ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán nhanh và bước đầu điều tra dịch tễ bệnh do mycoplasma gallisepticum trên gà doc

ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán nhanh và bước đầu điều tra dịch tễ
bệnh do mycoplasma gallisepticum trên gà
Nhữ Văn Thụ, Võ Văn Sự
Bộ môn Động vật quí hiếm và Đa dạng sinh học - Viện Chăn Nuôi
Tiểu đề tài này thuộc Đề tài KHCN-0203 - Trình bày tại Hội nghị nghiệm thu cấp nhà nước Đề tài 13/6/2001 tại Viện Thú
y

1.

Đặt Vấn Đề

Bệnh do mycoplasma là một bệnh nguy hiểm trên gia cầm và đa gây tổn thất rất lớn cho
ngành chăn nuôi gia cầm.
Những chủng mycoplasma gây bệnh nhiều nhất đó là MG, MS, MI, MM. Chủng MG và MS
gây cho cả gà và gà tây nhưng hai chủng MI và MM chỉ gây bệnh cho gà tây.
Để chẩn đoán bệnh này người ta thường dùng phản ứng huyết thanh học, tuy nhiên, các
chủng thường phản ứng chéo và không đặc hiệu. Các kháng nguyên đặc hiệu cho các
chủng không có sãn trên thị trường.
Gần đây các kỹ thuật sinh học phân tử ví dụ như kỹ thuật khuyếch đại ADN trong phòng thí
nghiệm (PCR), ADN dò và kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt (RFLP) được áp dụng
để xác định các chủng mycoplasma (Fan và cộng sự 1995) và dùng để chẩn đoán bệnh
này(Nacimento và cộng sự 1991, 1993). Các tác giả cho rằng đây là một phương pháp nhân
gen chẩn đoán rất nhậy có thể phát hiện ADN mầm bệnh rất nhỏ khoảng 10 pg. Zhao và
Yamamoto (1993) đã dùng 1 pg ADN để chẩn đoán Mycoplasma iowae. Lauerman và cộng
sự., (1993) đã tiến hành nghiên cứu 122 nhóm số liệu nhận xét PCR là phương pháp nhậy
và đặc trưng khi so sánh với các phương pháp nuôi cấy tế bào, huyết thanh( phản ứng
huyết thanh, ức chế PHA, ELISA), dịch tễ và lịch sử của bệnh. Kempf và cộng sự., (1994)
đã tiến hành các nghiên cứu chẩn đoán bệnh và nhận xét PCR là phương pháp nhậy, đặc
trưng, nhanh và có thể không dùng đồng vị phóng xạ để chẩn đoán M.gallisepticum.
Một số tác giả trên thế giới đã nghiên cứu và phát triển kỹ thuật PCR để phát triển thành kit
chẩn đoán để chẩn đoán mầm bệnh. Trình tự chuỗi 16s rRNA của các chủng mycoplasma

đã được xác định và nó là những căn cứ cơ bản để phân tích phát triển giống loài và chúng
là căn cứ để thiết kế cặp mồi chung cho các chủng cũng như cặp môì đặc hiệu đối với từng
chủng loài.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm lại để xác định độ nhạy và hoàn thiện
các khâu kỹ thuật của phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh do mycoplasma trên gia cầm.
Các phương pháp khác như nuôi cấy, phản ứng huyết thanh học... cũng được áp dụng để
khẳng định thêm kết quả đạt được qua phương pháp PCR.
2.
2.1

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.
Xác định chủng gây bệnh và độ nhạy phương pháp PCR

Mẫu nghiên cứu là mẫu Mycoplasma phân lập được trên môi trường nuôi cấy từ bệnh
phẩm 5 mẫu và mẫu lấy trực tiếp từ đường hô hấp của gà mang mần bệnh 20 mẫu.


Mẫu phân lập được từ gà ốm tại trung tâm chẩn đoán Thú Y trên môi trường PPLO có bổ
sung huyết thanh lợn tươi, toàn bộ thủ tục nuôi cấy được mô tả trong "Thông tin khoa học
kỹ thuật chăn nuôi, Viện chăn nuôi, trang 10, số 2 năm 1999"
2.1.1

Phương pháp tách ADN.
Bước 1: Cho vào 150 ml dd phá tế bào, lắc trên máy lắc
Bước 2: Cho vào 100 ml dd kết tủa Protein, lắc mạnh đến khi hỗn hợp trong
ống trở lên đặc quánh, nhày.
Bước 3: Ly tâm 16.000 vòng trong 5 phút. Chuyển phần trên vào ống mới có
chứa 300 ml dd 2-Propanol, lắc nhẹ, đảo dung dịch có thể không nhìn thấy
ADN kết tủa. Ly tâm 16.000 vòng trong 5 phút
Bước 4: Loại bỏ phần trên và rửa hai lần bằng dung dịch cồn 70%

Bước 5: Làm khô kết tủa và hoà tan trong 50 ml dd TE, bảo quản trong -20oC.

2.1.2
Phương pháp phân tích xác định chủng mycoplasma bằng kỹ thuật giải
trình tự.(Thí nghiệm này được tiến hành ở phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của
CIRAD-EMVT. Cộng hoà Pháp)
Các bước tiến hành:
1.

Tách ADN từ khuẩn lạc đã phân lập và ADN từ bệnh phẩm trực tiếp

2.

Nhân đoạn gene 16S rARN Mycoplasma (745 cặp ba zơ)

3.

Chèn đoạn gen trên vào plasmid PGEMT đã được mở sãn gồm:

30-90 ng ADN -PCR
Đệm

1 ml

Ligase enzyme

5 ml

H2O

20 ml

PGEMT

4.

3 ml

ủ 16oC trong 30 phút

1 ml

Biến nạp vào vi khuẩn Epicurial coli.( theo thủ tục của Stragene)
-

Plasmid tái tổ hợp( thu được từ bước 3) để trên đá

-

20 ml Epicurial coli


ủ 42oC trong 45 giây

-

Sau khi ủ, để trên đá 2 phút, cho vào 280 ml dd SOC, ủ 370C trong 1 giờ, sau đó chuyển
sang nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Chọn lọc các khuẩn lạc có chứa Plasmid tái tổ hợp,
chọn lọc 6 khuẩn lạc điển hình, nuôi tăng số lượng.
5.

Tách plasmid, sử sụng quy trình tinh sạch miniprep.

6.

PCR - sequencing

7.

Xác định trình tự trên máy giải trình tự tự động Perkin Elmer 377.

8.
Phân tích kết quả trên phần mềm ADNsis - HITACHI và so sánh với ngân hàng
dữ liệu (GENE-BANK).
2.1.3

Xác định độ nhạy phương pháp PCR.

Xác định điều kiện phản ứng thích hợp nhất với các nồng độ các chất tham gia phản ứng,
các loại mồi đã thiết kế và nhiệt độ bắt cặp mồi khác nhau. Dùng ADN mycoplasma tinh
sạch, đo nồng độ trên máy quang phổ tử ngoại UVvis sau đó pha loãng với độ pha loãng 10
lần, xác định nồng độ thấp nhất mà phản ứng cho kết quả dương tính. Sau khi đo bằng
máy UVvis, nồng độ ADN được tính bằng công thức
M = ABS x n x 50
Trong đó M là nồng độ ADN (ng/ml), ABS là giá trị mật độ quang đo ở bước sóng 260nm, n
độ pha loãng ADN trong lúc đo.
- 6 cặp mồi được thiết kế trên vùng gen 16s rARN của Mycoplasma gallisepticum sau đó
được thử để tìm ra cặp mồi thích hợp.
2.1.4

Kiểm tra trên gà nuôi và các đối tượng bệnh phẩm khác.

Sau khi có kết quả về xác định chủng gây bệnh, độ nhạy PCR, điều kiện thích hợp, chúng tôi
tiến hành trên mẫu gà trực tiếp. Đối với mỗi loại bệnh phẩm khác nhau thì khâu tiền sử lý
mẫu là khác nhau nhưng cuối cùng đều dùng kit tách ADN của Promega.
Mẫu phân tích bao gồm:

200 mẫu dịch mũi gà
35 mẫu nền chuồng
30 mẫu phôi gà
10 mẫu nước uống

o

Với mẫu dịch dỉ mũi gà được sử lý như theo Silveria 1996 có cải tiến kết hợp
với thủ tục của hãng Promega:
Mẫu lấy trực tiếp được lấy bằng tăm bông, ngoáy vào họng gà, cho vào
ống eupendof có chứa 500 ml PBS .


Để 4oC qua đêm, nhấc que bông ra, điều chỉnh lại cho đến 500 ml bằng
PBS.
Ly tâm 16.000 v/ phút/5 phút. Loại bỏ phần dung dịch phía trên sau đó
sử lý theo 5 bước được mô tả trong phần 2.2.
o

Với mẫu là chất độn nền chuồng:
Hoà tan vào ống 10 ml dd PBS, ngoáy đều, chuyên phần trên sang ống
mới, ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút.
Bỏ phần dịch nổi. Phần lắng cặn được sử lý như phần 2.2.

o

Với mẫu là phôi thì lấy nước ối và lòng đỏ:
Nghiền lòng đỏ với dịch nước ối ra với dung dịch PBS sau đó lấy phần
dung dịch ly tâm và xử lý như trên phần 2.2.

Tiến hành nhân gen, phân tích gen theo điều kiện và các bước như trên.
3.
3.1

Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Kết quả giải trình tự.

Sau khi có kết quả phân tích trình từ gen, chúng tôi tiến hành phân tích và so sánh trên
ngân hàng dữ liệu gen (gene bank) và kết quả được trình bày trong bảng 1.
Bảng 1: Kết quả xác định chủng Mycoplasma bằng kỹ thuật giả trình tự.
Chủng

M.gallinarum

M.gallisepticum

Nhiễm cả hai

Mẫu từ môi trường 10
nuôi cấy (n=10)

0

0

Mẫu từ bệnh
phẩm (n=20)

14

8

12

Kết quả cho thấy, trong hai loại mẫu phân tích, mẫu nuôi cấy phân lập là khuẩn lạc thì chỉ
thấy M.gallinarum còn đối với mẫu từ bệnh phẩm lấy trực tiếp thì có thêm M.gallisepticum.
Nguyên nhân của hiện tượng này là môi trường nuôi cấy không thích hợp cho
M.gallisepticum do vậy M.gallinarum dễ mọc hơn và mọc át cả M.gallisepticum. Chủng gây
bệnh trên gia cầm chủ yếu là do chủng M.gallisepticum gây ra còn chủng M.gallinarum
không gây bệnh. Do đó ta chỉ cần chú ý tới tỷ lệ nhiễm M.gallisepticum.
Kết quả được phân tích bằng chương trình (phần mềm) ADNsis cho thấy 2 mồi RP5 và FP2
nhân lên đoạn gen là 745 cặp ba zơ ở M.gallisepticum và 737 cặp ba zơ của M.gallinarum
nhưng rất khó phân biệt trên điện di agarose. Gữa hai chủng ở hai vùng thiết kế mồi chỉ
khác nhau 1 cặp ba zơ nhưng trình tự các nucleotide trong vùng được nhân lên của hai
chủng thì rất khác nhau và có thể sử dụng các enzyme giới hạn để phân biệt các chủng.
Trong số đó enzyme RsaI (nhận biết trình tự GTAC) là thích hợp nhất vì nó cắt đoạn gene


của M.gallisepticum ở 3 vị trí và trên M.gallinarum ở 1 vị trí và tạo các vạch trên điện di đồ
khác biệt và dễ phân biệt.
Nếu là M.gallisepticum tạo ra 4 vạch

401 cặp ba zơ

143 cặp ba zơ
123 cặp ba zơ
78

cặp ba zơ

Nếu là M.gallinarum tạo ra 2 vạch 538 cặp ba zơ và 199 cặp ba zơ. Giếng 8,9 và 11
trong điện di đồ

Và nếu mẫu có lẫn 2 chủng thì nó tạo ra sự kết hợp của cả 5 vạch. Do vậy có thể phân
biệt được hai chủng mycoplasma bằng PCR và RFLP.
3.2

Xác định độ nhạy phương pháp PCR

Dựa trên các cặp mồi đã thiết kế và tổng hợp, chúng tôi thấy rằng cặp mồi RP5, FP2 cho kết
quả rõ nhất, chiều dài đoạn gen sau khi nhân là 745 cặp ba zơ và các điều kiện phản ứng
như sau:
Mg

+2

2,5 mM

Primers

200 pg mỗi loại

dNTP

250 mM mỗi loại

Taq-Pol (Taq-gold)

2UI

Đệm PCR

5ml

Mẫu ADN

5ml

H2O cho đủ tới

50ml

Chu kỳ và điều kiện phản ứng
94oC

12 phút

94 oC

30 giây

55oC

1 phút

35 chu kỳ


72oC

1 phút

72oC

10 phút

Độ nhạy phản ứng được xác định như phần phương pháp nghiên cứu. Phản ứng cho kết
quả dương tính có thể phát hiện ở nồng độ 6.10-2 pg ADN, theo Blanchard và cộng sự 1995
thì nồng độ trên tương ứng với 50 CFU (~50 organisms) trên một phản ứng. Độ nhạy này
tương đối cao. ảnh 2.

ảnh 2. Kết quả xác định độ nhạy PCR Nồng độ
trước phản ứng theo thứ tự
là:600;60;6;0,6;0,06;0,006 pg;M; DC+
3.3

ảnh 3. Kết quả kiểm tra trên

Kết qủa kiểm tra trên mẫu

Dựa vào kết quả xác định và lựa chọn điều kiện thích hợp cho phản ứng PCR chúng tôi đã
tiến hành lấy 200 mẫu dịch họng gà, 35 mẫu chất độn nền chuồng, 30 phôi gà 14 ngày tuổi,
10 mẫu nước uống. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 2 và ảnh 3.
Bảng 2: Kết quả xác định các chủng mycoplasma trên các loại mẫu

Mẫu nghiên cứu

Số lượng Phương pháp PCR
mẫu

Phương pháp
SPA*

M.gallisepticum

M.gallinarum

+

%

+

%

+

%

Mẫu dịch họng ở 130
Gà lương phượng

79

66,0

50

38.46

38

31.7

Mẫu dịch họng ở 70
Gà Tam Hoàng

45

64,3

30

42.8

30

42.8

Nước uống

10

2

-

0

0

-

-

Nền chuồng

35

18

51,43

5

14.3

-

-

Phôi gà

30

3

10.0

0

0

-

-

*SPA: phương pháp ngưng kết trên phiến kính
Mẫu dịch họng:
Kết quả trên cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh mycoplasma xác định bằng phương pháp PCR cao
hơn rõ rệt (ở mức sác xuất p<0.001 bằng phương pháp Chi bình phương) so với phương
pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính đối với chủng M.gallisepticum và co hơn nhưng
không rõ rệt đối với chủng M.gallinarum.
Phương pháp PCR đã được khẳng định là nhân lên chủng gây bệnh là M.gallisepticum và
nó xác định sự tồn tại của mầm bệnh với độ nhạy rất cao 50 CFU, trong khi đó phương pháp
chẩn đoán ngưng kết nhanh trên phiến kính chỉ xác định kháng thể tồn tại trong cơ thể gà


và phản ưng ngưng kết nhanh trên phiến kính có hiện tượng phản ứng chéo giữa các
chủng.
Mẫu nước uống, nền chuồng và phôi gà:
Bằng phương pháp PCR có thể xác định mầm bệnh có trong chất độn chuồng, nước uống
cũng như trong phôi gà: trên nền chuồng là 51,43 và 14,3% và trên phôi gà là 10 đối với
các chủng.
Phương pháp ngưng kết không thể xác định được mầm bệnh trên các mẫu vật này.

4.

Kết luận và đề nghị

Kết luân
Bằng phương pháp PCR xác định tỉ lệ nhiễm bệnh mycoplasma chính xác hơn
phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính.
Sử dụng phương pháp PCR kết hợp với việc sử dụng enzyme giới hạn RsaI để
phân biệt chủng M.gallisepticum và chủng M.gallinarum.
Phương pháp ngưng kết không thể xác định mầm bệnh trên các bệnh phẩm,
phôi, các chế phẩm sinh học, nền chuồng. . . nhưng phương pháp PCR có thể xác
định được.
Đề nghị: ứng dụng phương pháp trong việc chẩn đoán xác định mycoplasma ở gà.
5.

Phụ lục

Trình tự đoạn gen nghiên cứu của 2 chủng M.gallisepticum và M.gallinarum.
Đoạn ADN được khuếch đại nằm trong vùng nucleotide từ 341 đến 1086 của M.gallisepticum
và nucleotide 312 đến 1049 của M.gallinarum