Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI
--------------

NGUYỄN THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG
VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN
VIÊM DẠ DÀY TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH HẢI DƢƠNG
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành:

Di truyền học

Mã số:

60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Phƣợng
PGS. TS Nguyễn Xuân Viết

HÀ NỘI, 2015


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Xuân Viết và TS. Lê Thị Phƣợng, ngƣời đã
hƣớng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực

hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các cán bộ, giảng viên Khoa Sinh
học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến tập thể cán bộ, giảng viên Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam và Khoa Thăm dò chức năng bệnh viện Đa khoa
tỉnh Hải Dƣơng đã chia sẻ khó khăn, giúp tôi triển khai các nội dung của đề
tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp và gia
đình đã động viên và nhiệt tình ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này.
Hà Nội, tháng 10 năm 2015
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Nhàn


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nội dung

Amoxicillin

Amoxicillinicillin

bp

base pair

Cag A

Cytotoxin - associated gene

Clarithromycin

Clarithromycinrithromycin

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxynucleotitde

EDTA

Ethylen diamine tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

H. pylori

Helicobacter pylori

kb

Kilo basepais

kDa

kilo Dalton

LB

Lysis bufer

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

TAE

Tris- Acetic –Acid EDTA

TBE

Tris - Boric - Acid EDTA

VacA

Vacuolating cytotoxin Antigen

µg

Microgram

µl

Microliter

16S r RNA

16S ribsomal RNA

23S rRNA

23S ribsomal RNA


MỤC LỤC
PHẦN I - MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu. .................................................................................... 2
3. Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3
4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3
PHẦN II - NỘI DUNG .................................................................................... 4
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI ...................................................... 4
1.1.1. Lịch sử phát hiện. .................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori........................................... 4
1.1.3. Đặc điểm di truyền của H. pylori ............................................................ 6
1.1.4. Dịch tễ học về H. pylori .......................................................................... 8
1.1.5. Cơ chế gây bệnh của H. pylori ................................................................ 8
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H. PYLORI ................................... 10

1.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn H. pylori. ................................................................. 11
1.2.3. Ứng dụng PCR trong chẩn đoán nhiễm H. pylori................................. 12
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H.PYLORI TRÊN THẾ GIỚI............ 13
1.3.1. Xác định sự có mặt của H.pylori bằng phân tích trình tự gen đặc hiệu
16S rRNA ........................................................................................................ 13
1.3.1.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen 16S rRNA............................... 13
1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu về gen 16S rRNA............................................ 15
1.3.2. Xác định tính kháng kháng sinh của H.pylori qua phân tích trình tự gen
23S RNA ......................................................................................................... 16
1.3.2.1. Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H. pylori .................................. 16
1.3.2.2. Dịch tễ học của kháng kháng sinh ..................................................... 16


1.3.2.3. Tình hình nghiên cứu về gen 23S rRNA liên quan đến kháng kháng
sinh ở H. pylori................................................................................................ 17
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H. PYLORI TẠI VIỆT NAM. ............ 19
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU H. PYLORI TẠI HẢI DƢƠNG ................ 22
CHƢƠNG II- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 23
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................ 23
2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ...................................................... 23
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 26
2.3.1. Cỡ mẫu .................................................................................................. 27
2.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................ 27
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA t mẫu bệnh phẩm ................................ 27
2.3.4. Điện di ................................................................................................... 28
2.3.5. Định lƣợng, định tính DNA bằng quang phổ kế ................................... 29
2.3.6. Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA xác định sự có mặt của H.
pylori ............................................................................................................... 30
2.3.7. Phản ứng PCR khuếch đại gen 23S rRNA xác định đột biến kháng thuốc ....32
2.3.8. Phân tích và xử lý số liệu: ..................................................................... 33

2.3.8.1. Về các yếu tố dịch tễ học .................................................................... 33
2.3.8.2. Về xác định sự có mặt của H. pylori dựa trên số liệu gen 16S rRNA và
đột biến kháng thuốc trên gen 23S rRNA ........................................................ 34
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 35
3.1. PHÂN TÍCH DỊCH TỄ HỌC ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG BỆNH
NHÂN VIÊM DẠ DÀY ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA
TỈNH HẢI DƢƠNG. ...................................................................................... 35
3.1.1. Tuổi và giới tính .................................................................................... 35
3.1.2. Một số yếu tố dịch tễ khác và tỷ lệ ngƣời mắc bệnh dạ dày. ................ 37


3.2. PHÂN TÍCH GEN 16S RRNA CỦA H. PYLORI TRONG CHUẨN
ĐOÁN BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H. PYLORI ĐANG ĐIỀU TRỊ
TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƢƠNG ................................................ 39
3.2.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA .................................................... 39
3.2.2. Xác định sự có mặt của H. pylori trên gen 16S rRNA ........................ 43
3.2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 16S rRNA ................... 43
3.2.2.2 Xác định sự có mặt của H. pylori bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA .......... 44
3.2.2.3. Kết quả đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA .......................................... 45
3.2.3. Kết quả về tỷ lệ nhiễm H. pylori ........................................................... 46
3.2.4. Mối tƣơng quan giữa yếu tố nguy cơ với tỷ lệ nhiễm H. pylori ........... 48
3.3. NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VI KHUẨN H. PYLORI KHÁNG
KHÁNG SINH Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H. PYLORI ĐANG
ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƢƠNG. ............................. 51
3.3.1. Xác định tính kháng kháng sinh bằng chỉ thị phân tử 23S rRNA .............. 51
3.3.1.1 Tối ƣu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 23S rARN ................... 51
3.3.1.2 Xác định đột biến kháng Clarithromycin và Amoxicillin trên gen 23S
rRNA ................................................................................................................ 51
3.3.1.3 Kết quả đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA ......................................... 52
3.3.2. Kết quả về tỷ lệ kháng kháng sinh của H. Pylori ................................. 53

3.3.3. Mối tƣơng quan giữa các yếu tố nguy cơ với đột biến kháng thuốc .......... 55
3.4. Đề xuất giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả bệnh viêm dạ dày trên
địa bàn tỉnh Hải Dƣơng ................................................................................... 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 66


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Vị trí phân loại học của H. pylori ..................................................... 5
Bảng 1.2: Độ nhạy của thử nghiệm nuôi cấy .................................................. 12
Bảng 1.3 : Tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các khu vực khác nhau trên thế giới....... 18
Bảng 2.1: Danh mục các dung dịch đã sử dụng. ............................................. 24
Bảng 2.2: Danh mục các hoá chất và hãng sản xuất ....................................... 24
Bảng 2.3: Các thiết bị, dụng cụ phân tích thí nghiệm ..................................... 25
Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi để xác đinh H.Pylori và H. Pylori kháng thuốc ...25
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR trong tối ƣu hóa điều kiện khuếch
đại đoạn gen 16S rRNA ..................................................................... 31
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA. ...... 31
Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng PCR trong tối ƣu hóa điều kiện khuếch
đại đoạn gen 23S rRNA ..................................................................... 32
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen 23S rRNA. ...... 33
Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân viêm dạ dày theo nhóm tuổi và giới............... 35
Bảng 3.2. Phân bố bệnh nhân viêm dạ dày theo các yếu tố dịch tễ khác ....... 37
Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch DNA của mẫu bệnh nhân ....................... 40
Bảng 3.5: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn gen 16S rRNA (nhiễm H. pylori) ..... 46
Bảng 3.6. Mỗi tƣơng quan giữa yếu tố nguy cơ với tỷ lệ H. pylori dƣơng tính . 48
Bảng 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn DNA 23S rRNA (kháng
Clarithromycin) ................................................................................. 53
Bảng 3.8. Mối tƣơng quan giữa các yếu tố nguy cơ và tỷ lệ H. pylori kháng
thuốc .................................................................................................. 55

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Vi khuẩn H. pylori ............................................................................ 5
Hình 1.2. Bản đồ di truyền của H. pylori. ......................................................... 6
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA và gen 23SrRNA của H. pylori .... 7
Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H. pylori.......................................................... 9
Hình 1.5: Mẫu thử CLO test ........................................................................... 10
Hình 1.6. Cấu trúc của gen 16S rARN đặc thù cho các loài vi khuẩn
Prokaryote và Archea (Woese et al 1987) ........................................ 13
Hình 3.1: Kết quả đo OD kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA .......... 42
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số đƣợc tách chiết t mẫu bệnh phẩm ... 42
Hình 3.3. Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 16S rRNA .................... 45
Hình 3.4 : Kết quả đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA ...................................... 46
Hình 3.5. Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 23S rRNA .................... 52
Hình 3.6. Kết quả đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA .................................... 53

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Phân bố theo các nhóm tuổi ở bệnh nhân viêm dạ dày. ............. 36
Biểu đồ 3.2. Phân bố theo các nhóm công việc ở bệnh nhân viêm dạ dày ..... 38
Biểu đồ 3.3 : Tỷ lệ H. pylori âm tính và dƣơng tính ....................................... 47
Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ đột biến tại vị trí A2143G và A2142C .............................. 54


PHẦN I - MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Viêm dạ dày là một bệnh lý tƣơng đối rõ ràng, là hậu quả của sự kích
thích niêm mạc bởi các yếu tố ngoại sinh hoặc nội sinh. Viêm dạ dày chủ yếu
gây ra bởi tác nhân nhiễm khuẩn và các rối loạn miễn dịch, bệnh tự miễn và

rất nhiều nguyên nhân khác. Helicobacter pylori đƣợc biết đến nhƣ là một
nguyên nhân chính hay thủ phạm của bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày
tá tràng và là yếu tố đƣợc công nhận nhiều nhất gây ung thƣ dạ dày, đặc biệt
là ở các nƣớc đang phát triển. Helicobacter pylori đƣợc phát hiện bởi Warren
và Marhall (Úc) năm 1982. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Helicobacter
pylori là một yếu tố quan trọng gây bệnh tiền ung thƣ dạ dày và ung thƣ dạ
dày. Ngƣời nhiễm Helicobacter pylori tăng nguy cơ ung thƣ dạ dày gấp 6 lần
so với ngƣời bình thƣờng. Helicobacter pylori làm giảm khả năng tiết ra dịch
của dạ dày, làm cho dạ dày dễ bị tác động bởi axit và gây loét dạ dày, đồng
thời tạo điều kiện cho các vi khuẩn non- Helicobacter pylori ƣa kiềm có khả
năng chuyển hóa nitrite thành các chất tiền ung thƣ.
Nhiễm Helicobacter pylori - căn nguyên các bệnh dạ dày của hơn 70%
ngƣời Việt Nam gây ảnh hƣởng đến khả năng lao động cũng nhƣ chất lƣợng
sống của ngƣời lao động. Ngƣời lao động bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter
pylori vì những lý do nhƣ môi trƣờng sống thiếu vệ sinh, tình trạng vệ sinh an
toàn thực phẩm không bảo đảm.
Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng nhƣ ở nhiều nơi trên thế giới,
các bệnh dạ dày liên quan đến Helicobacter pylori đã và đang đƣợc điều trị nhờ sử
dụng phác đồ chống tiết và kháng sinh. Tuy vậy, trên thực tế các chủng
Helicobacter pylori kháng thuốc đã xuất hiện, làm giảm hiệu lực diệt tr của thuốc
và do đó nhiều bệnh nhân đƣợc điều trị nhƣng không khỏi hoặc điều trị không triệt
để. Theo Nguyễn Văn Thịnh (năm 2007), Amoxicillin và Clarithromycin là những

1


kháng sinh đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong điều trị diệt Helicobacter pylori,
nhƣng t khoảng năm 2010, tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã lên
tới 23,7%, cao hơn nhiều lần so với các nƣớc Châu Âu, Mỹ, Tây Á, Hồng Công,
Nhật Bản và cao hơn một chút so với Hàn Quốc.

Các nghiên cứu nói trên đƣợc tiến hành chủ yếu ở các thành phố công
nghiệp lớn nhƣ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh. Tại Hải Dƣơng,
Helicobacter pylori đƣợc chẩn đoán là có trong dạ dày ngƣời bệnh dựa trên
hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy Helicobacter pylori t dịch tiêu hóa, làm
test Urease để phát hiện Helicobacter pylori. Nuôi cấy Helicobacter pylori t
mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tƣơng đối dài và khi các vi khuẩn bội nhiễm
non - Helicobacter pylori đi kèm làm cho việc phân tích trở nên khó khăn
hơn. Mặt khác, cho tới nay vẫn chƣa có một nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm
Helicobacter pylori và khả năng kháng thuốc của Helicobacter pylori trên địa
bàn tỉnh Hải Dƣơng. Do đó, ứng dụng các kỹ thuật y sinh học hiện đại nhƣ
PCR để phát hiện nhanh và chính xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định
tính kháng kháng sinh của chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị
bệnh viêm dạ dày ở các bệnh viện tuyến tỉnh nói chung và ở một số bệnh viện
tuyến huyện tại Hải Dƣơng là rất cần thiết trong việc nâng cao hiệu quả điều
trị bệnh, qua đó góp phần giảm tải cho các bệnh viện tuyến trung ƣơng. Xuất
phát t ý nghĩa lý luận và thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh
nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng bằng kỹ thuật sinh học
phân tử”.
2. Mục đích nghiên cứu.
2.1. Mục tiêu chung.
Góp phần trong chẩn đoán và điều trị viêm dạ dày ở bệnh nhân nhiễm vi
khuẩn Helicobacter pylori đồng thời có giải pháp định hƣớng kiểm soát và
điều trị hiệu quả căn bệnh này tại tỉnh Hải Dƣơng.

2


2.2. Mục tiêu cụ thể.
- Đánh giá đƣợc thực trạng nhiễm Helicobacter pylori và Helicobacter

pylori kháng thuốc ở các bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.
- Bƣớc đầu đƣa một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh
viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.
3. Nội dung của đề tài
- Phân tích dịch tễ học đánh giá thực trạng bệnh nhân viêm dạ dày do
đang điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dƣơng.
- Phân tích đoạn gen 16S rRNA của Helicobacter pylori trong chuẩn
đoán bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh
viện đa khoa Hải Dƣơng.
- Nghiên cứu thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori kháng kháng sinh
ở bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh viện đa
khoa Hải Dƣơng.
- Bƣớc đầu đề xuất một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn
bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả thực trạng nhiễm vi khuẩn H. pylori và tình trạng kháng kháng
sinh là cơ sở khoa học cho việc kiểm soát, đánh giá và điều trị hiệu quả căn
bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc ứng dụng quy trình phát hiện
nhanh, chính xác H. pylori và H. pylori kháng thuốc trong điều trị viêm dạ
dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.

3


PHẦN II - NỘI DUNG
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI

1.1.1. Lịch sử phát hiện.
T hơn 100 năm trƣớc đây, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận sự
hiện diện của một loại vi khuẩn sống ở dạ dày chó. Tiếp theo, nhiều nhà khoa
học cũng tìm thấy một loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày
nhƣng lại thất bại trong việc nuôi cấy vi khuẩn. Năm 1970, nhà giải phẫu bệnh
Robin Warren nhận xét có mối liên hệ giữa viêm dạ dày mãn tính và một loại
xoắn khuẩn trong niêm mạc dạ dày. Mãi đến năm 1982, Robin Warren và
ngƣời học trò của mình là Barry Marshall mới thành công nuôi cấy vi khuẩn t
11 bệnh nhân bị viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh đƣợc những ảnh
hƣởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày. Họ đã đặt tên cho vi
khuẩn này là Campylobacter pylori dựa theo hình dạng và đặc tính tăng trƣởng.
Năm 1983, phát hiện vi khuẩn Campylobacter pylori và mối liên quan của nó
với bệnh loét dạ dày tá tràng đƣợc công bố trên tạp chí Lancet. Năm 2005, với
phát hiện này, hai ông đã đƣợc trao tặng giải thƣởng Nobel về y học [7].
Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trƣởng của vi khuẩn mà ngƣời ta
đặt tên vi khuẩn là Campylobacter pylori. Tuy nhiên dƣới kính hiển vi điện
tử, vi khuẩn không giống Campylobacter vì có cấu trúc tiêm mao khác hẳn.
Ngoài ra còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hóa và cấu trúc chuỗi
RNA. Do đó hiện nay vi khuẩn đƣợc đặt lại là Helicobacter pylori [44,45].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori.
Về mặt sinh học, Helicobacter pylori (H. pylori) là vi khuẩn Gram âm
không tạo bào tử, có lông roi, một đầu đƣợc cấu tạo t các sợi bao bọc bởi lớp
vỏ bên ngoài có tác dụng bảo vệ khỏi axít dạ dày. Dƣới kính hiển vi, vi khuẩn

4


có hình xoắn cong, đƣờng kính khoảng 0,3 - 1 µm, dài 1,5 -10 µm. Ngoài ra,
đôi khi cũng gặp H. pylori ở dạng hình cầu coccoid. Cấu trúc của vi khuẩn
gồm có màng ở bên trong, lớp peptidoglycan ở giữa và lớp lipopolysaccharide

kị nƣớc ở bên ngoài [20].

Hình 1.1: Vi khuẩn H. pylori
Bảng 1.1: Vị trí phân loại học của H. pylori
Giới(regnum): Bacteria

Họ (familia): Helicobacteraceae

Ngành(phylum): Proteobacteria

Chi (genus): Helicobacter

Lớp(Clarithromycinssis):

Loài (species): Helicobacter pylori

Epsilonproteobacteria
Bộ (ordo): Campylobacterales

Vi khuẩn H. pylori tăng trƣởng ở nhiệt độ 30-400C, phát triển đƣợc trên
môi trƣờng thạch máu đơn giản ở nhiệt độ 370C trong điều kiện hiếu khí hoặc
vi hiếu khí. Trong dạ dày ngƣời, H. pylori sống trong phần sâu của lớp màng
nhầy của niêm mạc dạ dày, giữa lớp nhầy với bề mặt của lớp tế bào biểu mô
và ở các vùng nối giữa các tế bào này [21]. Vi khuẩn đã thiết lập một loạt các
cơ chế thích nghi để sống sót và tƣơng tác chặt chẽ với vật chủ. Vì thế H.
pylori có khả năng sống dai dẳng hàng chục năm trong dạ dày của ngƣời. Sự

5

tồn tại của nó trong môi trƣờng acid dạ dày còn nhờ tác dụng bảo vệ của
enzym urease tạo ra môi trƣờng kiềm xung quanh vi khuẩn. Trong điều kiện
không thuận lợi hoặc sau điều trị bằng một số kháng sinh H. pylori có thể gặp
ở dạng hình cầu và có thể chuyển thành dạng hoạt động [7]. Đây là dạng biến
thể kháng lại một phần chu trình sống của vi khuẩn và có vai trò quan trọng
trong việc lây truyền bệnh. Goodwin gọi đây là dạng “ngũ” và nhờ nó H.
pylori tồn tại lâu hơn ở môi trƣờng bên ngoài trong điều kiện không thuận lợi.
Tạ Long và cộng sự nhận xét về đặc điểm siêu cấu trúc của H. pylori có thể ở
dạng hình cầu hoặc hình oval, một đầu có chùm lông đƣợc quan sát dƣới kính
hiển vi điện tử [7].
1.1.3. Đặc điểm di truyền của H. pylori
H. pylori có kích thƣớc genome bằng khoảng 1/3 kích thƣớc genome của
E. coli và tƣơng đƣơng với genome của Haemophilus influenza. Genome của
H. pylori là một nhiễm sắc thể mạch vòng có kích thƣớc khoảng 1,67 Mb,
gồm khoảng 1600 gen tổng hợp các protein tham gia vào quá trình trao đổi
chất của vi khuẩn. [38,42].

Hình 1.2. Bản đồ di truyền của H. pylori.

6


Sau khi giải mã toàn bộ trình tự genome của vi khuẩn, các nhà khoa học
nhận thấy các chủng H. pylori có thể mang các kiểu gen và các kiểu hình khác
nhau do đột biến. Khoảng 1% genome của chúng mã hoá cho 30 protein màng
ngoài, đóng vai trò quan trọng trong mối tƣơng tác giữa vi khuẩn và các tế
bào biểu mô dạ dày. Các protein màng ngoài có thể sử dụng làm vắc-xin
phòng ng a nhiễm H. pylori [26]

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA và gen 23SrRNA của H. pylori

Hai chủng H. pylori là: HP 26695 (phân lập ở Anh vào năm 1987) và
chủng HP 199 (phân lập ở Mỹ vào năm 1994) đã đƣợc nghiên cứu cấu trúc bộ
gen. Cấu trúc bộ gen của chúng bao gồm một nhiễm sắc thể vòng kích thƣớc
1,64 đến 1,67 Mb, trong đó 90,8 - 91% đƣợc cấu tạo bởi vùng mã hóa. Hai bộ
gen của hai chủng khác nhau ở số lƣợng và bản chất của đoạn chèn cũng nhƣ
sự hiện diện hay không của gen mã hóa các enzym hạn chế. Nhiễm sắc thể
của vi khuẩn chứa các gen tham gia vào sự tổng hợp enzym urease, yếu tố gây
độc tế bào nhƣ VacA, kháng nguyên CagA và các tiêm mao. Đa số các chủng
phân lập ở Đông Á có CagA và các allen gây độc tế bào của gen VacA, trong
khi đó chỉ có 50% số chủng ở châu Âu và châu Mỹ là có các gen này. Sự khác
biệt này có thể giải thích bởi nguồn gốc địa lý của các chủng hoặc bởi sự chọn
lựa ký chủ của các chủng có sự khác nhau [9]. Nhìn chung bộ gen của các

7


chủng giống nhau t 92-99%, tuy nhiên một số chủng có sự khác biệt nhiều
hơn do H. pylori thiếu sửa chữa khi nhân đôi DNA [19,32].
1.1.4. Dịch tễ học về H. pylori
Nhiễm H. pylori là một trong những nhiễm khuẩn mãn tính thƣờng gặp
nhất ở ngƣời. Tần suất nhiễm H. pylori thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh
tế, xã hội và chủng tộc. Ngƣời ta ƣớc tính có hơn 50% dân số đã bị nhiễm H.
pylori, chủ yếu ở các nƣớc đang phát triển với tần số nhiễm rất cao t 50 90% ở lứa tuổi lớn hơn 20 và hầu hết trẻ em bị nhiễm ở độ tuổi t 2 - 8. Việt
Nam cũng là nƣớc có tỉ lệ nhiễm H. pylori cao, khoảng hơn 70% ở ngƣời lớn.
Trong khi đó, ở các nƣớc đã phát triển, tuổi bị nhiễm thƣờng trên 50, chiếm
hơn 50% dân số. Tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm [2].
Đƣờng lây nhiễm chủ yếu gồm 3 nguồn lây chính thức:
- Nguồn lây t động vật: một số loại gia súc, gia cầm và động vật trong
tự nhiên có thể mang H. pylori nhƣ chó, gà, vịt, chim, c u… và trở thành
nguồn lây cho ngƣời.

- Nguồn lây t môi trƣờng, trong đó nƣớc đƣợc coi là yếu tố quan trọng
nhất. Các nghiên cứu ở Chilê và Pêru đã chỉ ra nƣớc và thực phẩm là nguyên
nhân chính trong việc lây nhiễm H. pylori.
- Nguồn lây t ngƣời sang ngƣời: là đƣờng lây phổ biến, nhất là trẻ em
và đặc biệt tại những nơi có điều kiện vệ sinh kém.
Một số yếu tố đƣợc coi là nguy cơ làm tăng tỉ lệ nhiễm H. pylori nhƣ
sống cùng nhau trong gia đình, trong các doanh trại quân đội, và một vài nghề
nhƣ bác sĩ nội soi [22].
1.1.5. Cơ chế gây bệnh của H. pylori
H. pylori có khả năng tiết urease mạnh, enzym này có hoạt tính rất mạnh
phân giải urê thành amoniac. Urê là sản phẩm chuyển hóa của các mô tế bào,
chúng vào máu một phần và đƣợc đào thải ra ngoài qua thận. Một lƣợng urê

8


tƣơng đƣơng t máu qua lớp niêm mạc dạ dày vào dịch dạ dày. Amoniac có
phản ứng kiềm, tạo thành một lớp đệm bao quanh H. pylori, giúp cho chúng
tránh đƣợc môi trƣờng axit cao của dạ dày. Mặt khác, amoniac sinh ra cũng
gây độc trực tiếp đối với tế bào niêm mạc dạ dày. Các enzym catalase, lipase
và glycoproteinase của H. pylori phân giải chất nhầy giúp cho chúng xâm
nhập vào niêm mạc sâu hơn và phơi bày các thụ thể tế bào cho các adhesin
của H. pylori gắn vào đó và dần dần phá huỷ tế bào. H. pylori còn tiết ra các
độc tố tế bào, các độc tố này cũng gây độc và phá huỷ tế bào [7].
Gần đây, ngƣời ta phát hiện thấy kháng nguyên CagA làm tăng tiết
interleukin-8, có giả thuyết cho rằng yếu tố này cũng là một trong các yếu tố
làm bệnh tiến triển đến ung thƣ [12,19].

Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H. pylori

9


1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H. PYLORI
Kể t

khi H. pylori đƣợc tìm ra vào năm 1982, đến nay có nhiều

phƣơng pháp phát hiện H. pylori. Hiện nay ngƣời ta thƣờng sử dụng một số
phƣơng pháp phát hiện H. pylori nhƣ: thử nghiệm urease; nuôi cấy vi khuẩn;
phản ứng PCR…
1.2.1. Thử nghiệm Urease.
Test này xác định hoạt độ enzym urease của H. pylori bằng việc đặt
mẫu mô dạ dày vào môi trƣờng lỏng (test maison, CU test) hoặc bán đặc
(CLO test, HUT test) hoặc trên một cái màng gọi là Pyloritek có chứa urease
và một chất chỉ thị màu theo pH [22]. Nguyên tắc của thử nghiệm là nhằm
phát hiện enzym urease của H. pylori. H. pylori gần nhƣ là loại vi khuẩn duy
nhất trong dạ dày tiết enzym urease với khối lƣợng lớn (ngoại tr một số rất ít
bệnh nhân bị nhiễm Helicobacter helmanii). Enzym urease của H. pylori có
trong mẫu mô dạ dày sẽ làm biến đổi urease thành amoniac (NH 3), NH3 làm
môi trƣờng thuốc thử có pH kiềm, vì vậy làm thay đổi màu của chất chỉ thị
theo phản ứng sau:
Urê + H2O

CO2 + NH3

Hình 1.5: Mẫu thử CLO test

10

Độ nhạy thay đổi theo t ng loại test và thời gian đọc kết quả, gia tăng
khi đƣợc ủ ở 37 - 42oC, các test đƣợc đọc trong vòng 4 giờ cho độ nhạy 7080%. Trong điều kiện hiện nay ngƣời ta th a nhận ngƣỡng phát hiện vi khuẩn
là 104 - 105 vi khuẩn/ml [22,35].
Ở Việt Nam thƣờng sử dụng CLOtest (Campylobacter Like Organism
test) trong chuẩn đoán nhiễm H. pylori. Chẩn đoán nhiễm H. pylori bằng thử
nghiệm CLO test là một thử nghiệm nhanh chóng, rẻ tiền, đơn giản và hữu
hiệu để phát hiện H. pylori. Độ nhạy và độ đặc hiệu khoảng 70-80 % và nếu
sinh thiết cả hai mẫu ở hang vị và thân vị thì độ nhạy sẽ tăng thêm 4,3% so
với chỉ lấy một mẫu ở hang vị [7].
Tại Việt Nam, thử nghiệm urease dƣơng tính trong loét tá tràng là 64,7%
đến 87,3% và trong loét dạ dày khoảng 60% [7].
Thực tế cho thấy, sử dụng test urea có thể cho kết quả âm tính do mật độ
vi khuẩn thấp hoặc dƣơng tính giả do men urease của các vi khuẩn nhƣ
Enterobacter.sp và Pseudomonas.sp trong dạ dày làm cho thuốc thử chuyển
màu. Trong khi đó sử dụng các kỹ thuật phân tử sẽ không bỏ sót bất cứ trƣờng
hợp nào bởi tính nhạy và tính đặc hiệu của các kỹ thuật phân tử rất cao.
1.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn H. pylori.
Trong chẩn đoán nhiễm H. pylori, phƣơng pháp nuôi cấy cho biết mật độ
của H. pylori. Ngoài ra, còn cho biết dạng hình cầu của H. pylori là dạng hình
thái thoái hóa của vi khuẩn. H. Pylori phát triển tốt và phân lập đƣợc dễ dàng
trên môi trƣờng thạch máu. Sau khi đã mọc thành khuẩn lạc, H. Pylori đƣợc
xác định nhờ các tính chất: vi khuẩn Gram âm, có các enzyme urease,
oxydase, catalase. Dù vậy, về mặt thực tiễn lâm sàng ít khi dùng phƣơng pháp
này. H. pylori là loài vi khuẩn rất khó nuôi cấy ở điều kiện in vitro, nó cần môi
trƣờng và khí trƣờng đặc biệt khi nuôi cấy. Hơn nữa khuẩn lạc của H. pylori
trên môi trƣờng đặc thƣờng trong hoặc màu xám nhạt thƣờng khó phân biệt,

11

đôi khi gây tan máu, đƣờng kính của khuẩn lạc rất nhỏ khoảng 1 mm, xuất
hiện sau thời gian dài 48-72 giờ [2,29]. Do vậy kết quả chẩn đoán dựa trên kết
quả nuôi cấy thƣờng không ổn định, kém chính xác và mất nhiều thời gian. Tuy
nhiên, nuôi cấy làm kháng sinh đồ vẫn là thử nghiệm có ích để hƣớng dẫn
điều trị thích hợp và là một trong các phƣơng pháp để đánh giá tình trạng
kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh.
Mặc dù độ đặc hiệu của nuôi cấy đạt gần 100% nhƣng độ nhạy thì rất
khác nhau do ảnh hƣởng của các yếu tố đã nêu trên. Sau đây là kết quả độ
nhạy của một số nghiên cứu:
Bảng 1.2: Độ nhạy của thử nghiệm nuôi cấy
Số bệnh nhân

Độ nhạy

Nguồn

195

83

Logan (1991)

845

83

Olson (1995)

104

86

Soule ( 1995)

105

98,4

Thijs (1996)

351

93

Lerang (1998)

104

100

Monterio ( 1999)

Tại Việt Nam kết quả nuôi cấy chẩn đoán nhiễm H. pylori thấp hơn so
với các thử nghiệm khác, nuôi cấy cho kết quả dƣơng tính t 36,8% đến
68,7% [1,7].
1.2.3. Ứng dụng PCR trong chẩn đoán nhiễm H. pylori
Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhƣng chƣa đƣợc phổ
biến rộng rãi ở Việt Nam trong chẩn đoán nhiễm H. pylori. Theo một số kết
quả nghiên cứu thì PCR có độ nhạy khá cao. Mẫu bệnh phẩm có thể lấy t

mẫu sinh thiết dạ dày, dịch hút dạ dày, mãng cao răng, nƣớc bọt hay t phân.
Ngoài việc chẩn đoán nhiễm H. pylori trƣớc điều trị, PCR còn dùng để theo
dõi sau điều trị tiệt tr H. pylori. Hơn nữa, PCR có thể phân biệt đƣợc sự khác

12


nhau giữa tái nhiễm và tái phát, hoặc là một nhiễm khuẩn khác kết hợp. Một áp
dụng quan trọng khác trong khi nghiên cứu về bệnh viêm dạ dày, PCR tìm ra
đƣợc các gen có khả năng gây bệnh nhƣ CagA và hoặc là S1 VacA có liên quan
đến bệnh loét dạ dày tá tràng và ung thƣ dạ dày [38,42]. Liên quan đến kháng
thuốc, PCR còn giúp tìm ra gen đột biến tạo ra sự kháng thuốc của vi khuẩn. Ví
dụ đề kháng clarithromycin là do hiện tƣợng đột biến gen 23S RNA [35].
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H.PYLORI TRÊN THẾ GIỚI.
1.3.1. Xác định sự có mặt của H.pylori bằng phân tích trình tự gen
đặc hiệu 16S rRNA
1.3.1.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen 16S rRNA
16S rRNA là gen tổng hợp rRNA 16S cấu tạo nên tiểu phần nhỏ
ribosome của vi khuẩn. Ở H. pylori gen này có kích thƣớc khoảng 133 bp.
Ngƣời ta cho rằng rRNA đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của
ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết
định hình dạng của ribosome [19,27].

Hình 1.6. Cấu trúc của gen 16S rARN đặc thù cho các loài vi khuẩn
Prokaryote và Archea (Woese et al 1987)

13


Woese và các cộng sự (1977) đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích

hợp làm thƣớc đo tiến hóa. 16S rRNA là thành phần của bộ máy tổng hợp
protein có t lâu đời, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn
v a phải cho phép phán đoán sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật. Cả
3 loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể
đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thƣớc quá nhỏ
(khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít
đƣợc lựa chọn nghiên cứu. 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900
ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thƣớc đo tiến hóa. Tuy
nhiên, kích thƣớc của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này
không thuận lợi. Phân tử 16S rRNA có kích thƣớc v a phải, khoảng 1500
ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử
này đƣợc coi nhƣ là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do
những đòi hỏi cẩn trọng trong thao tác với rRNA bởi rRNA dễ bị phân hủy
nên sử dụng gen mã hóa cho rRNA thƣờng là đối tƣợng phân tích trong các
nghiên cứu [26,34].
Trình tự gen 16S rRNA còn là một công cụ đƣợc sử dụng để định danh
vi khuẩn vì nhiều lý do.
- Đầu tiên, số liệu DNA của một sinh vật là đáng tin cậy hơn số liệu hình
thái trong nghiên cứu phân loại.
- Các gen 16S rRNA là tƣơng đối ngắn, làm cho nó nhanh hơn và rẻ hơn,
nhƣng lại đủ dài để có thể để xác định trình tự gen của vi khuẩn.
Gen 16S rRNA của các vi khuẩn có một điểm rất đặc biệt là có những
vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau
giữa các loài trong cùng nhóm. Tuy là những vùng biến động, nhƣng những
vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở
các cấp độ khác nhau đã giúp cho gen 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên

14

của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối
quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Cho đến nay, số lƣợng các
gen 16S rRNA đã đƣợc giải trình tự lên đến hơn 10.000. Điều này cho thấy sự
quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học đến đối tƣợng này [30,46].
1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu về gen 16S rRNA
Gen 16S rRNA đƣợc sử dụng nhiều trong các nghiên cứu để xác định
vi khuẩn gây bệnh. Nhiều công trình nghiên cứu trình tự DNA liên quan
đến các gen gây bệnh đƣợc nhân bằng kỹ thuật PCR nhƣ gen protease A
phát hiện N. peningitidis (Kuritza & Oehler, 1991), gen autolysin phát hiện
các serotype của S. pneumoniae (Cherian & cs, 1998) [36,38]. Nghiên cứu
tƣơng tự cũng đƣợc tiến hành trong phòng thí nghiệm của Blaser, Trƣờng
Đại học tổng hợp New York, ông đã phát hiện 128 loài vi khuẩn dạ dày
bằng phân tích gen 16S rRNA [33].
Cũng nhƣ tất cả các loài vi sinh vật tiền nhân khác, H. pylori mang gen
16S rARN có trình tự đặc thù cho mỗi loài vi khuẩn (hình 1.6). Vì vậy, để xác
định tên của H. pylori trong mẫu bệnh phẩm, ngƣời ta dùng một cặp mồi đặc
thù để nhân vùng bảo thủ trên gen, sau đó giải trình tự và đối chiếu nó với
các đoạn gen đó biết trên các thƣ viện gen bằng chƣơng trình Blast. Các nhà
khoa học quốc tế đã sử dụng đoạn gen đặc hiệu 16S rRNA để phát hiện
nhanh vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm [24].
Năm 2002, các nhà khoa học tại Hà Lan đã phát hiện các đột biến trên
gen 16S rRNA của H. pylori và cho thấy sự xuất hiện đột biến thay thế đã làm
cho H. pylori trở nên kháng với tetracycline [36]. Nghiên cứu trong cùng năm
của các nhà khoa học Canada cũng cho kết quả tƣơng tự, đột biến thay thế ở
hai chủng H. pylori 26.695 và 11.639 làm H. pylori kháng tetracycline [23].
Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kết quả để phân tích
trình tự 16S rRNA nhằm phát hiện nhanh H. pylori trong các bệnh nhân viêm

15

loét dạ dày tá tràng (Nguyễn Đức Toàn và cs, 2012; Nguyễn Văn Thịnh,
2010) [10,15].
1.3.2. Xác định tính kháng kháng sinh của H.pylori qua phân tích
trình tự gen 23S RNA
1.3.2.1. Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H. pylori
Kể t khi đƣợc phát hiện, đến nay kháng sinh đã đƣợc chỉ định trong
điều trị các bệnh của dạ dày tá tràng do H. pylori gây ra. Hơn 30 năm đƣợc sử
dụng trong lâm sàng, vấn đề tiệt tr H. pylori đã đạt đƣợc rất nhiều thành
công [39,41]. Các kháng sinh đƣợc lựa chọn điều trị H. pylori phải thỏa mãn
đƣợc các yêu cầu sau:
- Nhạy với H. pylori
- Nồng độ kháng sinh trong dạ dày phụ thuộc vào pH của dạ dày, nên
nồng độ kháng sinh phải cao.
- Để tiêu diệt đƣợc vi khuẩn H. pylori kháng sinh phải vƣợt qua đƣợc
hàng rào chất nhày, đến với lớp biểu mô bề mặt nơi H. pylori cƣ trú. Hơn nữa,
kháng sinh phải tồn tại đƣợc thời gian dài đủ để tiêu diệt vi khuẩn. Trên cơ sở
này, mà các thuốc ức chế bơm proton, kháng sinh và bismuth là những thuốc
đƣợc lựa chọn đầu tiên. Trong đó, kháng sinh Clarithromycin, Amoxicillin,
Metrinidazole là những thuốc đƣợc ƣu tiên chọn lựa [39,41].
1.3.2.2. Dịch tễ học của kháng kháng sinh
Sự đề kháng kháng sinh của H. pylori là yếu tố chính ảnh hƣởng đến
hiệu quả của các phác đồ điều trị hiện dùng. Tỉ lệ loài vi khuẩn kháng thuốc
thay đổi tùy theo t ng vùng địa lý khác nhau, và tƣơng quan với mức sử dụng
kháng sinh trong dân số nói chung. Ví dụ, việc sử dụng clarithromycin và tỉ lệ
đề kháng kháng sinh này tăng tƣơng tự nhau (gấp 4 lần) ở Nhật Bản trong
khoảng thời gian t 1993 đến 2000 ( Perez Aldana Lvà cs, 2002) [40]. Trong
các tài liệu hƣớng dẫn của các nƣớc châu Âu về điều trị H. pylori cũng

16

khuyến cáo phƣơng pháp trị liệu phải đƣợc điều chỉnh cho thích hợp với sự đề
kháng clarithromycin và metronidazole [42,46,48]. Theo đó, một liệu pháp ba
thuốc kéo dài 14 ngày đƣợc khuyên dùng ở những nơi mà tỉ lệ kháng
clarithromycin trên 15-20%, ƣu tiên kết hợp với amoxicillin nếu tỉ lệ kháng
metronidazole tiên phát >40% (Malfertheiner P và cs, 2007). Do đó, việc theo
dõi tỉ lệ đề kháng kháng sinh tỏ ra có ý nghĩa đối với việc điều trị nhiễm H.
pylori trong thực hành lâm sàng.
1.3.2.3. Tình hình nghiên cứu về gen 23S rRNA liên quan đến kháng
kháng sinh ở H. pylori
Gen 23S rRNA là gen có chức năng cần thiết cho sự sống của vi khuẩn,
v a có vùng bảo tồn và v a có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau, giúp
cho việc định danh hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài
vi khuẩn [43].
Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành trên trình tự của gen
23S rRNA mã hóa 23S rRNA cấu tạo tiểu đơn vị lớn của ribosome ở vi
khuẩn. Theo Rina Uzuka, vùng 23S rRNA thƣờng liên quan đến việc kháng
kháng sinh phân tử vòng lớn. Việc thiết kế các mồi mới để khuếch đại vùng
23S rRNA là rất hữu ích trong chẩn đoán các vi khuẩn kháng thuốc.
Trong nhiễm H. pylori, kháng clarithromycin chủ yếu do hai đột biến
của gen 23S rRNA [37]. Tổng cộng có 31 nghiên cứu hội đủ các tiêu chí thu
nhận, báo cáo số liệu của bệnh nhân đƣợc thu thập t năm 1993 đến 2009
[25,30]. Cụ thể, có 17 nghiên cứu ở châu Âu, 10 ở châu Á, 2 ở châu Phi và 2
ở châu Mỹ [28,48]. Tỉ lệ kháng kháng sinh tính chung của H. pylori là 17,2%
dao động trong khoảng 16,5-17,9% với clarithromycin; 26,7% (25,2-28,1%)
với metronidazole; 11,2% (9,6-12,7%) với amoxicillin; 16,2% (14,4-18,0%)
với levofloxacin; 5,9% (4,7-7,1%) với tetracyclin; 1,4 (0,8-1,9%) với rifabutin
và 9,6% (8,5-10,7%) với 2 hoặc nhiều loại kháng sinh [44].

17