Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họn
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (765.83 KB, 27 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------------
HOÀNG VĂN MẠNH
XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN
EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG
THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VÒM MŨI HỌNG
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.80
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. Lê Thanh Hoà
Thái Nguyên - 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ala
Alanine
bp
Base pair
BL
Burkitt’s Lymphoma
CTC
Cổ tử cung
E
Early region
EBV
Epstein-Barr Virus
Gly
Glycine
gs-PCR
Group-specific PCR
HPV
Human papilloma virus
HP6
Hải Phòng 6 (ký hiệu mẫu)
L
Late region
LCL
Lymphoblastoid
LCR
Long control region
LMP
Latent membrane protein
MHC
Major Histocompatibility Complex
MT7
Miền trung 7 (ký hiệu mẫu)
NPC
Nasopharyngeal carcinoma
p53
Protein 53
PV
Papilloma virus
RB
Retinoblast
TR
Terminal repeat
ts-PCR
Type- specific PCR
UICC
Universal Integrated Circuit Card
UTBM
Carcinoma
VCA
Viral capsid antigen
VMH
Vòm mũi họng
WHO
World Health Organization
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng trong luận văn
Trang
Bảng 1.1
Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính Châu
Phi)
5
Bảng 2.1
Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản
ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18
38
Bảng 2.2
Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex-PCR
HPV16/HPV18
39
Bảng 2.3
Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản
ứng PCR gen E6 cua HPV-16
39
Bảng 2.4
Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1
40
Bảng 2.5
Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách
dòng (pCR2.1TOPO)
43
Bảng 2.6
Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzym EcoRI
47
Bảng 2.7
Thành phần phản ứng tạo DNA sợi đơn
49
Bảng 2.8
Chu trì nh nhiệt của phản ứng giải trì nh tự
49
Bảng 3.1
Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen E6
của mẫu PK12
56
Bảng 3.2
Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1
của mẫu PS16
57
Bảng 3.3
Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi
nucleotide gen EBNA-1 của EB17, EB18, EB19 và EB20
64
Bảng 3.4
Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân
tích acid amin tại vị trí 487 của EBNA-1
66
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Tên hình trong luận văn
Trang
Hình 1.1
Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả
năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lục
4
Hình 1.2
Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư
cổ tử cung
9
Hình 1.3
Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus
dựa trên so sánh chuỗi nucleotid của gene capsid L1
11
Hình 1.4
Human Papillomavirus chụp dưới kính hiển vi điện tử
12
Hình 1.5
Cấu trúc phân tử của hệ gene HPV -16.
13
Hình 1.6
Quá trình nhân lên của HPV
15
Hình 1.7
Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị
nhiễm
27
Hình 1.8
Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a)
và dạng mạch thẳng (b)
29
Hình 2.1
Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 của
virus EBV và E6 của virus HPV16 và L1 của HPV18
34
Hình 2.2
Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO® (Invitrogen)
43
Hình 3.1
Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm
51
Hình 3.2
Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng cùng lúc 2 cặp
mồi (E6F-E6R và HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng
số của các mẫu PS16, PK12, PK11, PK10.
52
Hình 3.3
Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 của mẫu PK12
(bản A) và đoạn gen L1 của mẫu PS16 (bản B).
53
Hình 3.4
Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen
E6 của mẫu PK12 (HPV-16).
54
Hình 3.5
Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen
L1 của mẫu PS16 (HPV18).
54
Hình 3.6
Trình bày chuỗi gen E6 của typ HPV-16.
55
Hình 3.7
Trình bày chuỗi gen L1 của typ HPV-18
55
Hình 3.8
Kết quả bước đầu phát hiện HPV16/HPV18 bằng phương
pháp đa mồi multiplex-PCR.
59
Hình 3.9
Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm EBV
61
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1
61
Hình 3.11
Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen
EBNA-1
63
Hình 3.12
Kết quả chuỗi gen EBNA-1 của EB17 được thu nhận sau giải
trình tự
63
Hình 3.13
So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 13 chủng
nghiên cứu
65
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................4
1.1. UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV).... 4
1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung.............................................................4
1.1.1.1. Trên thế giới..............................................................................
4
1.1.1.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam................................
6
1.1.1.3. Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC............................
6
1.1.1.4. Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung................
6
1.1.2. Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus...............................
9
1.1.2.1. Phân loại Papilloma virus.........................................................
9
1.1.2.2. Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus.........................
12
1.1.2.3. Quá trình nhân lên của HPV.....................................................
14
1.1.2.4. Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV..................................
16
1.1.3. Chẩn đoán ung thư CTC........................................................................
17
1.1.3.1. Chẩn đoán tế bào học................................................................
17
1.1.3.2. Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA.......................................
19
1.1.3.3. Định týp HPV bằng sinh học phân tử.......................................
19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1.1.4. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng
phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam........
21
1.2. UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV)....... 22
1.2.1. Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng........................................................
22
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................
22
1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam...........................................
23
1.2.2. Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV).....................................
24
1.2.2.1. Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH......................
24
1.2.2.2. Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV........................................
25
1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của
EBV….................................................................................... 26
1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV.........................
28
1.2.2.5. Gene và sản phẩm của gene EBNA-1.......................................
29
1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng
phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam...........
30
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................
33
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................
33
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu ..........................
33
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị..........................................................................33
2.2.2. Hoá chất................................................................................................33
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................
34
2.4. Quy trình nghiên cứu..........................................................................................
35
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản.............................................................................
35
2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số............................................................
35
2.4.3. Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR.............................
37
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.4.3.1. Thiết kế mồi………………………………………………. 37
2.4.3.2. Quy trình phản ứng PCR..........................................................
38
2.4.3.3. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR............................................
40
2.4.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR..........................................................
41
2.4.4. Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR....................................................
42
2.4.4.1. Tạo vectơ tái tổ hợp..................................................................
42
2.4.4.2. Chuyển nạp……………………………………..……………
43
2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp.....................................................
44
2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp...................................................
45
2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp..........................................................
47
2.4.5. Giải trình trình tự và xử lý số liệu...........................................................
48
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................
51
3.1. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16
và L1 của HPV-18....................................................................................................
51
3.1.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm............................. 51
3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và
HPV-18.....................................................................................................
52
3.1.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và
HPV-18 từ các mẫu kiểm tra..................................................................53
3.1.4. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và
chuỗi gen L1 của HPV-18................................................................. 54
3.1.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của
HPV16 và L1 của HPV18......................................................................56
3.1.6. Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương
pháp đa mồi multiplex-PCR.....................................................................
59
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.2. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của
EBV......................................................................................................................... 60
3.2.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm.................................
60
3.2.2. Kết quả thực hiện phản ứng PCR............................................................
61
3.2.3. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV............
62
3.2.4. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1
của EBV.................................................................................................
63
3.2.5. Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin
số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt
Nam và thế giới....................................................................................................... 64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................
69
4.1. KẾT LUẬN..........................................................................................................
69
4.2. KIẾN NGHỊ..........................................................................................................
70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là một
trong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng
12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ
lệ tử vong của các bệnh lí về tim - mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng.
Bệnh ung thư nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫn
đến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bệnh
có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơ
quan trong cơ thể. Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũi
họng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam
và các quốc gia đang phát triển trong khu vực. Trong đó, ung thư CTC đứng thứ
2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ở
Việt Nam [1], [9]. Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thư
phổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng ở
các nước vùng Đông nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56].
Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán,
thói quen và môi trường sống. Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quan
chặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, các
gốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiến
triển ung thư. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyên
nhân gây ra hai loại ung thư này ở người. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện
diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư
cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9].
Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư
VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạn
của bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong quá trình
sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
