Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng (tt)

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Xuất phát từ nhu nâng cao giá trị kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi
trƣờng do phế liệu ngành ngành chế biến tôm mang lại, cần tạo ra các
sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu tôm. Một trong những sản
phẩm đƣợc tạo ra từ chitin phế liệu tôm là N- acetylglucosamine (hay
NAG), có tiềm năng chữa bệnh nhƣ viêm khớp, viêm dạ dày,... Ngoài
ra NAG còn có đặc tính chống ung thƣ và đƣợc dùng trong chữa trị
bệnh tự miễn dịch. So với phƣơng pháp sản xuất NAG từ chitin bằng
phƣơng pháp hóa học thì sản xuất NAG bằng chitinase từ vi sinh vật
có nhiều ƣu điểm nhƣ thân thiện môi trƣờng, tạo sản phẩm tự nhiên
không chứa các dƣ lƣợng chất hóa học. Các nghiên cứu về thu nhận
NAG từ chitin bằng chitinase từ vi sinh vật còn khiêm tốn và chƣa
đầy đủ, đặc biệt là quá trình tinh sạch NAG. Do đó chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum
20B định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”
2. Mục tiêu nghiên cứu:
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ
Penicillium oxalicum 20B.
- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm
chitinase kỹ thuật.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật.
- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase
kỹ thuật nhận đƣợc.
- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hƣớng tới ứng dụng
vào thực phẩm chức năng.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
* Ý nghĩa khoa học: Là công trình nghiên cứu có hệ thống về điều
kiện lên men sinh tổng hợp, thu nhận chế phẩm enzym chitinase có

hoạt tính endochitinase và NAHase từ chủng Penicillium oxalicum
20B để ứng dụng thủy phân chitin từ phế liệu tôm và thu nhận NAG
tinh sạch có tiềm năng ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm
chức năng.
* Ý nghĩa thực tiễn: Quy trình thu nhận NAG từ chitin của phế liệu
tôm bằng phƣơng pháp enzym sử dụng chitinase có tính khả thi sẽ
góp phần tạo giá trị gia tăng từ phế liệu tôm bằng giải pháp công
nghệ thân thiện với môi trƣờng.
5. Những đóng góp mới của luận án
1


- Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym
và điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
- Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P. oxalicum 20B và xác định
các đặc tính của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu Nacetylglucosamine. Đặc biệt ảnh hƣởng của từng cấu tử endochitinase
và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase kỹ
thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã đƣợc xem xét.
- Đã đƣa ra qui trình tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy
phân chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm Nacetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực
phẩm chức năng.
6. Cấu trúc của luận án:
Luận án bao gồm 127 trang, trong đó: Phần mở đầu: 2 trang, Chƣơng
1 - Tổng quan tài liệu: 29 trang, Chƣơng 2 - Nguyên vật liệu và
phƣơng pháp nghiên cứu: 14 trang, Chƣơng 3 - Kết quả và thảo luận: 49
trang, phần Kết luận và kiến nghị: 1 trang, Các công trình của tác giả
công bố liên quan đến đề tài luận án: 1 trang, phần Tài liệu tham
khảo: 11 trang, phần Phụ lục: 21 trang.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. N- ACETYLGLUCOSAMINE

1.1.1. Các đặc tính của N- acetylglucosamine
1.1.2. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng
1.1.3. Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine
1.1.3.1. Phƣơng pháp hóa học
1.1.3.2. Phƣơng pháp chuyển hóa sinh học
1.1.3.3. Phƣơng pháp enzym
1.2. CHITIN
1.2.1. Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin
1.2.2. Nguồn thu nhận chitin
1.3. CHITINASE
1.3.1. Hệ chitinase
1.3.2. Đặc tính sinh hóa
1.3.3. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG
1.3.4. Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG
1.3.4.1. Các giải pháp tiền xử lý chitin
1.3.4.2. Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase
1.4. SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT
1.4.1. Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase
1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.4. Ảnh hƣởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase
2


1.4.5. Ảnh hƣởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.7. Ảnh hƣởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase
1.4.8. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc và cƣờng độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase
1.5. PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT
1.5.1. Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym

1.5.2. Cô đặc dịch chiết enzym
1.6. CÁCPHƢƠNGPHÁP TINHSẠCHNAGTỪDỊCHTHỦY PHÂNCHITIN
1.6.1. Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất
1.6.2. Cô đặc
1.6.3. Kết tinh
1.6.4. Tinh sạch NAG bằng dung môi
1.6.5. Qui trình tinh sạch để thu nhận NAG
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.2. Chủng vi sinh vật
2.1.3. Hóa chất
2.1.4. Thiết bị
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.2.1. Phƣơng pháp xác định sinh khối nấm mốc
2.2.2. Phƣơng pháp phân tích hóa lý
2.2.2.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm
2.2.2.2. Phƣơng pháp định lƣợng (NAG)i
2.2.2.3. Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số của mẫu chitin
2.2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein của mẫu chitin
2.2.2.5. Cách tính hàm lƣợng chitin
2.2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzym
2.2.3.1. Hoạt độ chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Binod cải tiến
2.2.3.2. Hoạt độ endochitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Yabuki cải tiến
2.2.3.3. Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase
2.2.3.4. Hoạt độ chitobiosidase
2.2.4. Phƣơng pháp xác định cấu trúc bề mặt của chitin, NAG
2.2.5. Phƣơng pháp xác định đặc tính vật lý của chitin, NAG
2.2.6. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của chitin, NAG
2.2.7. Phƣơng pháp xác định sai số trung bình

2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng sinh tổng hợp chitinase
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật
2.3.3. Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật
2.3.4. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật
3


2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu thủy phân chitin
2.3.5.1. Phƣơng pháp tiền xử lý chitin
2.3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh sạch
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P. OXALICUM 20B
3.1.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men
3.1.1.1. Ảnh hƣởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase
Dạng chitin ảnh hƣởng không nhiều đến hoạt tính chitinase thể hiện trên kết quả
Hình 3.1. Trong quá trình lên men, hoạt độ chitinase nhận đƣợc với cả 03
dạng chitin chỉ dao động từ 0,062 U/ml tới 0,065 U/ml và đạt cao nhất ở
thời điểm 120 h. Do đó, chitin dạng thô đƣợc lựa chọn làm chất cảm ứng nhằm
giảm công sức, hóa chất và năng lƣợng.
3.1.1.2. Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase
0.062

0.065

Hoạt độ chitinase (U/ml)

Hoạt độ chitinase (U/ml)

0.080

0.063

0.060

0.040

0.020

0.08
0.064
0.053

0.06
0.04
0.02

0.009

0

0.009

0
0.000
Không có
chitin

0.050

0.043

Chitin thô

Chitin nghiền Chitin dạng gel
(600μm - 2mm)

1

Hình 3.1. Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt
tính chitinase tại các thời điểm lên men

4

6

Nồng độ chitin thô (g/l)
72 h

72 h 96 h 120 h 144 h

2

96 h

120 h

144 h

Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ chitin
thô tới hoạt tính chitinase tại các thời
điểm lên men

Khảo sát nồng độ chitin thô từ 0 đến 6 (g/l) cho thấy khả năng sinh tổng hợp
chitinase đạt cực đại 0,064 U/ml ở nồng độ chitin thô 4 (g/l) (Hình 3.2).
3.1.1.3. Ảnh hƣờng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase
Nguồn nitơ ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase đƣợc
thực hiện trên 05 nguồn khác nhau (CNM, NaNO3 và urea, CNM kết
hợp với NaNO3 hoặc urea) với cùng lƣợng 10 g/l. Định kỳ thu dịch
lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.3. Nguồn nitơ là CNM
cho hoạt độ chitinase đạt cao nhất (0,066 U/ml). Nên CNM 10 (g/l) là nguồn nitơ
thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B.
3.1.1.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase
4


Chọn CNM làm nguồn nitơ bổ sung, kết quả Hình 3.4 cho thấy khi
nồng độ CNM từ 5 g/l đến 15 g/l, hoạt tính chitinase đạt cao nhất ở
nồng độ 10 g/l là 0,065 U/ml.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ
tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm
lên men

Hình 3.4. Ảnh hưởng nồng độ cao nấm
men tới hoạt tính chitinase tại các thời
điểm lên men

3.1.2. Ảnh hƣởng điều kiện lên men

3.1.2.1. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên men tới sinh tổng hợp chitinase
P.oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở pH 5, hoạt độ
enzym nhận đƣợc 0,064 U/ml chitinase tại thời gian 120 h lên men.
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase

Hình 3.5. Ảnh hưởng pH môi trường tới khả năng
sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men

Hình 3.6. Ảnh hưởng tốc độ lắc khả năng sinh
tổng hợp hitinase trong quá trình lên men

Nghiên cứu ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp enzym từ P.
oxalicum 20B đƣợc thực hiện với các thông số nhƣ thí nghiệm trên, nhƣng tốc
độ lắc đƣợc thay đổi từ 100 v/p - 180 v/p. Định kỳ lấy dịch lên men để xác định
hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.6. Khảo sát tốc độ lắc từ 100 v/p tới 180
v/p cho thấy hoạt độ chitinase đạt cao nhất 0,074 U/ml tại lắc 160 v/p. Do vậy
sinh tổng hợp chitinase tốt nhất đạt 0,074 U/ml ở môi trƣờng lên men thích hợp chứa
5


4 g/l cảm ứng chitin thô, 10 g/l cao nấm men và pH 5; lắc với tốc độ 160 v/p.
3.1.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase
Nghiên cứu đƣợc tiến hành với các điều kiện thích hợp nhất đã lựa chọn.
Trong quá trình lên men, pH giảm dần từ pH 6,67 xuống pH 5,50 và
giữ ổn định tới khi kết thúc lên men. Sinh khối tăng nhanh chóng đạt cực
đại sau 48 h (0,75 g/l), rồi giảm liên tục tới cuối quá trình lên men. Hoạt
tính chitinase tăng lên đáng kể tại pha sinh trƣởng cân bằng và đạt cao
nhất khi cuối pha cân bằng. Hoạt tính chitinase bắt đầu tăng sau lên men
24 h và đạt cực đại 0,074 U/ml tại 120 h, sau đó giảm nhanh và còn
0,051U/ml tại 144 h lên men (Hình 3.7).

Bảng 3.1. Động thái sinh tổng
hợp chitinase, endochitinase,
NAHase trong quá trình lên men
của P. oxalicum 20B

Hình 3.7. Động thái sinh tổng hợp chitinase

Hình 3.8. Khả năng thủy phân dịch gel chitin 50% thành
đường khử bằng dịch lên men chứa chitinase lấy ở các thời
điểm lên men khác nhau (dịch lên men pha loãng 02 lần

6

Hình 3.9. Sắc ký TLC của các
sản phẩm thủy phân từ gel chitin
50% bởi dịch lên men được pha
loãng 2 lần. (1) NAG chuẩn; (2)
Đối chứng;( 3), (4), (5), (6), (7),
(8) tương ứng thời gian lấy mẫu
dịch lên men 72 h; 96 h; 108 h;
120 h; 132 h; 144 h.


Kết quả Bảng 3.1 chỉ ra thời gian lên men từ 24 h đến 144 h, hoạt tính chitinase,
endochitinase, NAHase tăng và đạt cực đại 0,074 U/ml, 5,058 U/ml, 0,683
U/ml tƣơng ứng tại 120 h lên men. Sự kiểm định hoạt tính tại các thời điểm lấy
mẫu dịch lên men đƣợc xác định bằng thủy phân gel chitin 50% (ở điều kiện pH
5, nhiệt độ 35oC, tỷ lệ dịch lên men/ dịch gel chitin là 1/1) thành đƣờng khử
(Hình 3.8) cũng nhƣ thành NAG tăng tƣơng ứng (Hình 3.9).
Từ cơ sở nghiên cứu trên điều kiện pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p, 4 g/l chitin thô,

10 g/l CNM và thời gian lên men 120 h đƣợc lựa chọn để sinh tổng hợp enzym
từ P. oxalicum 20B cho nghiên cứu tiếp theo.
3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ
PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi
Dịch nổi chứa chitinase nhận đƣợc sau lên men trong điều kiện tối ƣu
đƣợc loại tạp chất và cô đặc. Do ảnh hƣởng lớn của độ nhớt nên mức
cô đặc cao nhất có thể là cô đặc 4 lần. Hoạt tính chitinase, NAHase,
endochitinase của các phân đoạn enzym nhận đƣợc thể hiện ở Bảng
3.2. Tỷ lệ cô đặc tăng, hoạt tính chitinase, NAHase và endochitinase
ở các phân đoạn trên màng đều tăng. Ngoài ra, khi tỷ lệ cô đặc tăng
từ 2 đến 4 lần thì tỷ lệ H/E ở các phân đoạn trên màng cao hơn hẳn từ
0,141 đến 0,170 và cao hơn so với tỷ lệ H/E trong dịch nổi enzym là
0,129. Và tại tỷ lệ cô đặc 4 lần thì tỷ lệ H/E của enzym trong phân
đoạn trên màng lớn gấp 17 lần so với tỷ lệ H/E của enzym trong phân
đoạn dƣới màng.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hoạt
tính và tỷ lệ chitinase, NAHase và endochitinase
(endo) trong các phân đoạn khi lọc màng

Bảng 3.3. Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu
suất thu nhận chitinase, NAHase và
endochitinase trong chế phẩm khi lọc màng

Hiệu suất thu hồi (HSTH) enzym khi cô đặc bằng hệ thống lọc dòng ngang
QuixStandTM màng lọc MWCO 10kDa thể hiện Bảng 3.3. Mức độ cô đặc càng
cao, HSTH enzym trên màng càng giảm. Trong đó giảm mạnh nhất là
endochitinase chỉ còn 61,66%, tiếp theo là chitinase còn 76,39% và giảm ít nhất là
NAHase còn 81,27% sau khi cô đặc 4 lần. Sự giảm HSTH do một phần enzym đi
qua màng lọc, thể hiện ở mức độ tăng HSTH của chitinase ở dịch qua màng. Tuy

nhiên, tính HSTH tổng của các enzym trên và dƣới màng đều thấp hơn 100%.
Chứng tỏ một phần enzym đã bị vô hoạt trong quá trình siêu lọc. Nên mức cô đặc
7


4 lần đƣợc chọn để lấy phần trên màng thu chế phẩm enzym kỹ thuật.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả năng tạo NAG
Ở mức độ cô đặc enzym 4 lần, phân đoạn trên màng đƣợc pha loãng tới cùng
nồng độ enzym với phân đoạn dƣới màng (nồng độ enzym 0,0024 U/ml
chitinase). Phản ứng thủy phân gel chitin 10% thực hiện với cùng liều lƣợng
enzym ở điều kiện pH 5 và nhiệt độ 35oC. Tại các thời điểm thủy phân ta có phổ
sản phẩm tạo thành theo phƣơng pháp TLC thể hiện Hình 3.10. Phân đoạn
enzym trên màng cho sản phẩm thủy phân trên vệt từ đƣờng 1 đến đƣờng 4 chủ
yếu là NAG, nhƣng sản phẩm thủy phân của phân đoạn dƣới màng là hỗn hợp
NAG và NAGi (với i khác 1) thể hiện đƣờng 6 - 9. Trên cơ sở tỷ lệ H/E của 02
phân đoạn enzym nghiên cứu rất khác nhau (0,170 và 0,010), vai trò của
NAHase trong thủy phân chitin triệt thành NAG đƣợc khẳng định rõ rệt.
Ngoài ra, ảnh hƣởng tỷ lệ H/E tới khả năng thủy phân chitin thành NAG của
các phân đoạn enzym trên màng (tƣơng ứng tỷ lệ cô đặc 2; 3; 4 lần) đã đƣợc
pha loãng về cùng đơn vị hoạt độ chitinase 0,037 U/ml, có cơ cấu NAHase và
endochitinase ở Bảng 3.4 để thủy phân 50% gel chitin điều kiện 35 oC, pH 5, tỷ
lệ E/S là 1/1 (v/v). Sau 15 h thủy phân, NAGi (với i từ 1 – 3) tạo thành đƣợc định
lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC cho thấy tất cả dịch thủy phân đều không chứa
2NAG (tức NAG2), không chứa 3NAG (tức NAG3), chỉ chứa duy nhất NAG
với hàm lƣợng tăng khi tỷ lệ H/E tăng thể hiện Bảng 3.4. Tỷ lệ cô đặc càng cao
(từ 1 đến 4 lần) làm tỷ lệ H/E càng tăng (từ 0,129 lên 0,170) và giúp lƣợng NAG tạo
thành càng lớn dần (từ 5,16 lên 9,49 mg/ml). Nên quá trình cô đặc làm tăng hoạt độ
chitinase, NAHase, endochitinase (U/ml) cũng nhƣ tỷ lệ H/E nên giúp HSTP chitin
ra NAG tăng. Nhƣ vậy, enzym cô đặc 4 lần trên màng đƣợc gọi là chế phẩm enzym
kỹ thuật và đƣợc lựa chọn dùng trong nghiên cứu thủy phân chitin ra NAG.

Bảng 3.4. Cơ cấu NAHase và endochitinase
(endo) trong các phân đoạn enzym (cùng
chung hoạt độ chitinase 0,037 U/ml) từ các
phân đoạn enzym

Hình 3.10. Sắc ký đồ sản phẩm thủy
phân gel chitin 10% bởi phân đoạn
cô đặc 4 lần trên màng và dưới màng
(cùng hoạt độ 0,0024 U/ml chitinase)
ở điều kiện pH 5 và nhiệt độ 35oC

Mô tả Hình 3.10: 1, 2, 3, 4: sản phẩm thủy phân bởi phân đoạn trên
màng cô đặc 4 lần trong thời gian lần lượt 24 h; 12 h; 6 h; 3 h;
5: Chất chuẩn NAG; 6, 7, 8, 9: sản phẩm thủy phân bởi phân đoạn
qua màng cô đặc 4 lần trong lần lượt 3 h; 6 h; 12 h; 24 h.
8


3.2.3. Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật
Bảo quản ở nhiệt độ 4oC, thời gian từ 30 đến 120 ngày, hoạt tính
chitinase ổn định nhất (hoạt tính chitinase còn lại khoảng 85% đến
82,5%) khi bảo quản bởi NaCl 3%, tiếp đến 0,1% Benzoat natri, kém
ổn định ở các giải pháp glycerol 20%, hỗn hợp glycerol 20% với
NaCl 3% hay mannitol 1 M với NaCl 3%. Do đó chế độ NaCl 3% ở
4oC dùng để bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật là hợp lý hơn cả.
3.2.4. Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật
Chế phẩm chitinase kỹ thuật có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 2,152 U/ml
HAHase và 12,695 U/ml endochitinase nhận đƣợc sau khi cô đặc 4 lần trên
màng đƣợc đem đi xác định đặc tính.

3.2.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym
Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính enzym của chế phẩm đƣợc xem xét qua
hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym thể hiện Hình 3.11.

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới
độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) của chế phẩm enzym kỹ thuật. Sự giảm hoạt độ
enzym tại 30 C (); 35 C (); 40 C (), 45 C () và 50 C ().

Khoảng nhiệt độ thích hợp cho xúc tác của chitinase là 35 C - 40 C và tối ƣu ở
40oC thể hiện Hình 3.11 A. Kết quả Hình 3.11 C và Hình 3.11 E cho thấy cả
9


endo và NAHase đều có khoảng nhiệt độ thích hợp là 35 C - 40 C.
Đánh giá độ bền hoạt lực của enzym với nhiệt độ, chế phẩm enzym đƣợc giữ ở
môi trƣờng pH 5 và nhiệt độ khác nhau từ 30 - 50 C trong 5 ngày. Sau đó, xác
định hoạt độ enzym và kết quả biểu diễn trên Hình 3.11 B, Hình 3.11 D, Hình
3.11 F. Chế phẩm chitinase không bền nhiệt. Nhƣ nhiệt độ 45 C và 50 C chỉ sau 2
ngày, hoạt độ của NAHase vẫn còn khá cao lần lƣợt 71% và 57%, nhƣng hoạt độ
của endochitinase giảm về không và hoạt độ chitinase tổng không tìm thấy. Ở 40oC
hoạt tính chitinase tối ƣu, hoạt độ chitinase chỉ còn lại khoảng 20% sau 5 ngày. Do
vậy để ứng dụng chế phẩm cho thủy phân chitin không nên kéo dài quá 3 ngày.
3.2.4.2. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzym
Ảnh hƣởng pH tới hoạt tính enzym của chế phẩm enzym kỹ thuật đƣợc xem xét
qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym thể hiện trên Hình 3.12.

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C),
NAHase (E) và tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) của chế
phẩm enzym kỹ thuật. Sự giảm hoạt độ enzym ở pH 3 (), pH 4 (), pH 5 (), pH
6 (), pH 7 (),

pH tối ƣu cho xúc tác của chitinase, endochitinase, NAHase lần lƣợt là pH 5, pH
4, trong khoảng pH 5 - pH 6. Chitinase có khoảng giá trị pH thích hợp trong
vùng axit (pH 5 - pH 6) (Hình 3.12 A). Endochitinase thể hiện rõ hơn là một
enzym axit (pH 4 - pH 5) (Hình 3.12 C). Khác với 02 loại enzym trên NAHase
tƣơng đối bền với sự thay đổi của pH (Hình 3.12 E).
3.3. ỨNGDỤNGCHẾ PHẨM CHITINASEKỸTHUẬT THỦYPHÂNCHITIN
3.3.1. Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản
10


Đường khử (mg/ml)

Khảo sát chitin (từ tôm mũ ni, sú và mai mực) thì chitin tôm mũ ni cho hiệu suất
thủy phân cao hơn cả. Nên chitin mũ ni đƣợc chọn để nghiên cứu tiếp theo
3.3.2. Lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni
3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin
Chitin tôm mũ ni đƣợc nghiền máy nghiền bi, và đƣợc phân loại theo kích
thƣớc các phân tử bằng hệ rây (kích thƣớc lỗ rây từ 63 µm đến 600
µm), sau đó xác định trọng lƣợng và hàm lƣợng chitin trong từng phân
đoạn. Ảnh hƣởng của mức độ nghiền tới khả năng thủy phân chitin cho
thấy lƣợng đƣờng khử nhận đƣợc tăng tỷ lệ thuận với mức độ nghiền
(Hình 3.13). Nhƣ vậy mức độ nghiền bi càng cao, càng giúp giảm kích
thƣớc và làm giảm độ kết tinh chitin trong nguyên liệu tạo điều kiện
cho enzym tiếp xúc mạnh với cơ chất. Do đó nghiền bi chitin cho kích
thƣớc càng bé thì hiệu quả thủy phân chitin càng cao.
3.3.2.2. Ảnh hƣởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng
thủy phân chitin
Các phân đoạn bột chitin tôm mũ ni sau khi nghiền bi đƣợc đƣa vào
siêu âm trong thời gian 60 phút, tiếp theo bổ sung chế phẩm enzym

kỹ thuật. Sau đó tiến hành thủy phân chitin ở nhiệt độ 40oC, lấy mẫu
xác định lƣợng đƣờng khử tạo thành theo thời gian thủy phân.
1.500
1.200
600µm425µmMN<63µm+SA60'

0.900
0.600
0.300

0.000
72h
96h
120h
Thời gian thủy phân

Hình 3.13. Ảnh hưởng kích thước các phần tử
chitin MN sau nghiền tới đường khử tạo thành

Hình 3.14. Ảnh hưởng xử lý siêu âm chitin
MN sau nghiền bi tới đường khử tạo thành.

Nghiền bi phối hợp với siêu âm cải thiện rõ rệt HSTP ở tất cả các phân đoạn
kích thƣớc bột nghiền khác nhau (Hình 3.13 và Hình 3.14). Thật vậy, sau 120
h thủy phân, lƣợng đƣờng khử nhận đƣợc cao nhất với phân đoạn <
63 m là 1,459 mg/ml có kết hợp siêu âm 60 phút cao hơn hẳn 1,329 mg/ml
khi chỉ nghiền bi. Kết quả này cũng đƣợc minh chứng bởi chụp SEM (Hình
3.16). Ảnh chụp SEM phân đoạn 425 μm < MN < 600 μm cho thấy sóng siêu

âm có tác dụng đáng kể trong việc phá liên kết sâu hơn vào bên trong
nguyên liệu tạo nên các phần tử có kích thƣớc nhỏ hơn so với trƣớc khi siêu
âm (Hình 3.16 D). Thực hiện siêu âm gián đoạn các phân đoạn bột nghiền có
kích thƣớc khác nhau và enzym đƣợc bổ sung vào trƣớc hoặc sau khi siêu âm.
Khi siêu âm có mặt cả enzym sẽ giúp enzym đi vào sâu hơn bên trong nguyên
liệu, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzym và chitin đẩy nhanh quá trình thủy
11


phân, rút ngắn thời gian thủy phân hơn so với phƣơng pháp chỉ siêu âm
nguyên liệu mà không có mặt enzym (Hình 3.15).
3.3.2.3. Ảnh hƣởngcác giải pháp xử lýchitintớicơ cấu sản phẩmnhận đƣợc sau thủyphân
Cơ cấu sản phẩm nhận đƣợc sau thủy phân 120 h thể hiện Bảng 3.5.
Kết quả Bảng 3.5 cho thấy xử lý chitin tôm mũ ni kích thƣớc càng bé
và kết hợp SA gián đoạn nhiều lần cho lƣợng NAG cao nhất
Bảng 3.5. Hàm lượng (NAG)I
trong dịch thủy phân 120 h

Đường khử (mg/ml)

1.800

1.500
1.200
0.900

0.600
0.300
0.000

Xử lý siêu âm lên các phân đoạn vỏ tôm Mũni

Hình 3.15. Ảnh hưởng phương thức xử lý
chitin vỏ tôm mũ ni tới đường khử tạo
thành sau 120 h thủy phân

Các giải pháp xử lý không làm ảnh hƣởng tới khả năng thủy phân đối với kích
thƣớc lớn (> 600 μm), nhƣng lại cải thiện rõ rệt với kích thƣớc nhỏ (< 600 μm).

Hình 3.16. Ảnh hiển vi điển tử quét của các loại nguyên liệu chứa chitin.A. Chitin
tôm mũ ni thô (MN thô); B. 425 μm < MN < 600 μm; C. MN < 63 μm; D. 425 μm <
MN < 600 μm + SA; E. Chitin mực thô (M thô); K. Chitin tôm sú thô (S thô).

12


3.3.2.4. Ảnh hƣởng của tác động nhiệt độ cao và áp suất
Xử lý nhiệt, áp suất và vi sóng không tác động cải thiện lên hiệu suất
thủy phân đối với chitin tôm MN. Nhƣng xử lý nhiệt độ 150ºC và áp
suất 2 psi trong 20 phút, xử lý siêu âm (SA) gián đoạn 3 lần (mỗi lần
20 phút) lại cải thiện HSTP.
3.3.2.5. Ảnh hƣởng của tác động xử lý hóa học và vật lý
Tác động mạnh lên chitin thô và chitin qua nghiền nhƣng lại không
ảnh hƣởng tới chitin dạng gel.
3.3.3.6. Ảnh hƣởng trạng thái chitin tới quá trình thủy phân ra NAG
Chitin ở trạng thái kích thƣớc MN < 63 μm và dạng gel đƣợc chọn để so
sánh ảnh hƣởng xử lý cơ học với xử lý hóa học lên HSTP NAG.

Phản ứng thủy phân đƣợc tiến hành khi phối trộn dịch enzym (hoạt
độ 0,0345 U/ml chitinase) và dịch chitin 22,44 mg/ml (gel chitin và

MN < 63 μm) với tỷ lệ 1/1 (v/v). Định lƣợng NAGi bằng phƣơng
pháp HPLC cho thấy (NAG)2, (NAG)3 đều không tồn tại trong tất
cả các dịch thủy phân. HSTP ra NAG thể hiện Bảng 3.6.
Chitin tôm MN dạng gel dễ bị thủy phân bởi chitinase tạo NAG hơn MN
< 63 µm. Nên HSTP NAG đối với chitin tôm MN dạng gel lớn hơn
nhiều so với chitin MN < 63 μm trong thời gian ngắn (6 h). Tuy nhiên
khoảng cách này giảm khi kéo dài thời gian thủy phân (24 h). Điều này
đƣợc minh chứng bởi phân tích nhiệt vi sai và FTIR trên Hình 3.17.
Bảng 3.6. NAG tạo
thành

Hình 3.17. A. Các đường cong phân tích nhiệt vi sai
(DSC).MN < 63 μm (M3_DSC), (M5_DSC); B. Phổ FTIR
MN < 63 μm (M3_FTIR) và gel chitin MN (M5_FTIR

3.3.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin
3.3.3.1. Ảnh hƣởng nhiệt độ
HSTP tƣơng đối chitin ra NAG tăng mạnh gần 36h thủy phân, sau đó hầu nhƣ
không tăng nữa ở các nhiệt độ 35oC và 40oC và đạt giá trị lớn nhất 83% và 88%.
Nhiệt độ thấp hơn 30oC, tốc độ thủy phân chậm hơn và đạt giá trị cao nhất sau
13


36 h là 73%. Nhƣng sự thủy phân chitin ở 45ºC dừng rất sớm (chỉ sau 24 h) và
HSTP tƣơng đối nhận đƣợc rất thấp 63% (Hình 3.18 A). Do vậy, nhiệt độ tối ƣu
cho thủy phân chitin đƣợc xem là 40ºC. Sản phẩm phân giải chính là NAG
(Hình 3.18 B).

Hình 3.18. (A) Ảnh hưởng nhiệt độ lên NAG tạo thành khi pH 5. Quá trình thủy phân
được thực hiện ở 450C (), 300C (), 350C (), 400C (). (B). Sắc ký bản mỏng của

các sản phẩm thủy phân từ gel chitin bởi chế phẩm chitinase kỹ thuật sau 36 h thủy
phân. (1) Chất NAG chuẩn; (2) ở 450C; (3) ở 400C; (4) ở 350C; (5) Kiểm chứng enzym; (6) Kiểm chứng-gel chitin.

3.3.3.2. Ảnh hƣởng pH

Hình 3.19. (A) Ảnh hưởng pH lên NAG tạo thành. Quá trình thủy phân được thực hiện ở 400C. (B)
Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin bởi chế phẩm chitinase kỹ thuật sau 24h
thủy phân. (1) Chất chuẩn NAG; (2) pH 3; (3) pH 4; (4) pH 5; (5) pH 6; (6) pH 7;
(7) Kiểm chứng – enzym; (8) Kiểm chứng – gel chitin.

Sau 24 h thủy phân, HSTP tƣơng đối gần nhƣ nhau tại pH 4 - 6, và
đạt lớn nhất 88% ở pH 5. Thủy phân chitin bởi chitinase ở pH axit tốt
14


hơn ở pH kiềm. HSTP tƣơng đối ở pH 7 và 8 giảm 1,7 lần so với ở
pH 5 (Hình 3.19.A). NAG là sản phẩm chính Hình 3.19.B.
3.3.3.3. Ảnh hƣởng nồng độ gel chitin
Cơ chất nồng độ từ 20% tới 40% gel chitin (v/v) tƣơng ứng 200 mg/ml tới 416
mg/ml gel chitin đƣợc thủy phân bởi chế phẩm enzym kỹ thuật có hoạt
độ 3,867 mU/ml chitinase với tỷ lệ dịch enzym và cơ chất là 1/1 (v/v).
Các kết quả đƣợc chỉ ra trên Hình 3.20.

Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ gel chitin lên thủy phân gel chitin. (A) nồng độ
NAG (mg/ml),(B) Hiệu suất thủy phân tương đối (%).Quá trình thủy phân được thực
hiện khi phối trộn dịch enzym kỹ thuật 3,867 mU/ml chitinase và gel chitin với tỷ lệ
1/1 (v/v) ở pH 5, 400C.

Nồng độ chitin 416 mg/ml ở 144 h thủy phân cho HSTP đƣờng khử
giảm nhẹ so với khi nồng độ chitin 200 mg/ml (từ 86% xuống 82%).

Sự đình trệ thủy phân có thể do sự khuếch tán kém vì nồng độ chitin cao
đã gây rất nhớt. Nồng độ chitin càng cao thì nồng độ đƣờng khử tạo thành
càng lớn, tuy nhiên có giới hạn. Do đó 416 mg/ml là nồng độ gel chitin
cao nhất có thể đạt đƣợc lựa chọn. Nồng độ chitin cao cần kéo dài thêm
thời gian ủ thì mới thủy phân hết chitin, nhƣng thời gian ủ kéo dài đã gây
bất lợi do dịch thủy phân chứa NAG dễ nhiễm tạp.
3.3.3.4. Ảnh hƣởng nồng độ enzym
Nồng độ enzym tăng làm tăng tốc độ phản ứng enzym và do vậy tăng
tốc độ thủy phân (độ dốc đƣờng cong tăng lên trên Hình 3.25. HSTP
ra NAG 88,5% và 89,7% đã đạt đƣợc lần lƣợt trong 96 h và 144 h
thủy phân khi tỷ lệ E/S 0,054 mU mg-1.
15


Thủy phân dịch 40% gel chitin bởi chế phẩm kỹ thuật 22,405 mU/ml
chitinase thành dịch NAG với HSTP tƣơng đối 89,7% phải mất khoảng thời
gian 144 h (Hình 3.21).

Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ enzym lên
thủy phân gel chitin. Quá trình thủy phân thực
hiện khi phối trộn dịch enzym kỹ thuật có hoạt
độ chitinase khác nhau và cơ chất 40% gel
chitin với tỷ lệ 1/1 (v/v) ở pH 5, 400C

Hình 3.22. Ảnh hưởng nồng độ
enzym tới khả năng thủy phân cơ
chất 40% gel chitin lên NAG tạo
thành trong 24h ở pH 5, 400C, tỷ lệ
dịch enzym/ dich gel chitin là 1/1 (v/v)

Do vậy để rút ngắn thời gian thủy phân trong 24 h, tăng nồng độ chế
phẩm enzym cần đƣợc nghiên cứu. Khi tăng nồng độ chế phẩm
enzym từ 1,367 mU/ml lên 239,103 mU/ml chitinase thủy phân 40%
gel chitin thì lƣợng NAG thu đƣợc bằng HPLC thể hiện Hình 3.25.
Sự tăng HSTP ra NAG chậm dần khi hoạt độ chitinase từ 105,783
mU/ml đến 239,103 mU/ml. Mặc dù tốn kém kinh tế nhƣng lại rút
ngắn thời gian, chế phẩm kỹ thuật 239,103 mU/ml chitinase đƣợc
chọn trong nghiên cứu để thủy phân 40% gel chitin ra NAG với
HSTP cao nhất đạt 89,43%.
3.4. NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM NAG
3.4.1. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc dịch sau thủy phân tới quá trình kết tinh lần 1
Trên cơ sở kết quả Hình 3.25, dịch thủy phân (đƣợc tạo ra từ phối
trộn chế phẩm enzym kỹ thuật 239,103 mU/ml chitinase và dịch 40%
gel chitin với tỷ lệ 1/1 (v/v) trong 24h ở điều kiện pH 5, 400C) đƣợc
tách cặn bằng ly tâm tốc độ 6000 v/p, 100C trong 20 phút; sau đó
đƣợc tách enzym và một phần chitin dƣ bởi hệ thống siêu lọc
QuixStandTM màng MWCO 10kDa. NAG đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp HPLC thể hiện Hình 3.25. Công đoạn lọc dòng ngang
làm thất thoát 4,5% tổng NAG.
16


Dịch thủy phân sau khi siêu lọc đƣợc cô đặc bằng máy cô quay chân không với
mức độ cô đặc khác nhau thu dịch có nồng độ chất khô hòa tan (Bx%) khác
nhau, để lắng ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 24 h nhằm loại bỏ tạp chất kết tinh
lần 1 bằng ly tâm, có kết quả Hình 3.23. Khối lƣợng tinh thể kết tinh lần 1
tăng lên mạnh từ 0 mg/ml đến 0,082 mg/ml khi mức độ cô đặc dịch
thủy phân tăng từ 1 đến 7,9 lần, nhƣng tăng chậm (từ 0,082 mg/ml tới
0,093 mg/ml) khi mức độ cô đặc tăng thêm nữa từ 7,9 tới 15,7 lần.
Các tinh thể kết tinh lần 1 này chứa hầu hết là tạp chất vì hàm lƣợng

NAG chỉ khoảng 2%. Tuy nhiên nồng độ cô đặc dịch thủy phân tăng
dẫn tới hàm lƣợng NAG trong hạt kết tinh lần 1 là gấp đôi khi mức
độ cô đặc dịch thủy phân tăng từ 11,2 đến 15,7 lần (Hình 3.23).
3.4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới quá trình kết tủa cồn
Xác đinh NAG bằng phƣơng pháp HPLC. Từ nghiên cứu mục 3.4.1,
dịch thủy phân cô đặc sau kết tinh loại tạp chất có nồng độ chất khô
hòa tan Bx = 29,3% (tƣơng ứng mức độ cô đặc dịch là 15,71) đƣợc
lựa chọn để thực hiện kết tủa bằng EtOH với tỷ lệ EtOH/Dịch thủy
phân lần lƣợt 7/1; 8/1; 9/1; 10/1; 11/1, cho kết tủa đƣợc sấy khô và
xác định độ ẩm, ta có lƣợng tạp chất kết tủa bởi EtOH loại bỏ thể
hiện Hình 3.24.

Hình 3.23. Ảnh hưởng mức độ cô đặc dịch
thủy phân tới lượng tinh thể kết

Hình 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ EtOH/
Dịch thủy phân cô đặc tới NAG thất thoát
vào kết tủa và cặn kết tủa bởi EtOH.

Khi tăng tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc từ 7/1 đến 9/1, khối lƣợng kết
tủa bởi EtOH tăng mạnh từ 77,5 mg/ml đến 95,2 mg/ml và sau đó chỉ tăng
nhẹ tới 96,3 mg/ml với tỷ lệ EtOH tăng thêm tới 11. Kết tủa này chứa chủ
17


yếu tạp chất vì % NAG trong kết tủa khoảng từ 3% đến 11%. Tăng tỷ lệ
EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc dẫn tới NAG trong kết tủa tăng. Điều này
có thể đƣợc giải thích vì NAG kém tan trong EtOH. Lƣợng NAG trong
kết tủa bởi EtOH tăng lên chậm từ 2,8% đến 3,9% khi tỷ lệ EtOH/ Dịch
thủy phân cô đặc từ 7/1 đến 9/1, nhƣng lại tăng mạnh từ 8,4% đến 11,3%

ở tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc cao hơn là 10/1 và 11/1. Nhƣ vậy 9 là
tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tối ƣu để loại tạp chất không làm mất mát
nhiều NAG vào kết tủa bởi EtOH. Trong nghiên cứu tinh sạch thu nhận NAG
của Aiba (2005) đã dùng tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc là 10/1 [1].
3.4.3. Ảnh hƣởng mức độ cô đặc và tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô
đặc tới hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch chế phẩm NAG
Sau loại tạp chất dạng tinh thể kết tinh lần 1, dung dịch nổi thu nhận
đƣợc kết tủa bởi EtOH với tỉ lệ EtOH/dịch thủy phân cô đặc là 9/1.
NAG thất thoát vào tinh thể kết tinh lần 1, NAG thất thoát vào kết tủa
bởi EtOH, NAG thất thoát vào dịch không kết tinh và NAG thu nhận
đƣợc xác định theo HPLC. Khảo sát mức độ cô đặc dịch thủy phân
khác nhau ta có kết quả Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch
chế phẩm NAG
Mức
NAG tổn
NAG tổn
NAG tổn
Hiệu
Độ tinh
độ
thất vào tinh
thất vào
thất vào dịch
suất
sạch chế
cô
thể kết tinh
kết tủa
không kết

thu hồi
phẩm
đặc
lần 1
bởi EtOH
tinh
NAG
NAG
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
0
0
0
1,0
0,812
1,48
6,50
81,99
85,25
6,7
0,947
1,53
8,22
80,36
88,45
7,9
1,090

1,75
9,91
78,11
89,78
10,2
2,148
2,43
11,75
74,47
93,25
15,7

Mức độ cô đặc dịch thủy phân tăng từ 1 đến 15,7 lần không những làm
tăng tổn thất NAG vào hạt kết tinh nhƣ đã chỉ ra ở trên (Hình 3.26), mà
còn làm tăng tổn thất NAG vào kết tủa bởi EtOH. Lƣợng NAG tổn thất
kết tủa cùng tạp chất bởi EtOH tăng từ 0 đến 2,43%. Ngoài ra việc tăng
mức độ cô đặc còn làm tăng lƣợng NAG còn lại trong dịch không kết
tinh. Điều này có thể do sự tăng độ nhớt dịch khi cô đặc cần có sự
nghiên cứu kỹ hơn. Kết quả khi mức độ cô đặc tăng từ 6,7 đến 15,7 lần
làm HSTH NAG giảm từ 81,99% xuống 74,47%. Nhƣng độ tinh sạch
chế phẩm NAG tăng từ 85,25% lên đến 93,25%. Mức độ cô đặc ảnh
hƣởng lớn tới độ tinh sạch và HSTH NAG, trong đó mức độ cô đặc càng
tăng thì độ tinh sạch càng tăng nhƣng HSTH NAG càng giảm (Bảng
3.6). Do vậy việc lựa chọn mục tiêu cô đặc phụ thuộc vào độ tinh sạch
yêu cầu của sản phẩm. Với mục tiêu đạt độ tinh sạch trên 90%, mức độ
cô đặc 15,7 sẽ đƣợc lựa chọn.
18


A

B

C

Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC:
A. (NAG)i chuẩn với i =1-3; B. Dịch thủy phân gel chitin 40% với Bx = 2,2%;
C. Chế phẩm NAG kết tinh từ dịch thủy phân Bx = 29,3%. Ký hiệu 3NAG là mẫu
chuẩn của đường triacetyl-chitotriose ((NAG)3), mẫu 2NAG là mẫu chuẩn của
diacetyl-chitobiose ((NAG)2), mẫu NAG là mẫu chuẩn của N-acetyl-D- glucosamine
(NAG)

Kết quả sắc kí Hình 3.25 cho thấy đều xuất hiện pic ở phút 7,28 là
H2SO4 (pha động); dịch thủy phân ban đầu có chứa NAG và không
chứa các (NAG)i (với i là 2 hoặc 3). Ngoài ra còn có các pic xuất
hiện ở phút 8,755 và 16,088 (Hình 3.25 B) là các tạp chất đã đƣợc
loại bỏ ở sản phẩm tinh sạch (Hình 3.25 C). Quá trình tinh sạch thu
nhận chế phẩm NAG thể hiện trên Hình 3.25 và Bảng 3.19 ta đƣợc
chế phẩm NAG tinh thể (độ ẩm 2,54%, độ tinh sạch 93,25%) với
hiệu suất thu hồi từ dịch sau thủy phân là 74,47% tƣơng ứng với
hiệu suất thu hồi từ chitin là 63,6%.
19


Bên cạnh đó, mối tƣơng quan giữa lƣợng NAG thất thoát vào kết tủa
bởi EtOH và NAG thất thoát vào dịch không kết tinh khi tỷ lệ EtOH/
Dịch thủy phân cô đặc tăng đƣợc thể hiện trên Hình 3.26.
Kết quả cho thấy tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tăng từ 7/1 đến
9/1 đã làm lƣợng NAG thất thoát vào dịch không kết tinh giảm từ
19,06% xuống 6,09%. Tuy nhiên lƣợng NAG thất thoát vào kết tủa

bởi EtOH tăng lên chậm từ 1,42% đến 2,43% khi tỷ lệ EtOH/ Dịch
thủy phân cô đặc từ 7/1 đến 9/1, nhƣng lại tăng mạnh từ 5,26% đến
7,08% ở tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc cao hơn là 10/1 và 11/1.
Tổng hợp hai quá trình đó HSTH NAG tăng mạnh từ 68,17% đến 74,47%
và độ tinh sạch NAG tăng mạnh từ 76,46% đến 93,25% khi tỷ lệ EtOH/
Dịch thủy phân cô đặc từ 7/1 đến 9/1. Nếu tiếp tục tăng tỉ lệ EtOH/ Dịch
thủy phân cô đặc cao hơn là 10/1 và 11/1 HSTH tăng nhẹ từ 74,75% đến
75,39% và độ tinh sạch NAG tăng nhẹ từ 93,25% đến 93,34% (Bảng 3.7).
Chính vì vậy tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc đƣợc chọn là 9 để
kết tủa tạp chất trong tinh sạch thu nhận chế phẩm NAG
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của
tỷ lệ EtOH/Dịch thủy
phân côđặctới HSTH
và độ tinh sạch
chế phẩm NAG

Hình 3.26. Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tới
khả năng thu hồi NAG, NAG thất thoát vào kết tủa bởi EtOH
và vào dịch không kết tinh

3.4.4. Đề xuất và ứng dụng qui trình sản xuất NAG
3.4.4.1. Đề xuất qui trình sản xuất NAG
Từ nghiên cứu trên, tác giả đề xuất qui trình sản xuất NAG từ chitin tôm
mũ ni nhƣ sau: Chuẩn bị gel chitin từ chitin tôm mũ ni nhƣ phƣơng
pháp mục 2.3.5.1. Sử dụng chế phẩm enzym kỹ thuật hoạt độ 0,239
U/ml chitinase, tỷ lệ H/E là 0,170 (với NAHase 2,152 U/ml và
endochitinase 12,695 U/ml) thủy phân cơ chât 40% gel chitin (tỷ lệ
giữa dịch chế phẩm chitinase kỹ thuật và dịch gel chitin là 1/ 1 (v/v),
ở điều kiện pH 5, 40oC, trong thời gian 24 h) nhƣ qui trình Hình 3.27
20

Hình 3.27. Sơ đồ quy trình sản xuất NAG

3.4.4.2. Ứng dụng qui trình sản xuất NAG với qui mô 5 lit dịch thủy phân
5 lit dịch thủy phân ban đầu đƣợc loại cặn nhờ ly tâm 6000 v/p trong 10 phút.
Sau đó đi qua hệ thống lọc dòng ngang chỉ thu 4,750 lít dịch qua màng. Dịch
lọc qua màng đƣợc tiến hành cô đặc bởi hệ thống cô quay chân không ở nhiệt
độ 60oC, vận tốc quay 30 v/p, áp suất 68 - 72 mbar cho tới khi mức độ cô đặc
đạt 15,71 lần. Dịch thủy phân cô đặc đƣợc kết tinh lần 1 ở 4oC trong 24 h, loại
tạp chất kết tinh lần 1 và thu dịch nổi. Tiếp theo bổ sung EtOH 99o vào dung
dịch nổi với tỷ lệ EtOH/ dịch nổi là 9/1 ở 4oC trong 24 h để loại cặn kết tủa,
thu dung dịch trong. Sau đó dung dịch trong này đƣợc loại EtOH bởi hệ thống
cô quay chân không ở nhiệt độ 55oC, vận tốc quay 30 v/p, áp suất 75 - 80
mbar, rồi thực hiện kết tinh lần 2 thu tinh thể NAG ở 4oC trong 24 h và phần
dịch không kết tinh đƣợc. Các tinh thể NAG (kết tinh lần 2) đƣợc rửa bằng 50
ml EtOH 99° và sấy 60oC thu nhận sản phẩm NAG.
21


NAG trong dịch không kết tinh, NAG trong cặn kết tủa bởi EtOH và NAG
trong sản phẩm tinh sạch đƣợc xác định theo phƣơng pháp HPLC ta có kết
quả Hình 3.28; độ tinh sạch NAG và HSTH NAG thể hiện Bảng 3.8.

Hình 3.28. Kết quả phân tích HPLC trong mẫu chứa NAG
A. Mẫu hỗn hợp chất chuẩn 1NAG, 2NAG, 3NAG; B. Mẫu sản phẩm sau tinh sạch;
C. Mẫu kết tủa EtOH; D. Mẫu dịch không kết tinh.
Bảng 3.8. Kết quả tinh sạch chế phẩm NAG
Bảng 3.9. Đặc điểm của
sản phẩm NAG

22


Từ kết quả Bảng 3.7 và Bảng 3.8 cho thấy cùng chung dịch thủy
phân sau cô đặc 15,71 lần, tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc thực
hiện tinh sạch và thu nhận chế phẩm NAG với qui mô lớn cho HSTH
và độ tinh sạch chế phẩm NAG cao hơn chút ít thể hiện Bảng 3.22.
HSTH NAG của nghiên cứu Aiba (2005) là 43% với độ tinh sạch
trên 95%. So với kết quả nghiên cứu này, nghiên cứu thu nhận và
tinh sạch NAG đạt hiệu suất thu hồi NAG (đạt 95,1%) là cao hơn, độ
tinh sạch sản phẩm (đạt 93,28%) lại thấp hơn.
Ngoài ra, kết quả phân tích nhiệt vi sai Hình 3.27 A cho thấy sự
chuyển khối lƣợng diễn ra đối với sản phẩm NAG sau tinh sạch tại
nhiệt độ 200,61oC, đối với NAG của hãng Sigma diễn ra ở nhiệt độ
209,05oC. Sản phẩm NAG sau tinh sạch có điểm nóng chảy bắt đầu
diễn ra ở nhiệt độ 546,83oC nhƣng điểm nóng chảy của NAG Sigma
diễn ra ở nhiệt độ 526,35oC. Do vậy, sản phẩm NAG sau tinh sạch
bền nhiệt hơn so với NAG hãng Sigma.
A
B

Hình 3.27. A. Các đường cong phân tích nhiệt vi sai sản phẩm NAG sau tinh sạch
(M6_DSC), NAG hãng Sigma (M7_DSC). B. Phổ FTIR của sản phẩm NAG sau tinh
sạch (M6_FTIR) và NAG hãng Sigma (M7_FTIR)

23


Hình 3.27.B biểu thị phổ FTIR của sản phẩm NAG sau tinh sạch

(M6_FTIR) và NAG hãng Sigma (M7_FTIR). Hình dạng của đỉnh
(peak) trong khoảng 4000 - 700 cm-1 của phổ M6_FTIR và phổ
M7_FTIR gần nhƣ giống nhau nên cấu trúc của chúng đƣợc coi nhƣ
tƣơng đƣơng. Kết độ tinh sạch sản phẩm NAG sau tinh sạch 93,28%
là gần với độ tinh sạch 100% của sản phẩm NAG Sigma.
3.5. XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM NAG
Đặc tính chế phẩm NAG đƣợc thể hiện trên kết quả Bảng 3.9
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Với kết quả nghiên cứu của luận án có thể rút ra một số kết luận sau:
1. Điều kiện tối ƣu để lên men sinh tổng hợp chitinase từ Penicillium
oxalicum 20B: nguồn Cacbon là chitin mũ ni dạng thô 4,0 g/l; cao
nấm men 10 g/l; pH 5,0; tốc độ lắc 160 vòng/phút; thời gian 120 h.
Hoạt độ dịch lên men thu đƣợc đạt 0,074 U/ml chitinase, 5,058 U/ml
endochitinase và 0,683 U/ml NAHase.
2. Thu nhận chế phẩm enzym kỹ thuật bằng cách cô đặc lọc dòng
ngang 4 lần (màng lọc MWCO 10kDa). Chế phẩm enzym kỹ thuật
nhận đƣợc có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 12,695 U/ml
endochitinase và 2,152 U/ml NAHase; không có chitobiosidase, và
nhiệt độ tối ƣu đều ở 40oC; chitinase tối ƣu pH 5, và bền trong
khoảng nhiệt độ 30 - 40oC ở pH 5; endochitinase, NAHase của chế
phẩm tƣơng ứng pH tối ƣu 4 và 6. NAHase bền nhiệt hơn trong
khoảng 30 - 50oC và ít chịu ảnh hƣởng của pH trong khoảng 4 - 7
hơn endochitinase. Và điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ
thuật: NaCl 3% ở 4oC.
3. Điều kiện tối ƣu để thủy phân chitin thu NAG là: 40oC, pH 5, dịch
cơ chất gel chitin nồng độ 416 mg/ml (gel chitin 40%), enzym hoạt
độ 11,600 mU/ml chitinase. Ở điều kiện này, hiệu suất thủy phân
NAG đạt 87,5% sau thời gian 144 h (tỷ lệ dịch chế phẩm enzym và
dịch cơ chất là 1/1 (v/v)).

4. Đề xuất qui trình thu nhận chế phẩm NAG với hiệu suất thu hồi
NAG từ chitin đạt 63,78% và độ tinh sạch 93,28% từ dịch thủy phân.
Chế phẩm NAG thu đƣợc đạt các yêu cầu vi sinh, kim loại năng và
LD50 trong ngƣỡng cho phép theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc đối với
thực phẩm để dùng làm nguyên liệu chế biến thƣc phẩm chức năng.
KIẾN NGHỊ
- Nghiên cứu khảo sát quá trình lên men sinh tổng hợp chitinase cao
đồng thời với tỷ lệ H/ E cao, và ứng dụng thủy phân chitin ra NAG.
- Thu hồi và tinh sạch NAG với qui mô lớn hơn (Pilot).
24