Thực hành nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Header Page 1 of 166.
150

THỰC HÀNH

NUÔI CẤY MÔ
VÀ TẾ BÀO
THỰC VẬT

Footer Page 1 of 166.


Header Page 2 of 166.
151

MỤC LỤC
Bài 1 Mở đầu ................................................................ 154
I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào
thực vật............................................................................. 154
II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế
bào thực vật ...................................................................... 158
Bài 2 Môi trường dinh dưỡng ....................................... 175
I. Thành phần chính của môi trường ............................... 177
II. Vấn đề lựa chọn môi trường ....................................... 188
III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc ............................... 189
Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng................................... 202
I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 203
II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ...................................... 204
III. Phương pháp tiến hành .............................................. 206
Bài 4 Nuôi cấy đơn bội in vitro...................................... 213

Footer Page 2 of 166.


Header Page 3 of 166.
152

I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 213
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 215
III. Phương pháp tiến hành .............................................. 217
Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù.......................... 223
I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 223
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 226
III Phương pháp tiến hành ............................................... 228
Bài 6 Nuôi cấy protoplast .............................................. 233
I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 233
II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 235
III. Phương pháp tiến hành .............................................. 237
Bài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens ..................................................................... 243
I. Mục đích và yêu cầu ..................................................... 243

Footer Page 3 of 166.


Header Page 4 of 166.
153

II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .......................................... 244
III. Phương pháp tiến hành .............................................. 247
TÀI LIỆU ĐỌC THÊM ................................................ 256

Footer Page 4 of 166.


Header Page 5 of 166.
154

Bài 1 Mở đầu

I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế
bào thực vật
(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)

1. Phòng rửa và cất nước
+ Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ)
+ Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ)
- Máy sản xuất nước khử ion

2. Phòng sấy hấp
+ Tủ sấy 60-300oC
+ Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L)

Footer Page 5 of 166.


Header Page 6 of 166.
155

- Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)

3. Phòng chuẩn bị môi trường
+ pHmeter
+ Máy khuấy từ
+ Cân phân tích 10-4g
+ Cân kỹ thuật 10-2g
+ Bếp điện
- Microwave
+ Tủ lạnh 100-200 L
- Tủ lạnh sâu (-20  -80oC)
4. Phòng cấy vô trùng
+ Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench)
+ Quạt thông gió

Footer Page 6 of 166.


Header Page 7 of 166.
156

+ Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m)
- Thiết bị lọc không khí

5. Phòng ảnh
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu

6. Phòng kính hiển vi
+ Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần).
+ Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có
gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số.

+ Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần).
- Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học.
- Kính hiển vi huỳnh quang

Footer Page 7 of 166.


Header Page 8 of 166.
157

7. Phòng nuôi
+ Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu
sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
+ Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút)
+ Tủ ấm
- Nồi phản ứng sinh học (bioreactor)

8. Phòng sinh hóa
+ Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...)
+ Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide)
+ Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của
DNA, RNA và protein (Gene documentation system)
+ Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm

Footer Page 8 of 166.


Header Page 9 of 166.
158

- Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh
hóa của các tế bào và mô nuôi cấy.

II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy môtế bào thực vật
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng.
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng
cách.
- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau
khi cấy.

1. Bảo đảm điều kiện vô trùng
1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật

Footer Page 9 of 166.


Header Page 10 of 166.
159

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có
chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các
loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của
nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thực
vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào
tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn
bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc
nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong

điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào
thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy),
trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một
vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng trong thí nghiệm
nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc,
điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào
đơn thực vật trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor),
điều kiện vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công
được.

1.2. Nguồn nhiễm tạp

Footer Page 10 of 166.


Header Page 11 of 166.
160

Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không
được vô trùng tuyệt đối.
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các
sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn
theo bụi lên bề mặt môi trường.

1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thủy tinh
Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào

thực vật phải là loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua
được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh
gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử
dụng. Thông thường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng
sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ

Footer Page 11 of 166.


Header Page 12 of 166.
161

cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy
nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráo
nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích)
cần được vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ. Sau
khi nguội được lấy ra cất vào chỗ ít bụi.

b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông
không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi
không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị
bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không
thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược
điểm sau:
+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường
thì về sau sẽ bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiệm nuôi
cấy trong thời gian dài.
+ Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi

nuôi cấy trên quy mô lớn.

Footer Page 12 of 166.


Header Page 13 of 166.
162

+ Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ.
Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác
thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô
cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa
chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC (khoảng 1
atm) mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm
dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện cho
việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy
nhôm để làm nắp đậy. Trong giáo trình này, chúng tôi sử
dụng giấy nhôm làm nút đậy.

c. Môi trường
Nói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong
điều kiện không vô trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân
phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đậy nút hoặc nắp. Thời
gian hấp từ 15-20 phút ở áp suất khoảng 1 atm (121oC).
Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc
nút bông.

Footer Page 13 of 166.

Header Page 14 of 166.
163

Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế
môi trường (dung dịch muối khoáng, vitamine, chất kích
thích sinh trưởng...) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung
dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ
và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một
lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường
chỉ nên dùng các lọ có dung tích từ 100 đến 200 mL.
Ở áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vật có
trong môi trường đều bị diệt, kể cả các vi sinh vật ở dạng
bào tử. Thời gian hấp thường từ 15 đến 20 phút ở 1 atm.
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải dùng nước
cất hoặc nước khử ion, tốt nhất là dùng nước cất 2 lần từ
các máy cất hoàn toàn bằng thủy tinh.
Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế
phẩm mẫn cảm với nhiệt, có thể bị phân hủy khi ta hấp ở
121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng riêng
các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi trường được khử
trùng.

Footer Page 14 of 166.


Header Page 15 of 166.
164

d. Lọc vô trùng
Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc

Millipore (Hình 1.1) do hãng Millipore sản xuất hoặc dùng
các phểu lọc thủy tinh xốp số 5.

Hình 1.1. Một số loại màng lọc vô trùng của hãng
Millipore (disposable). Đây là loại màng lọc đã được
khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần.

Footer Page 15 of 166.


Header Page 16 of 166.
165

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: Hãng
Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu
nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có
đường kính 25 mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa
chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt
màng lọc (có kích thước lỗ 0,25 μm) trên đế, đặt vòng cao
su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong
một tờ giấy nhôm và khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC
trong 15-20 phút. Đồng thời vô trùng một bình thủy tinh để
hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ
lọc.

1.4. Vô trùng mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau
của thực vật như: hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh
sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự tiếp xúc với điều
kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay

nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô
nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên
trong chứ không hạn chế ở bề mặt.

Footer Page 16 of 166.


Header Page 17 of 166.
166

Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất
hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn.
Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào
thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng
vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả
năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy.
Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của
chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy
trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trong
dung dịch diệt khuẩn.
Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì
tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự
sinh trưởng của mô cấy.
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn
trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật
có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng
dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa
nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần
trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải
cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh

Footer Page 17 of 166.


Header Page 18 of 166.
167

hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên
chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch
diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi
trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành
công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được
nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử,
chắc chắn sẽ đạt kết quả.
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt
khuẩn để xử lý mô
cấy thực vật

Thời gian
Stt

Tác nhân vô trùng

Nồng

xử lý

độ

quả
(phút)

Footer Page 18 of 166.

Hiệu


Header Page 19 of 166.
168

1

2

Calcium
hypochlorite

Sodium
hypochlorite

9-10%

5-30

Rất tốt

2%

5-30

Rất tốt

1-2%

2-10

Rất tốt

3

Nước Bromine

4

H2O2

10-12%

5-15

Tốt

5

HgCl2

0,1-1%

2-10

Khá

6

Kháng sinh

30-60

Khá

4-50
mg/L

1.5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là
bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi

Footer Page 19 of 166.


Header Page 20 of 166.
169

mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng
nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp
này.
Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ
10-15 m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động
từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch

men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử
dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót
formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải
rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa
phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử
hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng
trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt
bàn bằng cồn 90%.
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước:
từ áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao,
kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy
thường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng
trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng
cụ làm việc.

Footer Page 20 of 166.


Header Page 21 of 166.
170

Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà
phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo
mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử
ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi
không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30
phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không
khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các
dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để
trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần.

Hình 1.2. Tủ cấy vô trùng

Footer Page 21 of 166.


Header Page 22 of 166.
171

2. Chọn môi trường dinh dưỡng
Xem bài 2

3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy
Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn
mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các
mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy.
Tuy vậy, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển,
thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh... khi
đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng
thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa (Bảng
1.2). Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây
nhất định, trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và
mô phân sinh ngọn.
Cần biết rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền
như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh
trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây
hoàn chỉnh rất khác nhau.

Footer Page 22 of 166.

Header Page 23 of 166.
172

Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây
cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật,
trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng các bộ phận
khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh
trưởng khác nhau.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện
nhiệt độ và ánh sáng ổn định. Tùy vào các mục đích nghiên
cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá
trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng
quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh
sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định từ 25 ± 2 oC
bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng
từ 2000-3000 lux.

4. Một số điểm cần lưu ý
- Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau
khi tiệt trùng ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau
mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90% rồi hơ lên
ngọn lửa đèn cồn.

Footer Page 23 of 166.


Header Page 24 of 166.
173

- Trước khi cấy phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy
bằng cồn 90%.
- Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4-5 mẫu, tránh
trường hợp để nhiều không cấy kịp mẫu sẽ bị khô.
- Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi
đợt cấy.

Bảng 1.2. Các cơ quan của thực vật sử dụng trong nuôi
cấy mô và tế bào

Nguồn gốc
Stt

mẫu vật nuôi
cấy

1

Kích
thước

Mô phân sinh

0,5-1

đỉnh

mm

Footer Page 24 of 166.

Mẫu nuôi cấy

Đỉnh sinh trưởng


Header Page 25 of 166.
174

(meristem)

Chồi đỉnh
2

Chóp đỉnh có chứa một
0,5-1 cm phần thân

(shoot tip)

Chồi nách

Chồi bên có chứa một
0,5-1 cm phần thân, lá và chồi

3
(axillary bud)

Cuống lá
4
(leaf petiole)

Phiến lá

nách

0,2-0,3
cm

Cuống lá được cắt nhỏ,
phân nửa được cấy
chìm vào môi trường

Phiến lá non đặt trên
0,2-1 cm môi trường, mặt dưới

5
(leaf blade)

Rễ
6

đặt trên mặt thạch

Mẫu rễ được đặt trên
0,5-1 cm mặt thạch

(root)

Footer Page 25 of 166.