đề cương khóa luận tốt nghiệp Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống Nưa Konjac (Amorphophallus konjac ) bằng phương pháp in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG
------------o O o------------

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống Nưa Konjac
(Amorphophallus konjac) bằng phương pháp in vitro

Giảng viên hướng dẫn

: TS. Đồng Thị Kim Cúc

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Mai Phương

MSSV

: 513301032

Hà Nội – 2017


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU...............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................1
1.2. Tính cấp thiết của đề tài..........................................................................2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài...............................................................2
1.4. Ý nghĩa của đề tài.....................................................................................3

1.4.1. Ý nghĩa khoa học...............................................................................3
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn.....................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU..................................4
2. Cơ sở khoa học của đề tài................................................................................4
2.1. Giới thiệu chung về chi Nưa....................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại....................................................................4
2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây Nưa konjac...........................................4
2.1.3. Giá trị của cây Nưa konjac...............................................................5
2.2. Phương pháp nhân giống cây Nưa konjac.............................................6
2.2.1. Phương pháp nhân giống truyền thống...........................................6
2.2.2. Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học.......................6
2.3. Tình hình nghiên cứu chi Nưa trên thế giới và Việt Nam....................7
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..................................................7
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam................................................10
2.4. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
trong nhân nhanh giống cây trồng..........................................................11
2.4.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật..............11
2.4.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật....................13
2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy.............................................................13
2.4.2.2. Điều kiện nuôi cấy................................................................19


PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................20
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...........................................................20
3.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng....................................................................20
3.2.1. Hóa chất sử dụng..............................................................................20
3.2.2. Thiết bị sử dụng.................................................................................20
3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành..............................................................21
3.4. Nội dung nghiên cứu................................................................................21

3.5. Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi.................................21
3.5.1. Ảnh hưởng kết hợp của 2,4D + IBA đến
quá trình tạo mô sẹo từ củ.................................................................21
3.5.2. Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA + 2,4D đến
quá trình hình thành mô sẹo từ củ....................................................22
3.5.3. Ảnh hưởng của tuổi củ đến quá trình tạo mô sẹo...........................22
3.5.4. Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA đến
quá trình tái sinh chồi........................................................................23
3.5.5. Ảnh hưởng của kinitin đến quá trình
tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................................23
3.5.6. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình
tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................................24
3.6. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................24
PHẦN 4. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC.....................................................25
4.1. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của
2,4D + IBA đếnquá trình tạo mô sẹo từ củ..............................................25
4.2. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của
BA + NAA + 2,4D đến quá trình hình thành mô sẹo từ củ.....................25
4.3. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của tuổi củ


đến quá trình tạo mô sẹo...........................................................................26
4.4. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp
của BA + NAA đến quá trình tái sinh chồi..............................................26
4.5. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của kinitin
đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................27
4.6. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA
đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................27
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................29
5.1. Kết luận.....................................................................................................29

5.2. Kiến nghị...................................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................30
I.
II.
III.

Tài liệu Tiếng Việt.................................................................................30
Tài liệu Tiếng Anh.................................................................................31
Nguồn khác............................................................................................31


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong xã hội công nghiệp hóa hiện nay, mọi mặt cuộc sống của con người
ngày càng được cải thiện, đời sống được nâng cao hơn nhưng công nghiệp hóa
cũng làm nảy sinh nhiều bệnh tật mang tính xã hội như: mỡ máu, tiểu đường, béo
phì,... Chính vì vậy, các nhà dược học, thực vật học luôn mong muốn tìm ra các
loài thực vật có thể dùng làm thuốc hay làm thức ăn có thể phòng và chữa trị được
những bệnh này. Nưa là một trong số các loại cây có thể đáp ứng những tiêu chí
đó.
Ở nước ta, Nưa mọc rải rác ở khắp ngoài tự nhiên, trên các vùng rừng núi,
được người dân nhiều địa phương trồng trong vườn, bên cạnh đó nưa còn là nguồn
thực phẩm giàu chất dinh dưỡng làm thức ăn cho người và gia súc, nưa phân bố rải
rác ở khắp các tỉnh như: Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh,
Quảng Trị, Thừa Thiên Huế.
Củ Nưa có chứa nhiều tinh bột ăn ngon hơn sắn nên trước đây dân ta trồng
nhiều để lấy củ làm lương thực. Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm
mà còn có ý nghĩa trong việc chống xói mòn đất.
Thực trạng hiện nay, diện tích rừng nước ta đang ngày càng bị thu hẹp, việc
khai thác tài nguyên rừng bừa bãi, sự đa dạng sinh học bị phá vỡ, nhiều nguồn gen

thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với thực tế là ngày nay đời sống con người
ngày càng nâng cao, nhiều người không còn nghĩ đến một loài cây có nhiều giá trị
to lớn như vậy.
Hơn nữa hiện nay chưa có nhiều những nghiên cứu về cây Nưa, chính vì vậy
việc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân giống và bảo
tồn giống cây Nưa.

5


1.2. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài, trong đó có 2 trong 3 loài được trồng
phổ biến ở Trung Quốc để sản xuất nguyên liệu glucomannan. Hiện nay, nghiên
cứu trong lĩnh vực nhân giống và trồng trọt các loài Nưa ở Việt Nam vẫn chưa
được quan tâm nhiều. Trong khi đó, hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập hàng trăm
ngàn tấn bột Nưa để phục vụ cho công nghệ thực phẩm, nhiều sản phẩm thực phẩm
chức năng như viên giảm béo...
Cây Nưa konjac sinh sản chủ yếu bằng con đường sinh sản vô tính, thông qua
các thân hành nên hiệu quả tái sinh rất thấp và thân hành thường chứa các mầm
bệnh, điều này dẫn đến nhiều rủi ro trong trồng trọt. Phương pháp nhân giống này
không làm cây sạch bệnh, năng suất không cao đồng thời nó còn tốn nhiều thời
gian và công chăm sóc.
Trước tình hình đó, việc tìm ra biện pháp nhân giống cây Nưa konjac sạch
bệnh, có chất lượng tốt là cần thiết. Và thế là một phương pháp nhân giống mới
được áp dụng, đó là phương pháp nuôi cấy mô. Phương pháp này làm cho cây Nưa
tăng thêm cả về số lượng lẫn chất lượng, tạo ra một số lượng trong thời gian ngắn
và cây sạch bệnh.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống Nưa konjac (Amorphophallus konjac)
bằng phương pháp in vitro”.

1.3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Tìm hiểu nghiên cứu quy trình nhân giống cây Nưa konjac bằng phương
pháp in vitro.
Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây Nưa konjac trong điều kiện phòng
thí nghiệm.

6


1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân
giống và bảo tồn loài Nưa konjac.
Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân giống và bảo tồn loài
Nưa konjac.
Cung cấp tài liệu học tập, nghiên cứu cho sinh viên.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đề tài phục vụ cho việc tạo cây hoàn chỉnh góp phần nhân giống
phục vụ trực tiếp cho các ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược học
phục vụ cho sản xuất.

7


PHẦN 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2. Cơ sở khoa học của đề tài
2.1. Giới thiệu chung về chi Nưa
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây Nưa konjac có tên khoa học Amorphophallus konjac, là một loài thực
vật có hoa thuộc họ Ráy Araceae, được K. Koch mô tả lần đầu năm 1858. Nó là

loài bản địa mọc tự nhiên vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới ẩm miền đông châu Á, từ
Nhật Bản và Trung Quốc về phía nam tới Indonesia. Konjac được biết đến ở Nhật
Bản từ thế kỷ thứ 6 như một loại dược phẩm.
Phân loại khoa học:
Giới (Kingdom):

Plantae

(unranked):

Angiosperms

(unranked):

Monocots

Bộ (Order):

Alismatales

Họ (Family):

Araceae

Chi (Genus):

Amorphophallus

Loài (Species):

A. konjac

2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây Nưa konjac
Nưa konjac có một số đặc điểm thực vật học sau:
Nưa konjac là cây thân thảo, có củ lớn hình cầu lõm, đường kính có thể lên
tới 25cm. Từ củ lớn còn hình thành nên những củ nhỏ hơn, được gọi là củ nhánh.
Từ trục thân chia thành 3 nhánh (còn gọi là dọc hay chột) mang lá.
Phiến lá xẻ thùy sâu hình lông chim, các thùy cuối hình quả quả trám thuôn,
nhọn đầu; cuống lá thon dài, dài 40 – 80cm, nhẵn, màu lục nâu.
Cụm hoa có mo lớn, phần bao mo màu lục nhạt điểm các vết lục thẫm, ở
phía mép màu hung tím, mặt trong màu tím nâu thẫm. Trục hoa dài gấp đôi mo.

8


Quả mọng có đường kính khoảng 3-5cm và chứa nhiều hạt.
2.1.3. Giá trị của cây Nưa konjac
Cây Nưa có giá trị thực phẩm rất to lớn. Cuống lá Nưa có thể dùng để nấu
canh hoặc muối dưa ăn. Củ, dọc và lá, bã bột Nưa là nguồn thức ăn rất tốt để chăn
nuôi gia súc. Củ Nưa là phần có giá trị to lớn nhất. Tuy nhiên, Nưa chủ yếu được
trồng để lấy bột.
Thành phần hóa học chính:
Mỗi 100 gram bột konjac chứa 1.64g protein, 0.004g chất béo, 57mg
photpho, 4.06mg sắt, 123mg kẽm, 0.2mg mangan, 0.25chromium, 0.08mg đồng và
79.37mg Glucomannan.
Trong củ Nưa có chứa glucomannan – một polysaccharide hòa tan trong
nước. Glucomannan là một chất phụ gia thực phẩm được sử dụng như một chất
chuyển đổi sữa hay chất làm đặc. Trong lịch sử, glucomannan đã được sử dụng
trong thực phẩm truyền thống châu Á như mì, đậu phụ, và các sản phẩm khác.
Ngoài ý nghĩ trong thực phẩm, glucomannan còn đóng vai trò quan trọng trong

một số loại dược phẩm. Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được
sử dụng để điều trị táo bón. Glucomannan cũng có tác dụng làm giảm colesterol,
lipoprotein và chất béo trung tính, do đó được bổ sung vào thành phần của các loại
thuốc chữa béo phì. Chất này cũng được chứng minh là có tác dụng chống lão hóa,
hạ đường huyết. Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống cây Nưa để thu glucomannan
có ý nghĩa rất to lớn.

9


2.2. Phương pháp nhân giống cây Nưa konjac
2.2.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
Gieo hạt
Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống được
thu từ quả đã chín, trong điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm hình thành cây.
Ưu điểm: vận chuyển và bảo quản hạt giống dễ dàng do kích thước hạt
giống nhỏ.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp.
Cắt chồi từ cây mẹ
Là phương pháp cắt cành (ngó) từ củ cây mẹ để cho tạo thành những cây
mới.
Ưu điểm: ít tốn thời gian.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp, cây dễ bị thoái hóa, rễ
cây yếu. Phương pháp này không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được
truyền từ cây mẹ sang.
2.2.2. Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học
Nuôi cấy mô (nhân giống in vitro)
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn
thân non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mới
hoàn chỉnh.

Ưu điểm: Hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ động trong việc
sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống.
Nhược điểm: Cây con có kích thước nhỏ, xảy ra đột biến biến dị làm xuất
hiện những cây không mong muốn, cần trang thiết bị đặc biệt (Võ Quốc Việt và cs,
2010).

10


Ngoài ra, theo Hoàng Ngọc Thuận (2000) việc nuôi cấy in vitro sử dụng
nguồn hydrocacbon nhân tạo do đó mà khả năng tự tổng hợp chất hữu cơ kém,
đồng thời cây nuôi cấy in vitro được nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa,
do vậy mà khi trồng cây ra ngoài điều kiện tự nhiên cây thường bị mất nước,
không thích nghi được cây dễ bị héo và chết.
2.3. Tình hình nghiên cứu chi Nưa trên thế giới và Việt Nam
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay nhiều loài được nghiên cứu và triển khai trồng với diện tích lớn ở
nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand, Ấn Độ, Thái Lan,
Indonesia,...
Ở Trung Quốc, chỉ riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn ha đất đồi núi được sử
dụng để trồng Nưa, ngoài ra Nưa còn được trồng ở Nam Ninh, Quảng Đông,
Quảng Tây, Trùng Khánh... Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và Uedama, ngay từ
những năm 70 của thế kỷ trước, hàng năm khoảng hơn 15 nghìn ha Nưa được
trồng với sản lượng đạt tới hàng nghìn tấn. Do tầm quan trọng của nguồn lợi từ củ
Nưa, nên cây này đã được nhập trồng từ Nhật Bản vào New zealand từ hàng chục
năm trước.
Nưa là cây trồng có thể mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên trong những năm
qua đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng như kỹ thuật
canh tác cây Nưa.
Hiroshi Kurihama (1979) đã đưa ra các định hướng và kinh nghiệm trong

trồng trọt Nưa Konjac trên đất bằng và đất dốc tại 2 tỉnh Jinnejo và Uedama ở Nhật
Bản, cũng như các yếu tố về nhiệt độ, đất, sâu bệnh và thời vụ.
Dhua và cộng sự (1988) đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất hóa
học đến quá trình nảy mầm, phát triển và sản lượng của củ Nưa chuông
(Amorphophallus paeoniifolius).

11


Liu và cs. (1998) khi nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển của một số loài
Nưa ở Trung Quốc đã chỉ ra các điều kiện sinh thái của Nưa. Theo nhóm nghiên
cứu, Nưa không phải là cây đòi hỏi nhiều nước, có khả năng chịu hạn tốt nhưng
không chịu được ngập úng. Về nhiệt độ, Nưa là cây ưa ấm, có khả năng chịu biến
thiên nhiệt độ từ 5 - 43°C, nhiệt độ tối thích là 20 – 25°C, sau khi nhiệt độ xuống
dưới 0°C và lên trên 48°C cây sẽ chết sau 5 ngày. Nghiên cứu này cũng đưa ra
một số mức nhiệt tối thích cho sự phát triển của củ và rễ, khả năng lai của một số
loài Nưa và thu được nhiều kết quả khả quan. Cũng theo nghiên cứu cho biết Nhật
Bản và Trung Quốc là hai nước có lịch sử trồng và sử dụng bột Nưa như loại thực
phẩm truyền thống từ hàng nghìn năm trở về trước. Dựa trên những nghiên cứu
rộng rãi về an toàn thực phẩm, Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đưa bột Nưa vào
trong những thực phẩm quản lý thông thường từ năm 1998. Ở Mỹ người ta chấp
nhận bột Nưa như thực phẩm bổ sung (1997), và cũng cho phép sử dụng bột Nưa
như nhân tố làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa và chất ổn định trong các thực
phẩm. Ngày nay Nhật Bản, Trung Quốc và một số nước đã sử dụng bột Nưa làm
nguyên liệu trong công nghiệp dược phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ trợ
nhiều bệnh như đái tháo đường, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ trợ giảm
cân.
Long Chi Lin (1998) đã có công trình nghiên cứu thực vật dân tộc học của
các loài Nưa, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng người dân Trung Quốc đã sử dụng nưa
làm thức ăn từ 3000 – 4000 năm trước, nhiều kiến thức về kỹ thuật trồng cây Nưa

theo lối cổ truyền cũng được đề cập. Theo nghiên cứu này, hạt của một số loài Nưa
khó nảy mầm ở ngoài tự nhiên, tuy nhiên nó lại nảy mầm dễ dàng sau khi qua
đường tiêu hóa của một số loài chim. Theo cách nảy mầm nhân tạo, quả Nưa chín
sau khi rửa sạch vỏ và cơm quả, trộn lẫn với cát ẩm ở tỷ lệ 1:4 rồi cất vào chỗ tối
hoặc phủ bằng lớp đất dày thì dễ dàng nảy mầm.

12


Theo Santosa và cs. (2002) Nưa là cây lương thực quan trọng ở Java những
năm 1940 – 1950, sau một thời gian ít được sử dụng, hiện nay Nưa đã trở thành
loài có triển vọng kinh tế lớn, sự có mặt của loài cây này tại các vườn nhà ở Java
ngày càng nhiều.
Liu (2004) đã đề cập khá kỹ về nguồn gốc, phân bố của chi Nưa, phân loại
học, hình thái học, chu trình sinh trưởng và phát triển, sinh thái, sự chuyển hóa của
glucomannan, trồng trọt, nhân giống và chế biến cũng như bảo quản sau thu
hoạch... của các loài Nưa. Theo Liu trên thế giới đã biết khoảng 173 loài Nưa,
trong đó có trên 20 loài được phát triển thương mại ở Trung Quốc, Nhật Bản,
Malaysia, Ấn Độ và Indonesia, hàng năm thế giới sản xuất khoảng 30 nghìn tấn
bột Nưa. Sản lượng củ Nưa tuoi có thể đạt tới 30 – 35 tấn/ha nhưng chỉ khoảng 2,5
tấn glucomannan được chiết xuất từ số lượng củ này.
Douglas và cs. (2005) đã có công trình nghiên cứu về kỹ thuật trồng Nưa
konjac ở New Zealand và đã thu được nhiều kết quả về trọng lượng, chất lượng củ
Nưa khi trồng dưới tán rừng và trồng trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời.
Theo Zhang và Liu (2006) Nưa phát triển theo mùa, chúng thường rụng lá
vào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý của Nưa kéo dài từ 60 – 80 ngày
và không thể có bất kỳ tác nhân nào có thể phá vỡ trạng thái ngủ để hình thành
chồi trong giai đoạn này. Sau khi ngủ, cây bắt đầu nảy mầm, lá phát triển mạnh để
hình thành củ mới, lúc này củ mẹ hết chất dinh dưỡng và chết đi. Trong tự nhiên,
Nưa cần ít nhất 3 năm để phát triển đủ lớn và có thể ra hoa. Do đó, Nưa được đánh

giá là cây sinh trưởng chậm cho năng suất thấp.
Kết quả nghiên cứu của Nedunchezhiyan và cs. (2006) đã giới thiệu khá cụ
thể về các bước nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng, tưới nước,
thu hoạch, cũng như bảo quản củ Nưa ở Ấn Độ.
Theo Melinda Chua và cs. (2010), ở Trung Quốc, Nưa được trồng xen canh
với ngô cũng đạt năng suất khá cao.

13


Zhang và cs. (2010) đã công bố kết quả nghiên cứu nhân giống so le giữa 2
loài Nưa là: A. bulbifer và A. muelleri nhằm tìm ra loài Nưa thích hợp cho vùng
Nam Á. Sau khi nghiên cứu và so sánh với Nưa konjac (A. konjac), nhóm nghiên
cứu đã kết luận loài A. muelleri có khả năng thích ứng tốt với khí hậu Nam Á, cho
hàm lượng glucomannan cao (>70%) có thể phát triển trồng ở bắc Mianma và Lào.
Nghiên cứu đã giải thích tại sao ở Nam Á người ta sử dụng củ mà không sử dụng
hạt Nưa làm vật liệu nhân giống. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậu
của khu vực rất thuận lợi cho sự phát triển của các loài cỏ dại, cây từ hạt thường
không đủ sức cạnh tranh. Hơn nữa, cây có nguồn gốc từ hạt không thể cho củ lớn
trong thời gian 1 năm trong điều kiện tự nhiên.
Mặc dù đã có nhiều tác giả nghiên cứu về Nưa nhưng các tài liệu được công
bố chủ yếu là các tài liệu về phân loại học và hình thái học còn các tài liệu về sinh
trưởng, phát triển cũng như trồng trọt, nhân giống chủ yếu được nghiên cứu ở một
số loài như: A. konjac, A. bulbifer, A. muelleri và A. paeoniifolius. Các loài Nưa
khác còn ít được biết đến.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam nhưng hầu
hết tập trung ở các tỉnh miền núi, một số tỉnh duyên hải và hải đảo. Một số loài đã
được các dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không chỉ làm thực phẩm mà còn là
nguồn dược liệu tự nhiên quý giá. Người dân thường trồng Nưa lấy củ làm lương

thực, thân và cành lá dùng làm chăn nuôi, cuống lá Nưa dùng nấu canh hay muối
dưa ăn. Củ được dùng làm thuốc trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa trị đờm
tích trong phổi, trúng phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau đầu, đầy bụng, tức
ngực, ăn uống không tiêu, sốt rét,...
Tài liệu về Nưa ở Việt Nam chủ yếu là các công trình về phân loại chi Nưa.
Các loài Nưa đầu tiên ở Việt Nam được Gagnepain tổng hợp và mô tả trong bộ

14


sách Thực vật chí Đại cương Đông Dương (1942) với 5 loài. Đó là Nưa chuông
(A. paeoniifolius), Nưa rex (A. rex), Nưa đứt đoạn (A. interruptus), Nưa rivieri (A.
rivieri) và Nưa Bắc Bộ (A. tonkinensis).
Phạm Hoàng Hộ (1993) đã thống kê và mô tả 7 loài, từ năm 1994 – 2000,
nhiều loài Nưa mới đã được một số nhà thực vật mô tả từ các mẫu thu được ở Việt
Nam. Dựa trên các mô tả đó Phạm Hoàng Hộ (2000) đã thống kê được 18 loài Nưa
ở Việt Nam.
Cùng với các nhà thực vật nước ngoài, Nguyễn Văn Dư (2001 & 2004),
cũng mô tả nhiều loài Nưa mới cho khoa học và một số loài Nưa bổ sung cho hệ
thực vật Việt Nam, làm cho số loài của chi này lên tới 25 loài.
2.4. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống
cây trồng
2.4.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào thực
vật. Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là
mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng
phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ
của một cây hòa thảo trong 12 ngày. Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế

bào được chứng minh bằng thực nghiệm. Từ đó đến nay, rất nhiều công trình
nghiên cứu đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay
một phần của cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ
sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
- Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

15


Biệt hóa (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho
đến khi thể hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trường nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và
chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở
lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi
là phản phân hóa.

Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản
phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào
càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó xảy ra
quá trình phản phân hoá và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào
thần kinh ở động vật. Người ta đã chứng minh rằng: các tế bào càng gần trạng thái
của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt
động của gene. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một gene nào đó
đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho một tính trạng
mới. Ngược lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá,
ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gene của
tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà. Khi
tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho

16


việc hoạt hoá các gene của tế bào.
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và
phản phân hoá của tế bào thực vật để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào,
người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trưởng
thực vật chính là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất kích
thích sinh trưởng này của mô nuôi cấy khác nhau tuỳ từng mục đích nghiên cứu
(phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo).
2.4.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử
phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí
nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn
chế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởnghầu như chưa được
khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.
Đến nay đã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được xây dựng và
thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm các thành phần
chính sau:
- Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế
bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng là: nhóm đa lượng và
nhóm vi lượng.
+ Các nguyên tố khoáng đa lượng
Là các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồm
các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca. Các nguyên tố này có chức năng tham
gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng nên thành tế bào. Môi

17


trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trường nhiều kali giúp
cho quá trình trao đổi chất diễn ramạnh.
+ Các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới
30ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi
trường nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và
phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu
Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp.
Hàm lượng các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi
trường nuôi cấy và các đối tượng nuôi cấy.
- Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon.Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện
bắt buộc.Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu là
saccharose và glucose. Ở một số mô thì có thể

dùng mantose, fructose và

galactose.
- Vitamin
Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) vẫn có khả
năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu
sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng.Vì vậy, phải bổ sung thêm các vitamin
cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co-enzyme xúc tác cho các
phản ứng sinh hóa trong tế bào. Các vitamin thường đươc sử dụng như:
B1(Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Panthotenic), B5 (Nicotinic acid) với nồng độ

phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan
trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật.
- Các chất kích thích sinhtrưởng

18


Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả
nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy.Nó ảnh
hưởng đến sự phân hóa, phản phân hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự
biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ.Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng đối
với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau.Vì vậy, để tiến hành
nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng
độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế
bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất kích thích sinh trưởng là auxin,
cytokinin và gibberelin.
+ Auxin
Auxin (Aux) là hormone thực vật được phát hiện đầu tiên.Qua nhiều nghiên
cứu của các nhà khoa học, người ta nhận ra rằng Aux là hormone thực vật quan
trọng đối với toàn bộ giới thực vật. Aux dạng tự nhiên gồm có β- Indolacetic Acid
(IAA), Phenylacetic Acid, β- Indolyacetonitril Acid. Ngoài ra có các dạng Aux
được tổng hợp bằng con đường nhân tạo, đáp ứng nhu cầu của con người trong
lĩnh vực trồng trọt và nghiên cứu như: β-Indolbutiric Acid (IBA), α-Naphtylacetic
Acid (α-NAA), 2,4 Diclorophenoxiacetic Acid(2,4D)…
Aux là nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng thường xuyên trong
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Aux kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác
của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế
bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng kết hợp với
cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Aux trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc
vào: kiểu tăng trưởng và phát triển cầnnghiên cứu, hàm lượng Aux nội sinh của

mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa Aux ngoại sinh và Aux nội sinh.
Aux kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng kích
thước của các cơ quan như tăng diện tích lá, phình to của quả, củ, tăng đường
kính và chiều dài của cành, thân, rễ, tạo quả không hạt, kìm hãm sự rụng lá, hoa

19


quả...
Aux điều khiển tính hướng của cây như hướng sáng, hướng đất. Do sự phân
bố không đều của Aux ở hai phía của cơ quan, dẫn đến sự sinh trưởng không đều
của tế bào trong một cơ quan, gây ra tính hướng.
Ở cấp độ tế bào, Aux còn ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất, các
quá trình sinh lý của cây trồng như: quang hợp, hô hấp, trao đổi nước hay khoáng,
tăng khả năng thẩm thấu của tế bào, tăng quá trình trao đổi acid nucleic,protein…
Quan trọng nhất là Aux kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất định
trên cành chiết, cành giâm và trên mô nuôi cấy.Vì vậy, trong kỹ thuật nhân giống
vô tính, việc sử dụng Aux để kích thích ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc.
+ Cytokinin
Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia
tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, BAP. Kinetin là một dẫn xuất của
bazo nito adenine được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất nucleic acid.
BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin.Kinetin
và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động
của tế bào phôi sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Ngoài ra, các chất này
có tác dụng lên qua trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein
và tăng cường hoạt tính của nhiều loại enzyme. Cơ chế tác động của cytokinin ở
mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với
các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự
tổng hợp DNA. Tác động phối hợp giữa auxin và cytokinin có tác động quyết

định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu
của Skoog (1963) chothấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao phù hợp cho sự hình thành rễ
và thấp thì thích hợp cho sự phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức cân bằng thì
thuận lợi cho phát triển mô sẹo. Miller và Skoog (1957) đã khẳng định vai trò của
cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình

20


chuyển pha trong phân bào và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình
thường. Cytokinin được hình thành bởi rễ và hạt đang phát triển.
+ Gibberellin
Gibberellin là nhóm hormone thực vật thứ hai được phát hiện sau auxin bởi
nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa (1920) từ việc nghiên cứu bệnhcủa cây mạ
do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra, đây là chứng bệnh rất phổ biến trong nghề
trồng lúa ở các nước phương Đông thời bấy giờ, khi nghiên cứu cơ chế gây bệnh
ông đã tách được hàng loạt các chất là sản phẩm tự nhiên của nấm G. Fujikuroi
cũng như từ thực vật bậc cao gọi là gibberellin A. Hiện nay, người ta đã phát hiện
được trên 50 loại gibberellin và ký hiệu A1, A2, …,A52 hoặc GA1, GA2, …,
GA5,… trong đó GA3 (gibberellic acid) có hoạt tính mạnh nhất.
Gibberellin (GA) được tổng hợp trong phôi và các cơ quan đang sinh trưởng
khác như lá non, rễ non, quả non…. GA được vận chuyển không phân cực, có thể
hướng ngọn và hướng gốc tùy vào vị trí cơ quan sử dụng.Trong tế bào, nơi tổng
hợp GA mạnh nhất là ở lục lạp.
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng
kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng cây họ lúa. Hiệu quả này có được do ảnh
hưởng kích thích đặc trưng của GA lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Vì
vậy, khi xử lý GA làm tăng nhanh sự sinh trưởng dinh dưỡng nên làm tăng sinh
khối của chúng.
GA ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng các đột biến lùn. Các nghiên cứu về

trao đổi chất di truyền của GA khẳng định rằng các đột biến lùn của một số thực
vật như ngô, đậu Hà lan (chiều cao của cây chỉ bằng 20% chiều cao của cây bình
thường) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu những gen chịu trác nhiệm
tổng hợp các enzyme của một số phản ứng trên con đường tổng hợp GA mà cây
không thể hình thành được GA dù là một lượng rất nhỏ. Với những đột biến này
thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh trưởng bình thường.

21


- Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia hữu cơ được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích
thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, dịch chiết khoai
tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các acid
amin, acid hữu cơ, đường, Myo-inositol và các chất có hoạt tính auxin, các
gluoxit của cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng do
trong thành phần của chúng có chứa một số loại vitamin và các chất kích thích tố
có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cây nuôi cấy.
- Chất giá thể (thạch -Agar)
Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường nuôicấy,
hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng.
Khi nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất
dinh dưỡng cũng như sự hấp thụ của mô gặp khó khăn. Đa số nuôi cấy phôi được
thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào từng loại cây mà sử dụng
cho phù hợp. Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng, việc sử dụng agar được
tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na
và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các chất nói trên cũng có thể
được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong
o
cồn và làm khô ở 60 C trong 24 giờ.

- Giá trị pH môi trường
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng môi
trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độpH của
môi trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy mô sẹo (callus) của nhiều loài cây,
pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0 - 6,5.
Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino

22


acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi
trường về từ 5,5 - 6,5.
Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều
loài thực vật biến đổi từ 5,0 - 6,0. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn
trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar đồng thời hoạt hóa các
enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm sự sinh trưởng, kích thích sự già hóa của tế
bào trong mô nuôi cấy.
2.4.2.2. Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới sự phân chia tế bào và
quá trình trao đổi chất trong các mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng đến hoạt
động của auxin do đó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây nuôi cấy
mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định trong khoảng 25 – 27°C.
Ánh sáng: có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng.
Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy
nhiều loại mô. Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại
nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ.

23

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu là cây
Nưa konjac được cung cấp bởi Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp
Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông Nghiệp.
- Phạm vi nghiên cứu: Đối tượng được nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm.
3.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
3.2.1. Hóa chất sử dụng
- Hóa chất sử dụng là các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần
của môi trường MS.
- Các chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D (Bio science), kinetin (Wako), BA
(Duchefa), NAA (Trung quốc), IBA (Duchefa); các chất bổsung như: inositol (Bio
science).
3.2.2. Thiết bị sử dụng
- Các thiết bị dùng cho nghiên cứu: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp
khử trùng ALP (Nhật bản), tủ sấy (Memmenrt) (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II
(Airtech) (Hàn Quốc), máy chuẩn pH (Hanna HI2210) (Đức), Lò vi sóng Sanyo
(Nhật bản)…
Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm Trung tâm
Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông
Nghiệp.

3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành

24

Địa điểm: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế
bào thực vật, Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao –
Viện Di truyền Nông Nghiệp.
`

Thời gian tiến hành: thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2016 đến tháng

5/2017.
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Nội dung 1:Ảnh hưởng kếthợp nồng độcủa 2,4D và IBA đến quá trình tạo
mô sẹo từ củ.
3.4.2. Nội dung 2: Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA + 2,4D đến quá trình hình
thành mô sẹo từcủ.
3.4.3. Nội dung 3: Ảnh hưởng của tuổi củ đến quá trình tạo mô sẹo.
3.4.4. Nội dung 4:Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA đến quá trình tái sinh chồi.
3.4.5. Nội dung 5: Ảnh hưởng của Kinitin đến quá trình hình thành chồi từ mô sẹo.
3.4.6 Nội dung 6: Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh.
3.5. Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi
3.5.1. Ảnh hưởng kết hợp của 2,4D và IBA đến quá trình tạo mô sẹo từ củ
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến quá trình tạo mô sẹo từ củ.
Công thức 1: Môi trường MS + 2,4D 0,5mg/l + 0,1 mg/l IBA
Công thức 2: Môi trường MS + 2,4D 1mg/l + 0,2 mg/l IBA
Công thức 3: Môi trường MS + 2,4D 2mg/l + 0,3 mg/l IBA
Công thức 4: Môi trường MS + 2,4D 3mg/l + 0,5 mg/l IBA
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có
5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, cấy 30 mẫu cho mỗi công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo.
Tổng số mô sẹo tạo thành
Số mô sẹo tạo thành (%) =
× 100%

Tổng số mẫu vào

25