KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) SKEELS TỪ CAO ETHYL ACETATE THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

Header Page
1 of 161.ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG

KHOA HĨA HỌC – BỘ MƠN HĨA HỮU CƠ

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
CÂY CHÙM RUỘT
PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) SKEELS
TỪ CAO ETHYL ACETATE
THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN ĐÌNH PHƯỚC

Giáo viên hướng dẫn : TS. BÙI XUÂN HÀO
MSSV: K38.201.091

Footer Page 1 of 161.

TP. Hồ Chí Minh, 2016


HeaderKhóa
Pageluận
2 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU
1.1.1 Giới thiệu về cây chùm ruột Phyllanthus
acidus
Thuộc họ Thầu dầu – Euphorbiaceae, chi
Phyllanthus.
Tên khoa học: Phyllanthus acidus (L.)
Skeels. Tên thông thường: Cây chùm ruột, cây
tầm ruột.

Hình 1.1: Thân và quả cây chùm ruột

Phân bố phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt Nam.
1.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu là cây chùm ruột Phyllanthus acidus
(L.) Skeels (Euphorbiaceae) được thu hái ở huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận.
1.1.3 Mơ tả thực vật
Ở Việt Nam, một số cây thuộc chi Phyllanthus có trong danh mục từ điển cây
thuốc Việt Nam. Theo Phạm Hồng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, chùm ruột
là loại cây nhỏ, cao 3-5 m, thân nhẵn, cành có vỏ màu xám nhạt, cành non màu lục nhạt,
nhẵn; cành già màu xám có nhiều vết sẹo do lá rụng để lại. Lá chùm ruột thuộc loại lá
kép, mọc so le, cuống dài, lá chét mỏng, mềm, dài 4-5 cm, rộng 18-20 mm. Gốc lá bầu,
tròn, phần đầu phiến lá nhọn, mặt dưới màu xám nhạt, gân lá rõ ở cả hai mặt. Cụm hoa
mọc ở kẽ những lá đã rụng thành xim, dài 6-15 cm, cuống mảnh có cạnh; hoa nhỏ màu
đỏ, hoa cái và hoa đực ở cùng một cây; hoa đực có đài 4 răng, 4 nhị, rời; hoa cái có 4 lá
đài, bầu 4 ô, hoa mọc thành cụm từ 4-7 hoa ở mỗi mấu trịn. Quả chùm ruột mọng, có

Footer Page 2 of 161.

-1-


HeaderKhóa
Pageluận
3 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

khía, 4 mảnh, đường kính khoảng 5 mm, cuống quả dài khoảng 7 mm. Khi quả chín có
màu vàng nhạt, vị chua, hơi ngọt, ăn được.[32-34]
1.1.4 Một số ứng dụng của cây chùm ruột Phyllanthus acidus trong y học
Theo Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, trong y học cổ truyền các nước, những
bộ phận khác nhau của cây chùm ruột được dùng làm thuốc chữa các bệnh ngoài da, như
lá được dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa và mề đay. Vỏ thân cây chùm ruột được dùng để
tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích ở phổi, dùng bơi ngồi, chữa ghẻ, loét, vết
thương sứt da chảy máu; ngậm chữa đau răng, đau họng. Bột vỏ thân ngâm giấm, uống
chữa bệnh trĩ. Rễ và vỏ cây chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sơi, xơng hít
chữa ho và nhức đầu hay được người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng
rất nhỏ). Vỏ rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (Psoriasis).[32-33]
1.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI CÂY THUỘC CHI PHYLLANTHUS
Cây chùm ruột thuộc chi Phyllanthus từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền
các nước để điều trị bệnh về thận, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng đường ruột,
bệnh tiểu đường và viêm gan siêu vi B. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao
chiết các bộ phận của cây chùm ruột cũng khá phổ biến như hoạt tính kháng khuẩn
(Menlendez và cộng sự, 2006),[18] kháng nấm (Satish và cộng sự, 2009),[24] kháng ký sinh

trùng giun đũa trên thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997),[17] bệnh sơ nang (Sousa và cộng
sự, 2007),[28] chữa trị tổn thương gan (Nilesh và cộng sự, 2011),[10] giảm nhẹ mỡ ở các
mô, tạng, giảm lipid trong huyết thanh và trong gan của chuột lang trong 6 tuần (Chongsa
và cộng sự, 2014).[5] Ngoài ra, các hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane chỉ được thử
nghiệm độc tính tế bào và kháng virus viêm gan siêu vi B (Lv và cộng sự, 2014;
Vongvanich và cộng sự, 2000).[16][30]
1.2.1 Độc tính tế bào
Nhiều cơng trình nghiên cứu gần đây nhất cho thấy cao chiết từ các loài thuộc chi
Phyllanthus như Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria,
Phyllanthus watsonii, Phyllanthus emblica có độc tính đối với các dịng tế bào ung thư,

Footer Page 3 of 161.

-2-


HeaderKhóa
Pageluận
4 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

bao gồm ức chế sự xâm lấn, di căn và kích hoạt sự chết theo chương trình của tế bào
(apoptosis) (Tang và cộng sự, 2011).[29] Năm 2011, các nghiên cứu của Lee và cộng sự
cho thấy cao chiết của bốn loài, gồm Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria,
Phyllanthus watsonii và Phyllanthus amarus đều có tác dụng ức chế sự di căn của dòng tế
bào ung thư phổi A549 và dịng tế bào ung thư vú MCF-7, bằng cách kích hoạt quá trình
apoptosis (Lee và cộng sự, 2011).[14] IC 50 của cao chiết methanol của các lồi trên có giá

trị khoảng 50-180 µg/ml, và của cao chiết nước khoảng 65-470 µg/ml. Trong thành phần
cao chiết, các hợp chất polyphenol giữ vai trò quan trọng trong sự ức chế xâm lấn, di
chuyển và gắn bám của các tế bào ung thư. Năm 2013, Sumalatha đã cơng bố cao chiết
ethanol của lồi Phyllanthus emblica có tác dụng chống oxy hố và có hoạt tính ức chế
dịng tế bào ung thư tá tràng HT-29 (Sumalatha, 2013).[27] Ngoài ra, cao chiết polyphenol
của loài này cịn cho thấy vai trị của nó trong việc ức chế sự phân bào và kích hoạt q
trình apoptosis ở tế bào ung thư cổ tử cung (Zhu và cộng sự, 2013).[31] Nhiều thử nghiệm
độc tính tế bào in vitro của các loại cao chiết từ các bộ phận của cây chùm ruột và của các
hoạt chất tinh khiết cô lập được trên các dòng tế bào ung thư, bao gồm tế bào ung thử
phổi NCI-H460, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư gan HepG2.
1.2.2 Tác dụng ức chế kí sinh trùng
Tác dụng kháng ký sinh trùng của chi Phyllanthus vẫn chưa được nghiên cứu
nhiều. Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều lồi thuộc chi Phyllanthus có tác
dụng rất hiệu quả lên ký sinh trùng. Năm 2011, nghiên cứu của Ajala và cộng sự cho thấy
cao chiết của loài P. amarus có tác động kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoelii in
vivo trên chuột Swiss (Ajala và cộng sự, 2011).[3] Tác động kháng ký sinh trùng này của
loài P. amarus tương đương với thuốc kháng ký sinh trùng tiêu chuẩn khi dùng ở liều
1600 mg/kg thể trọng chuột/ngày. Một nghiên cứu khác trên ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum kháng thuốc chloroquine cho thấy cao chiết nước và cồn của loài
P. amarus ức chế mạnh ký sinh trùng này ở mức độ in vitro với giá trị IC 50 là 11.7 µg/ml
(Opong). Một nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ lồi P. niruri có tác dụng làm tê liệt
và chết sán bao tử (Paramphistomes) ở động vật nhai lại theo thứ tự khoảng 2 giờ và 4 giờ

Footer Page 4 of 161.

-3-


HeaderKhóa
Pageluận

5 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

ở nồng độ 10 mg/ml (Jahan và cộng sự, 2013).[9] Ngoài ra, cao chiết từ chùm ruột có thể
kháng ký sinh trùng giun đũa trên thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997).[17] Các kết quả
này cho thấy, chi Phyllanthus có thể là nguồn dược liệu chứa các hợp chất kháng nhiều
lồi ký sinh trùng.
1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn
Các bệnh về nhiễm khuẩn đang gây nhiều vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe
con người. Escherichia coli (E. coli) là những vi khuẩn thường trú chính trong đường ruột
của người và động vật, nhưng một số chủng E. coli lại có khả năng gây tiêu chảy nặng và
nhiều bệnh ngoài đường ruột như viêm đường tiểu, nhiễm trùng máu. E. coli có liều gây
bệnh thấp và lây truyền qua đường phân – miệng. Trên thế giới đã có nhiều dịch tiêu chảy
do E. coli gây bệnh gây nên và dẫn đến nhiều thương vong. Theo nghiên cứu GEMS
(Global Enteric Multi-Center Study), thì các chủng E. coli gây bệnh là một trong bốn tác
nhân chính gây tiêu chảy ở Châu Phi và Nam Á. Trong đó, tỉ lệ thương vong cao nhất đối
với EPEC (enteropathogenic E. coli) và ETEC (enterotoxigenic E. coli) (Kapper và cộng
sự, 2004).[11] Bệnh lỵ trực trùng (bacilli dysentery), một trong vấn đề về sức khỏe đang
được quan tâm trên toàn cầu, bệnh do nhiễm trùng đường tiêu hóa với những triệu chứng
đặc trưng như sốt, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy (đi phân lỏng kèm máu và dịch nhầy).
Trực trùng Shigella được xác định là ngun nhân chính gây bệnh. Bệnh lỵ trực trùng có
khả năng lây lan cao từ người sang người qua đường phân – miệng, nguồn nước hoặc
thực phẩm nhiễm Shigella. Trong tổng số các ca bị bệnh tiêu chảy trên toàn thế giới, có
khoảng 5-10% ca nhiễm được xác đinh do trực trùng Shigella gây ra. Cùng với đó, theo
ước tính của Tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 1999, số ca nhiễm Shigella chiếm đến
164.7 triệu mỗi năm tại các quốc gia đang phát triển với gần 1.1 triệu ca tử vong và hơn
1.5 triệu ca nhiễm hằng năm tại các quốc gia phát triển, trong đó có 61% các ca tử vong là

trẻ em dưới 5 tuổi (Kotloff và cộng sự, 1999).[12] Cũng theo một báo cáo gần đây của
Trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm (CDC) - Mỹ, tỉ lệ nhiễm Shigella đến 7.6 ca
trong tổng số 100 000 trong năm 1993.

Footer Page 5 of 161.

-4-


HeaderKhóa
Pageluận
6 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

Các loại kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng để đối phó với các bệnh nhiễm
khuẩn. Tuy nhiên, hơn 50% các loại thuốc hiện nay đang được sử dụng vẫn có nguồn gốc
từ thiên nhiên (Sharmin và cộng sự, 2015).[26] Việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp đang
gây ra tình trạng kháng đa kháng sinh ở nhiều chủng vi khuẩn cũng như gây ra nhiều tác
dụng phụ khác. Việc sử dụng các loài thảo dược được xem là một trong những phương
pháp thay thế để đối phó với tình trạng kháng đa kháng sinh của vi khuẩn. Ngồi ra việc
sử dụng các lồi thảo dược cịn làm giảm tác dụng phụ, khơng có hoặc rất ít độc tính, chi
phí thấp hơn (Sharmin và cộng sự, 2015).[26] Cây chùm ruột hiện đang được sử dụng trong
y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như các chất kháng sinh và kháng oxy hóa. Nghiên cứu
của Eldeen và cộng sự (2011), cho thấy các loài thuộc chi Phyllanthus thu thập ở
Malaysia có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn gram âm và gram dương như
Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri
(Eldeen và cộng sự, 2011).[8] Một số nghiên cứu của Mensah và cộng sự (1990), cho thấy

các lồi P. muellerianus và P. discoideus có tiềm năng lớn trong việc sử dụng như là một
chất kháng khuẩn (Mensah và cộng sự, 1990).[18] Ở Việt Nam, chùm ruột cũng được sử
dụng trong một số bài thuốc dân gian để trị các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, các nghiên
cứu chi tiết hơn về hoạt tính của lồi này cũng như khả năng kháng khuẩn của nó vẫn
chưa nhiều.
1.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT
PHYLLANTHUS ACIDUS
1.3.1 Những nghiên cứu trên thế giới
Một số nghiên cứu hoá thực vật trên cây chùm ruột được thực hiện khá sớm và chỉ
công bố sự cô lập của các triterpene và phytosterol (Dekker, 1908; Sengupta và
Mukhopadhyay, 1966; Pettit và cộng sự, 1982).[3][6][25] Các hợp chất triterpene đã được cô
lập thuộc khung oleane như β-amyrin (22), khung lupane như lupeol (23) và khung
cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol (24). Trong khi đó, các hợp chất
sterol chủ yếu có khung sitosterol và các glycoside của chúng.

Footer Page 6 of 161.

-5-


HeaderKhóa
Pageluận
7 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

Những nghiên cứu trong khoảng 15 năm gần đây trên các lồi thuộc chi
Phyllanthus đã cơng bố sự cơ lập của một nhóm các hợp chất norbisabolane

sesquiterpenoid, với hoạt tính sinh học của chúng khá đa dạng (Lv J.-J. và cộng sự, 2014;
Vongvanich và cộng sự, 2000).[16][30] Năm 2000, hai hợp chất Phyllanthusol A (2) và B
(3) đã được cơ lập, có khung sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử
đường glucosyl và mannosamine-N-acetate (Vongvanich và cộng sự, 2000).[30] Tuy nhiên,
đến năm 2014, cùng với sự cô lập 19 hợp chất cũng thuộc khung sườn norbisabolane, các
hợp chất Phyllanthusol A và B được xác nhận cấu trúc, trong đó hai đơn vị đường là
glucopyranosyl và glucosamine-N-acetate. Như vậy, cho đến nay, 21 hợp chất
norbisabolane đã được cô lập, với tên gọi tương ứng là phyllanthacidoid A-T (1-21).
Trong đó hai hợp chất phyllantacidoid S (20) và T (21) chứa khung sườn rất lạ so với các
hợp chất được cơ lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có trong cấu trúc của
chúng. Các hợp chất này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B
(HBV), với giá trị IC 50 trong khoảng 0.8-36.0 µM (Lv J.-J. và cộng sự, 2014).[16] Ngoài
ra, các hợp chất phyllanthacidoid cũng được xác định là thành phần chính có trong rễ cây
chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, tính trên khối lượng rễ chưa khô (Vongvanich
và cộng sự, 2000).[30] Q trình chiết xuất và phân tích hàm lượng của phyllanthacidoid A
và B cũng được xác nhận bằng phương pháp điện di (capillary electrophoresis) (Durham
D. G. và cộng sự, 2002).[7]
Năm 2010, các hợp chất kaemferol (28), adenosine (29), 4-hydroxybenzoic acid
(30), hypogallic acid (31), caffeic acid (32) được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm
ruột (Leeya Y. và cộng sự, 2010).[15] Cao n-butanol toàn phần và 5 hợp chất được cơ lập
đều có khả năng làm giảm huyết áp và giãn cơ vòng ở động mạch chủ.
1.3.2 Những nghiên cứu trong nước
Năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyen T.T và cộng sự đã cô lập được các hợp chất
phenylbutanoid và diphenylheptanoid, trong đó có một hợp chất diphenylpentanoid mới
(Nguyen T. T. và cộng sự, 2014).[20] Cho đến nay, các hợp chất có khung sườn
phenylbutanoid và phenylheptanoid chưa được cơng bố trong chi Phyllanthus. Các hợp

Footer Page 7 of 161.

-6-

HeaderKhóa
Pageluận
8 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

chất cơ lập gồm glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone
(26),

1-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3-

pentanone (27).
Năm 2015, trong tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ của Võ Thị
Như Thảo, với đề tài : “Nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của vỏ thân
cây chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam trong một số dịch chiết”, tác giả công bố đã thu
được một số kết quả như xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô là 8.87%; hàm lượng
tro trung bình là 5.00%; định tính được dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu cơ thuộc các
nhóm hợp chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol; dịch chiết chloroform có 9 cấu tử hữu
cơ thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester của acid béo; dịch chiết ethyl acetate có 14 cấu tử
hữu cơ thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpene....Ngồi ra, tóm tắt luận án cũng cơng
bố thơng tin về thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của bột vỏ cây chùm ruột trên hai dòng
chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis và Klebsiella. Tuy nhiên, công bố của tác giả không
cho thấy bất kỳ sự xác định cấu trúc của hợp chất nào cô lập được từ vỏ thân cây chùm
ruột ở Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam, và cho đến nay, các kết quả này vẫn chưa được tìm thấy
trong các báo cáo khoa học tại Việt Nam.

Footer Page 8 of 161.

-7-


HeaderKhóa
Pageluận
9 of
tốt161.
nghiêp

Nguyễn Đình Phước

O

O

HO

H
O

OR

1 R =CH3
2a R = H

HO
HO
HO

HN
O

O

O

2
3
7
11

O
OH

R1
H
H
OH
OCH3

O

R2

HO

R2
H

OH

R2
H
H
OH
OCH3

R3
H
OH
OH
OH

O
O

O

O

H

OR1

HO

O

O

O

H

R1
15 N-Ac-GlcN
16 Glc
17 N-Ac-GlcN

R2
H
OH
OCH3

OHOH

OHOH
O
O

H
O

R
18 N-Ac-GlcN
O 19 Glc

HO
HO

HO

HO

O
O
OR

O
OH HO
O

HO
O

H

HO

HO

HO
(22)

(23)

(24)

Hình 1.2: Một số hợp chất cô lập được từ cây chùm ruột

Footer Page 9 of 161.

R2

OR1

R2
H
OH
OH

O
O

O

HO
HO

R2

R1
12.N-Ac-GlcN
13.N-Ac-GlcN
14.Glc

R3
OH
OH

O

OR

OH

OH OH
OH

O

HO
HO

R2

4
5
8
10

O

R3

O

HO

O

O

O

O

O HO
HO

OR1

O

O

OH OH
H

O

O

O

R1
6 H
9 Glc(2-1)Glc

R2
OH

H
OH
OH

R1

O O

O

Glc

O

HO
HO

HO
HO
HO
HO
HO

R2

OH OH
OH

HO

HO
O

O

O

N-Ac-GlcN

R1

O O

HO
HO
O
HO
O
HO
HO
HN

HO

HO
HO
HO

O

O

O
O

OH OH
OH

OH OH
OH

OH OH
OH

-8-

R
20 N-Ac-GlcN
21 Glc


HeaderKhóa
Pageluận
10tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

H 3C

O

28

OH

O

HO

O

HO

O

OH
(26)

(25)
O

OH
HO
HO

O

O

O

HO
OH
OH

O

OH

HO
(27)

NH2
OH

O

N

OH

N
HO

O

O

N

HO
OH
OH

HO

O

N

OH

OH

(29)

(28)

O

(30)

O

OH

OH

OH

HO
OH

OH
(32)

(31)

Hình 1.2: Một số hợp chất cơ lập được từ cây chùm ruột (tiếp theo)

Footer Page 10 of 161.

-9-


HeaderKhóa
Pageluận
11tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước
CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM

2.1 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1 Hóa chất
 Silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
 Sắc kí bản mỏng loại Kieselgel 60F

254

(20×20), Merck.

 Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate,
acetic acid, chloroform, acetone, methanol, petroleum ether và nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng là vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2 Thiết bị
 Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng,…).
 Các cột sắc kí.
 Máy cô quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và 2D-

NMR tại phịng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố
Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
2.3 THỰC NGHIỆM
2.3.1 Thu hái và khảo sát nguyên liệu
Cây chùm ruột Phyllanthus acidus được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh
Bình Thuận vào tháng 4 năm 2014. Tên khoa học của cây được xác định là Phyllanthus
acidus (L.) Skeels.

Footer Page 11 of 161.

- 10 -

HeaderKhóa
Pageluận
12tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

2.3.2 Q trình trích ly và cơ lập các hợp chất trên cây chùm ruột
Nguyên liệu (rễ cây chùm ruột) được sấy khô ở 60oC và xay nhỏ thành bột thơ. Sau
đó đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút đối với mỗi bình cầu dung tích 1000
ml. Tiến hành lọc bỏ phần rắn, cơ quay phần dịch thu được cao 1.0 kg ethanol thô.
Cao ethanol thơ (0.5 kg) được thực hiện sắc kí cột, giải ly bắt đầu từ hexane : ethyl
acetate (95:5) rồi tăng dần độ phân cực lên (80:20), (50:50), (90:10), (0:100), sau đó tiếp
tục giải ly bằng ethyl acetate : methanol (50:50), (0:100) thu được các cao tương ứng H1
(2.0 g), H2, H3, H4 (3.4 g), EA1 (67.0 g), EA2 (85.0 g), Me.
Cao EA2 thực hiện phương pháp chiết lỏng – lỏng, thu được phần dịch Ea (7.0 g) và
phần dịch Me:H 2 O (70.0 g).
Phần dịch Ea thực hiện sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi C:Me:H 2 O
(4:0.9:0.1), thu được 5 phân đoạn E0.1 – E0.5. Phân đoạn E0.1 (1.16 g) được thực hiện
sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi PE:EA:AcOH (5:1:0.2) thu được 19 phân đoạn
E0.1.1 – E0.1.19, sau đó thực hiện sắc kí cột rồi giải ly với với hệ dung mơi PE:C:Me
(1:8:0.2) trên phân đoạn E0.1.14 (46.0 mg) thu được hợp chất (1) (8.8 mg).
Phần dịch Me:H 2 O hòa với methanol nguyên chất, đun nóng và khuấy đều một thời
gian, thấy xuất hiện phần dịch D0 (9.0 g) và phần tủa T, lọc lấy phần dịch D0, thực hiện
sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung môi H:EA:Me (1:5:0.4) thu được 5 phân đoạn D0.1D0.5. Từ phân đoạn D0.5 (162.9 mg), tiếp tục thực hiện sắc kí cột và giải ly bằng hệ dung
môi C:Me:H 2 O (4:0.9:0.1) thu được 3 phân đoạn D0.5.1 (47.2 mg), D0.5.2, D0.5.3, thực
hiện sắc kí bản mỏng điều chế trên phân đoạn D0.5.1 ta thu được hợp chất (2) (9.6 mg).

Dưới đây là sơ đồ khái qt q trình trích ly và cơ lập hợp chất 1-2.

Footer Page 12 of 161.

- 11 -


Header Page 13 of 161.
Rễ chùm ruột
Làm sạch, để khô, nghiền nhỏ
Bột khô (20.0 kg)
Đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút
Bỏ phần rắn, cô quay phần dịch
Cao ethanol thơ (1.0 kg)
Phần cịn lại
Hịa tan một nửa cao thơ bằng methanol nóng
Phần dịch methanol (300.0 g)
Phần bã cịn lại (200.0 g)
Sắc kí cột
Giải li bằng các dung mơi khác nhau
H1 (2.0 g) H2

H3

H4 (3.4 g)

EA1 (67.0 g)

EA2 (85.0 g)
Chiết lỏng – lỏng

Dịch Ea (E0) (7.0 g)

Dịch Me:H 2 O (70.0 g)
Ngâm dầm với methanol đun nóng

SKC/C:Me:H 2 O (4:0.9:1)
E0.1
(1.16 g)

E0.2
E0.3
E0.4
E0.5
(933.8 mg) (350.0 mg) (260.0 mg) (180.0 mg)

Me

Tủa T

D0 (9.0 g)
SKC/H:EA:Me (1:5:0.5)

SKC/PE:EA:AcOH (5:1:0.2)
E0.1.1-E0.1.13

E0.1.14 (46.0 mg) E0.1.15-E0.1.19
SKC/PE:C:Me (1:8:0.2)

D0.1-0.4

(1) (8.8 mg)

D0.5 (162.9 mg)
SKC/C:Me:H 2 O (4:0.9:0.1)

D0.5.1 (47.2 mg)

D0.5.2

Sắc kí bản mỏng điều chế
(2) (9.6 mg)

Sơ đồ 2.1: Q trình trích ly và cô lập các hợp chất trên rễ cây chùm ruột

Footer Page 13 of 161.

- 12 -

D0.5.3


HeaderKhóa
Pageluận
14tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

Từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus, đã cô lập được 2 hợp chất là (1) và (2).
Cấu trúc hóa học của các hợp chất (1) và (2) được biểu diễn trong hình
OH

1''

17
11

20
1

13
9

16

A

B

HO

5'

1

C
3

7

HO

10
5

OH

18

19

B

7

15

5

1'

O

HO

9

3

3'

O

C

10

A

OH

CH3

O

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 1-2
3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HĨA HỌC HỢP CHẤT (1)
Hợp chất (1) được cơ lập từ phân đoạn E0.1.14 của cao ethyl acetate.
 Có dạng bột màu trắng.
 Hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 cho vết màu tím, với đèn UV thấy vết
màu tím sáng rõ.
 Phổ 1H-NMR được trình bày ở Phụ lục 1.1.
 Phổ 13C-NMR được trình bày ở Phụ lục 1.2.
 Phổ HMBC được trình bày ở Phụ lục 1.4.
 Phổ NOESY được trình bày ở Phụ lục 1.5.
Phổ

13

C-NMR (Bảng 3.1) cho thấy sự xuất hiện của 20 tín hiệu carbon, có 5 tín

hiệu carbon Csp2 tứ cấp [δ C (119.0, 125.3, 139.2, 147.9, 151.9)], 2 tín hiệu carbon Csp3 tứ
cấp (δ C 38.8) và 1 carbon của nhóm methine liên kết với dị tố oxygen (δ C 78.9).

Footer Page 14 of 161.

- 13 -


HeaderKhóa
Pageluận
15tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

Phổ 1H-NMR (Bảng 3.1) cho thấy sự hiện diện của 1 proton thơm H-11 [δ H 6.67
(1H, s)] và 3 proton olefin là H-15 [δ H 6.57 (1H, dd, 17.5 Hz, 11.0 Hz)], H-16a [δ H 5.53
(1H, dd, 11.0 Hz, 2.5 Hz)] và H-16b [δ H 5.16 (1H, dd, 17.5 Hz, 2.5 Hz)], phân tích sự chẻ
mũi của các proton H-15, H-16a và H-16b, giúp xác định (1) có chứa nhóm vinyl
(CH 2 =CH-). Mặc khác, phổ 1H-NMR cịn cho thấy 1 nhóm methyl liên kết với nhân thơm
H 3 -17 [δ H 2.18, (3H, s)], 3 nhóm methyl mũi đơn H 3 -18, H 3 -19 và H 3 -20 [δ H 1.06 (3H,
s), 0.83 (3H, s) và 1.20 (3H, s)], 1 nhóm oxygen methine H-3 [δ H 3.29 (1H, dd, 11.5 Hz,
4.5 Hz)], 4 nhóm methylene H 2 -1 [δ H 2.23 (1H, m) và 1.75 (1H, m)], H 2 -2 [δ H 1.80 (2H,
m)], H 2 -6 [δ H 1.89 (1H, ddt, 13.5 Hz, 7.5 Hz, 1.0 Hz) và 1.67 (1H, ddd, 13.5, 11.5, 6.0)]
và H 2 -7 [δ H 2.78 (1H, ddd, 17.5 Hz, 6.0 Hz, 1.0 Hz) và 2.57 (1H, ddd, 17.5 Hz, 11.5 Hz,

7.5 Hz)].
Phổ HMBC cho thấy proton H-3 tương quan C-4, C-18 và C-19, các proton H 3 -18
và H 3 -19 cùng cho tương quan với C-3 và C-4 giúp xác định vị trí lân cận của chúng trên
nhân A. Các proton H 3 -17 và H 2 -16 cùng cho tương quan HMBC với C-14 giúp xác định
vị trí của chúng trên cấu trúc của hợp chất (1). Mặc khác H 3 -17 và H-11 cùng cho tương
quan HMBC với C-12 giúp xác định vị trí lân cận của H-11, 12-OH và H 3 -17. Các tương
quan HMBC cịn lại giúp xác định tồn bộ cấu trúc của (1).
Trên phổ NOESY cho thấy tương quan của proton H-3 với H-5 và H 3 -18 giúp xác
định cấu hình lập thể của tâm bất đối của carbon C-3. Đồng thời proton H 2 -16 cho tương
quan NOESY với H 3 -17 giúp xác định được cấu trạng s-trans của nhóm vinyl với nhân C.
Dựa vào sự phân tích dữ liệu phổ trên, so sánh các dữ kiện phổ của hợp chất (1)
với các dữ liệu phổ của hợp chất spruceanol đã được cơng bố (Bảng 1) thấy có sự tương
hợp, đồng thời tương quan thu nhận được từ các phổ hai chiều như HSQC, HMBC và
NOESY của (1) đều phù hợp với cấu trúc của hợp chất spruceanol, do đó cấu trúc của hợp
chất (1) được đề nghị như Hình 3.2.[1]

Footer Page 15 of 161.

- 14 -


HeaderKhóa
Pageluận
16tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất (1) và spruceanol

Hợp chất (1)-CDCl 3
Vị trí C

Loại C δ C ppm

Spruceanol

δ H ppm (J, Hz)

δ C ppm

1

-CH 2 -

37.4

2.23 (m) và 1.75 (m)

37.3

2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

-CH 2 >CH>C<
>CH-CH 2 -CH 2 >C=
>C=
>C<
-CH=
>C=
>C=
>C=
-CH=
=CH 2
-CH 3
-CH 3
-CH 3
-CH 3

28.3
78.9
38.8
49.3

19.2
29.8
125.3
147.9
38.8
109.5
151.9
119.0
139.2
135.5
119.7
13.0
28.2
15.3
24.8

1.80 (m)
3.29 (dd, 11.5, 4.5)

28.0
78.7
37.4
49.3
18.7
29.3
125.2
147.8
37.6
109.7
152.0

119.1
139.2
135.2
119.5
12.8
28.2
15.3
24.8

1.29 (dd, 2.0, 2.0)
1.89 (ddt, 13.5, 7.5, 1.0) và 1.67 (ddd, 13.5, 11.5, 6.0)
2.78 (ddd, 17.5, 6.0, 1.0) và 2.57 (ddd, 17.5, 11.5, 7.5)

6.67 (s)

6.57 (dd, 17.5, 11.0)
5.53 (dd, 11.0, 2.5) và 5.16 (dd, 17.5, 2.0)
2.18 (s)
1.06 (s)
0.88 (s)
1.20 (s)

OH

OH

OH

17

CH2

H
H

H

20

H
9

10

2

A

B

5

3

HO

10

4

H

A
HO

A

B

5

7

H

6

H

H
H

10

H

H

- 15 -

15

4

H

HO

Hình 3.2: Cấu trúc và tương quan HMBC của (1)

Footer Page 16 of 161.

B

Ha

13
14

14

4

4

H
19

12

C

C

1

1

H

10

C

H

16

H
b


HeaderKhóa
Pageluận
17tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HĨA HỌC HỢP CHẤT (2)
Hợp chất (2) được cô lập từ phân đoạn D0.5.1 của cao ethyl acetate:
 Có dạng bột vơ định hình, màu cam.
 Hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 cho vết màu tím, soi UV thấy vết màu
tím sáng rõ.
 Phổ 1H-NMR được trình bày ở Phụ lục 2.1.
 Phổ 13C-NMR được trình bày ở Phụ lục 2.2.
 Phổ HMBC được trình bày ở Phụ lục 2.4.
Phổ

13

C-NMR (Bảng 3.2) cho thấy sự xuất hiện của 17 tín hiệu carbon, có 7

carbon Csp2 tứ cấp, trong đó có 1 tín hiệu carbon carbonyl (δ C 197.9) (C-4), 4 carbon
thơm tứ cấp liên kết trực tiếp với oxygen (δ C 157.6, 157.5, 156.3 và 155.4) và 2 carbon
thơm tứ cấp khác (δ C 129.4 và 101.7). Ngoài ra, phổ

13

C-NMR cho thấy 2 carbon của

nhóm methine thơm (δ C 128.1 và 115.4), 1 carbon của nhóm methoxy (δ C 60.1) và 1
nhóm methylene (δ C 41.8). Từ dữ liệu phổ 13C-NMR, kết hợp với tài liệu tham khảo, cho
phép dự đốn (2) là có khung sườn flavanone, có mang nhóm thế methoxy (-OCH 3 ).
Phổ 1H-NMR (Bảng 3.2) cho thấy sự xuất hiện của một nhóm -OH kiềm nối (δ H
13.06) đặc trưng cho nhóm 5-OH của nhân A. Mặc khác trên nhân A khơng có tín hiệu
cộng hưởng của các nhóm methine và các carbon C-5, C-7 và C-9 đều chuyển dịch về
vùng từ trường thấp chúng tỏ các vị trí này đều liên kết trực tiếp với oxygen. Trên nhân B
có tín hiệu của hai mũi cộng hưởng của proton thơm H-1’/6’ [δ H 7.40 (1H, d, 8.0 Hz)] và

H-3’/5’ [δ H 6.75 (2H, d, 8.0 Hz)] ghép ortho với nhau, ngồi ra, dựa vào độ chuyển dịch
hóa học của các proton này, giúp xác định cấu trúc của nhân B.
Trên phổ HMBC (Hình 3.4), H-2 [δ H 5.53 (1H, dd, 11.0 Hz, 3.5 Hz)] cho tương
quan với C-1’ và C-4. Proton H 2 -3 cho tương quan với C-1’, C-4 giúp xác định được cấu
trúc nhân C của (2).
Từ dữ liệu phổ

C-NMR, 1H-NMR kết hợp với phổ HMBC, khẳng định (2) có

13

khung sườn flavanone, mang 1 nhóm thế -OCH 3 , cịn lại là các nhóm -OH.

Footer Page 17 of 161.

- 16 -


HeaderKhóa
Pageluận
18tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

Dữ liệu phổ HMBC chưa giúp xác định được vị trí nhóm methoxy -OCH 3 trên
nhân A được, so sánh các dữ liệu phổ 13C-NMR của (2) với các flavanone có trong tài liệu
tham khảo (Bảng 3.3) giúp xác định vị trí nhóm -OCH 3 ở C-8 (Hình 3.3).[22]
Trên phổ 1H-NMR cịn 1 tín hiệu nhóm -OH kiềm nối (δ H 12.29), nên hợp chất (2)

có thể tồn tại hai cấu trúc có thể có (Hình 3.3). Chúng tơi chưa thể có dữ liệu khối phổ để
khẳng định cấu trúc của (2).
1''

OH

CH3
3'

O
1'

O

HO

5'

1

9
7

3
10

HO

5

OH

O

(2a)
1''

CH3

OH
3'

O
HO

OH
9

OH

1'

5'

1

7
3

HO

10
5

OH

O

(2b)

Hình 3.3: Hai cấu trúc có thể có của (2)

Footer Page 18 of 161.

- 17 -


HeaderKhóa
Pageluận
19tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR và tương quan HMBC của (2)
Hợp chất (2) (DMSO-d 6 )

Vị trí

HMBC (H → C)

C

Loại

5

-OH

13.06 (s)

9

-OH

12.29 (s)

4’

-OH

9.45 (s)

2

>CH-

78.3

5.53 (dd, 11.0, 3.5)

C-4, C-1’

3

-CH 2 -

41.8

3.11 (dd 17.5, 11.0) và 2.95 (dd, 17.5, 3.5)

C-2, C-4, C-1’

4

>C=

197.9

5

>C=

155.4

6

>C=

129.4

7

>C=

156.3

8

>C=

129.4

9

>C=

157.5

10

>C=

101.7

1’

>C=

129.4

2’

-CH=

128.1

7.40 (d, 8.0)

C-2, C-1’, C-4’

3’

-CH=

115.4

6.75 (d, 8.0)

C-1’, C-2’, C-4’

4’

>C=

157.6

5’

-CH=

115.4

6.75 (d, 8.0)

C-1’, C-6’, C-4’

6’

-CH=

128.1

7.40 (d, 8.0)

C-2, C-1’, C-4’

1’’

-CH 3

60.1

3.63 (s)

δ C ppm

δ H ppm (J, Hz)

1''

CH3

O

HO
9

OH

H

O
H

1

3'
1'

5'

H

7
3

HO

10
5

OH

H
H

O

Hình 3.4: Cấu trúc và tương quan HMBC (2)

Footer Page 19 of 161.

- 18 -


Header Page 20 of 161.

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 13C-NMR của (2) và một số hợp chất flavanone đã được cơng bố
Flavanone
(2)
A (Didyomcarphin)
OH

CH3

Vị trí
carbon

8

HO

1'

O
9

5'

8

H3CO

1

1'

O
9

1

5'

8

H3CO

1'

O
9

6

10

4

H3CO

6

10

8

H3CO
O

O

1'

O

H3CO

OH

5'

10

6

8

HO

H3CO

OCH3

O

6

10

4

5

OH

O

1'

O
9

5'

10

6

8

HO

4

OCH3

1'

O
9

2
3

6

10

4

5

5

OH

O

OH

O

δC

δC

δC

δC

δC

δC

4

197.9

198.2

189.6

196.8

198.5

198.1

5

155.4

145.6

152.5

155.0

159.3

159.2

6

129.4

134.0

138.7

129.0

129.5

92.0

7

156.3

151.0

153.4

159.4

160.6

160.9

8

129.4

130.9

141.1

95.1

91.9

129.0

9

157.5

147.6

150.2

157.6

154.4

154.6

10

101.7

104.3

111.6

102.0

102.4

102.2

- 19 -

Footer Page 20 of 161.

5'

1

7

2
3

H3CO

3'

OCH3

1

7

2
3

4

5

H3CO
3'

1

9

2

E

3

4

5

OH

OH

5'

7

5

D
3'

HO

1

7

3

3

HO

C
3'

OCH3

2

7

2

7

3'

OH

3'

O

B (Kanakugin)

OCH3


HeaderKhóa
Pageluận
21tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN
Trong nội dung khóa luận này, từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus thu hái ở tỉnh
Bình Thuận, hai hợp chất được cơ lập và xác định cấu trúc. Dựa vào các kết quả phổ cộng
hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều cũng như kết hợp với so sánh với tài liệu tham
khảo, cấu trúc của các hợp chất đó là spruceanol (1) và 5,6,7-trihydroxy-2-(4’hydroxyphenyl)-8-methoxychroman-4-one (2) được xác định. Trong đó hợp chất (1) lần
đầu được tìm thấy trong chi Phyllanthus với hoạt tính sinh học đã được khảo sát là độc
tính tế bào và kháng u và hợp chất (2) được đề nghị là hợp chất mới trong tự nhiên thuộc
khung sườn flavanone.

OH
1''

CH3

17

OH
3'

O
13

11

20

HO
1

16

9

9

5'

1

7

10

15
3

3
5

HO
19

1'

O

7

HO

10
5

OH

18

O

5,6,7-trihydroxy-2-(4’-hydroxyphenyl)-8-

Spruceanol (1)

methoxychroman-4-one (2)

Hình 4.1: Cấu trúc hai hợp chất cơ lập được từ cao ethyl acetate
4.2 KIẾN NGHỊ
Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài
này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao E0.1.14 và D0.5.1 của cao ethyl acetate. Trong thời

Footer Page 21 of 161.

- 20 -


HeaderKhóa
Pageluận
22tốt
ofnghiêp
161.

Nguyễn Đình Phước

gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tơi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất cịn lại trên cao
ethyl acetate ở các phân đoạn khác và cao butanol. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử
nghiệm một số hoạt tính sinh học của hợp chất (2).

Footer Page 22 of 161.

- 21 -


Header Page 23 of 161.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo nước ngoài
[1]

Agnes B. A., Kathlia A. D. C., Chien-Chang S., Wen-Tai L. and Consolacion Y.
R., “Chemical constituents of the bark of Aleurites moluccana L. Willd”, Journal
of Chemical and Pharmaceutical Research, 6(5):1318-1320, 2014.

[2]

Ahmed B., Verma A., “Pharmacological and phytochemical review on Phyllanthus
species’’, An Indian Journal, 4(1), 5-21, 2008.

[3]

Ajala T. O., Igwilo C. I., Oreagba I. A., Odeku O. A., “The antiplasmodial effect
of the extracts and formulated capsules of Phyllanthus amarus on Plasmodium
yoelii infection in mice”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 283-287,
2011.

[4]

Calixto J. B., Santos A. R. S., Filbo V. C., Yunes R. A., “A review of the plants of
the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential”,
Med. Res. Rev., 18(4), 225-258, 1998.

[5]

Chongsa W., Radenahmad N., Jansakul C., “Six weeks oral gavage of a
Phyllanthus acidus leaf water extract decreased visceral fat, the serum lipid profile
and

liver

lipid

accumulation

in

middle-aged

male

rats”,

Journal

of

Ethnophramacology, 396 – 404, 2014.
[6]

Dekker S., Pharm. Weekbe, 95, 1156, 1908.

[7]

Durham D. G., Reid R. G., Wangboonskul J., Daodee S., “Extraction of
Phyllanthusols A and B from Phyllanthus acidus and analysis by capillary
electrophoresis”, Phytochem. Anal., 13, 358-362, 2002.

[8]

Eldeen I. M. S., Seow E. M., Abdullah R., Sulaiman S. F., “In vitro antibacterial,
antioxidant, total phenolic contents and anti-HIV-1 reverse transcriptase of extract
of seven Phyllanthus sp”, South African journal of botany, 77: 75 – 79, 2011.

[9]

Jahan A., Jangde C. R., Khatoon S., Umap S. A., “In vitro antihelmintic activity of
Phyllanthus niruri Linn. against Paramphistomes”. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Science, 5(3), 836-838, 2013.

Footer Page 23 of 161.


Header Page 24 of 161.
[10]

Jain N. K., Singhai A. K., “Protective effects of Phyllanthus acidus (L.) Skeels leaf
extracts on acetaminophen and thioacetamide induced hepatic injuries in Wistar
rats”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 470 – 474, 2011.

[11]

Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L., “Pathogenic Escherichia coli”, Nature

Reviews Microbioy, 2, 123-140, 2004.

[12]

Kotloff K. L, Winickoff J. P, B. Ivanoff J. D. Clemens D. L., Swerdlow P.
J., Sansonetti G. K., Adak M. M. L., “Global burden of Shigella infections:
implications for vaccine development and implementation of control strategies”,
Bull World Health Organ, 77, 651-666, 1999.

[13]

Kumar S. C., Bhattacharjee C., Debnath S., Chandu A. N., Kanna K. K.,
“Remedial

effect

of

Phyllanthus

acidus

against

bleomycin

provoked

pneumopathy”, Journal of Advanced Pharmceutial Research, 2(1), 317 – 325,
2011.

[14]

Lee S. H., Jaganath I. B., Wang S. M., Sekaran S. D.,“Antimetastatic Effects of
Phyllanthus on Human Lung (A549) and Breast (MCF-7) Cancer Cell Lines”,
PLoS ONE, 6(6), e20994, 2011.

[15]

Leeya Y., Mulvany M. J., Queiroz E. F., Marston A., Hostettmann K., Jansakul C.,
“Hypotensive activity of an n-butanol extract and their purified compounds from
leaves of Phyllanthus acidus (L.) Skeel in rats”, European Journal of
Pharmacology, 649, 301-313, 2010.

[16]

Lv J.-J., Yu S., Wang Y.-F., Wang D., Zhu H.-T., Cheng R.-R., Yang C.-R., Xu
M., Zhang Y.-J., “Anti-hepatitus B virus norbisabolane sesquiterpenoids from
Phyllanthus acidus and the establishment of their absolute configurations using
theoretical calculations”, The Journal of Organic Chemistry, 79(12), 5432-5447,
2014.

[17]

Mackeen, Muhammad M., Ali Abdul M., Abdullah Mohd A., Nasir Rozita M.,
Mat Nashriyah B., Razak Abdul R., Kawazu K., “Antinematodal activity of some
Malaysian plant extracts against the pine wood nematode, Bursaphelenchus
xylophilus”, Pesticide Science, 51(2), 165-170, 1997.

Footer Page 24 of 161.

Header Page 25 of 161.
[18]

Menléndez P. A.; Capriles V. A., “Antibacterial properties of tropical plants from
Puerto Rico”, Phytomedicine: international journal of phytotherapy and
phytopharmacology, 13, 272 – 276, 2006.

[19]

Mensah, J. L., Lagarde I., Ceschin C., Michel G., Gleye J., Fouraste I.,
“Antibacterial acitivity of leaves of Phyllanthus discoideus”, Journal of
Ethanopharmacology, 28, 129 -133, 1990.

[20]

Nguyen T. T., Duong T. H., Nguyen T. A. T., Bui X. H., “Study on the chemical
constituents of Phyllanthus acidus (Euphorbiaceae)”, Journal of Science and
Technology, 52(5A), 156-161, 2014.

[21]

Opong R. A., Nyarko A. K., Dodoo D., Gyang F. N., Koram K. A., Ayisi N. K.,
“Antiplasmodial activity of extracts of Tridax procumbens and Phyllanthus
Amarus in in vitro Plasmodium falciparum Culture Systems”, Ghana medical
journal, 45(4), 143-150, 2011.

[22]

P.K. Agrawal, Carbon-13 NMR of flavanoids, Central Institute of Medicinal and

Aromatic Plants, Lucknow, India, 1989.

[23]

Pettit G. R., Cragg G. M., Gust D., Brown P., Can. J. Chem., 60, 939, 1982.

[24]

Satish S., Raghavendra M. P., Raveesha K. A., “Antifungal potentiality of some
plant extracts against Fusarium sp.”, Archives of Phytopathology and Plant
Protection, 42(7), 618-625, 2009.

[25]

Sengupta, P., Mukhopadhyay J., “Terpenoids and related compds. VII.
Triterpenoids of Phyllanthus acidus”, Phytochemistry, 5(3), 531-4, 1966.

[26]

Sharmin M., Prangan D. B., Laboni P., Fouzia F. K. C., Sarak A., Mrityunjoy A.,
Tasmina R., Rqashed N, “Study of microbial proliferation and the in
vitro antibacterial traits of commonly available flowers in Dhaka Metropolis”,
Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2, 91-97, 2015.

[27]

Sumalatha D., “Antioxidant and Antitumor activity of Phyllanthus emblica in
colon cancer cell lines”, International Journal of current microbiology and applied
sciences, 2(5), 189-195, 2013.

[28]

Supaporn P., Marisa S., Jiraporn O., Roswitha S., Ana R., Andre S., Tiago G.,

Footer Page 25 of 161.