Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak

Header Page 1 of 166.
PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định sự biến đổi vật chất và năng
lượng. Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosin triphosphate
(ATP)… là những chất cần thiết cho sự sống [2]. Ngoài ra lân còn đóng những vai trò
khác như tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây.
Đất chứa khối lượng lớn chất chứa lân. Tuy nhiên không phải hợp chất chứa lân nào trong
đất cũng được cây sử dụng dễ dàng. Đặc biệt là đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên vốn rất
giàu lân tổng số nhưng lân dễ tan lại rất thấp.
Sự chuyển hóa lân xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của quá trình hóa học và sinh học
[1]. Quá trình chuyển hóa hợp chất phophat khó tan trong đất có phần đóng góp quan
trọng của các loại vi sinh vật. Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa quặng phosphate khó
tan thành dễ tan để cây trồng hấp thụ được. Do vậy bón vi sinh vật phân giải phosphate
khó tan sẽ cung cấp một lượng lân dễ tan cho cây trồng và giúp cây hấp thụ các chất dinh
dưỡng trong đất tốt hơn [3].
Ngoài ra những vi sinh vật chuyển hóa hợp chất lân vừa có khả năng tạo các chất
dinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật đồng thời cũng có
khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng [7].
Theo Fridland (1973) đất bazan nâu đỏ là loại đất hình thành trên đất bazan, trong
điều kiện nhiệt đới ẩm, các bazơ bị rửa trôi mạnh, đất có phản ứng chua, sắt nhôm tích lũy
nhiều, đây là nguyên nhân chủ yếu của quá trình giữ chặt lân trên đất bazan [13].
Theo Đoàn Triệu Nhạn (1999): Đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên có hàm lượng lân
tổng số đạt 0,02% P2O5 và lượng lân dễ tiêu là 4,12mg P2O5/ 100g đất [13].
Đak Lak với hơn 360.000 ha đất bazan nâu đỏ là một loại đất giàu lân tổng số rất
thích hợp cho việc phát triển các cây công nghiệp dài ngày [21]. Tuy nhiên các quá trình
cố định lân từ dễ tiêu thành dạng khó tiêu thường xuyên xảy ra nên lượng lân dễ tiêu luôn
ở mức nghèo. Đồng thời, nông dân trong thời gian qua thường chỉ dùng phân hóa học để

Footer Page 1 of 166.

Header Page 2 of 166.
bón cho cây trồng thiếu bón phân hữu cơ cũng như phân vi sinh vật làm cho đất trồng bị
thoái hóa, chai cứng, vi sinh vật đất bị suy thoái, gây ô nhiễm môi trường.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu
phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâu
đỏ ở Đak Lak.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải photphate khó tan cao
trên đất Bazan nâu đỏ tại Đak Lak.
1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phân làm sáng tỏ vai trò của vi sinh vật phân
giải lân khó tan . Các nghiên cứu của Việt Nam và thế giới về phân giải lân khó tan dạng
phosphate sắt, nhôm còn rất ít nghiên cứu. Đáng chú ý đề tài nghiên cứu, tuyển chọn và
phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân khó tan hiệu quả trên đất bazan
nâu đỏ trong điều kiện cụ thể ở Đak Lak và góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật bản
địa hữu ích.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh
vật phân giải lân khó tan trong sản xuất nông, lâm nghiệp nhằm cung cấp lân dễ tan cho
cây trồng, giảm chi phí đầu tư, giảm sự thoái hóa đất, góp phần cải thiện đời sống của
nông dân và bảo vệ môi trường nông thôn ở Đak Lak.
1.4. Giới hạn của đề tài
Trong quá trình thực hiện do thời gian, trang thiết bị, hóa chất có hạn nên chúng tôi
chỉ tiến hành phân lập trên một số mẫu đất của tỉnh Đak Lak và chỉ theo dỏi một số chỉ

Footer Page 2 of 166.

Header Page 3 of 166.
tiêu cơ bản. Mặc khác, là sinh viên lần đầu tham gia nghiên cứu nên không thể tránh khỏi
thiếu sót. Kính mong quý thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến.

Footer Page 3 of 166.


Header Page 4 of 166.
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Các dạng lân trong đất
Lân rất quan trọng đối với cây trồng. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng lân bởi cây trồng
không quá 25%, trong khi đó một lượng lớn bị cố định trong đất và chuyển thành dạng
khó hấp thụ. Lượng dự trữ lân trong đất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P2O5 nhưng chúng tồn tại
trong đất ở dạng không tan trong nước cây khó hấp thụ. Thành phần lân dễ tan và khó tan
trong đất được quyết định bởi tính chất đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu
cơ quyết định [5].
Theo Sepfe-Satsaben (1960) thì hàm lượng phosphate trung bình ở nhiều loại đất
thường từ 0.02 – 0.08%. Do quá trình tích lũy sinh học, hàm lượng phosphate trong lớp
đất mặt cao hơn ở lớp dưới [13].
Trong các loại đất khoáng , tỉ lệ lân hữu cơ thường từ 25 – 65%. Các cỡ hạt thuộc
thành phần sét thường chứa nhiều lân hơn các cỡ thuộc thành phần cát. Do đó: Ở các chân
đất nhẹ, đất bạc màu… có ít keo sét, thì tỉ lệ phosphate thường thấp hơn các loại đất khác
[13].
Tỉ lệ lân trong đất khác nhau thùy theo tính chất của đá mẹ và những tầng phát sinh
từ đá mẹ như: Nai, mica, quartzit… thường tỉ lệ lân thấp hơn là đất phát sinh từ mẫu thạch
không chua như: Bazan, đá vôi,…[13]
Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn phosphate
quan trọng. Như vậy việc bổ sung chất hữu cơ vào đất giúp làm tăng cường hàm lượng
lân cho đất. Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng , phosphate tồn tại ở hai dạng
chủ yếu sau:

2.1.1 Lân hữu cơ
Tùy loại đất, tỷ lệ phosphate hữu cơ thường chiếm từ 20 – 80% phosphate tổng số
trong đất. Ở lớp đất mặt, phosphate chiếm khoảng 50% [5]. Phosphate hữu cơ trong đất
chủ yếu ở trong thành phần mùn. Đất càng giàu mùn thì càng giàu phosphate hữu cơ.

Footer Page 4 of 166.


Header Page 5 of 166.
Theo Kletcôpki và Petecbuaxki (1964) thì: Trong phosphate hữu cơ của đất, dạng phổ
biến nhất là dạng fytat, có thể chiếm đến 50% tổng số phosphate hữu cơ. Tùy theo môi
trường acid hay kiềm mà tồn tại các dạng fytat khác nhau. Ở đất chua, phosphate hữu cơ
chủ yếu là fytat Fe, Al; ở đất trung tính, kiềm tồn tại dạng fytat Ca, Mg [13].
Phosphate hữu cơ trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp các hợp
chất chủ yếu như fitin, phospholipide, acid nucleic. Điều đáng chú ý là phosphate ở vi
sinh vật không tham gia trực tiếp vào dinh dưỡng cây trồng mà phải đợi vi sinh vật chết
đi, tế bào bị khoáng hóa thì cây trồng mới hấp thu được [5].
Khi thực hiện khoáng hóa có sự tham gia của vi sinh vật phân giải phosphate,
những hợp chất hữu cơ (trong đó có lân hữu cơ) sẽ được khoáng hóa để giải phóng ra lân
vô cơ hay hữu cơ, là nguồn dinh dưỡng cung cấp thức ăn cho cây trồng. Có 70 – 80 tập
đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải phosphate [13]. Trong quá trình khoáng
hóa chất hữu cơ của đất, phosphate hữu cơ được giải phóng ra dưới dạng acid phosphoric
và muối dễ tan của nó. Nhưng các dạng lân này lại bị đất hấp phụ và vi sinh vật hút lại,
nên trong đất rẩ ít phosphate ở dạng hòa tan. Nhiều tác giả nghiên cứu cho rằng: Nếu chất
hữu cơ vùi trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate thì qua quá trình phân giải không
những hàm lượng phosphate hữu cơ trong đất không tăng mà còn giảm xuống (Ivanop
1955) [3].
Theo những công trình nghiên cứu của Kaila (1954): Nếu chất hữu cơ vùi xuống
đất chứa ít hơn 0.2 – 0.3% P2O5 thì quá trình phân giải không tăng thêm về phosphate dễ
tancho cây vì vi sinh vật sẽ hút hết. Cường độ hút phosphate hữu cơ của đất thông qua sự

phân giải của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo Sepfe-Satsaben (1960)
trong điều kiện nhiệt độ bình thường, ở các nước ôn đới , sự khoáng hóa phosphate hữu
cơ tiến hành rất chậm và lượng phosphate cung cấp cho cây từ những hợp chất hữu cơ
không đáng kể. Trái lại, ở nhiệt độ từ 35 – 50oC thì quá trình khoáng hóa tăng lên rất
mạnh và cung cấp cho cây được nhiều phosphate từ những hợp chất hữu cơ. Vì thế, ở
nước ta bón phân chuồng cũng là giải pháp cung cấp phosphate cho cây trồng [13].

Footer Page 5 of 166.


Header Page 6 of 166.
2.1.2. Lân vô cơ
Phosphate vô cơ tồn tại ở dạng muối của những nguyên tố Ca, Fe, Al. Ở đất trung
tính và đất kiềm thì phosphate Ca là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate Fe, Al là chủ
yếu. Phosphate Ca dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate Fe, Al. Sự
tồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate bị chuyển
đổi hóa trị [13].
Môi trường chua: H2PO4-

HPO42-

PO43-

Trong thực tế, H2PO4- là dạng cấy trồng dễ hấp thu nhất. Các dạng phosphate còn
lại thường là những loại khó hòa tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn cây
trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan [13]. Cũng như các yếu
tố khác, phosphate trong tự nhiên luôn luôn tuần hoàn chuyển hóa. Nhờ vi sinh vật, lân
hữu cơ được vô cơ hóa biến thành dạng muối của acid phosphoric. Các dạng lân này một
phần được cây trồng sử dụng biến thành dạng lân hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạng
khó tan như Ca3PO4, AlPO4, FePO4. Những dạng khó tan này trong các môi trường có pH

thích hợp sẽ chuyển thành dạng dễ tan. Trong quá trình này, vi sinh vật giữ vai trò quan
trọng.
2.1.3 Vòng tuần hoàn của lân trong tự nhiên
Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của nitơ. Trong khi nitơ
luôn khan hiếm trong đất thì lân tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải [15, 18].
Nitơ được đưa vào đất nhờ vi sinh vật cố định đạm từ không khí, còn đối với lân, chúng
được các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau. Vòng tuần
hoàn của lân được biểu diễn trong sơ đồ sau:

Footer Page 6 of 166.


Header Page 7 of 166.

Động vật

Cây xanh
PO43- trong dung dịch đất
PO43- bị hấp thụ

Quá trình khoáng

Hòa tan

Quá trình cố định

Lân vô cơ
Cố định tạm thời
Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật
Chất hữu cơ mùn hóa

2.2. Sự chuyển hóa lân trong đất
2.2.1. Đối với lân hữu cơ
Trong đất có nhiều loại vi sinh vật khoáng hóa được lân hữu cơ. Các vi sinh vật
này tiết ra các enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate. Phản ứng
enzyme nhanh khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất và sau đó xảy ra chậm khi lân
đã bị cải biến. Lân sẽ tạo các phức liên kết với Fe, Al, các chất hữu cơ phân tử lượng cao
và bị giữ chặt trên các phần tử sét.
Tốc độ giải phóng lân phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Bản chất các hợp chất hữu cơ có lân: Acid nucleic dễ khoáng hóa hơn phytin.
Nguyên nhân dohầu hết các vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ đều tiết ra các enzyme
tương ứng để phân giải acid nucleic [3].
- Nếu lượng C/P cao hơn 300 thì lân sẽ bị các vi sinh vật trong đất cố định. Còn ở
mức C/P nhỏ hơn 200, lân sẽ thừa nên được khoáng hóa [3].

Footer Page 7 of 166.


Header Page 8 of 166.
- pH tối thích là 6 – 7. Ở môi trường kiềm lân vô cơ được phóng thích nhanh hơn
lân hữa cơ.
- Nhiệt độ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hóa lân hữu cơ. Tối thích là 40 –
50oC. Do đó, trong mùa hè tốc độ khoáng hóa lân mạnh hơn các mùa khác.
2.2.2. Đối với lân vô cơ
Sự tồn tại các loại ion phosphate trong đất phụ thuộc vào pH đất. Do vậy, thực tế
trong đất, lân tồn tại chủ yếu ở hai dạng: H2PO4- và HPO42-.
H2PO4-

HPO42-

Dung dịch acid

PO43Dung dịch kiềm

Ở pH = 7 tỷ lệ 2 loại ion này gần bằng nhau. H2PO4- dễ đồng hóa hơn HPO42-, nên
về mặt lý thuyết ở pH = 5 – 6 dinh dưỡng lân của cây thuận lợi nhất. Song trong đất do có
mặt của nhiều ion khác mà vấn đề trở nên phức tạp hơn.
2.2.2.1. Sự chuyển hóa lân ở đất chua
Trong đất chua nghèo chất hữu cơ: Fe, Al và Mn thường nằm dưới dạng hòa tan
phản ứng với H2PO4- tạo thành hợp chất không tan cây không đồng hóa được [13].
Al3+ + H2PO4- + 2H2O

2H+ + Al(OH)3.H2PO4
Không tan

Ở các loại đất rất chua, Al3+ và Fe3+vượt các ion H2PO4- nhiều làm cho phản ứng
trên càng nghiêng theo chiều thuận, tạo thành lân không tan khiên cho chỉ còn một lượng
rất nhỏ H2PO4- trong đất.
Ở đất chua, ion H2PO4- không những phản ứng với Fe3+, Al3+ hòa tan mà còn phản
ứng với các oxit ngậm nước của các nguyên tố đó như gibbsit (Al2O3.3H2O) và goethit
(Fe2O3.3H2O). Ở đất chua số lượng lân bị các oxit sắt, oxit nhôm ngậm nươc cố định còn
vượt quá cả số lượng lân bị kết tủa với Fe, Al và Mn hòa tan.

Footer Page 8 of 166.


Header Page 9 of 166.
Al(OH)3 + H2PO4-

Al(OH)2.HPO4- + H2O

Điều đáng lưu ý là hầu hết các loại đất đều chứa oxit sắt, nhôm ngậm nước nên đây
cũng là kiểu cố định khá nhiều lân và diễn ra trên phạm vi rộng.
Trong môi trường chua còn có hai quá trình cố định lân liên quan tới sét. Đó là do
sự tồn tại các ion OH- lộ trên bề mặt khoáng sét. Sự cố định này đi kèm với việc giải
phóng kiềm theo phản ứng sau:
Sét – OH + Ca(H2PO4)2

sét – H2PO4- +1/2Ca(OH)2

Khả năng cố định thay đổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ tự sau
đây: Illit > Kaolinit > Montmorillonit.
[Al] + H2PO4- + 2H2O

2H+ + Al(OH)2.H2PO4

Vai trò của sắt và nhôm thể hiện qua thực tế là việc cố định các anion mạnh lên khi
tỉ lệ SiO2/seoquioxit giảm, với các loại đất đã mất vôi nếu các seoquioxit cũng mất đi thì
khả năng cố định lân cũng giảm.
Còn về vôi, người ta thấy khi để cho sét hấp thụ Ca2+, tỉ lệ anion phosphate được
hấp thu tăng lên, bất chấp ngưỡng kết tủa canxi phosphate. Điều đó chứng tỏ rằng : Đây là
quá tình cố định ion chứ không phải bằng con đường hóa học. Tính ổn định của quá trình
giữ chặt này phụ thuộc vào điều kiện môi trường và việc giải phóng anion có thể xảy ra
khi điều kiện môi trường thay đổi và đặc biệt là nếu sét bị giải keo.
Ở đất chua, các hydroxit sắt, nhôm lương tính có thể mất 1 nhóm OH- trở thành
keo dương tính tham gia hấp phụ trao đổi anion:
Al(OH)3 + H+ = Al(OH)2+ + H2O
2.2.2.2. Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm
Trong môi trường kiềm giàu Ca, ion H2PO4- phản ứng mạnh với Ca tạo thành các
hợp chất ít tan hơn theo các phản ứng lần lượt như sau [13]:

Footer Page 9 of 166.


Header Page 10 of 166.
Ca(H2PO4)2 + CaCO3 + H2O → 2CaHPO4.2H2O + CO2
6CaHPO4.2H2O + 2CaCO3 + H2O → Ca8H2(PO4)6.5H2O + 2CO2
Ca8H2(PO4)6.5H2O + CaCO3 → Ca3(PO4)2 + CO2 + 6H2O
Lân trở nên kém hòa tan hơn khi gặp điều kiện thuận lợi và đủ thời gian Ca3(PO4)2
có thể chuyển thành các hợp chất không tan hơn nữa như hydroxy, carbon và ngay cả
fluoro apatit.
2.3 Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân
Vi sinh vật (microorganisms) là tên chung dùng để chỉ tất cả các loại sinh vật nhỏ
bé mà muốn thấy chúng, người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Theo Hoàng Lương Việt
(1978) trung bình một gam đất khô có đến gần 200 triệu tế bào vi sinh vật. Vi sinh vật có
các nhóm chính sau: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi tảo, virus [6]. Các nhóm
có khả năng phân giải phosphate là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc [5]. Nghiên
cứu của Puneet và cộng sự cho thấy: Việc nhiểm một số chủng nấm sợi có khả năng hòa
tan phosphate như Aspergillus flavus

và Asp. niger với vi khuẩn cố định nitơ

Azotobacter sp đã tăng năng suất hạt 17.7%, trong khi chỉ nhiễm Azotobacter sp chỉ làm
tăng 9% [18]. Kopoor và cộng sự cũng đạt kết quả tương tự khi nghiên cứu sự phối hợp
giữa chủng Azotobacter sp với các vi khuẩn phân giải phosphate thuộc các chi
Asgrobacterium sp, Bacillus sp và Pseudomonas sp…[20]
Vi sinh vật phân giải lân được chia thành hai nhóm: Vi sinh vật phân giải lân hữu
cơ và vi sinh vật phân giải lân vô cơ.
2.3.1 Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ
Sự chuyển hóa các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4(Stoklaza – 1991,
Menkina – 1952) theo sơ đồ sau [1, 5]:

1. Nucleoprotein
2. Lơxitin

Nuclein

Glixerphosphate

Footer Page 10 of 166.

acid nucleic
H3PO4

Nucleotic

H3PO4


Header Page 11 of 166.
Sơ đồ của quá trình phân giải nucleoprotein cụ thể như sau:
Nucleoprotein

protein

Acid nucleic

4C5H10O5

C6H5O5

C5H5O5O

NH3

C5H5O5O2

CO2

C4H5O5O

4H3PO4

H2S

Acid amin

H2O

Chất khác

Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Pseudomonas.
Ngoài ra còn có một số xạ khuẩn và nấm khác. Đáng chú ý là B. megaterium var
phosphatsum có khả năng phân giải lân hữu cơ cao [13]. Đồng thời B. megaterium còn
có khả năng hình thành bào tử nên sức sống rất mạnh [4].
2.3.2. Vi sinh vật phân giải lân vô cơ
Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,
Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả
năng phân giải Ca3(PO4)2 và bột apatit. Khả năng phân giải lân vô cơ liên quan mật thiết
tới sự sản sinh acid của vi sinh vật. Quá trình lên men tạo ra acid carbonic, là acid chủ yếu
thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ [3].
Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2

Footer Page 11 of 166.


Header Page 12 of 166.
Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng
quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2. Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích
lũy trong đất HNO3 và H2SO4. Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo phương trình sau:
Ca3(PO4)2 + 4 HNO3

= Ca(H2PO4)2

Ca3(PO4)2 + 2 H2SO4 = Ca(H2PO4)2

+ 2 Ca(NO3)2
+ 2CaSO4

Đối với nấm thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất. Ngoài ra
còn có một số chủng khác như Penicillin, Rhizopus…
2.3.3. Các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của vi sinh vật
- Độ pH: nhìn chung pH ít ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân. Tuy nhiên pH
trong khoảng 7.8 – 8.0 ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân [5].
- Nhiệt độ: các chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lân
là khác nhau. Nhìn chung khoảng nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 20 – 40oC [9].
- Hợp chất hữu cơ: chất hữu cơ làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Do
đó khả năng phân giải lân của chúng sẽ tăng lên.
- Độ ẩm: ở những nơi có độ ẩm cao, do hoạt động của vi sinh vật mạnh nên tạo ra
nhiều acid hữu cơ làm tăng phân giải lân.
- Hệ rễ: hệ rễ cây trồng khích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó phân giải
lân cũng được tăng cường. Tuy nhiên một số loài cây có thể tiết ra các chất độc ngăn cảng

sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật.
- Tỷ lệ N và C trong môi trường: N, C là những thành phần cần thiết cho sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật. Tỉ lệ N, C trong môi trường cao sẽ thúc đẩy khả năng
phân giải lân.
2.4. Tổng quan về đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak
Theo hệ thống phân loại đất của FAO – UNESCO (1995), Đak Lak có 11 nhóm và
84 đơn vị đất đai. Trong đó, nhóm đất xám chiếm diện tích lớn nhất 44%. Nhưng nhóm

Footer Page 12 of 166.


Header Page 13 of 166.
đất sám thường phân bố ở những vùng đất dốc, về bản chất có độ phì thấp, chua, hàm
lượng lân tổng số và lân dễ tiêu thấp. Như vậy, nhóm đất xám không thuận lợi cho việc
trồng các loại cây trồng. Nhóm đất chiếm diện tích nhiều thứ 2 ở Đak Lak là đất bazan đỏ
(Ferrasols). Diện tích đất bazan đỏ khoảng 311.340ha, chiếm 23.7% diện tích đất tự
nhiên. Phân bố tập trung tại các khối bazan Buôn Ma Thuột. Nhóm đất này có các đơn vị
phân loại: Nâu đỏ trên Bazan (Fk), nâu vàng trên bazan (Fu), là nhóm đất có tầng B tích
tụ nhôm rõ nhất. Đất được phân bố tập trung ở khối bazan Buôn Ma Thuột chảy từ bắc
xuống Nam, từ Đông sang Tây. Phía Bắc cao nguyên (Ea H'Leo) có độ cao 800m, phía
Nam độ cao 400 m, phía Tây cao 300m (khu vực huyện Cư M'gar). Bề mặt cao nguyên
rất bằng phẳng [21].
Đất bazan nâu đỏ hình thành và phát triển trên các cao nguyên Ba zan phần lớn có
độ dốc thấp, tầng đất mịn dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khi
ẩm, độ xốp trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt... Rất thích hợp
với các loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao: cà phê, cao su, tiêu và
những cây ăn quả khác... [21]. Tuy nhiên, điểm hạn chế của nhóm đất này là hàm lượng
lân dễ tiêu thấp, lượng P2O5 dễ tan nhỏ hơn 1,0 mg/100 g đất. Trong khi đó, lân tổng số
của nhóm đất này lại cao, P2O5 tổng số trên 0.2% [21].
2.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hàm lượng lân trong các loại đất thường rất thấp vì vậy người ta tìm cách để tăng
lượng lân dễ tan trong đất bằng cách bón phân. Nhưng 2/3 lượng lân bón vào đất bị
chuyển hóa trở thành lân khó tiêu khiến cây trồng không hấp thụ được hoặc bị rữa trôi đi.
Do đó hiệu quả của việc bón phân lân bị giảm đi nhiều. Các vi sinh vật phân giải lân khó
tan đã giải quyết được vấn đề này. Chúng vừa giảm được lượng phân lân bón cho cây,
đồng thời huy động được cả lượng lân khó tiêu trong đất. Với những lợi ích như vậy, các
vi sinh vật phân giải lân được nhiều nước trên thế giới quan tâm. Nhiều công trình nghiên
cứu ở châu Âu, Mỹ và Ấn Độ đã cho thấy hiệu quả to lớn của các vi sinh vật phân giải
lân.
Các nghiên cứu của Sen và Paul, 1957 , Katznelson và Bose,1967; Ostwal và
Bhide, 1999 cho thấy: các chủng vi khuẩn đặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus,

Footer Page 13 of 166.


Header Page 14 of 166.
các chủng nấm thuộc loài Penicillium, Aspergillus có khả năng chuyển hóa photphat
không tan thành dạng dễ hòa tan ở trong đất nhờ tiết ra các acid hữu cơ như formic,
acetic, lactic, propionic, fumaric, glucolic và acid succinic. Những acid này làm giảm pH
và hòa tan các dạng photphate khó tan [20].
Ở Liên xô (cũ) sản phẩm phân bón vi sinh vật thương mại “phosphobacterin” với
sự có mặt của B. megateirum var phosphaticum đã được sử dụng rộng rãi ở Liên xô và
các nước Đông Âu , làm tăng năng suất cây trồng 5 – 10% so với đối chứng.Viện nghiên
cứu nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng đã
cho kết quả tăng đáng kể so với đối chứng. Người ta tính nếu sử dụng vi sinh vật phân
giải lân có tác dụng tương đương với việc bón 50kg P2O5/ha [3].
Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada cho thấy bón vi sinh vật phân giải lân có
thể thay thế 50 – 75% lượng lân cần bón bằng quặng nghèo P2O5 mà năng suất, chất
lượng không hề thay đổi (Gaur, 1992). Sử dụng chủng Pseudomonas striata khi bón quặng
phosphate và superphosphate cũng làm tăng đáng kể năng suất khoai tây (Gaur và Negi,

1980) [16].
Perez (2007) đã nghiên cứu phân lập được 130 chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải phosphat khó tan ở Venezuela. Tuy nhiên, không có chủng nào có hoạt tính phân giải
phosphate Fe và Al. Tác giả cũng chọn được 10 chủng có tiềm năng để nghiên cứu tiếp
thuộc các chi Raltonia, Pantoea, Serratia [15].
Alvaro (2009) đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ rễ cỏ ở Tây Ban Nha có hoạt
tính phân giải phosphate và kích thích sinh trưởng đối với cây trồng thuôc chi mới là
Acenitobacter [17].
Hiện nay, hai nước Trung Quốc và Ấn Độ đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng dụng
công nghệ sinh học trong sản xuất phân lân vi sinh với quy mô công nghiệp, ứng dụng
trên hàng chục triệu ha [3].

Footer Page 14 of 166.


Header Page 15 of 166.
2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững. Việt Nam đã có khá
nhiều nghiên cứu về vi sinh vật phân giải lân. Thập kỉ 90 thế kỷ XX các vi sinh vật phân
giải lân sau khi được nhân sinh khối được tẩm nhiễm vào chất mang tạo thành chế phẩm
vi sinh vật phân giải lân hoặc phối trộn với chất hữu cơ để tạo thành phân lân hữu cơ vi
sinh vật.
Kết quả nghiên cứu ở nhiều nơi cho thấy phân vi sinh vật phân giải photphate khó
tan có thể nâng cao hiệu quả sử dụng phân lân khoáng lên 20 – 30% so với đối chứng
đồng thời có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng 5 – 10% tùy loại đất trồng và cây
trồng. Việc sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 30 – 50% lượng lân cần bón
bằng quặng phosphorit với hàm lượng lân tổng số tương đương mà năng suất cây trồng
không bị giảm sút. Ngoài tác dụng phân giải lân ,vi sinh vật phân giải lân còn có khả năng
sản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật hoặc các chất kháng sinh giúp cây
trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài [7].

Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn thị Quỳnh Mai đã nghiên cứu khả
năng tiết enzyme photphataza của 10 chủng vi sinh vật hòa tan lân và nhận thấy rằng
ngoài khả năng hòa tan lân khó tan các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinh
enzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc tác
không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa lân. Vũ Thúy
Nga ,Nguyễn Ngọc Quyên, Trần Thủy Tú, Phạm văn Toản (2003) nghiên cứu khả năng
sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphate vô cơ khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium.
Kết quả cho thấy chúng có khả năng tổng hợp 20 – 100 microgam/ml môi trường nuôi
cấy. Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các
nguồn nitơ lên khả năng phân giải photphat khó tan của hai chủng nấm sợi Aspergillus
awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1.Tác giả nghiên cứu 7 nguồn cung cấp
nitơ khác nhau lên khả năng phân giải photphat của Aspergillus awamori MN1 và
Penicillum cyaneofulvum ĐT1. Kết quả cho thấy KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 là những
nguồn nitơ tốt nhất cho môi trường nuôi chủng MN1 tạo khả năng phân giải photphat cao.
Còn đối với chủng ĐT1 là NH4Cl [10].

Footer Page 15 of 166.


Header Page 16 of 166.
Nghiên cứu gần đây nhất đối với vi sinh vật phân giải lân trên đất bazan nâu đỏ là
sử dụng chế phẩm vi sinh phân giải lân (50g) cho 1 ha cà phê có tác dụng tương đương
với 34.3kg P2O5/ha [13]. Nghiên cứu cũng cho thấy, việc bón thêm vi sinh vật phân giải
lân làm tăng số lượng vi sinh vật phân giải lân trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải
lân khó tan trong đất 23 – 35%.

Footer Page 16 of 166.


Header Page 17 of 166.

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật phân giải photphat khó tan trên đất
bazan nâu đỏ ở Đak Lak.
- Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan mạnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính phân giải
phosphate khó tan trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc) đến
khả năng phân giải phosphate khó tan trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu khảo sát hoạt tính phân giải phosphate nhôm khó tan của các chủng
vi sinh vật được tuyển chọn.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp thu mẫu
Địa điểm thu mẫu: Rẫy cà phê của các địa bàn sau: thôn 4 - xã Eahu - huyện Cư
Kuin, thôn 3 – xã Cư Suê – huyện Cư Mgar, Thôn Xuân Hoà – Xã Phú Xuân – Huyện
Krông Năng.
Thời gian thu mẫu: từ ngày 29/01/2010 đến ngày 31/01/2010.
Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 0 đến 30cm. Lượng đất lấy mỗi lần từ 40 – 50g.
Mẫu đất được đựng trong túi nilon polypropylen đã được khử trùng. Các mẫu sau khi lấy
được ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu. Mẫu đất sau khi thu được đem ngay
tới phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập [15].
3.2.2. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
Môi trường phân lập nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa phosphate khó tan được sử
dụng là NBRIP [15]. NBRIP là môi trường chỉ chứa dạng phosphate khó tan nên các vi

Footer Page 17 of 166.


Header Page 18 of 166.
sinh vật muốn sinh trưởng và phát triển được phải có khả năng sử dụng phosphate khó

tan. Hay nói cách khác, các vi sinh vật đó phải có khả năng phân giải phosphate khó tan.
Thành phần cơ bản của môi trường NBRIP gồm:
- 5 g Ca3(PO4)2
- 0.25g MgSO4.
- 0.2g KCl.
- 0.1g (NH4)2SO4
- 5 gMgCl2.6 H2O.
- 10g glucose
- Nước 1lít.
-Phân lập các vi khuẩn trên môi trường đặc ở đĩa petri [8]:
+ Đất được nghiền nhỏ và phơi khô.
+ Cân 1g đất pha trong 99ml nước muối sinh lý 0.9% vô trùng. Lắc 10 phút.
+ Pha loãng dung dịch đất 10-2 – 10-5 lần.
+Dùng micropipette có đầu côn vô trùng hút 0.1ml dịch đất ở các độ pha
loãng cấy trải trên các đĩa petri chứa sẵn môi trường NBRIP.
- Tuyển chọn các vi khuẩn phân giải phosphate khó tan: sau 5 – 7 ngày, quan sát
khuẩn lạc, những khuẩn lạc nào có vòng phân giải được lựa chọn.
- Đếm số lượng tế bào (CFU/ml) theo Trần Linh Thước (2007). Đếm tất cả các
khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc
để tính kết quả. Mật độ vi sinh vật phân giải phosphate tổng số được tính theo công thức
sau [12]:

Footer Page 18 of 166.


Header Page 19 of 166.
A (CFU/ml) =

Trong đó:

N
n1Vf1 + … + niVfi

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm trên cá đĩa đã chọn.
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng i.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
fi: độ pha loãng tương ứng.

- Làm thuần: cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi trường
NBRIP khác để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến hành 2 – 3 lần. Chọn
khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy truyền vào ống thạch nghiên để giữ giống.
3.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính phân giải photphat khó tan của các chủng vi
sinh vật
Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật dựa trên nồng độ
PO4 có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ PO4 càng cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị
phân giải càng nhiều.
Nồng độ PO4 được xác định bằng phương pháp xanh molipdate [9]. Nguyên tắc
của phương pháp là ion PO4 sẽ phản ứng với (NH4)2SO4 tạo ra phức chất
(NH4)2PO4.12MoO3 màu vàng. Trong điều kiện acid và có ion Sn2+ phức màu vàng sẽ
chuyển thành phức màu xanh (NH4)3(4MoO2.2MoO3):
PO43- + 12(NH4)2SO4 + 24H+ = (NH4)2PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O
(NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2+ + 16H+ = (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4+ + 8H2O
Phức màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại ở 690nm. Sử dụng máy UV Vis đo ở
bước sóng 690nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất. Độ hấp thụ màu càng lớn
chứng tỏ nồng độ ion PO4 càng cao.

Footer Page 19 of 166.

Header Page 20 of 166.
Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ PO4 cần thiết lập
phương trình tương quan giữa hai chỉ số đó bằng KH2PO4. Sử dụng dung dịch KH2PO4
5mg/l để pha dãy nồng độ theo bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng nồng độ KH2PO4 (mg/l)
Nồng độ PO4 (mg/l)

Thể tích KH2PO4 5mg/l (ml)

Thể tích nước cất (ml)

0

0

100

0.1

2

98

0.2

4

96

0.3

6

94

0.4

8

92

0.5

10

90

Thực hiện phản ứng xanh molipdate các nồng độ KH2PO4 rồi đo OD ở bước sóng
690nm. Đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l được
xây dựng trên phần mềm Excel.
Chuẩn bị bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường NBRIP đã được
khử trùng. Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập được vào và ủ 5 ngày. Sau đó, lấy 1.5ml
dịch môi trường nuôi cấy đem ly tâm ở 10000rpm trong 10 phút. Hút cẩn thận 1ml dich
phía trên để làm phản ứng xanh molipdate rồi đo OD xác định nồng độ PO4.
Chọn ra 6 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphate khó tan mạnh nhất để
tiếp tục thí nghiệm.

Footer Page 20 of 166.

Header Page 21 of 166.
3.2.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào
- Tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch: sử dụng kỹ thuật ria chữ T ( T streak) [12]. Sau
đó ủ ở 30oC trong 72h.
- Khuẩn lạc sẽ được xác định hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1979). Mô tả các
đặc điểm sau: hình dạng, kích thước, bề mặt, đặc tính quang học, màu sắc, mặt cắt ngang,
cấu trúc [6].
- Làm tiêu bản tế bào bằng thuốc nhuộm methyl blue và quan sát bằng kính hiển vi
quang học ở độ phóng đại 40x10.
3.2.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phosphate khó tan là
Ca3PO4.
3.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Thực hiện 54 ống nghiệm chứa 10ml môi trường NBRIP. Hấp khử trùng các ống
nghiệm bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 1atm trong thời gian 20 phút. Cấy giống mỗi chủng
vi sinh vật vào 9 ống nghiệm. Chia các ống nghiệm thành 3 lô. Mỗi lô có 3 ống nghiệm
của mỗi chủng vi sinh vật. Mỗi lô thí nghiệm được phân bố như sau:
- Lô 1: Đặt trong điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm.
- Lô 2: Đặt trong tủ ấm, chỉnh nhiệt độ tại 30oC.
- Lô 3: Đặt trong tủ ấm, chỉnh nhiệt độ tại 35oC.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các ống nghiệm để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4.

Footer Page 21 of 166.


Header Page 22 of 166.
3.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải

phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Sử dụng môi trường NBRIP cho thí nghiệm. Đo pH của môi trường bằng máy đo
pH – meter. Điều chỉnh pH môi trường bằng KOH 1N và HCl 1N. Thí nghiệm trên 3 lô:
- Lô 1: Sử dụng môi trường NBRIP không có điều chỉnh pH (pH = 6.8).
- Lô 2: Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 5.8.
- Lô 3: Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7.8.
Mỗi lô thí nghiệm môi trường được phân phối vào 18 ống nghiệm, mỗi ống
nghiệm chứa 10ml môi trường. Sau đó hấp khử trùng ở 1atm trong 20 phút. Cấy giống vi
sinh vật vào 3 lô. Cấy mỗi giống vi sinh vật vào 3 ống nghiệm của một lô.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các ống nghiệm để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO43-.
3.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giải
phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
Chuẩn bị 3 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm gồm 12 bình tam giác 250ml. Phân
phối vào mỗi bình tam giác 50ml môi trường NBRIP, đem hấp khử trùng ở 121 oC, 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào cấc bình tam giác. Mỗi giống cấy vào 2 bình tam giác trên 1 lô.
Các lô được lắc ở các tốc độ khác nhau:
- Lô 1 : Để ở trạng thái tĩnh.
- Lô 2 : Lắc ở tốc độ 75rpm.
- Lô 3 : Lắc ở tốc độ 150 rpm.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO43-.

Footer Page 22 of 166.


Header Page 23 of 166.
3.2.6. Phương pháp nghiên cứu một số thành phần môi trường để nuôi cấy các
chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
3.2.6.1. Phương pháp xác định nguồn carbon thích hợp cho nuôi cấy các chủng vi

sinh vật phân giải phosphate khó tan
Thành phần môi trường dựa trên môi trường NBRIP nhưng có thay đổi. Các nguồn
carbon sử dụng là glucose và saccharose.
Thực hiện 2 lô thí nghiệm.
- Lô 1 : sử dụng nguồn carbon là glucose (10g/l). Môi trường được phân phối vào
18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lô 2 : Sử dụng nguồn carbon là saccharose (10g/l). Môi trường được phân phối
vào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121 oC và 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4.
3.2.6.2. Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho nuôi cấy các chủng vi sinh
vật phân giải phosphate khó tan
Sử dụng môi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa nitơ được thay đổi. Các
nguồn nitơ sử dụng là urê và (NH4)2SO4.
Thực hiện 2 lô thí nghiệm.
- Lô 1 : sử dụng nguồn nitơ là urê ( 0.053g/l). Môi trường được phân phối vào 18
ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm. Cấy
giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

Footer Page 23 of 166.


Header Page 24 of 166.
- Lô 2 : Sử dụng nguồn nitơ là (NH4)2SO4 (0.1g/l). Môi trường được phân phối vào
18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO43-.

3.2.7. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính phân giải phosphate khó tan của các
chủng vi sinh vật tuyển chọn được trên nguồn phosphate AlPO4
Sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phosphate khó tan được thay đổi là
AlPO4(3.9g/l).
Thực hiện 2 lô thí nghiệm:
- Lô 1 : sử dụng nguồn phosphate khó tan là Ca3(PO4)2. Môi trường được phân
phối vào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121 oC và
1atm. Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
- Lô 2 : Sử dụng nguồn phosphate khó tan là AlPO4. Môi trường được phân phối
vào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121 oC và 1atm.
Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.
Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làm
phản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4. So sánh hoạt tính phân giải phosphate
khó tan khi sử dụng AlPO4 với đối chứng là Ca3(PO4)2 ở lô 1.
3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Các số liệu về khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật
được xử lý trên phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học bang Michigan. Các số
liệu được phân tích ANOVA 1 và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa
0.01.

Footer Page 24 of 166.


Header Page 25 of 166.
Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD và
nồng độ PO4 được xử lý trên phần mềm EXCELL 2007 của Microsoft. Các biểu đồ khác
cũng được xử lý trên phần mềm này.

Footer Page 25 of 166.