Khoá luận tốt nghiệp khảo sát thành phần hóa học lá cây kháo phoebe tavoyana

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA
HÓA HỌC
____________
•

TRẦN THỊ KIM GIANG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
LÁ CÂY KHÁO PHOEBE TAVOYANA

KHÓA LUÂN
TỐT NGHIẼP
ĐAI
HOC
•
•
•
•
Chuyên ngành: H óa hữu

Ctf

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. NGUYỄN VĂN BẰNG

HÀ N Ộ I-2 0 1 6


LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính ttọng và lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm
ơn đến thầy giáo PG S.TS NGUYỄN VĂN BẰNG đã định hướng và hướng
dẫn em tận tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo và các anh, chị cán bộ Viện
Hóa sinh biển đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện cho em được sử dụng các
thiết bị tiên tiến của viện để nghiên cứu,học tập và hoàn thành tốt đề tài khóa
luận tốt nghiệp của mình.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến TS.Phạm Hải Yến - Viện Hóa
Sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận
tình, hướng dẫn và giúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học - Trường
ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học
tập tại trường. Xin cảm ơn gia đình và tất cả các bạn bè đã động viên, khích lệ
giúp đỡ trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố
gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính
mong nhận được ý kiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy, cô.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Trần Thị Kim Giang


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong
khóa luận:

“Khảo sát thành phần hóa học lá cây Kháo Phoebe tavoyana”
Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn
trung thực và không trùng vói kết quả của tác giả khác.

Sinh viên

Trần Thị Kim Giang


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
M

Chú giải
Độ quay cực specific optical Rotation

d

13c -n m r

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

^-N M R

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Specữoscopy

COSY
2D-NMR

Chemical Shift Correlation Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều TwoDimensional NMR

cc

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

IIMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

HR-FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao
High Resolution Fast Atom Bombardment Mass
Spectrometry

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography


DANH M Ụ C CÁC BẢNG BIỂU , H ÌN H VẼ VÀ s ơ ĐỒ
Trang
Hình 1.1: Cây K h á o .................................................................................................. 3
Hình 1.2: Qủa Kháo ................................................................................................ 3

Hình 1.3: Flavan (2-phenyl chrom an).....................................................................7
Hình 1.4: Flavon và flavonol................................................................................... 8
Hình 1.5: Flavanonol-3.............................................................................................9
Hình 1.6: C hacol........................................................................................................9
Hình 1.7: Auron........................................................................................................ 10
Hình 1.8: Antoxianidin............................................................................................ 10
Hình 1.9: Leuoantoxiandin......................................................................................10
Hình 1.10: (+) Catechin........................................................................................... 11
Hình 1.11: (-) C atechin........................................................................................... 11
Hình 1.12: (+) Epicatechin......................................................................................11
Hình 1.13: (-) Epicatechin.......................................................................................11
Hình 1.14: 3-phenyl chrom an................................................................................ 11
Hình 1.15: Iso flavon............................................................................................... 11
Hình 1.16: Iso flavanon........................................................................................... 11
Hình 1.17: Rotenoid...............................................................................................11
Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana).......27
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các họp chất từ cặn nước của lá cây Kháo (Phoebe
tavoyana)................................................................................................. 28
Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học của họp chất 1 .......................................................30
Hình 4.1.2: Phổ *H-NMR hợp chất 1 ....................................................................31
Hình 4.1.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 1...................................................................32
Hình 4.1.4: Phổ HMBC và phổ HSQC hợp chất 1 ............................................. 33


Hình 4.2.1 : c ấ u trúc hóa học của hợp chất 2 ..................................................... 34
Hình 4.2.2: Phổ ^ -N M R hợp chất 2 ...................................................................35
Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 ................................................................. 36
Hình 4.2.4: Phổ DEPT hơp chất 2........................................................................ 37
Bảng 1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham k h ả o ................................. 33
Bảng 2: số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham k h ả o ................................. 37

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ s ơ ĐỒ
MỤC LỤC
MỞ Đ Ầ U ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cây Kháo.................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu về cây K h á o ......................................................................... 3
1.1.2. Phân bố, sinh th á i...................................................................................4
1.1.3. Hoạt tính sinh h ọ c ..................................................................................4
1.1.4. Công d ụ n g ...............................................................................................4
1.1.5. Thành phần hóa h ọ c ...............................................................................5
1.2. Giới thiệu về lớp chất ílavonoid................................................................7
1.2.1. Giới thiệu chung..................................................................................... 7
1.2.2 Các nhóm ílavonoid................................................................................8
1.3. Các phưcmg pháp chiết mẫu thực vật........................................................12
1.3.1. Chọn dung môi chiết............................................................................12
1.3.2. Quá trình chiết...................................................................................... 14
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các họp chất hữu cơ................15
1.4.1. Đặc điểm chung.................................................................................... 15
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc k í ........................................................... 16
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc k í......................................................16
1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các họp chất hữu c ơ . 21
1.5.1. Phổ hồng ngoại (IR ).......................................................................... 21

1.5.2. Phổ khối lượng (MS).......................................................................... 21
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)................................................. 22
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .............. 25
2.1. Đối tượng nghiên c ứ u ...............................................................................25
2.2. Phương pháp phân lập các họp chất.........................................................25
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (T L C )......................................................................25
2.2.2. Sắc kí cột (C C ).................................................................................... 25
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các họp c h ấ t...................25
2.4. Dụng cụ và thiết b ị ...................................................................................... 26
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết............................................................ 26
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các họp ch ất.. 26
2.5. Hoá chất.........................................................................................................26
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả ................................................ 27
3.1. Thu và xử lí m ẫ u ......................................................................................... 27
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các họp c h ấ t............................ 29
3.2.1. Hợp chất 1 .............................................................................................29
3.2.2. Hợp chất 2 .............................................................................................29
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ.............................................................. 30
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của họp chất 1 ...............................................30
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của họp chất 2 ...............................................34
KẾT L U Ậ N .............................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................41


M Ở ĐẦU

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa với địa hình ba phần tư là đồi
núi. Do có vị trí địa lý như vậy nênViệt Nam rất đa dạng về địa hình, kiểu đất,
cảnh quan, có đặc trưng khí hậu khác nhau giữa các miền. Đặc điểm đó là cơ
sở rất thuận lợi để giới sinh vật phát triển đa dạng về thành phần loài, phong

phú về số lượng. Theo ước tính số loài thực vật bậc cao ở nước ta có thể lên
đến 12000 loài, trong đó đã biết khoảng 4000 loài là cây thuốc mọc tự nhiên,
được nhân dân dùng làm thảo dược [3]. Chính vì thế mà các ngành y tế,
ngành hóa học và một số ngành khác ngày càng phát triển.
Hiện nay, các sản phẩm chiết xuất từ thiên nhiên ngày càng được con
ngưòi quan tâm và ứng dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không
làm tổn hại đến môi trường. Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng
60% - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang, được lưu hành hoặc trong giai
đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc thiên nhiên.
Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao,
con người đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu
các chất đã tách ra từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều họp chất
có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lọi cho việc phát
triển ngành y dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người. Chính vì vậy việc
nghiên cứu các thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý
nghĩa khoa học và thực tiễn cao.Từ đó mà các loài thực vật đang được các nhà
khoa học đặc biệt quan tâm.
Trong số đó,có cây Kháo (Phoebe tavoyana) hiện đang thu hút các nhà
khoa học nghiên cứu. Cây Kháo (Phoebe tavoyana) thuộc chi Phoebe thường
được phân bố ở Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên. Theo kinh
nghiệm dân gian lá cây Kháo dùng để tiêu mụn nhọt và thuốc sắc vỏ cây dùng

1


để trừ phong thấp. Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính
sinh học về một số họp chất ừong cây Kháo có khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng tiểu cầu và hoạt tính
chống ung thư [2,4].
Vì vậy, tôi chọn cây Kháo làm đối tượng nghiên cứu, với mục đích

nhằm góp phần làm rõ thêm những hiểu biết thành phàn hóa học của cây. Từ
đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng cây làm dược liệu trong chữa
bệnh và làm tăng thêm kho tàng tri thức về cây thuốc cổ truyền Việt Nam vói
đề tài khóa luận là: “Khảo sát thành phần hóa học lá cây Kháo Phoebe

tavoyana”
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Thu mẫu lá cây Kháo, xử lí mẫu và tạo dịch chiết
2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất hóa học từ lá cây Kháo.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các họp chất đã phân lập được.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Kháo
1.1.1. Giới thiệu về cây Kháo
Tên khoa học: Phoebe tavoyana
Tên tiếng việt: Cây Kháo (Sụ lá to, Bòi lời cơm).
Chi: Kháo (Phoebe)
Họ: Long não (Lauraceae).
Bộ: Long não (Laurales).
Lớp (nhóm): Cây gỗ nhỏ.

Hình 1.1: Cây Kháo

Hình 1.2: Quả Kháo

Cây Kháo (P. tavoyana) là loại cây gỗ nhỏ, cao 10 m, cành nhỏ, phủ
lông dày màu nâu chồi non có vảy, nhánh non có lông sét. Lá có phiến thon

gọn ở 2 đầu, hình mác ngược, dài 20- 27 cm, rộng 7 -1 3 cm, đầu nhọn, gốc
hình nêm, mặt trên nhẵn, mặt dưói có lông, có 8-11 đôi gân bậc hai. Cuống lá
dài 1,5- 2,5 cm, có lông.

3


Chùm tụ tán ở nách lá, hoa trắng, cụm hoa chùy ở đầu cành, dài 6 - 10
cm, phủ lông dày, cuống hoa dài 5 - 7 mm. Mảnh bao hoa 6, các mảnh của
vòng ngoài nhỏ hơn của vòng trong, phủ lông nâu. Nhị hữu thụ 9, 6 nhị ở hai
vòng ngoài không lông, 3 nhị vòng trong có lông, ở gốc chỉ nhị có hai tuyến
hình tim có chân. Nhị lép hình đầu mũi tên có lông. Quả hình cầu, đường kính
khoảng 1 cm.

1.1.2. Phân bố, sinh thái
Chi Kháo có khoảng 23 loài, phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Nhật
Bản, Triều Tiên. Cây thường mọc trong rừng lá rộng thường xanh nhiệt đới ở
độ cao 700- 2500 m. Ở nước ta, cây Kháo phân bố ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc và
Như Xuân, Thanh Hóa. Ngoài ra, còn phân bố ở Ấn Độ, Malaixia, Myanmar,
Lào, Thái Lan, Inđônêxia [4].
Nó thường mọc rất rải rác dưới tán rừng mưa nhiệt đới thường xanh
mưa mùa ẩm, ở độ cao khoảng 300 m trở lên, cùng với một số loài của các họ
khác như Na (Ảnnonaceae), Đậu (Fabaceae), Thầu Dầu (Euphoriaceae)...
Cây thường tái sinh bằng hạt, mùa quả chín tháng 12. Đây là nguồn gen
quý, hiếm có thể bị đe dọa bị tuyệt chủng do thu hẹp môi trường sống. Mức
độ đe dọa: bậc K [7].

1.1.3. Hoạt tính sinh học
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của
aporphin ancaloit có trong cây Kháo. M ột số aporphin ancaloit có khả năng

kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng
tiểu cầu và hoạt tính chống ung thư. Các hợp chất này được tìm thấy trong các
loài của chi Kháo (p.pittier, p. chinensis. ..) [5].

1.1.4. Công dụng
Theo kinh nghiệm dân gian thì lá của cây được dùng để tiêu mụn nhọt
và nước sắc vỏ cây được dừng để trừ phong thấp [4].

4


Theo Đông y, các bộ phận của cây đều có tác dụng làm thuốc.vỏ giã nát
dừng đắp lên những nơi sưng, bỏng, vết thương, có nơi dừng cả lá giã đắp. v ỏ
còn dùng sắc nước uống chữa đi ỉa, lị. Nước ngâm vỏ mùa thành từng mảnh
mỏng có thể dùng bôi dầu cho tóc bóng. Dầu dùng làm sáp, chế xà phòng...
Ngoài ra, gỗ Kháo dễ gia công và được sử dụng làm ván lạng, cột, con
tiện, chạm khảm, đồ mộc, diêm, dùng trong xây dựng, điêu khắc.

1.1.5. Thành phần hóa học
Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về cây Kháo. Trên
Tạp chí Hóa học (2005), GS. Nguyễn Văn Hừng và GS. Nguyễn Văn Tuyến
[5] đã công bố 7 hợp chất ancaloit phân lập từ vỏ thân cây Kháo (Phoebe

tavoyana) là: corydin (1), pronuciferin (2),anonain (3),norcorydin (4),
stepharin (5), N-metyllaurotetenin (6), N- metyllaurolitsin (7).

Cho đến nay, thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về các loài trong
chi Kháo (p.molocella, p. pỉttier, p.lanceolata , p. valeriana, p. grandis, Phoebe

chekiangensis ...) thuộc họ Long não. Người ta đã phân lập và xác định cấu

trúc của rất nhiều aporphin ancaloit từ các chi này [11, 12, 17, 18-21].

5


Từ vỏ thân cây của loài Phoebe grandis, 4 hợp chất dạng ankaloit
khung aporphin là boldine (8), norboldine (9), laurotetanine (10) và
lindecarpine (11) được phân lập và xác định cấu trúc [15]. Dịch chiết
methanol từ vỏ thân cây Phoebe grandis cho thấy chúng có khả năng ức chế
quá trình sản xuất oxi hoạt động in vitro [17].

Từ dịch chiết methanol quả của loài Phoebe chekiangensis, 4 ancaloit: 5hydroxy-indoline (12), tyramine (13), N-noramiepavine (14), và tetrahydroisoquinoline
glycozit (15) đã được phân lập [21].

HO

HO

Từ thân loài Phoebe pittier, 2 ankaloit mới là l,2,3-trimethoxy-9,10methylenedioxynoraporphine (16)và 10-hydroxy -1,2,9-trimethoxynoraporphine
(noraporphine) (17) cùng với 2 hợp chất đã biết là norpurpureine (18) và
reticuline (19), đã được phân lập [19].

6


1.2. Giói thiệu về lớp chất Aavonoid
1.2.1. Giới thiệu chung
Các ílavonoid là lớp chất phổ biến trong thực vật. Chúng là hợp chất
được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B được kết nối bởi 1 dị vòng c với
khung các bon c 6 - c 3 - c 6.

Các ílavonoid là dẫn xuất của 2 - phenyl chroman (ílavan).
2'

3'

Flavan (2- phenyl chrom an)

Hình 1.3: Flavan (2- Phenyl chroman)
Trong thực vật, flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp hai
lá mầm. Động vật không tự tổng hợp được ũavonoid, nhưng có thể lấy
flavonoid từ nguồn thức ăn.
Trong thực vật bậc thấp, flavonoid ít gặp hơn. Trong ngành rêu, chỉ
phát hiện được rất ít chất. Trong dương xỉ, số lượng flavonoid ít hơn nhưng
có mặt các nhóm: anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon,
dihydrochalcon
Ngành hạt trần có mặt các nhóm: anthocyanidin, leucoanthocyanidin,
flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần khác
biệt với thực vật bậc thấp và hạt kín ở chỗ có sự hiện diện của nhiều dẫn chất
biflavonoit.
Các flavonoid có ở trong tất cả các bộ phận của cây, bao gồm quả,
phấn, hoa, rễ... Một số flavonoid có hoạt tính sinh học thể hiện ở khả năng
chống oxi hóa. [1,13,16]

7


1.2.2 Các nhóm flavonoid
Hơn 5000 ílavonoid tự nhiên được đặc trưng bởi nhiều loại thực vật
khác nhau và được phân loại theo cấu trúc hóa học, và thường được chia
thành các phân nhóm sau đây [6,8,9,10,13,16]

1.2.2.1. Flavon vàflavonol
Nhóm ílavon và ílavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3. Công thức
cấu tạo của họp chất như sau:

Hình 1.4: Flavon và flavonol
Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các
nhóm hydroxi liên kết vói các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất
khác nhau.
Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng
tự do mà thường dưới dạng glycozit.

ồ
Flavanon

Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcol do vòng
dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcol.

8


[O H ]J

[H ]

7.2.2.2. Flavanonol - 3
Flavanonol-3 có 2 nguyên tử cacbon bất đối là C-2 và C-3 nên chúng có
tính quang hoạt. Các hợp chất thường gặp là aromadendrin, íustin và taxiíolin.

Hình 1.5: Flavanonol - 3

1.2.2.3. Chacol
2

Chacol khác với các loại Havonoid
khác là nhóm chacol có phân tử gồm hai vòng

4' /

V

3

’

4

benzen A và B được nối với nhau bởi một

6

5

mạch hở có 3 nguyên tử cacbon, số thứ tự các
o

nguyên tố được bắt đầu đánh từ vòng B.

Chalcol

Hình 1.6: Chacol

Hiện nay người ta biết đến khoảng 20 họp chất Chalcol, ngoài ra còn
thấy hợp chất dihydrochalcol. Tuy vậy, giữa chalcol và dihydrochalcol hầu
như không có mối quan hệ khăng khít nào. Chalcol có thể bị đồng phân hoá
thành ílavanon khi đun nóng với axit clohydric (HC1).

1.2.2.4. Auron
Auron là họp chất có vòng c là một dị vòng 5 cạnh. Công thức cấu tạo
chung của nhóm auron như sau:

9


Hình 1.7: Auron
Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng
Shinoda (phản ứng định tính Aavonoit). Trong tự nhiên, các chalcol - glycozit
dễ bị oxy hóa thành auron - glycozit nên hai nhóm chất này tồn tại cạnh nhau.
Các auron - glycozit hay xuất hiện trong họ Cúc.

1.2.2.5. Antoxianidin
Antoxianidin thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong
nước. Công thức chung như sau:

Antoxỉanỉdỉn

Hình 1.8: Antoxỉanidỉn
1.2.2.6. Leucoantoxỉanidỉn
Leucoantoxianidin còn gọi là Aavan - 3,4 -diol. Các hợp chất này mới chỉ tìm
thấy ở dạng aglycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit.

,

.
1.2.2.7. Catechin

Hìnhl.9:Leucoantoxiandin

Catechin là các dẫn xuất ũavan - 3 - ol. Do đó hai trung tâm cacbon
bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang. V í dụ như

10


các cặp catechin và epicatechin.Trong đó chỉ có (+) - catechin và (-) epicatechin xuất hiện trong thiên nhiên.

Hình 1.10: (+) Catechin

Hình 1.11: (-) Catechin

.OH
HO.

“

^

Hình 1.12: (+) Epicatechỉn

Hình 1.13: (-) Epỉcatechin

I.2.2.8. Isoýlavonoid
Isoílavonoid bao gồm các dẫn xuất của 3 - phenyl chroman, được chia

thành các nhóm như sau:
OR

RO n

o
Iso flavon

3- p h en y l ch ro m an

Hình 1.14: 3-phenyl chroman

Hình 1.15: Iso ỉlavon

Iso

fla v a n o n

Hình 1.16: Iso ílavanon

1.2.2.9. Rotenoid và neoflavonoid
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ vói các isoflavon về mặt cấu trúc
cũng như sinh tổng họp. Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử
cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai. Công thức như sau:

Hình 1.17: Rotenoid
11


1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.

1.3.1. Chọn dung môi chiầ
Trong quá trình chiết các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây thường có
độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan ừong nước lại ít
được quan tâm vì vậy dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa
chọn cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất
lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu
được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi
như các diankyl phtalat, tri - n - butyl - axetylcitrar và tributylphosphat. Những
chất này có thể lẫn vói dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo
quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh
học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen clorit và
methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ
bộ một phàn của cây như: lá, thân, rễ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroữom như CH2Ơ 2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng

12

có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các họp
chất khác. Chloroữom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm
việc với chất này càn được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroírom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chloroữom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các họp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ ừechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1 - hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dừng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các họp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trường axit. Quá
trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dừng với quá trình phân

13

tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể tạo
thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích họp
cho quá trình chiết, ừánh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình
tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30 - 40°c, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hom.

1.3.2. Quá trình chiầ
Hầu hết quá trình chiết đom giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
Trong đó, chiết ngâm là một ừong những phương pháp được sử dụng
rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công
sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở
dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi.
Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn.
Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có
thể dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định
bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:

14


- Khi chiết các alcaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của họp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Dragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy
ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này ừong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid ừ ợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các họp chất hữu cơ
Phưong pháp sắc kí (Chromatography) là một phưong pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các họp chất
hữu nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

1.4.1. Đặc điểm chung
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác
nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha:
pha động và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn họp sẽ phân bố giữa tính chất

của chúng (tính bị hấp phụ, tính ta n ...) tương ứng với pha động và pha tĩnh.
Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết vói
một pha tĩnh có sự khác nhau. Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả

15


năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác
nhau của các chất ở pha động vói các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực với pha động và pha tĩnh khác nhau.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này
đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phi và phản hấp phụ. Kết
quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ
thống sắc kí nhờ vào đặc điểm trên.

1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
động và pha tĩnh.ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử
đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh
với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần):

n =

n.,-b.c
l+b.c

Trong đó
n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đại cân bằng.
U»: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b: Hằng số.

C: Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong các phương pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay
lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
• Theo bản chất của hai pha sử dụng:
- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử
lý, nó có thể nạp vào trong một cột.

16


+ Pha tình là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt
một chất mang.
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha động là chất lỏng: Ví dụ trong kỹ thuật sắc kí giấy, sắc kí lớp
mỏng, sắc kí cột.
+ Pha động là chất khí: Ví dụ trong lã thuật sắc kí khí. Trong trường
họp này chất khí được gọi là khi mang hay khí vectơ.
• Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình phân tách chất.
- Sắc kí phân chia (partition chromatography).
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (Uong sắc kí khí).
+ Pha tinh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất
lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc kí hấp thụ (Adsorption chromatography).
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí,
+ Pha tinh là chất rắn: Đó là những hạt rang nhuyễn mịn, có tính
ừơ,được nối trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tinh, pha tình thường sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.

- Sắc kí trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tinh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa
học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Be mặt của các hạt mang các nhóm chức hóa
học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc kí lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration
chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tinh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên
bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc kí ái lực (arrinicy chromatography)

17