Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

-------

HÀ THỊ PHƢỢNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

-------

HÀ THỊ PHƢỢNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill]
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Chu Hoàng MậuPhó Giám đốc Đại học Thái nguyên và TS. Chu Hoàng Hà - Phó Giám đốc
Phòng thí nghiệm trọng điểm , Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn , chỉ bảo , hết lòng giúp đỡ tôi
trong suốt quá trì nh nghiên cƣ́u và thực hiện đề tài luận văn .
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS .TS. Lê Trần Bình - Nguyên
Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi hoàn thành luận văn của mì nh .
Tôi xin chân thành cảm ơn TS . Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trƣờng Đại
học khoa học tƣ̣ nhiên –ĐH Thái nguyên và CN . Hoàng Hà - Phòng Công
nghệ tế bào thực vật , Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài luận văn .
Trong quá trình thƣ̣c hiện đề tài , tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình
của toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ Khoa sau đại
học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái nguyên đã giảng dạy và tạo
điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học.
Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trƣờng THPT Đồng Hỷ , các bạn đồng nghiệp

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn
Cuối cùng tôi rất biết ơn những ngƣời thân trong gia đình, các bạn của tôi
đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, tháng 8 năm 2010
Tác giả luận văn
Hà Thị Phƣợng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Trang phụ bì a

Trang

Lời cảm ơn
Nhƣ̃ng chƣ̃ viết tắt
Danh mục các bảng trong luận án
Danh mục các hì nh trong luận án
MỞ ĐẦU…………………………………………………………..................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………….. .........4
1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC TÍ NH CHỊ U HẠN
CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG .............................................................................4
1.1.1. Cây đậu tƣơng……………………………...................…………….....4
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng………… ……….............….. .....8
1.2. CHẤT Ƣ́C CHẾ CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN
Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƢƠNG ....................................................12
1.2.1. Chất ƣ́c chế Cystatin ............................................................................12

1.2.1.1. Giới thiệu chung về Cystatin ở sinh vật .............................................12
1.2.1.2. Phân loại Cystatin .............................................................................13
1.2.1.3. Cấu trúc, chức năng của Cystatin thực vật ......................................15
1.2.2. Gen mã hóa Cystatin ở thƣ̣c vật và cây đậu tƣơng… . …….….….......19
1.3. ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
PHÂN LẬP GEN .................................................................................... ....21
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... ....28
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................. ...28
2.1.1. Vật liệu thực vật ..................................................................................28
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ...........................................29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. .....29
2.2.1. Đánh gía khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non
bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo......................................................... ...29
2.2.2. Xử lý kết quả và tính toán số liệu ........................................................31
2.2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ............................................................31
2.2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết ARN tổng số
từ mầm đậu tƣơng ..........................................................................................31
2.2.3.2. Phƣơng pháp điện di ADN trên gel agarose .....................................32
2.2.3.3. Phƣơng pháp RT-P............................................................................32
2.2.3.4. Ph-¬ng ph¸p g¾n gen vµo vector t¸ch dßng ......................................35
2.2.3.5. BiÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5 ............36
2.2.3.6. Ph-¬ng ph¸p PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) ...................36
2.2.3.7. Tách chiết plasmit ............................................................... ............37
2.2.3.8. Phƣơng pháp xác định trình tự gen

bằng thiết bị tự động( N)............................................................................... 37
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. ....38
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA HẠT VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC
GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU ...................................................... 38

3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng hạt
5 giống đậu tƣơng nghiên cứu ......... ............................................................38
3.1.2. Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tƣơng ..........................................39
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊ NH TRÌ NH TƢ̣
GEN CYSTATIN Ở ĐẬU TƢƠNG............................................................40
3.2.1. Tách chiết ARN tổng số ................................................................... 40
3.2.2. KÕt qu¶ RT-PCR ..................................................................................43
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3.2.3.. KÕt qu¶ biÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn
E.coli DH5α ............................................................................... ..................44
3.2.4.. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp ........ ..................46
3.2.5. Kết quả tách chiết ADN plasmid ........................................................
47
3.2.6. Kết quả kiểm tra các dòng plasmid ...................................................48

3.2.7. Kết quả giải trình tự nucleotit ................................................. ...........49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……………….........………………. ….......... 58
CÔNG TRÌ NH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ..................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

ASTT

Áp suất thẩm thấu

ATP- aza

Enzym phân giải ATP

Bp

Cặp bazơ

cADN

Sợi ADN bổ sung đƣợc tổng hợp từ mARN
nhờ enzyme phiên mã ngƣợc

dNTP

Deoxynucleotid

cs

Cộng sƣ̣

DHA

Docosa Hexaenoic Axit

EDTA

Ethylendiamin tetraacetic axit

EPA

Eicosa Pentaenoic axit

HSP

Heat shock protein - Protein sốc nhiệt

HSG

Heat Shock Granules

HSPL

Hệ số pha loãng

Kb

Kilo bazơ = 1000 bp

LEA

Late embryogenesis abundant

MGPT

Môi giới phân tử - Molecular chaperone

MW

Molecular weight - Khối lƣợng phân tử

PCR

Polymeraza chain reaction - Phản ứng chuỗi polimeraza

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

2.1

Tên Bảng

Trang

Nguồn gốc, đặc điểm của 6 giống đậu tƣơng nghiên

30

cứu
2.2

Thành phần phản ứng của PCR

24

2.3

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

37

2.4

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
tách dòng pBT

38

3.1

Màu sắc, số lƣợng và khối lƣợng hạt của 6 giống đậu

42

tƣơng nghiên cứu
3.2

Đánh giá khả năng chị u hạn của

6 giống đậu tƣơng

45

Hệ số tƣơng đồng và hệ số khác nhau của gen cystatin

58

nghiên cứu
3.3

ở 10 giống đậu tƣơng (%)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên Hì nh

Trang

2.1.

Sơ đồ vector pBT

38

3.1

Hình ảnh hạt của 6 giống đậu tƣơng nghiên cứu

42

3.2

Hình ảnh cây đậu tƣơng 3 lá trƣớc khi xử lý hạn

44

3.3

Hình ảnh cây đậu tƣơng 3 lá sau khi xử lý hạn

44

3.4

Kết quả tách chiết RNA tổng số

46

3.5

KÕt qu¶ PCR nhân gen củ a giống đậu tƣơng Thái

48

Nguyên
3.6

Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả
biến E. coli DH5α

49

3.7

PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pUC18F-

50

3.8

Kết quả tách ADN plasmid tái tổ hợp

51

3.9

Kết quả cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI

52

3.10

Trình tự trình tự nucleotid của mẫu nghiên cứu

54

Thái Nguyên và 4 mẫu giống đậu tƣơng đã công bố
trên genbank
3.11

Biểu đồ hì nh cây so sánh mƣ́c tƣơng đồng gen

59

cystatin của 10 giống đậu tƣơng
3.12

Trình tự

axit amin của mẫu nghiên cƣ́u Thái

60

Nguyên và 4 mẫu giống đậu tƣơng đã công bố trên
genbank

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tƣơng Glycine max (L.) Merrill là loại cây có vị trí quan trọng trong cơ
cấu cây trồng nông nghiệp, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Hạt
đậu tƣơng chứa 30%- 46% protein, 12%-25% lipit, và nhiều loại vitamin (B1, B2,
C,D, E, K…), chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin,
xystein, lizin…), là nguồn năng lƣợng cần thiết cho con ngƣời.
Cây đậu tƣơng có thời gian sinh trƣởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi
khuẩn cố định đạm, tạo khả năng cố định nitơ không khí thành chất hữu cơ
nên cây đậu tƣơng thƣờng đƣợc trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và
cải tạo đất bạc màu. Vì vậy trồng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất và bảo vệ
môi trƣờng. Với những giá trị to lớn đó, mà cây đậu tƣơng đƣợc trồng phổ
biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, phát triển mạnh ở Mỹ, Braxin, Argentina ,
Trung Quốc và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc gieo trồng ở cả 7
vùng nông nghiệp trên cả nƣớc với nguồn gen rất đa dạng và phong phú, gồm
các giống nhập nội, giống lai tạo, giống đột biến và tập đoàn các giống địa
phƣơng. Sự đa dạng và phong phú đó chính là nguồn nguyên liệu phục vụ cho
công tác giống nhằm chọn tạo những giống đậu tƣơng mới cho năng suất và
chất lƣợng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9]. Những giống đậu tƣơng địa
phƣơng thƣờng có năng suất thấp, nhƣng lại có chất lƣợng hạt tốt và khả năng
chống chịu cao đối với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh.

Trong những năm gần đây diễn biến khí hậu ngày càng phức tạp, lƣợng
mƣa phân bố không đều giữa các vùng và giữa các thờì kỳ trong năm nên hạn
hán và nắng nóng kéo dài cùng với sự biến đổi của các yếu tố môi trƣờng
khác đã tác động xấu đến sự sinh trƣởng và phát triển, làm giảm năng suất và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....