NGHIÊN cứu QUY TRÌNH sản XUẤT γ AMINOBUTYRIC AXIT từ DỊCH cám gạo BẰNG LACTOBACILLUS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH TẤT CƯỜNG

Hà N ội - 2014


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Trịnh Tất Cường là
người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Sinh học làm
cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các
anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và
Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.
Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014

Học viên

Lý Thị Kim Tuyến

3


MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

GABA

Axit gamma-amino butylric

GABA-T

GABA transaminase

GAD

L-glutamate decarboxylase

HTS

Phương pháp sàng lọc High throughput
screening

KC1

Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT

ml

milliliter

mM

millimolar

MRS

De Man, Rogosa, Sharpe

MSG

Monosodium glutamate

OD

Mật độ quang học

PLP

Pyridoxalphosphate

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

4


TLC

Thin layer chromatography

TPCN

Thực phẩm chức năng

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Cấu trúc của GABA.......................................................................................4

Hình 2. Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA...............................................5
Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA...........................................................6
Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB............................................................7
Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA..........................7
Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trường MRS........29
Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo được xác định thông qua MSG...................31
Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC...........................32
Hình 9: Đường chuẩn glutamic acid.........................................................................33
Hình 10: Hiệu quả nhiệt độ và thời gian đối với quá trình thủy phân glutamic acid
từ cám
gạo.....................................................................................................................35
Hình 11: Đường chuẩn GABA..................................................................................36
Hình 12: Hiệu quả của NaCl trên quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA...37

5


Hình 13: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men
dịch chiết cám gạo.....................................................................................................41
Hình 14: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên
men dịch chiết cám gạo.............................................................................................42
Hình 15: Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên
men dịch chiết cám gạo.............................................................................................43
Hình 16: Ảnh hưởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men
dịch chiết cám gạo.....................................................................................................44
Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo...............................................................45
Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B)...............................46
Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC........................................................................46
Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT.....................................................................................................48
Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn......................................................................49

Hình 22: Xây dựng đường chuẩn GABA qua HPLC...............................................49
Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men.......................................................50
Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột.........................................51
Hình 25: Đưa mẫu GABA tinh sạch vào đường chuẩn để xác định độ tinh sạch của
mẫu............................................................................................................................52
Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dưới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy tế bào WSS-1
(A), sau 48 giờ (B)....................................................................................................53
Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên
men............................................................................................................................54
Hình 28: Đường chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bước sóng
405nm........................................................................................................................55

6


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Thành phần môi trường MRS.........................................................................15
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng của hai mẫu cám gạo....................................................30
Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo....................................................33
Bảng 5: Lượng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon.....................38
Bảng 6: Lượng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ.........................39
Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hưởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi
trường........................................................................................................................40
Bảng 8: Hàm lượng GABA trong dịch lên men theo hai phương pháp đo...............55

7


8

MỞ ĐẦU
γ-Aminobutyric axit (GABA) là một axít amin có chức năng quan trọng trong
hệ thống thần kinh. GABA thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu
thần kinh qua khe xináp và giữ liên lạc các tế bào với nhau trong hệ thống thần kinh
trung ương. Ngoài ra, GABA đã được biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần
kinh giống như bệnh Parkinson, Huntington và bệnh Alzheimer. Chính vì GABA có
những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm
vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng. Hiện nay, quá trình sản xuất
GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc,
tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tương bằng vi sinh vật.
Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang
được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới. Đặc biệt, vi khuẩn axít
lactic đã được ứng dụng để lên men cho hàm lượng lớn GABA từ thực phẩm truyền
thống và đã tối ưu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với
mục tiêu công nghiệp.
Tại Việt Nam, có thể nói chưa có công nghệ chế biến GABA có khả năng
hướng tới quy mô công nghiệp. Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất
GABA đã được nghiên cứu nhưng vẫn chưa có sản phẩm GABA bán ra thị trường.
Ngoài ra cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn
Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích
miễn dịch ổn định ở Việt Nam.
Hiện nay, hướng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm
thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam. Thực tế, khi một sản phẩm có
thể tiếp cận được trên thị trường thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lượng và giá
thành. Để giải quyết hai vấn đề lớn này, hướng nghiên cứu của đề tài là chọn một
nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có nhất ở trong nước mà vẫn cung cấp được đầy đủ
các thành phần cơ bản để có thể lên men được GABA có hiệu suất cao.
Về chất lượng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài đã sử dụng chất chỉ thị chỉ ra
được sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào.

9


Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo
bằng Lactobacillus”
Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu:
+ Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng
chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ.
+ Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA)
GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao như khoai tây,
đậu tương, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi.
Trong cơ thể, GABA được phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ương vào
khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhưng đến năm 1960, GABA mới được đề
xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể. Ngoài não, GABA cũng có
mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa. GABA có chức
năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5]. Hoạt động của GABA cùng với
glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ
thống thần kinh trung ương [20, 51].
Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con người:
- Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn.
-

Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và hiện tượng
mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân. Trong những trường hợp này, bổ sung
thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần kinh tại não
bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân.

-

Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự đau nhức. Như một chất
dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng đau nhức
kéo dài khi giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho chúng ta
bớt cảm giác về sự đau nhức đó.

-

Giảm trầm cảm.

-

Việc sử dụng các loại thuốc an thần làm giảm lượng GABA trong cơ thể và là một
trong các nguyên nhân gây ra hiện tượng hoảng loạn.

-

GABA cũng được coi là có thể điều trị được trạng thái rối loạn tâm lý trước thời kỳ
kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) đối với phụ nữ.

1.2. Cấu trúc và hình dạng của GABA
GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon. Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin
nhận proton (hình 1). Hình dạng của GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện của môi

11


trường. Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo ra sức hút điện tích giữa
hai nhóm chức năng amin và cacbon. Theo tính toán hóa học để phá vỡ cấu trúc này
cần một năng lượng khoảng 50 kcal/mol. Ở trạng thái rắn, GABA luôn có hình dạng
mạch thẳng. Dưới dạng mạch thẳng, GABA luôn có cấu trúc hình học trans ở nhóm
amin cuối và dạng cis ở nhóm cacbon kết thúc. Cấu trúc này sẽ giúp cho phân tử
GABA liên kết dễ dàng với các phân tử GABA khác. Ở trạng thái lỏng, GABA tồn
tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng.
Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có
nhiều chức năng sinh học quan trọng [20, 22].

Hình 1: Cấu trúc của GABA [58]

1.3. Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não
GABA tham gia vào nhiều quá trình của hệ thống thần kinh trung ương.
Chẳng hạn như liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA không thể
xuyên qua được hàng rào để vào trong não. Do vậy, GABA được tổng hợp trong
não bằng con đường trao đổi chất được biết là “GABA shunt” (hình 2). Giai đoạn
cuối của con đường này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate
bằng sự phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích
truyền tín hiệu thần kinh [20, 22].
Khi lượng GABA được sinh ra vượt quá ngưỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh
sẽ được một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm
giảm bớt [20]. Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde
succinic nhưng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA. Ngoài ra, những
chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lượng lớn GABA ở trong
não [20]. Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin

12


B6 hay còn được gọi là pyridoxal-5’-phophate được xem như một cofactor [32].
Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não.

Hình 2: Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]
GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các
neuron thần kinh. GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của
các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu.
GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ương
bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20].
Do vậy, GABA giúp cho thư giãn thần kinh và cải thiện được tinh thần. Cho tới nay,
nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con người có
giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài, rối
loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trước thời kỳ kinh
nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54].

1.4. Enzym tổng hợp GABA
L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp
GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO 2. GAD tồn tại dưới hai dạng đồng
phân là GAD65 và GAD67 theo khối lượng phân tử của chúng (lần lượt là 65 và 67
kDa). Chúng được mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số
10 ở người, gen GAD65 nằm trên NST số 10 và gen GAD67 nằm trên NST số 2
[20, 40]. GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic

13

trong cơ thể. Ngược lại, GAD65 chủ yếu được tìm thấy ở tận cùng các dây thần
kinh và nó có thể được neo trên màng của các túi chất dẫn truyền thần kinh. Hoạt
động của enzym GAD cần một cofactor là pyridoxal phosphate (PLP) [52].

1.5. Thụ thể GABA
Thụ thể GABA bao gồm: thụ thể GABAA là phần phức hệ mang kênh ion và vị
trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABA B thuộc họ thụ thể protein G có nhiệm vụ mở
kênh ion thông qua truyền thông tin nội bào qua protein G [20, 39].
Thụ thể GABAA là một phân tử lớn có 5 tiểu đơn vị protein. Tất cả các tiểu
đơn vị này đều có đoạn cuối là N ở phần bên ngoài tế bào, tiếp đến là 4 đoạn xuyên
màng, ở đoạn xuyên màng 3 và 4 có một đoạn loop lớn, cuối cùng là đoạn cuối C
ngắn. Các tiểu đơn vị protein này tổ hợp bằng những con đường khác nhau và được
sắp xếp tạo ra một lõi cho phép kênh Cl - đi qua (Hình 3). GABAA có vai trò cơ bản
trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hưởng tới trí nhớ ở não. Các tế bào thần
kinh sản xuất ra GABA được gọi là các thần kinh GABAergic và hoạt động chính
trong quá trình ức chế ở các động vật có xương sống trong giai đoạn trưởng thành
[39]. 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hết các hoạt tính sinh lý của
GABA được tạo thành thông qua thụ thể GABA A. Trong động vật có xương sống,
GABA hoạt động ở các khe xináp trong não bằng liên kết với thụ thể GABA xuyên
màng tế bào thần kinh. Quá trình liên kết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép
kênh ion mang điện tích âm Cl- đi vào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích
dương ra ngoài tế bào. Quá trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn
tới vị trí này thường xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [20].

Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA [59]

14


Thụ thể GABA B có hai tiểu đơn vị là GABA B1 và GABAB2 (Hình 4). GABAB1

có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABA B2 có nhiệm vụ ở trên
màng tế bào và truyền tín hiệu. Thụ thể GABA B được ứng dụng như là đích để tìm
các loại thuốc trong điều trị dược học và liên quan đến vai trò truyền tín hiệu về
khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm
[20].

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59]

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA [52]

15


1.6. Sản xuất GABA từ vi sinh vật
Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng
hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD [11, 8], tách
chiết từ các loại ngũ cốc [24, 27], tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm cho hàm
lượng GABA gần 15,8 g/100 g gạo [36], kích thích GAD trong mầm gạo để có thể
chuyển hóa GABA đạt hiệu suất là 29 g/100 g mầm gạo [36] hoặc lên men đậu
tương bằng vi sinh vật [9, 11, 37, 55]. Công nghệ sử dụng các vi sinh vật đặc biệt vi
khuẩn lactic là một phương pháp tốt để sản xuất GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45,
47, 53].
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đã được rất nhiều nghiên cứu gần đây
chứng minh có khả năng sản xuất GABA [24]. Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt
tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào mục
đích chăm sóc sức khỏe cho con người [10, 15, 23, 29, 30, 34]. Do vậy, GABA
được sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và an toàn cho sức khỏe
như làm tăng lượng GABA trong nước ép dâu [8]. Nhiều sản phẩm được làm tăng
hàm lượng GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic được
phân lập từ sản phẩm của bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] và

những sản phẩm lên men từ cá [26]. Một vài chủng sản xuất GABA đã được chứng
minh có tiềm năng sản xuất GABA ở quy mô lên men với thể tích lớn [28]. Chẳng
hạn, chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc [32] đã
thu được nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 1005,8 mM. Leuconostoc
NC5 phân lập từ sản phẩm lên men của tôm Malaysia cho nồng độ GABA là gần
800 mM [6]. Đặc biệt, chủng Latobacillus sakei B2-16 được phân lập từ kim chi
Hàn Quốc đã có khả năng lên men GABA từ dịch chiết cám gạo với nồng độ 660
mM [28]. Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể
mở ra một triển vọng mới về quá trình sản xuất GABA.
Ngoài ra, một số vi sinh vật khác cũng có khả năng sinh GABA đã được ứng
dụng chẳng hạn như vi khuẩn kỵ khí đã sản xuất GABA trong các loại chè như chè
mầm tươi, chè đen, chè Gabaron, chè olong, chè xanh [5].

16


Lactobacillus (viết tắt là Lb) là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic, là những
trực khuẩn không sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn gram dương. Trình tự gen
GAD được tìm thấy trong Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25], và
Lactococcus lactis subsp. Lactis [34].
Trong các thập kỉ qua, các nghiên cứu cơ bản mở ra một lĩnh vực nghiên cứu
mới đối với các chất có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
từ thực phẩm.Việc sử dụng các chủng trên trong lên men tổng hợp GABA đã được
nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong thực tế. Hiện nay, việc lên men
Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dư thừa của
nông nghiệp đang là một hướng mới đầy tiềm năng. Hoạt động của GAD trong
Lactobacillus plantarum giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp của môi trường.
Sau khi hấp thụ L-glutamate từ các transpoter đặc hiệu, GAD sẽ xúc tác phản ứng
decarboxyl hóa L-glutamate trong tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ một proton trong tế

bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi
L-glutamate thành GABA kiềm hơn [25, 14].

1.7. Cơ chất tham gia sản xuất GABA
Monosodium glutamate (MSG) được xem như là một cơ chất trong quá trình
sản xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28]. MSG là một
dạng muối của glutamic axit. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà được tìm
thấy trong đa số các thực phẩm. Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lượng protein
cao chẳng hạn như bơ, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau. Trong thực phẩm
thường sử dụng MSG để tạo ra vị đã được biết tới khoảng 1200 năm về trước. Với
vị đặc biệt của MSG đã có tên là “ Unami” trong người dân Nhật Bản. Nó đã có mặt
trên thị trường cách đây hơn 100 năm. Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hương vị
bằng cho thêm MSG với hàm lượng cao. Trong sữa của các bà mẹ thì hàm lượng
MSG chiếm tỉ lệ cao nhất so với các axit amino. MSG trong một số loại thuốc cao
cấp đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở chuột cống mới sinh. Tuy
nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã không xảy ra trong thực phẩm có

17


MSG. Ngoài ra, dựa vào vô số những chứng minh khoa học cũng đã công bố MSG
là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con người mà nó có vai
trò như một phân tử truyền tín hiệu không chỉ ở trong thần kinh mà còn ở một số
các mô khác. Tuy nhiên, nếu quá trình tích lũy MSG vượt quá ngưỡng trong các khe
xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn tới phá hỏng hoặc làm
tổn thương tới tế bào. Hơn nữa, MSG đã có nhiều công bố là gây độc cho tế bào
thần kinh ở trẻ em dưới 5 tuổi. Bởi vậy, sử dụng MSG như là một cơ chất cho quá
trình chuyển hóa thành GABA là một điều đáng được quan tâm [60].

1.8. Thực phẩm chức năng GABA

Hiện nay, thực phẩm chức năng (TPCN) GABA đã có mặt khá phổ biến trên
thị trường nước ngoài với các dạng sản phẩm khác nhau chẳng hạn như: dưới dạng
đồ uống, thực phẩm, kem, dạng viên, trong kẹo... Ở Việt Nam, thực phẩm chức
năng GABA đã có bán trên thị trường. Tuy nhiên, tất các sản phẩm GABA đều vẫn
là nhập khẩu [58].
1.8.1. Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA
Trong cám gạo có chứa nhiều chất quan trọng như: vitamin E, vitamin B1,
B3, B6, ma-giê, man-gan, sắt, GAD và chất xơ mà thành phần chủ yếu là các
polysaccharide [1, 7, 12, 13, 11]. Cám gạo còn được chứng minh có thể làm giảm
nguy cơ ung thư, giảm cholesterol và tốt cho hệ tim mạch của phụ nữ sau mãn kinh.
Đồng thời, với chất xơ trong cám gạo giúp chống lại bệnh xơ vữa động mạnh, giảm
nguy cơ mắc bệnh tim và bệnh tiểu đường. Mặc dù vậy, cám gạo không thể là thực
phẩm cho con người vì không cho vị giác ngon nên không thể ăn hàng ngày với một
lượng lớn cho mục đích tăng cường hệ miễn dịch. Chính vì vậy, đã có một số công
trình nghiên cứu cám gạo như là một nguồn sản xuất GABA. Tuy nhiên, với những
điều kiện tối ưu để làm tăng cường quá trình hoạt động của GAD trong cám gạo thì
cũng chỉ cho hàm lượng GABA là 29 g/100 g cám gạo [36]. Ngoài ra, một công bố
gần đây của nhóm nghiên cứu Hàn Quốc đã sử dụng Lactobacillus để lên men dịch
cám gạo đã cho hiệu suất lên men GABA là 660 mM trong dịch lên men từ 1 kg

18


cám gạo đã được bổ sung thêm 10 lít nước và 12% MSG tương đương với 679
g/1kg cám gạo [28].
1.8.2. Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam
Tại Việt Nam, cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về GABA như
tách chiết GABA từ đậu tương hoặc dự án cấp nhà nước năm 2007 về nghiên cứu
công nghệ sản xuất một số thực phẩm chức năng giàu GABA phòng chống bệnh
nhân ung thư do Viện Công nghệ Thực phẩm chủ trì. Tuy nhiên, khả năng ứng dụng

sản xuất ở mức quy mô công nghiệp vẫn chưa hiệu quả vì sử dụng nguồn nguyên
liệu đắt tiền do đó giá thành còn cao. Hơn nữa, sản phẩm tạo ra để ứng dụng vào
thực phẩm chức năng đang còn hạn chế về phương pháp kiểm tra hoạt tính sinh học.
Trong khi đó, một số công ty dược của Trung Quốc đang bán GABA với giá chỉ
khoảng 400.000 đồng/kg. Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên
cứu nào sử dụng cám gạo như một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất
GABA. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu lên men từ cám gạo trong nước rất dồi
dào, giá thành thấp và gần như chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc. Do vậy, đây là
một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất GABA có giá thành thấp.

1.9. Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể
Trong cơ thể, tế bào có rất nhiều quá trình sinh hóa thiết yếu cho sự sống và
hoạt động chức năng được điều hòa bởi các chất dẫn truyền thần kinh và nhiều phân
tử “tín hiệu” khác. Sự điều hòa bởi những chất như vậy được thực hiện thông qua
các tương tác giữa các phân tử có nguồn gốc tự nhiên này với các thụ thể gắn trên
màng tế bào (các thụ thể liên kết màng tế bào) hoặc có mặt trong tế bào chất (thụ
thể hòa tan) hoặc trong nhân tế bào (thụ thể nhân tế bào). Trong các loại thụ thể của
cơ thể, thụ thể GABA thuộc họ thụ thể G protein là những thụ thể màng tế bào, có
những phân tử nhận dạng cấu tử ở bên ngoài tế bào và kích hoạt những con đường
truyền tín hiệu ở bên trong tế bào. Thụ thể GABA được biết tới có khả năng chi
phối nhiều loại bệnh và cũng là đích chữa bệnh của gần 30% các loại thuốc y học
hiện đại hiện nay có mặt trên thị trường. Trong các chương trình sàng lọc nhanh các

19


hợp chất có hoạt tính sinh học dựa trên các protein thụ thể, được tiến hành phân tích
sự tương tác trực tiếp của hàng loạt các hợp chất mới (hoặc có nguồn gốc tổng hợp,
hoặc có nguồn gốc tự nhiên) với các protein thụ thể đích được quan tâm nghiên cứu.
Từ kết quả phân tích này, các hợp chất có hoạt tính tương tác đặc hiệu với các thụ

thể đích mạnh thường được xem là các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng, và
tiếp tục được đưa vào các chương trình đánh giá hoạt tính sinh học của chúng ở cấp
độ tế bào hoặc cơ thể. Trong thực tế, các phép thử sinh học tương tác với các
protein thụ thể đã là một bước ngoặt về mặt công nghệ trong việc phát hiện và thiết
kế các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng mới, đặc biệt là cung cấp các thông
tin về mối quan hệ “hoạt tính sinh học - cấu trúc hóa học” của các hợp chất. Các
phương pháp tương tác thụ thể cho phép đánh giá, phân tích một lượng rất nhỏ một
hợp chất hoặc dịch chiết mới (chỉ cần ở hàm lượng thấp từ 5 mg đến 10 mg) về khả
năng tương tác trực tiếp của chúng với các mục tiêu dược lý ở cấp phân tử [59].
Các phương pháp đang được sử dụng rộng rãi ở nước ta đều dựa trên cơ sở sử
dụng các chất gắn phóng xạ theo nguyên tắc đánh giá cạnh tranh. Các phương pháp
này có các ưu điểm là tính đặc hiệu và độ nhạy cao, đồng thời không làm thay đổi ái
lực tương tác giữa các chất gắn với protein thụ thể, nhưng cũng bộc lộ nhiều hạn
chế chẳng hạn như: nguy cơ phơi nhiễm phóng xạ và ảnh hưởng đến sức khỏe, cộng
đồng và môi trường xung quanh, cần chi phí cao cho thiết kế và xây dựng phòng thí
nghiệm đảm bảo an toàn phóng xạ, trang thiết bị phân tích phóng xạ và nguyên vật
liệu có giá thành cao. Hiện nay, một phương pháp khác không sử dụng đồng vị
phóng xạ đó là dùng chất gắn đặc hiệu huỳnh quang bởi fluorescein trên mô hình ở
thụ thể đích. Phương pháp này đã được sử dụng khá phổ biến trên thế giới và có độ
chính xác cao. Với phương pháp này, thì hoàn toàn có thể tiếp cận được một
phương pháp sàng lọc mới hiện đang sử dụng rất nhiều ở trên thế giới là High
throughput screening. Đây là một quá trình thí nghiệm khoa học đặc biệt được sử
dụng trong khám phá ra các loại thuốc và liên quan tới lĩnh vực sinh học và hóa
học. High throughput screening cho phép nhà nghiên cứu đánh giá nhanh hàng triệu
điều kiện về kiểm tra dược học di truyền, hóa học. Thông qua quá trình này có thể

20


nhận dạng nhanh các hợp chất có hoạt tính, kháng thể và gen tham gia điều khiển

con đường phân tử sinh học cụ thể. Những kết quả của phương pháp này sẽ giúp
cho quá trình khởi đầu tạo ra những loại thuốc mới và hiểu quá trình tương tác hoặc
vai trò của quá trình sinh hóa trong sinh học .Trong hoàn cảnh hiện nay của Việt
Nam, để phát triển phương pháp đánh dấu phóng xạ là rất khó khăn. Do vậy, việc
phát triển phương pháp đánh dấu huỳnh quang hoặc đánh giá các tín hiệu thứ cấp
khi thụ thể hoạt động sinh ra hoàn toàn có thể phát triển và ứng dụng được trong
điều kiện thực tế của Việt Nam hiện nay [17].
Bên cạnh đó, xây dựng các hệ thống sàng lọc đơn giản hóa và tự động cần
được thiết lập trong các phòng thí nghiệm và tránh việc sử dụng các chất phóng xạ.
Hơn nữa, các hệ thống sàng lọc này sẽ cho phép phân biệt chức năng đơn giản giữa
các chất chủ vận, các chất đối vận và có khả năng ứng dụng cho phần lớn các thụ
thể. Do vậy, phương pháp sàng lọc chức năng đối với thụ thể GABA đã phát triển
gần đây dựa vào quá trình thay đổi kênh Cl- bên trong tế bào khi thụ thể này liên kết
với GABA. Từ quá trình thay đổi kênh Cl- sẽ bắt mầu với Iot. Do vậy, việc đánh giá
tín hiệu thay đổi màu Iot có thể bắt được bằng bước sóng hấp phụ 405 nm. Phương
pháp sàng lọc này có thể thực hiện trong những đĩa microplate với số lượng giếng là
96, 384, 1536, 3456. [17]. Đây là một phương pháp được chúng tôi lựa chọn xây
dựng để đánh giá hoạt tính và định lượng GABA trong đề tài nghiên cứu.

21


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Vi sinh vật
Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) được cung cấp bởi Phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên.
2.1.2. Các mẫu cám gạo

Cám gạo Thái Bình (giống lúa BC15) và cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long
(giống lúa OM4900) mua trực tiếp từ người nông dân sau khi xay xát, để nguội và
đóng gói.
2.1.3. Các dòng tế bào
Dòng tế bào WSS-1 có vectơ tái tổ hợp thụ thể GABA mua từ ATTC của Mỹ.
Dòng tế bào P12 là dòng tế bào thần kinh chuột nhắt trắng Swiss được cung
cấp bởi Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên.
2.1.4. Máy móc và dụng cụ
Máy đo OD, máy đo pH, máy khuấy từ, máy ly tâm, tủ hút, tủ đẩy, máy đọc
đĩa ELISA, máy lắc ổn nhiệt, máy đông khô, HPLC (Simazu) cùng nhiều thiết bị
khác của phòng enzym học và phân tích hoạt tính sinh học.
2.1.5. Các hóa chất, nguyên liệu khác
Agar, peptone, cao nấm men, glucose, cao thịt, CH3COONa, Tri ammonium
citrate, MgSO4, Monosodium glutamate (MSG), Tween, CaCO 3, Sucrose, Borate, 2mercaptoethanol, butanol, axít acetic, ninhydrin, methanol, acetonitrile, LaCl 3,
o-phthaldialdehyd, 1-butanol, K+pyrophosphate, ß-Nicotinamide adenine, NaCl,
dinucleotide phosphate hydrate, GABASE, α-ketoglutarate, NaI, GABA chuẩn,
kháng sinh (Sigma, Mỹ). DNAzol® Direct (invitrogen, Mỹ), GFX PCR, Gel Band

22


Purification Kit (Amersham Biosciences). CellTiter 96® Aqueous One Solution
Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ), Triton X-100, citrate, malate, Tripsin,
2-morpholinoethanesulfonic (MES), Pyridoxal 5-phosphate (PLP), succinate, axít
trichloroacetic (TCA), triethylamine, phenylisothiocyanate (Sigma, Mỹ). Fetal
bovine serum (FBS), môi trường DMEM, (Invitrogen, Mỹ).
Sắc ký bản mỏng TLC (Meck), Ống Falcon các loại (50 ml, 15 ml), đĩa ELISA
96 giếng, đĩa nuôi tế bào 24 giếng, đĩa nuôi tế bào 12 giếng, đĩa petri vô trùng nuôi
cấy vi khuẩn và nuôi cấy tế bào (Corning, Mỹ). Bình nghiêng nuôi cấy tế bào, đầu

côn các loại (1 ml; 0,2 ml) và các ống eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tiệt
trùng dùng trong nuôi cấy tế bào (1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml), Bình thủy tinh duran
các loại (Inovagen, Mỹ). Màng lọc vi khuẩn (Sigma, Đức).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo

2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1
Bảng 1: Thành phần môi trường MRS
Công thức

gram/ lít

Peptone

10

Cao thịt

10

Cao nấm men

5

Glucose

20

Tween

1giọt

Dipotassium hydrogen phosphate

2

CH3COONa

5

Triammonium citrate

2

MgSO4

0,1

MnSO4

0,05

Agar

10

23

+ Pha môi trường MRS với thành phần hóa chất như bảng 1, chỉnh pH=6, bổ sung 1
lít nước cất. Sau đó, môi trường được hòa tan bằng thiết bị khuấy từ (IKA, Đức), và
đem đi khử trùng bằng nồi hấp (ALP, Nhật) ở 121ºC trong vòng 15 phút.
+ Chủng KC1 được bảo quản ở 4 o - 6oC được cấy trên đĩa petri chứa môi trường
MRS có bổ sung agar theo phương pháp cấy ria, sau đó ủ ở 37oC trong 24 giờ.
+ Khuẩn lạc phát triển được nhân giống cấp II với môi trường MRS lỏng trong bình
tam giác 50 ml.

2.2.1.2. Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1
Chủng KC1 sẽ được cấy vào môi trường MRS có bổ sung 5% MSG và lắc
với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy sau khi ly
tâm 1500 vòng trong 15 phút sẽ được phân tích bằng TLC để đánh giá khả năng
sinh GABA.

2.2.1.3.

Đánh giá chất lượng cám gạo
Các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, tro tổng số, chất xơ tổng số,

mảnh vật sắc nhọn được kiểm nghiệm.
 Phương pháp xác định độ ẩm

Việc xác định độ ẩm của cám gạo được tiến hành theo TCVN-4326-86.
+ Sấy khô chén ở nhiệt độ 100ºC, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng chén.
+ Lấy 100 g cám gạo cho vào chén cân đã sấy khô, cân trọng lượng chén với mẫu (S1)
trước khi cho vào sấy.
+ Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-105ºC trong khoảng 6-8 giờ để
nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, cân đến trọng lượng mẫu không đổi (S2).
+ Tính độ ẩm: S1 - S2 (g).
 Phương pháp xác định hàm lượng protein

Việc phân tích xác định hàm lượng nitơ trong cám gạo được áp dụng theo
phương pháp Kjeldahl cho phép xác định hàm lượng protein thô.
 Phương pháp xác định hàm lượng lipid

24


+ Sấy cốc nhôm ở nhiệt độ 100-105°C trong thời gian 2-3 giờ. Gắp cốc vào bình hút
ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng và cân trọng lượng cốc (B).
+ Cân 100 g mẫu cho vào ống cân mẫu (ống bằng giấy để chiết suất mỡ), đặt lên trên
mẫu một lớp bông đã khử mỡ và lắp vào ống mẫu. Lắp toàn bộ ống mẫu vào bộ chưng
cất mẫu.
+ Đổ khoảng 70 ml ete-petrol có nhiệt độ sôi 40-600°C vào cốc chưng cất và lắp cốc
vào bộ chưng cất mẫu.
+ Chưng cất mẫu trong thời gian 45-60 phút.
+ Sau đó lấy cốc chưng cất ra và sấy ở nhiệt độ 100-105°C trong thời gian 30 phút.
+ Gắp cốc chưng cất có mỡ vào bình hút ẩm để nguội và cân trọng lượng cốc và mỡ
thu được (A).
+ Tính kết quả: A - B (g).
Trong đó: A - Trọng lượng cốc và mỡ (g).
B - Trọng lượng cốc chưng cất (g).
 Phương pháp xác định tro tổng số

Tro hoá mẫu bằng nhiệt:
+ Chuẩn bị mẫu.
+ Rửa sạch cốc nung bằng nước, sấy trong tủ sấy ở 105 °C trong 30 phút nung trong lò
nung ở 525°C. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác đến 0,001 g. Quá
trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
+ Cân 100 g cám với độ chính xác 0,001 g trong cốc nung đã chuẩn bị.

+ Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng khối lượng không đổi.
+ Nung ở nhiệt độ 525°C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà.
+ Làm nguội trong bình hút ẩm.
+ Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
+ Tính kết quả: X = m2 - m1 (g).
X: Hàm lượng chất tro.

25