Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam (TTLA tiến sĩ)

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN HUY HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY BÌNH BÁT
(Annona reticulata L.) Ở VIỆT NAM

Chun ngành: HĨA HỮU CƠ
Mã số: 62. 44. 01. 14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2016


2

Cơng trình được hồn thành tại:
Phịng thí nghiệm Chun đề Hữu cơ, khoa Hóa học,
Trường Đại học Vinh

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Trần Đình Thắng
2. GS. TS. Yang-Chang Wu

Phản biện 1: PGS. TS Đặng Ngọc Quang

Phản biện 2: PGS. TS Đỗ Quang Huy

Phản biện 3: PGS. TS Hoàng Văn Lựu

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp
tại:
vào hồi …… giờ …… phút, ngày …… tháng …… năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Quốc gia Việt Nam
2. Trung tâm Thông tin & Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường
Đại học Vinh


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Họ Na (còn gọi là họ Mãng cầu - Annonaceae Juss) là họ lớn có
khoảng 135 chi và khoảng 2500 lồi [5]. Phân bố ở vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới. Trung tâm đa dạng nhất của họ Na (Annonaceae) là vùng
nhiệt đới Indo-Malaysis và nhiệt đới châu Mỹ. Có một vài lồi phân bố
khắp các lục địa như: Xylopia được tìm thấy ở Trung và Nam Mỹ, châu
Phi, Madagascar, châu Á và châu Úc. Họ Na (Annonaceae) hiện đã biết
khoảng 34 chi và khoảng 900 loài ở châu Mỹ, 42 chi và 450 loài ở châu
Phi và Madagascar, 51 chi và 950 loài ở châu Á và châu. Họ Na
(Annonaceae) ở việt Nam hiện đã biết 183 loài, 2 phân loài và 21 thứ.
Về phương diện kinh tế, họ Na có giá trị kinh tế quan trọng, là
nguồn cung cấp quả ăn được; dầu hạt của một số loài được sử dụng để
sản xuất dầu ăn, xà phịng; vỏ của một số lồi được sử dụng sản xuất
rượu. Mùi thơm của loài Cananga odorata là nguyên liệu quan trọng

dùng trong nước hoa.
Về phương diện y học, một số loài đã được sử dụng trong y học cổ
truyền để điều trị nhiều bệnh khác nhau: mụn nhọt, mất kinh, hen suyễn,
ho, chướng bụng, chứng khó tiêu, bệnh sốt, ngộ độc, chứng phong thấp,
bệnh ghẻ, viêm da, đau răng, vết thương và lở loét nhỏ, chống co thắt, trị
rắn cắn, diệt sâu bọ. Rễ của một số loài được sử dụng để điều trị bệnh
tiêu chảy, kiết lỵ, đau dạ dày.
Trong y học hiện đại, từ năm 1982 họ Na bắt đầu được quan tâm
đặc biệt bởi các nhà khoa học bằng việc phát hiện lớp chất acetogenin có
hoạt tính kháng u, chống ung thư, chống oxi hóa, kháng HIV với liều
lượng thấp, và có tính chọn lọc cao do đó tác dụng phụ rất ít [11]. Ngoài


2
acetogenin, rất nhiều cơng trình nghiên cứu đã cho thấy nhiều lớp chất
có hoạt tính kháng u, kháng khuẩn, chống sốt rét mạnh mẽ.
Chi Na (Annona) có khoảng 125 lồi, mọc hoang dại ở châu Mĩ,
châu Phi, châu Á như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Cambuchia, Lào
và Việt Nam. Việt Nam có 4 lồi, trong đó có ba lồi là cây trồng gồm:
Annona squamosa L., Annona muricata L., Annona reticulata L. (bình
bát), Annona glabra L.; nhiều cơng trình nghiên cứu trong và ngoài
nước về ba loài Annona squamosa L, Annona muricata L, Annona
glabra L chứng minh rằng các loài này đều có hoạt tính sinh học q
giá: chống viêm khớp, kháng ung thư, chống co giật, trị đái tháo đường,
giảm mỡ máu, chống viêm, chống oxi hóa, hạ huyết áp, chống kí sinh
trùng, chống sốt rét, diệt cơn trùng, chống co thắt dạ dày - môn vị, chữa
lành vết thương. Một số sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng đã được
nghiên cứu ứng dụng trên thị trường có nguồn gốc từ các lồi này.
Tuy nhiên, lồi bình bát (Annona reticulata L.) chưa nhận được
nhiều sự quan tâm nghiên cứu của giới khoa học. Số lượng các cơng

trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi này
cịn khiêm tốn về số lượng và chất lượng, ở Việt Nam chưa có nhiều
nghiên cứu về lồi này. Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học của
lồi cây này giúp đánh giá được giá trị của nguồn tài nguyên thiên nhiên
của nước ta. Kết quả nghiên cứu về loài cây này sẽ mang lại ý nghĩa to
lớn đối với ngành dược liệu trong nước và thế giới. Với ý nghĩa thực tiễn
và cấp thiết như vậy nên chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học cây bình bát (Annona reticulata
L.) ở Việt Nam.
.


3
2. Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu là lá và hạt bình
bát (Annona reticulata L.) thuộc họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong luận án này, chúng tơi có các nhiệm vụ:
- Chiết chọn lọc với các dung mơi thích hợp để thu được hỗn hợp
các hợp chất từ lá và hạt bình bát (Annona reticulata L.).
- Sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lập
các hợp chất.
- Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất
thu được.
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất tinh khiết phân lập
được từ lá và bình bát.
4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô
ở 400C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với
các dung mơi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho
nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.

- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất:
đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng
(TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel,
sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha
đảo và pha silica gel.
- Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất: Cấu trúc hoá học
các hợp chất được phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý
hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va
chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS),
phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân


4
một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D NMR) với các kỹ thuật khác
nhau như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC
đã được sử dụng.
- Cấu trúc lập thể tương đối và tuyệt đối của các hợp chất này được
xác định bằng các phản ứng hoá học và các phương pháp phổ NMR với
các kỹ thuật NOE, NOESY.
- Thăm dò tác động ức chế sự sản sinh NO đối với dòng tế bào đại
thực bào chuột RAW 264.7
5. Những đóng góp mới của luận án
Đây là cơng trình nghiên cứu về thành phần hố học và hoạt tính
sinh học của một số chất phân lập được từ lá và hạt cây bình bát
(Annona reticulata) lần đầu tiên ở Việt Nam.
1. Từ phần tan trong hexane

và ethyl acetate của dịch chiết

methanol lá của cây bình bát (Annona reticulata) đã phân lập và xác

định cấu trúc 12 hợp chất:
+ 1 hợp chất triterpenoid mới: Annonaretin A (ARLE1); 3 hợp
chất triterpenoid lần đầu được phân lập từ lá cây bình bát: taraxasterol
(ARLE3), taraxerol (ARLH3), uvaol (ARLE4);
+ 2 hợp chất sterol: β-sitosterol (ARLH4), 6β-hydroxystigmast-4en-3-one (ARLH6). ARLH6 lần đầu tiên phân lập từ chi Annona.
+ 4 hợp chất diterpenoid: axit kaurenoic, axit 17-acetoxy-16βhydroxy-ent-kauran-19-oic (ARLH7), axit 16α-hydro-ent-kauran-17,19dioic

(ARLE1), axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5).

Trong đó, các hợp chất này phần đầu tiên phân lập từ cây này.
+ 2 hợp chất flavonoid: (2S)-di-O-methylquiritigenin (ARLE2),
rutin (ARLE5). ARLE2 lần đầu tiên phân lập từ chi Annona.


5
2. Từ phần tan trong ethyl acetate của dịch chiết methanol của hạt
cây bình bát (Annona reticulata) phân lập được 10 hợp chất:
+ 2 hợp chất acetogenin: uvarigrandin A (ARSE1), cis-reticulatacin-10one (ARSE2).
+ 1 hợp chất amin béo: N- (Triacontanoyl)tryptamin (ARSE3);
+ 2 hợp chất triterpenoid: axit rotundic (ARSE4) và pedunculoside
(ARSE5);
+ 2 hợp chất sterol: β-sitosterol (ARSE6) và β-sitosteryl-3-O-β-Dglucopyranoside (ARSE7);
+ 3 hợp chất dẫn xuất của benzen là: sinapaldehyde glucoside
(ARSE8); eleutheroside B (ARSE9); axit vanilic (ARSE10);
Các hợp chất ARSE4, ARSE5, ARSE8, ARSE9 lần đầu tiên phân
lập được từ chi Annona. Hai hợp chất ARSE1 và ARSE2 lần đầu tiên phân
lập từ cây này.
3. Các hợp chất ARLH2, ARLH3 và ARLH5, ARLH6, ARLH7,
ARLE1 có khả năng ức chế sự sản sinh NO với các giá trị IC50 trong
khoảng 48,6 ± 1,2 và 99,8 ± 0,4 μM. Hợp chất ARLH5 cho thấy tác

động ức chế đáng kể đối với sự sản sinh NO với giá trị IC 50 nhỏ nhất là
48,6 ± 1,2 μM. Đây là lần đầu tiên các hợp chất được thử nghiệm khả
năng ức chế sự sản sinh NO đối với tế bào của tế bào RAW 246.7.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm 149 trang với 34 bảng số liệu, 22 hình và 5 sơ đồ
với 189 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (3 trang),
tổng quan (32 trang), phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật thực nghiệm
(23 trang), kết quả và thảo luận (71 trang), kết luận (1 trang), danh mục
cơng trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (18 trang). Ngồi ra cịn
có phần phụ lục gồm 134 phổ của một số hợp chất chọn lọc.


6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung:
1. Giới thiệu về họ Na (Annonaceae)
- Đặc điểm thực vật họ Na.
- Các hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ chi na
(Annona).
2. Giới thiệu về loài Annona reticulate L. : đặc điểm chung về hình thái,
thành phần hóa học, hoạt tính sinh học.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Mẫu lá và hạt cây bình bát thu hái ở Tiền Giang vào tháng 3/2010
và 11/2011 được PGS. TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật định danh, tiêu bản (Viet-TSWu-20101015) được lưu
giữ tại khoa Sinh, Trường Đại học Vinh.
Mẫu được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm, rửa sạch, sấy
khơ tự nhiên ở điều kiện thường. Mẫu khô được xay nhỏ để quá trình

ngâm chiết đạt hiệu suất cao.
2.1.2. Các phương pháp phân lập các hợp chất
Để phân tích và phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp
như:
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel
Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm. Hiện hình bằng đèn tử ngoại (UV) ở bước
sóng 254 nm và 365 nm, kế tiếp hiện màu với hơi iot đến khi quan sát
thấy xuất hiện vệt màu hoặc hiển thị bằng dung dịch H2SO4 10% ở 1100 C
cho đến khi xuất hiện vết than đen tại vị trí có vết chất.


7
Sắc ký cột thường (CC)
Các cao chiết được phân lập bằng các phương pháp sắc kí trên cột
thơng thường với pha tĩnh là chất hấp phụ silica gel 0,063 ÷ 0,200 mm
và 0,04 ÷ 0,063 mm (Merck). Kích thước cột khác nhau: 150 x 10 cm;
120 x 8 cm; 120 x 5 cm; 110 x 5 cm; 100 x 4 cm; 90 x 4 cm; 80 x 3,5
cm; 60 x 3,5 cm; 60 x 3 cm; 80 x 2cm và sắc kí cột pha đảo RP-18 với
kích thước cột 80 x 2 cm; 50 x 1,5 cm.
Các phương pháp kết tinh.
Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa
tan vào một hoặc một hỗn hợp dung mơi. Trong q trình để n để
dung mơi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ kết tủa hoặc kết tinh
trước. Lọc lấy phần tinh thể thô và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh
khiết. Phần dung dịch cịn lại có thể để bay hơi dung mơi và kết tinh để
tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt
độ để q trình kết tinh hiệu quả hơn. Dung mơi dùng để hịa tan trong
q trình kết tinh phân đoạn thường là một dung mơi nhưng cũng có thể
là một hỗn hợp 2 hay 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh.

2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
phân lập được là sử dụng kết hợp các thông số vật lý với các phương
pháp phổ hiện đại gồm:
2.1.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện
Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3.2. Độ quay cực ([α]D)


8
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY
polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.1.3.3. Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) được đo trên máy Brucker
Dailtonics APEX II 30eV spectrometer của khoa Dược, Trường Đại học
Y Trung Quốc, Đài Loan và máy micr OTOF-QII 10187 thuộc Phịng
Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hồ Chí Minh.
2.1.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR đo trên máy Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội
là TMS), tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR,13C-NMR và
DEPT.
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và
NOESY.
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6,

CD3OD, CDCl3. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của
từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hịa tan hồn tồn mẫu thử.
2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính kháng viêm
Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất đuợc đánh giá dựa trên khả
năng ức chế sự sản sinh NO trong điều kiện đại thực bào RAW 264.7
được kích thích với LPS.
2..2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất phân lập được từ lá bình bát
2.2.1. Chiết xuất, phân lập


9
Lá (5,0 kg), được phơi khơ, xay nhỏ đạt kích thước 1,5x1,5 mm và
ngâm với metanol ở nhiệt độ phòng 7 ngày (20L x 3 lần). Dịch chiết
được cất loại dung môi thu được cao metanol (316 g). Phân bố cao
metanol trong 1L nước cất, sau đó chiết lần lượt với n-hexane (1L x 5),
etyl axetate (1L x 5), butanol (1L x 5), rồi cất loại dung môi các dịch
chiết thu được 31 g cao n-hexane, 82 g cao etyl acetate, 47 g cao
butanol và 52 g cao từ dịch nước.
Cao n-hexane được sắc ký cột silica gel với dung môi rửa giải nhexane - acetone thu được 14 phân đoạn, ký hiệu ARLH-1 đến ARLH14.
Cao chiết ethyl acetate được sắc ký cột silica gel với dung môi rửa
giải chloroform - methanol gradient từ 20:1 đến 5:1 thu được tám phân
đoạn, kí hiệu ARLE-1 đến ARLE-8.
Lá cây bình bát
(5,0 kg).
- Ngâm với metanol. Cất thu hồi metanol
Cao methanol
(316 g).
- Phân bố trong nước
- Chiết với n-hexane, thu hồi n-hexane
Cao n-hexane

(31g)
Dịch nước
- Chiết với etyl acetate
- Thu hồi etyl acetate

Cao etyl axetate
(82g)

Dịch nước
- Chiết với butanol
- Thu hồi butanol

Dịch nước

- Cất loại nước

Cao butanol
(47g)
Cao dịch nước
(52 g)

Sơ đồ 2.1: Chiết xuất các hợp chất trong lá cây bình bát


10
Cao n-hexane
31 g

ARLH-1

ARLH-2

H/A 25:1
ARLH2
968 mg

ARLH-3

ARLH-4

H/A 15:1 H/A 15:1
9:1

ARLH3
78 mg

ARLH4
302 mg

ARLH-5

H/A 15:1

ARLH5
26 mg

ARLH-6

H/A 9:1

ARLH6
31 mg

ARLH-9

H/A 7:1 H/A 7:1
5:1

ARLH7
22 mg

ARLH1
789 mg

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao n-hexane lá bình bát
Cao ethyl acetate
82 g

ARLE-1

ARLE-2

ARLE-3

ARLE-4

ARLE-5

N/A 9:1

C/M 9:1, 5:1

ARLE1
38 mg

ARLE-2-1

ARLE-6

ARLE2
23 mg

H/A 15:1, 9:1, 6:1, 4:1, 2:1
ARLE-2-2

ARLE-2-3
H/A 9:1, 6:1, 4:1, 2:1

H/A 8:1
ARLE-3-1

ARLE-3-2

ARLE-3-3

ARLE-3-4

ARLE3
14,3 mg
H/A 6:1

ARLE4
17,4 mg

H/A 4:1
ARLE5
21,4 mg

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate lá bình bát


11
2.2.2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ hạt bình
bát
Hạt bình bát rửa sạch, sấy khơ ở 40oC được 3kg, sau đó xay dập để tạo
điều kiện thn lợi cho q trình trích ly rắn lỏng. Mẫu sau khi xay được chiết
với methanol trong thời gian 7 ngày (3 x 5L), dịch chiết được cất thu hồi dung
môi thu được 184 g cao chiết methanol. Cao chiết methanol được hòa vào 1L
nước cất, chiết lần lượt với các dung môi n-hexane (3 x 1L), ethyl acetate (5 x
1L), butanol (3 x 1L) thu được các dịch chiết tương ứng, các dịch chiết được
cất thu hồi dung môi thu được 10 g cao n-hexane, 94,5 g cao ethyl acetate và 12
g cao butanol. Các cao chiết n-hexane và butanol thu được q ít nên khơng
tiến hành phân lập. Cao ethyl acetate tiến hành sắc ký cột silica gel bằng
gradient nồng độ với dung môi rửa giải n-haxane - acetone 50:1, 30:1, 25:1,
20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1 (v/v), thu được 8 phân đoạn, ký hiệu từ ARSE-1
đến ARSE-8.
Hạt cây Bình bát(3,0 kg).
Ngâm với metanol. Cất thu hồi metanol
Cao metanol (184 g)
- Phân

bố trong nước. Chiết với n-hexane
- Thu hồi n-hexane
Cao n-hexane
(10 g)
Dịch nước
Chiết với ethyl acetate
- Thu hồi etyl acetate

Cao etyl axetate
(94,5g)

Dịch nước
Chiết với butanol
- Thu hồi butanol

Cao butanol
(12 g)

Dịch nước

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ chiết xuất hạt bình bát


12
Cao ethyl acetate
94,5 g
H/A 50:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1

ARSE-1
1,8 g

ARSE-2
3,2 g

ARSE-3
4,7 g

ARSE-4
4,1 g

ARSE-5
3,4 g

ARSE-6
2,7 g

ARSE-7

H/E 20:1, 15:1, 9:1

ARSE-2-1

ARSE-2-2
0,7 g
H/E 15:1
ARSE6
34 mg

D/M 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1

ARSE-2
0,45 g

ARSE-4-1

H/E 9:1

ARSE-4-2
0,35 g

ARSE-4-3

ARSE-3-2
0,34 g

ARSE7
21 mg

H/E 8:1
ARSE8
17 mg

ARSE-3-3
0,42 g
H/E 6:1
ARSE9
11,5 mg

ARSE-6-1

ARSE-6-2
0,57 g

ARSE-6-3

D/M 4:1

H/E 4:1

ARSE-6-2-1
25 mg

ARSE3
12,1 mg

H/E 15:1, 9:1, 6:1, 2:1

ARSE-3-1

ARSE-8

D/M 20:1, 15:1, 10:1, 6:1, 4:1
ARSE-3-4
0,47 g
H/E 4:1
ARSE10
13,1 mg

ARSE-5-1

ARSE-5-2
0,43 g

D/M 10:1
ARSE4
21 mg

ARSE-5-3
0,52 g

D/M 7:1
ARSE5
14,3 mg

Sơ đồ 2.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ hạt bình bát

ARSE-5-4

RP-18, MeOH
ARSE1
11,3 mg

ARSE2
13,2 mg


13

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và xác định cấu các hợp chất từ lá bình bát

3.1.1. Phân lập hợp chất
Quá trình phân lập các chất từ lá cây bình bát đã được trình bày cụ thể ở
phần thực nghiệm. Trong q trình nghiên cứu chúng tơi đã tập trung nghiên
cứu thành phần hoá học từ dịch chiết metanol của lá cây bình bát bằng cách kết
hợp các phương pháp chiết xuất, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp
với từng phân đoạn.
Kết quả của quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các hợp chất phân lập từ lá bình bát
TT Ký hiệu
Tên hợp chất
CTPT
C33H56O3
1
ARLH1 annonaretin A (chất mới)
C20H30O2
2
ARLH2 axit kaurenoic
C30H50O
3
ARLH3 Taraxerol
C29H50O
4
ARLH4 β-sitosterol
C20H30O3
5
ARLH5 axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic
C29H48O2
6
ARLH6 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on

C20H32O3
7
ARLH7 axit 16β-hydroxy-17-acetoxy--ent-kauran-19-oic
C20H30O4
8
ARLE1 axit 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic
C17H16O4
9
ARLE2 (2S)-di-O-methylquiritigenin
C30H50O
10 ARLE3 Taraxasterol
C30H50O2
11 ARLE4 Uvaol
C27H30O16
12 ARLE5 Rutin
3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất ARLH1 (Chất mới)
Hợp chất ARLH1 là chất bột khơng màu, điểm nóng chảy 120-121°C.
Phổ khối luợng phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử [M+Na]+
m/z 523,4122 (C33H56O3Na theo tính tốn m/z là 523,4127) tuơng ứng với
công thức C33H56O3.
Trong phổ 1H-NMR, có 7 nhóm methyl gồm: 5 tín hiệu singlet ở δH 0,82
(3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-21), 0,97 (3H, s, CH3-22), 0,98 (3H, s, CH319) và 1,60 (3H, s, CH3-30) và hai tín hiệu doublet ở δH 0,80 (3H, d, J = 9,5
Hz, CH3-32) và 0,93 (3H, d, J = 6,0 Hz, CH3-33). Đặc biệt, hai tín hiệu doublet
của proton cyclopropyl ở δH 0.40 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-20) và 0,62 (1H, d, J =
4,5 Hz, H-20) từ đó cho ta dự đốn đây là một dẫn xuất triterpen có kiểu khung
cycloartanol.
Phổ 13C-NMR cho thấy có tổng số 33 nguyên tử carbon trong phân tử,
bao gồm một nhóm methylen cuối mạch (δC 111,9, 147,4), ba carbon gắn với

14
oxy (δC 62,8, 71,0, 83,2) và 7 nhóm methyl (δC 15,1, 18,1, 19,0, 19,3, 20,7,
21,3, 25,7).
Ngoài ra, trong vùng truờng thấp có 4 tín hiệu của proton liên kết với
carbon gắn với oxy ở δH 3,01 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3), 3,54 (1H, dd, J = 11,0,
6,0 Hz, H-24), 3,64 (1H, br dd, J = 16,0, 9,0 Hz, H-2), và 3,70 (1H, br d, J =
11,0 Hz, H-24) đuợc gắn với C-2, C-3, và C-24 xác định bởi các tương tác xa
của H-2 với C-3 (δ 83,2), C-4 (δ 40,3); H-3 với C-1, C-2, C-4, và C-18; H-24
với C-23, C-25. Vị trí của nhóm methylen cuối mạch tại δH 4,64 (1H, br s, H29) và 4,77 (1H, br s, H-29) cũng đuợc xác định dựa trên phổ HMBC thông
qua sự tương tác giữa H-29 và C-27, C-30. Trong phổ HMBC, có sự tuơng tác
xa của H-32 và C-33, C-31, C-27; H-33 và C-32, C-31, C-27, cho thấy rằng
nhóm isopropyl đuợc liên kết với C-27. Các tín hiệu doublet vùng trường cao ở
δH 0,40 và 0,62 cho thấy mối tuơng tác xa với các nguyên tử C-1, C-11, và C-5
khẳng định sự có mặt của nhóm cyclopropyl như C-20 nối với C-9 và C-10. Số
liệu phổ cộng hưởng từ của hợp chất ARLH1 được xác định trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất ARLH1
C

DEPT

1
2
3
4

CH2
CH
CH
C

5

CH

6

CH2

7

CH2

8
9
10

CH
C
C

11

CH2

12
13
14

CH2
C

C

15

CH2

16
17
18
19
20

CH2
CH
CH3
CH3
CH2

ARLH1
δH
1,53 (2H, m)
3,64 (1H, dt, 9,5; 6,5 Hz)
3,01 (1H, d, 9,5 Hz)
1,38 (1H, dd, 12,0; 3,5
Hz)
1,58 (1H, m)
0,79 (1H, m)
1,35 (1H, m
1,10 (1H, m)
1,53 (1H, m)

2,02 (1H, m)
1,16 (1H, m)
1,31 (2H, m)

1,66 (1H, m)
1,60 (1H, m)
1,64 (1H, m)
1,42 (1H, m)
0,82 (3H, s)
0,98 (3H, s)
0,61 (1H, d, 4,0 Hz)

δC
39,7
71,0
83,2
40,4

HMBC
H→C
C-2, C-3, C-5, C-20, C-9
C-1, C-3
C-1, C-4, C-18, C-19

47,1

C-18, C-20, C-4, C-9

20,9

C-5, C-10, C-7, C-4, C-8

25,7
47,7
25,1
19,2

C-9, C-20, C-10, C-5

26,5

C-10, C-20, C-9

35,3
45,1
48,7

C-13, C-21

31,8

C-13, C-22, C-16

26,8
43,1
15,1
25,7
29,7

C-13,
C-12,
C-4, C-5, C-3, C-19
C-4, C-5, C-3, C-18
C-1, C-8, C-11, C-9, C-10


15
C

DEPT

21
22
23

CH3
CH3
CH

24

CH2

25

CH2

26

CH2

27
28

CH
C

29

CH2

30
31
32
33

CH3
CH
CH3
CH3

ARLH1
δH
0,40 (1H, d, 4,5 Hz)
0,91 (3H, s)
0,97 (3H, s)
1,90 (1H, m)
3,70 (1H, d, 10,5 Hz)
3,54 (1H, dd, 11,0; 6,0

Hz)
1,41 (1H, m)
1,12 (1H, m)
1,86 (1H, m)
1,33 ( (1H, m)
1,57 (1H, m)
4,77 (1H, br s)
4,64 (1H, br s)
1,60 (3H, s)
1,52 (1H, m)
0,81 (3H, d, 6,0 Hz)
0,93 (3H, d, 6,0 Hz)

δC

HMBC
H→C

19,3
18,1
46,3

C-12, C-13, C-14, C-17
C-8, C-13, C-14, C-15
C-26, C-13

62,8

C-25, C-23

27,7

C-27

27,3

C-23

55,4
147,3
111,9

C-30, C-27, C-28

19,0
30,2
21,3
20,7

C-27, C-28, C-29
C-27, C-28
C-31, C-33
C-31, C-32

H (500 MHz , CDCl3 + CD3OD) và C (125 MHz, CDCl3+ CD3OD)
Hợp chất ARLH1 là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ cây Annona
reticulata và được đặt tên là annonaretin A.

Hình 3.1 Phổ khối lượng (HR-ESI-MS) của hợp chất ARLH1

16

Hình 3.2 Phổ 1H của hợp chất ARLH1

Hình 3.3 Phổ 13C của hợp chất ARLH1


17

Hình 3.4 Phổ HSQC của hợp chất ARLH1

Hình 3.5 Phổ COSY của hợp chất ARLH1


18

Hình 3.6 Phổ HMBC của hợp chất ARLH1

Annonaretin A
3.2. Phân lập và xác định cấu các hợp chất từ hạt bình bát
Bảng 3.13: Danh sách các hợp chất phân lập từ hạt bình bát
Ký hiệu
TT
Tên hợp chất
CTPT
hợp chất
C37H66O7
1
ARSE1 Uvarigrandin A

C37H67O6
2
ARSE2 Cis-reticulatacin-10-on
C40H70ON2
3
ARSE3 N- (Triacontanoyl)tryptamin


19
axit rotundic
C30H48O5
Pedunculoside
C36H58O10
β-sitosterol
C29H50O
-sitosteryl-3-O--DC35H60O6
7
ARSE7
glucopyranoside
C17H22O9
8
ARSE8 Sinapaldehyde glucoside
C17H24O9
9
ARSE9 Eleutheroside B
C8H8O4
10 ARSE10 axit vanilic
3.3 . Tác động ức chế sản sinh NO của một số hợp chất phân lập từ lá bình
bát
Chín hợp chất phân lập từ lá bình bát là ARLH1-ARLH7, ARLE1ARLE2 được sàng lọc về tác động của chúng đối với sự sản sinh NO của tế

bào RAW 246.7 khi đã bị kích ứng với LPS tại Đại học Chang Gung, Đài
Loan. Các tế bào được nuôi cấy cùng các hợp chất ARLH1-ARLE2 ở các
nồng độ khác nhau với sự có mặt của 100 mg/mL LPS trong thời gian 24h
(Bảng 3.25).
Các hợp chất ARLH1, ARLH2, ARLH4, ARLE2 đã thể hiện độc tính
tế bào, trong khi các hợp chất khác đã không cho thấy ảnh hưởng lên khả năng
sống sót của các tế bào. Sự sản sinh NO đã giảm đáng kể khi được xử lý cùng
với các chất ARLH2, ARLH3 và ARLH5-ARLE1 theo sự phụ thuộc vào
liều lượng, với các giá trị IC50 trong khoảng 48,6 ± 1,2 và 99,8 ± 0,4 μM (Bảng
3.25). Các tác động ức chế của ARLH1, ARLH4, ARLE2 thì ít rõ ràng hơn.
Các hợp chất ARLH2, ARLH3 và ARLH5- ARLE1 đã khơng thể hiện độc
tính tế bào đáng kể trong khoảng nồng độ 12,5 - 100 μM (Bảng 3.25).
Axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5), đã cho thấy tác động
ức chế đáng kể nhất đối với sự sản sinh NO với giá trị IC50 nhỏ nhất là 48,6 ±
1,2 μM.
Trong các kết quả thực nghiệm của chúng tôi, các hợp chất ARLH2,
ARLH3, ARLH5 thể hiện các tác động ức chế NO tương tự như các báo cáo
kháng viêm.
Bảng 3.24: Tác động ức chế NO trong các tế bào RAW 264.7.
4
5
6

ARSE4
ARSE5
ARSE6

Kiểm
soát LPS

Liều
(μM)
(−)
(+)

Tế bào
sống sót (%)
100,0 ± 4,9
98,7 ± 8,0

Mức độ
NO
−0,5 ± 0,1
45,4 ± 2,7 ###

Sự ức chế
NO (%)
(−)
(−)

IC50
(μM)
(−)
(−)

ARLH1

12,5

88,0 ± 1,5

36,6 ± 1,9

19,3 ± 4,2

(−)


20

ARLH2

ARLH3

ARLH4

ARLH5

ARLH6

ARLH7

ARLE1

ARLE2

Liều
(μM)

Tế bào

sống sót (%)

Mức độ
NO

Sự ức chế
NO (%)

25
50
100
12,5
25
50
100
12,5
25
50
100
12,5
25
50
100
12,5
25
50
100
12,5
25
50

100
12,5
25
50
100
12,5
25
50
100
12,5
25
50
100

81,2 ± 1,8
73,0 ± 3,6 *
66,9 ± 5,5 **
98,0 ± 2,2
91,0 ± 3,6
82,9 ± 1,2
65,7 ± 8,6 **
93,5 ± 1,8
92,6 ± 3,1
88,7 ± 1,8
81,4 ± 2,3
82,8 ± 2,7
80,7 ± 3,8
65,3 ± 2,3 **
55,8 ± 2,7 **
98,9 ± 5,2

96,5 ± 9,2
95,9 ± 8,6
80,2 ± 5,7
94,8 ± 3,1
83,7 ± 3,5
83,5 ± 3,0
81,3 ± 2,8
98,6 ± 3,1
93,6 ± 4,0
92,5 ± 2,8
83,7 ± 1,6
98,4 ± 3,2
94,0 ± 2,6
88,6 ± 2,6
82,4 ± 1,2
99,9 ± 4,8
90,0 ± 1,6
82,6 ± 2,7
76,2 ± 1,1 *

33,5 ± 0,9
(−)
(−)
34,3 ± 4,7
35,1 ± 1,2
22,7 ± 0,5 **
(−)
38,5 ± 2,3
39,5 ± 0,6
35,6 ± 0,9 *

22,6 ± 0,4 **
38,4 ± 0,7
38,6 ± 3,3
(−)
(−)
38,3 ± 1,3
33,1 ± 1,0 *
22,1 ± 1,5 **
14,8 ± 0,7 ***
37,0 ± 1,8
33,1 ± 2,4 *
22,9 ± 1,1 **
15,1 ± 0,3 ***
42,6 ± 0,7
40,6 ± 2,8
23,7 ± 0,2 **
14,3 ± 0,3 ***
39,8 ± 1,2
35,4 ± 0,8 *
23,5 ± 0,9 **
14,4 ± 0,3 ***
42,0 ± 1,2
40,4 ± 0,7
25,9 ± 2,3
(−)

26,2 ± 2,0
(−)
(−)
24,5 ± 10,2

22,7 ± 2,6
50,0 ± 1,0
(−)
15,2 ± 5,0
13,1 ± 1,2
21,6 ± 2,0
50,1 ± 0,9
15,5 ± 1,5
15,1 ± 7,3
(−)
(−)
15,5 ± 2,8
27,1 ± 2,3
51,4 ± 3,2
67,3 ± 1,5
18,5 ± 4,0
27,1 ± 5,3
49,5 ± 2,4
66,7 ± 0,6
6,2 ± 1,5
10,6 ± 6,1
47,7 ± 0,3
68,5 ± 0,7
12,3 ± 2,6
21,9 ± 1,8
48,2 ± 2,0
68,3 ± 0,7
7,5 ± 2,7
11,0 ± 1,6
42,9 ± 5,0

(−)

Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD.

###

IC50
(μM)

50,0 ± 0,3

99,8 ± 0,4

(−)

48,6 ± 1,2

51,5 ± 0,5

55,5 ± 0,3

54,5 ± 0,8

(−)

So sánh với mẫu

của nhóm đối chứng. * p < 0,05; ** p < 0,01 và *** p < 0,001 đã được so
sánh với nhóm LPS-alone. (−): không xác định.

21
Các hợp chất hóa học phân lập từ lá cây bình bát

Annonaretin A (ARLH1)

17-acetoxy-16β-ent-kauran-19-oic
(ARLH7)

Kaurenoic acid (ARLH2)

16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic
(ARLE1)

16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5)

Taraxerol (ARLH3)

Taraxasterol (ARLE3)

Uvaol (ARLE4)

β-sitosterol (ARLH4) 6β-hydroxystigmast-4-en-3-one (ARLH6)

(2S)-di-O-methylquiritigenin (ARLE2)

Rutin (ARLE5)


22

Các hợp chất hóa học phân lập từ hạt cây bình bát

Uvarigrandin A (ARSE1)

Cis-reticulatacin-10-one (ARSE2)

N- (Triacontanoyl)tryptamin (ARSE3)

Axit rotundic (ARSE4)

-sitosterol (ARSE6)

Pedunculoside (ARSE5)

-sitosteryl-3-O--D-glucopyranoside (ARSE7)

HO

O

OCH3
OH

Sinapaldehyde glucoside
(ARSE8)

Vanilic
(ARSE10)

Eleutheroside B

(ARSE9)


23
KẾT LUẬN
Nghiên cứu thành phần hố học và hoạt tính sinh học của lá và hạt của
cây bình bát (Annona reticulata) ở Việt Nam, chúng tôi đã thu được một số kết
quả như sau:
1. Từ phần tan trong hexane và ethyl acetate của dịch chiết methanol lá
của cây bình bát (Annona reticulata) đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp
chất:
+ 1 hợp chất triterpenoid mới: annonaretin A (ARLE1); 3 hợp chất
triterpenoid lần đầu được phân lập từ lá cây bình bát: taraxasterol (ARLE3),
taraxerol (ARLH3), uvaol (ARLE4);
+ 2 hợp chất sterol: β-sitosterol (ARLH4), 6β-hydroxystigmast-4-en-3one (ARLH6). ARLH6 lần đầu tiên phân lập từ chi Annona.
+ 4 hợp chất diterpenoid: axit kaurenoic, axit 17-acetoxy-16β-hydroxyent-kauran-19-oic

(ARLH7),

axit

16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic

(ARLE1), axit 16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ARLH5). Trong đó, các
hợp chất này phần đầu tiên phân lập từ cây này.
+ 2 hợp chất flavonoid: (2S)-di-O-methylquiritigenin (ARLE2), rutin
(ARLE5). ARLE2 lần đầu tiên phân lập từ chi Annona.
2. Từ phần tan trong ethyl acetate của dịch chiết methanol của hạt cây
bình bát (Annona reticulata) phân lập được 10 hợp chất:
+ 2 hợp chất acetogenin: uvarigrandin A (ARSE1), cis-reticulatacin-10-one

(ARSE2).
+ 1 hợp chất amin béo: N- (Triacontanoyl)tryptamin (ARSE3);
+ 2 hợp chất triterpenoid: axit rotundic (ARSE4) và pedunculoside
(ARSE5);
+ 2 hợp chất sterol: β-sitosterol (ARSE6) và β-sitosteryl-3-O-β-Dglucopyranoside (ARSE7);