiệt trùng không khí, không gian thao tác thí
nghiệm và dụng cụ thí nghiệm.
Ghi thông tin cần thiết lên ống nghiệm, petri, bình nuôi cấy
Khi bị đổ, nhiễm vi sinh vật thì thực hiện lau, sát trùng lại bề mặt làm việc.
Không dùng mũi ngửi, hít các mẫu vi sinh vật trong đĩa petri.
Đầu tóc cần gọn gàng khi thực hiện thí nghiệm.

2.1.4 Dụng cụ, thiết bị:
Dụng cụ và thiết bị cần thiết: tủ sấy, nồi tiệt trùng, tủ ấm, cân, pH kế, nhiệt kế, kính
hiển vi, máy cất nước, máy đếm, máy lắc vortex, bể điều nhiệt.
Tủ cấy vô trùng cần được tiệt trùng. Các cách đẻ tiệt trùng tủ cấy là bằng hoá chất, đèn
tử ngoại UV, bơm khử trùng qua màng lọc.


Dụng cụ: que cấy, đèn cồn hoặc đèn Busen, đĩa petri, ống nghiệm, lame kính và
lamelle, buồng đếm khuẩn lạc, máy đếm khuẩn lạc.
2.2 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc:
Các phương pháp tiệt trùng :
-

-

Nhiệt: chế độ 170oC – 2 giờ dành cho vi sinh vật ưa nhiệt, vi sinh vật ưa ấm thì chế
độ nhiệt 63oC – 30 phút hoặc 72 oC – 20 phút. Tiệt Trùng ở 121oC – 30 phút thì cả
bào tử và tế bào sinh dưỡng đều chết.
Quang học: tia X, Gamma, tử ngoại.
Sử dụng vi lọc: chỉ dùng cho vi sinh vật kích thước <0,2µm.
Sử dụng các chất hoá học.

2.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật
2.3.1 Khái niệm:
Môi trường dinh dưỡng là 1 hỗn hợp các chất dinh dưỡng (những chất tham gia vào
quá trình nội bào), và những chất này có thể duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu
của tế bào và sự ổn định pH trong môi trường.
2.3.2 Phân loại:
- Phân loại theo trạng thái lý hóa:

• Môi trường lỏng: thường dùng để nhân giống, nghiên cứu, tổng hợp vi sinh vật,
môi trường này không chứa agar hay gelatin…
• Môi trường rắn(môi trường đặc): cho một lượng agar (1.5-2%) hay gelatin(1020%) vào môi trường lỏng để làm đặc môi trường, thường dùng để nghiên cứu
đặc điểm hình thái, sinh lý vi sinh vật..
• Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn môi trường rắn (0.3-0.7%
agar), thường dùng cho việc xác định khả năng chuyển động của vi sinh vật…
- Phân loại theo thành phần:
• Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần được xác định và
định lượng một cách cụ thể và chính xác…
• Môi trường tự nhiên: thành phần hóa học của môi trường không được xác định
chính xác do sự không ổn định của các sản phẩm tự nhiên. Môi trường có độ lặp
lài tùy thuộc nhà sản xuất. Một số môi trường: pepton, cao thịt…
• Môi trường hòa tan chuẩn bị sắn: môi trường do nhà sản xuất pha sẵn dưới dạng
bột, chỉ cần hòa tan với một hàm lượng nước nhất định là có thể sử dụng.
- Phân loại theo công dụng:
• Môi trường cơ bản
• Môi trường chọn lọc
• Môi trường kiểm định


2.3.3 Nguyên tắc tạo môi trường dinh dưỡng:
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh
dưỡng của từng loại vi sinh vật.
- Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật
nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.
- Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
2.3.4 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng:
- Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.
- Có pH thích hợp.

- Không chứa các yếu tố độc hại.
- Có độ nhớt nhất định.
- Tuyệt đối vô trùng.

3. Tiến hành thí nghiệm:
3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Hansen dùng cho phân lập, nuôi cấy nấm men
Công thức pha chế môi trường Hansen:
-

Glucose: 50g
Peptone: 10g
KH2PO4: 3g
Agar: 20g
H2O: đủ 1L
MgSO4.7H2O: 2g
pH: 6.00

3.2 Các bước tiến hành
Cân, đong các thành phần môi trường

Cho vào bình erlen có nút
bông, lắc đều

Đặt vào lò microwave điều chỉnh nhiệt độ
thời gian 30 giây - 1 phút

Rót môi trường vào ống nghiệm có nút bông
(ống nghiêng – ¼ ống, ống đứng – ½ ống)

o

Tiệt trùng
Đặtbằng
các ống
nồi nghiệm
Autoclave
vàoởbao
121chịu
C –nhiệt
15 (20) phút


Để nguội . ống thạch nghiêng thì để nằm nghiêng sao cho
đỉnh thạch cách bông 1,5 – 2 cm, đặt ống nghiệm đứng vào
để định
4. Kết quả vàgiá
nhận
xét hình.
Nhận xét:
Khi pha môi trường, cần phải khuấy đều cho agar tan hoàn toàn để tránh việc môi
trường không đông đặc lại.
5. Ứng dụng
Bao gói dụng cụ:
Nguyên tắc:
- Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô.
- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô
trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
Yêu cầu đối với làm nút bông:
- Nút có kích thước, độ chặt vừa phải.
- Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm.
- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng.

Yêu cầu đối với bao gói:
- Phần giấy bao gói phải chặt kín.
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng.
- Với các dụng cụ như pipet, đĩa petri phải dùng giấy bao kín toàn bộ.


Bài 2:
KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT
1 Mục tiêu:
- Thực hành kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật. Đối tượng cụ thể thực hành là nấm men.
- Kỹ thuật cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: Cấy ria từ ống
giống sang ống môi trường thạch nghiêng.
6. Sơ lượt lý thuyết:
6.1 Gieo cấy vi sinh vật
 Khái niệm:
Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục
đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần
thiết cho nghiên cứu. Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ
môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống.
Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa
đèn cồn hay tủ cấy.
 Mục đích :dùng cho việc nuôi cấy, giữ giống và phân lập giống vi sinh vật.
Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng cần khảo sát nhằm
mục đích nhân giống.
Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc nhằm mục đích giữ giống.
Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc để giữ giống nghiên cứu đặc
tính vi sinh vật.
 Nguyên lý:

Vi sinh vật được cấy từ môi trường này sang môi trường khác, đảm bảo trong khi
cấy chuyền không làm nhiễm vi sinh vật đang mong muốn với các loại vi sinh vật
không mong muốn từ bên ngoài.
 Các dung dich gieo cấy:
Loại rắn – lỏng, rắn, lỏng hoặc bán rắn
 Dụng cụ thí nghiệm cần thiết:
Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn hoặc đèn busen.
6.2 Các dụng cụ
6.2.1 Các loại que cấy
- Que cấy thẳng: có đầu nhọn, dùng để cấy điểm. thường dùng cho nhóm vi sinh vật
yếm khí.
- Que cấy móc: có đầu vuông góc dùng để cấy mốc (vi sinh vật có hệ khuẩn ty)
- Que cấy đầu tròn: dùng đế cấy vi sinh vật từ môi trường rắn lên môi trường rắn
trên đĩa petri, thạch nghiêng.
6.2.2 Dụng cụ bằng thuỷ tinh:
Que trang: dùng để trải chủng vi sinh vật từ môi trường rắn, lỏng sang môi trường
rắn trên hộp petri.
6.2.3 Dụng cụ khác:
Tăm bông, pipet, micropipette.
6.3 Các phương pháp cấy chuyền
6.3.1 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:
Mục đích: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng que cấy đầu tròn thao tác
Ống thạch nghiêng được chuẩn bị trước, có gắn bông, nút giấy, được hấp tiệt trùng.


6.3.2
-

Phương pháp cấy trên thạch đứng:

Mục đích: dùng để cấy các vi sinh kỵ khí.
Sử dụng que cấy đầu kim để thao tác.
Ống thạch đứng được chuẩn bị trước, có gắn bông, nút giấy, được hấp tiệt
trùng.


6.4 Các thao tác cần lưu ý:
- Trước và sau khi thao tác phải tiệt trùng que cấy, miệng ống nghiệm, đầu bông
bằng ngọn lửa đèn cồn. Tiệt trùng bàn tay bằng cồn 70o
- Que cấy đun nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, đầu cấy cách tâm ngọn lửa 2/3,
tạo 1 góc 75o với mặt phẳng ngang..
- Nút bông chỉ hơ gần ngọn lửa, không quá gần vì gây cháy bông.
- Cách làm nguội đầu que cấy khi lấy sinh khối: ở cuối ống nghiệm giống sẽ có
1 ít nước do vi sinh vật thải, đưa đầu que cấy vào giọt nước đó để làm nguội.
7. Thực hành:
Cấy nấm men ống thạch nghiêng theo hình chữ chi
Hình vẽ các bước thao tác cấy ống thạch nghiêng:


a. Tay trái cầm 2
ống nghiệm giống
và ống môi trường

b. Tay phải cầm que cấy,
nung đỏ đầu que cấy trên
ngọn lửa, sau đó hơ hết đến
phần kim loại
c. Dùng ngón út và áp út lấy nút
bông. Có thể hơ nút bông gần
ngọn lửa đèn cồn

d. Hơ miệng ống nghiệm qua
ngọn lửa đèn cồn
e. Đưa đầu que cấy vào cuối ống
giống, làm người bằng giọt nước
ngưng, gạt 1 ít sinh khối nấm men

f. Chuyển đầu que cấy sang ống thạch
nghiêng, từ cuối đáy ống, quệt sinh khối
theo hình chữ chi trên bề mặt thạch.


g. Hơ miệng ống nghiệm
trên ngọn lửa đèn cồn

h. Hơ nút bông gần ngọn lửa
đèn cồn và gắn lại vào miệng 2
ống nghiệm

i. Tiệt trùng lại que cấy
tương tự bước b.

8. Kết quả thí nghiệm và nhận xét
Mẫu ống nghiêng cấy nấm men không bị nhiễm. Trong 2 ống có 1 ống sinh khối
nấm men theo hình chữ chi đều hơn, ống còn lại có 1 chút đứt đoạn.
Nhận xét:
-

Do thao tác cấy hình chữ chi ông thứ 2 hơi chệch hơn so với ống thứ 1.
Thao tác vô trùng không tốt nên để tạp nhiễm trong quá trình phân lập.

Cấy đều tay để thu được vết cấy đều và đẹp.
Mọi thao tác cần nhanh, gọn và phải thực hiện ngay trên ngọn lửa đèn cồn để tránh
nhiễm tạp.
Tránh làm rách bề mặt thạch trong quá trình gieo cấy và phân lập.


Bài 3:
KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VÂT
1 Mục đích:
8.1 Mục đích của phân lập:
Tạo ra khuẩn lạc riêng biệt thuần khiết của 1 chủng vi sinh vật. Từ đó phục vụ cho
mục đích quan sát, nhân giống.
8.2 Mục đích của định lượng vi sinh vật:
- Xác định số vi sinh vật/1 đơn vị khối lượng canh trường.
- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây nhiễm, độc
- Chuẩn bị cho các quá trình trong sản xuất
- Kiểm tra các canh trường trong quá trình sản xuất
9. Sơ lượt lý thuyết:
9.1 Phương pháp phân lập:
9.1.1 Khái niệm
Phân lập là quá trình phân tách vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các khuẩn
lạc riêng lẻ, có hoạt tính cao.


Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên môi trường
dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng lẽ, cách biệt nhau.
9.1.2 Phân loại
Phương pháp trực tiếp: từ canh trường  pha loãng  tạo khuẩn lạc  soi kính
hiển vi.
Phương pháp gián tiếp: từ canh trường  gieo cấy môi trường mới  phân lập

đĩa petri , tạo khuẩn lạc riêng biệttạo tiêu bản  soi kính hiển vi.
9.1.3 Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật:
Phương pháp đổ đĩa:
Nguyên lý: 1 lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng trộn đều với môi trường agar
nóng chảy, đổ vào hộp petri vô khuẩn. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, sẽ xuất hiện
các khuẩn lac riêng lẽ, thuần chủng.
Phương pháp trải đĩa:
Nguyên lý: 1 lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng được dàn trải đều trên bề mặt
petri có môi trường thích hợp
Phương pháp cấy ria:
Nguyên lý: 1 lượng sinh khối được ria nhiều lần trên bề mặt thạch hộp petri. Sau
mỗi lần ria, các sinh khối vi sinh vật sẽ dần hình thành các khuẩn lạc riêng lẽ.
9.2 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch:
9.2.1 Khái niệm:
Định lượng vi sinh vật là quá trình pha loãng mẫu sau đó cấy chuyền mẫu qua một
môi trường mới nhằm mục đích hình thành các tế bào riêng rẽ, và cuối cùng là đếm số
tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu.
9.2.2 Phương pháp định lượng:
Định lượng trực tiếp:
- Là phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu.
- Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng.
- Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết nên độ chính xác
kém.
9.2.3
-

Một số phương pháp định lượng trực tiếp:
Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu.
Phương pháp Brit.
Phương pháp Vinogratxki-Sungina.

Định lượng gián tiếp:
- Là phương pháp định lượng bằng cách gieo cấy một lượng nhất định mẫu lên
một môi trường dinh dưỡng thích hợp và nuôi cấy trong vòng 36-48 giờ, sau đó
đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào trong một đơn vị mẫu ban đầu.
- Ưu điểm: chỉ đếm những tế bào còn sống nên kết quả chính xác hơn.
- Nhược điểm: Tốn thời gian, công sức, không có loại môi trường dinh dưỡng
nào cho phép đồng thời tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển, độ pha
loãng chênh lệch nhau 10 lần nhưng số lương vi sinh vật không lệch nhau 10
lần.
9.2.4 Một số phương pháp định lượng gián tiếp:
- Đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch.
- Phương pháp lắng của Omelianxki.

10. Thực hành:
10.1 Phân lập bằng phương pháp trải đĩa


Pha loãng mẫu
(5ml mẫu + 95ml nước vô khuẩn trong erlen vô khuẩn)

Pha loãng từng mẫu theo độ
loãng: 10-1, 10-2 , 10-3 , 10-4

.

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt
Tháo bao petri vô khuẩn,
hơ quanh hộp petri trên

ngọn lửa đèn cồn.
Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp
petri
Xoay đều.
Để thạch
Dùng
pipet cho
Tiệt trùng
que trang
Dàn đều mẫu trên bề mặt thạch

Để ổn định trong 5 phút

Lật ngược
hộp petri,


Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp
(28-300C), trong vòng 48-72
giờ

10.2 Phương pháp cấy ria trên hộp petri:
Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một vòng hỗn hợp vsv cần phân
lập
Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy rạch
đường song song ở một phần tư hộp petri.

Kéo di que cấy từ phần tư thứ
nhất sang phần thứ hai và tiếp
tục rạch những đường song

song

Tiếp tục thao tác trên với
phần tư thứ ba và thứ tư.

Lật ngược, bao gói hộp petri và nuôi tủ ấm trong 48
giờ


Lưu ý:
-

Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn.

-

Hơ nóng que cấy sau mỗi lần kéo di ở những phần tư khác nhau.

10.3 Phương pháp đổ đĩa:

Lưu ý:
-

Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn.

-

5 ống nghiệm chứa 9mL + bông + giấy và erlen 95mL nước cất sau đó hấp tiệt
trùng 121o C vào khoảng 15-20 phút.

Pha loãng mẫu
(5ml mẫu + 95ml nước vô khuẩn trong erlen vô khuẩn)

Pha loãng từng mẫu theo độ
loãng: 10-1, 10-2 , 10-3 , 10-4

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt
.
Tháo bao petri vô khuẩn,
hơ quanh hộp petri trên
ngọn lửa đèn cồn.
Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp
petri
Xoay đều.
Để thạch
Dùng
pipet cho
Để ổn định trong 5 phút
Lật ngược
hộp petri,
Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp
(28-300C), trong vòng 48-72
giờ


11. Kết quả và nhận xét:
Phần phân lập do thao tác vô trùng không tốt nên bị nhiễm. Tuy nhiên khuẩn lạc
lên đều, đẹp, không dính vào nhau. Khi cấy thực hiện đúng kỹ thuật, vô trùng tốt và tắt
quạt.

Phương pháp cấy nghiêng đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên nó chỉ thích hợp
trong thí nghiệm, nghiên cứu với quy mô nhỏ. Muốn cấy với một số lượng lớn ta có
thể dùng phương pháp cấy trộn trên đĩa Petri
Trong thực hành, do mẫu với độ pha loãng 10 -5 quá ít vi sinh vật nên chỉ thực hiện
phân lập với độ pha loãng 10-3 và 10-4.
Định lượng số lượng vi sinh vật
Hộp petri có số khuẩn lạc nằm trong khoản 25-250 khuẩn lạc để tính kết quả theo công
thức:
Hộp có độ pha loãng 10-3: 147 khuẩn lạc
Hộp có độ pha loãng 10-4: 35 khuẩn lạc
X= = = 165454 (tổng số vsv/ml)
Trong đó:
⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn.
n1, n2, n3: số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp.
d: hệ số pha loãng của độ pha loãng đầu.
12. Ứng dụng:
Gieo cấy thường được sử dụng trong bảo quản và giữ giống. Tiến hành nuôi cấy
một số chủng vi sinh vật hữu ích như B.thuringiensis, Rhizobium để quan sát khả năng
phát triển tốt của các loài vi sinh vật này trên môi trường bùn thải của nhà máy bia
(với nồng độ của bùn thải là 20 g MLSS/L) nhằm tận dụng nguồn môi trường từ bùn
thải sinh học từ các nhà máy.
Phân lập để nghiên cứu tính chất và ứng dụng của vi sinh vật. Ví dụ: Phân lập và
xác định 10 chủng vi khuẩn B.subtilis sau đó khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi
cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ)
đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn B.subtilis thì xác định chế
độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn.


Hay phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh acid lactic cao
từ các sản phẩm lên men.

Bài 4:
QUAN SÁT VI SINH VẬT
1
-

Mục tiêu:
Sử dụng kính hiển vi để quan sát tế bào vi sinh vật
Làm tiêu bản sống để quan sát trên kính hiển vi
Quan sát hình thái vi sinh vật
Mô tả cấu tạo, chức năng mỗi bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi.

13. Sơ lược về lý thuyết:
Có 2 loại tiêu bản dùng cho quan sát trên kính hiển vi: Tiêu bản sống và tiêu bản chết.
13.1 Tiêu bản sống:
Tiêu bản sống dùng cho quan sát tế bào nấm men, vi khuẩn, nấm mốc.
Ưu điểm: Quan sát được hình thái TB vi sinh vật, chất lượng, hình thái sinh sản của
loài vi sinh vật không chuyển động. Phân biệt được tế bào sống chết nên chính xác hơn
về kết quả.
Nhược điểm: Không phân biệt được bào tử và tế bào sinh dưỡng.
Tiêu bản sống có 2 dạng là tiêu bản sống kiểu giọt ép và kiểu giọt treo.
13.1.1 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt ép:
- Lame kính đem nhúng sát trùng bằng cồn và đốt ở ngọn lửa ở cồn 70oC
- Lá kính sát trùng bằng cồn 70oC, làm nguội gần vùng nóng của đèn cồn (không đốt
trực tiếp bằng lửa cồn vì sẽ gây vỡ)
- Nhỏ 1 giọt dịch canh trùng vi sinh vật lên lame kính.
- Đăt lá kính xuống lame kính theo 1 góc 45o, tránh tạo bọt khí
- Sử dụng giấy thấm để hút nước làm khô phần rìa của các lá kính
 Mục đích: quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật.

 Ưu điểm: nhanh, gọn, dễ quan sát.
 Nhược điểm: không quan sát được trong thời gian lâu. (<15 - 20 phút).


13.1.2 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt treo:

Dùng một phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa, bôi vasellin quanh phần lõm
của lam kính, cho 1 giọt canh trường lên giữa lam men, Thận trọng xoay ngược lam
kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lam men lên lam kính sao cho giọt
canh trường “treo” trong không gian lõm của phiến kính. Không để giọt canh trường
lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của lam kính.


 Mục đích: dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động
và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học.
 Ưu điểm: tiêu bản giữ được lâu hơn, quan sát dễ dàng hơn, nhờ đó có thể quan
sát phương thức chuyển động của vi sinh vật.
 Nhược điểm: khó làm.

13.2 Tiêu bản chết:
Dùng quan sát các vi sinh gây bệnh.
 Ưu điểm: Tương đối an toàn cho người thực hiện quan sát trên kính hiển vi.
 Nhược điểm: Không quan sát được hình thức sinh sản của vi sinh vật.
Ví dụ về 3 loài vi sinh vật gây bệnh được sử dụng tiêu bản chết để quan sát là E.coli,
Salmonella, Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao)
13.3 Cấu tạo, chức năng từng bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi:
13.3.1 Kính hiển vi điện tử


Thao tác sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát:

1) Làm tiêu bản (lame và lamelle).
2) Cắm điện, bật công tắc, nhìn vào thị kính, điều chỉnh khẩu độ để ánh sáng chiếu
đều thị trường.
3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng
tâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước.
4) Nhìn dưới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame.
Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõ
hình ảnh mẫu vật.
5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường.
Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho không
đụng lame là được. Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉ
dùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh.
6) Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại x90, x100 nên sử dụng vật kính dầu để giảm
sự tán sắc của ánh sáng khi đi qua lame và lamelle để vào vật kính. Dùng vật kính
có độ phóng đại nhỏ để xác định vị trí cần tìm trên tiêu bản như phần trên. Nhỏ một
giọt dầu cede lên tiêu bản. Đổi vật kính sang độ phóng đại lớn (x90, x100). Nhúng
đầu vật kính chìm vào giọt dầu. Điều chỉnh ốc vi chỉnh nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnh
của mẫu vật khi vật kính vẫn chìm trong giọt dầu.
7) Độ phóng đại = thị kính (x10 = const) * vật kính (soi thô: x10, x40 hay soi dầu:
x90, x100).

13.3.2 Kính hiển vi quang học dùng gương:


Hình
vẽ
cấu
tạo
của
kính

hiển
vi

quang học dùng gương
Thao tác sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát:
1) Làm tiêu bản
2) Quay gương về phía nguồn sáng mạnh nhất đã chọn (dùng mặt phẳng của gương
nếu ánh sáng mạnh, dùng mặt lõm của gương nếu ánh sáng yếu) ,mắt nhìn qua lỗ
trên mâm kính nếu thấy trên hộp tụ quang có 1 chùm sánh sáng mạnh là đạt yêu
cầu. Xoay vật kính 10, nhìn vào thị kính thấy vi trường sáng tròn đều là được. Nếu
chưa tròn đều thì dùng tay điều khiển gương sao cho vi trường sáng tròn đều.
3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng
tâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước.
4) Nhìn dưới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame.
Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõ
hình ảnh mẫu vật.
5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường.
Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho không
đụng lame là được. Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉ
dùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh.
6) Ngoài ra, kính hiển vi quang học còn có dạng dùng nguồn sáng là từ bóng đèn, vì
thế kính hiển vi sẽ có thêm các bộ phận như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch
điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.