Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính Gelatinaza và Xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực vườn Bách Thảo - Hà Nội

1

VIN KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM
VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT

NGUYN VN BC

Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản
một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza
v xenlulaza gặp trong môi trờng đất
khu vực vờn bách thảo - H Nội

LUN VN THC S SINH HC
Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc
Mó s:
60 42 40

Ngi hng dn : TS. Li Vn Hũa

H Ni - 2012

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn




2

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng
tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lại Văn Hòa. Các số liệu và

kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực có
nguồn gốc rõ ràng.
Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Bắc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3

MụC LụC
ặt vấn đề.................................................................................................................
Chơng 1: Tổng quan tài liệu ......................................................................

1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới........................................................
1.2. Tính đa dạng của vi nấm................................................................
1.3. Vi nấm trong đất............................................................................
1.4. Vai trò của vi nấm trong công nghiệp ...........................................
1.5. Đặc tính đặc trng của vi nấm.......................................................
1.6. Hệ thống phân loại vi nấm.............................................................
1.6.1. Hệ thống phân loại của Robert Shaffer (1969)...........................
1.6.2. Hệ thống của Ainsworth & Bisby (1995)...................................
1.7. Những vấn đề chung về cơ chế sinh hoá và sự phá huỷ sinh học
do vi nấm gây nên.........................................................................
1.7.1. Đặc điểm phá huỷ sinh học do vi nấm .......................................
1.7.2. Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực của sợi nấm - các loại
enzym và các axít hữu cơ .............................................................

1.8. Các phơng pháp bảo quản vi nấm................................................
1.8.1. Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển ......................
1.8.2. Nhóm phơng pháp làm khô ......................................................
1.8.3. Nhóm phơng pháp làm đình chỉ trao đổi chất ..........................
1.9. Lựa chọn các phơng pháp bảo quản ............................................
1.10. Những nghiên cứu về phân loại và bảo quản vi nấm ở Việt Nam....
Chơng 2: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu .........

2.1. Đối tợng nghiên cứu ....................................................................
2.2. Vật liệu nghiên cứu........................................................................
2.2.1. Dụng cụ, thit b .........................................................................
2.2.2. Môi trờng nuôi cấy ...................................................................
2.2.3. Hoá chất và các cơ chất sinh học................................................
2.3. Phơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu.............................................
2.3.1. Phơng pháp lấy mẫu .................................................................
2.3.2. Phơng pháp phân lập.................................................................
2.3.3. Phơng pháp phân loại vi nấm ...................................................

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn



1
3
3
4
5
7
8
9

9
10
12
12
13
16
19
20
22
25
26
28
28
28
28
29
29
30
30
30
30


4

2.3.4. Phơng pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi nấm
2.3.5. Phơng pháp bảo quản các chủng nấm sợi.................................
2.3.6. Phơng pháp phục hồi ................................................................
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu.....................................................................

3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng
đất khu vực vờn Bách Thảo ........................................................
3.1.1. Thnh phn chng loi vi nấm trong đất vờn Bách Thảo .........
3.1.2. Đặc điểm phân loại hình thái của các chi vi nấm phân lập đợc
3.2. Lựa chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân hủy cơ
chất gelatin và xenluloza phân lập từ môi trờng khu vực vờn
Bách Thảo đa vào bảo quản........................................................
3.3. Kết quả phục hồi của các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân
lập từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Hà Nội sau khi
bảo quản trong glyxerin 10%, -200C và trên silicagel .................
3.4. Khả sinh enzym phân huỷ cơ chất sinh học của các chủng nấm sợi
phân lập đợc từ môi trờng đất vờn Bách Thảo sau bảo quản 18
tháng..............................................................................................
Chơng 4: Bàn Luận ...........................................................................................

4.1. Phân lập, phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực
vờn Bách Thảo ............................................................................
4.2. Lựa chọn các chủng vi nấm có hoạt tính enzym phân huỷ 2 cơ
chất sinh học (xenluloza, gelatin) để đa vào bảo quản...............
4.3. Bảo quản các chủng vi nấm có hoạt tính enzym đã đợc chọn bằng
hai phơng pháp: lạnh sâu (glyxerin 10% ở -200C) và trên silicagel.
4.4. Khả năng sinh enzym phân huỷ các cơ chắt sinh học của các
chủng nấm sợi phục hồi sau bảo quản..........................................
Chơng 5: Kết luận và kiến nghị................................................................
TàI LIệU THAM KHảO ...........................................................................................

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn

33
34
35
36
36
36
40

57

59

66
73
73
75
76
77
79
81


5

C¸c ch÷ viÕt t¾t

ATCC

American Type Culture Colletion

CCRC

Culture Collection Research Center

IMI

International Mycological Institute

LS

Lạnh sâu

SLC

Silicagel

TBQ

Trước bảo quản

SBQG

Sau bảo quản glyxerin

SBQS

Sau bảo quản Silicagel

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1

Đặt vấn đề
Nm (Fungi) là mt gii sinh vt ph bin trong t nhiờn. Chúng có thể
sinh trởng và phát triển ở khắp mọi nơi, trên mọi loại cơ chất với tốc độ phát
triển nhanh, mạnh. Đa phn cỏc nm u khụng th nhỡn thy c bng mt
thng, chỳng sng phn ln trong t, cht mựn, xỏc sinh vt cht, cng sinh
hoc kớ sinh trờn c th ng thc vt v nm khỏc. Mt s loi nm cú th nhn
thy c khi dng th qu, nh nm ln v nm mc.
Ngi ta c tớnh gii nm cú khong 1,5 triu loi, khong 70.000 loi
nm ó c cỏc nh phõn loi hc phỏt hin v miờu t, tuy nhiờn tớnh a dng
ca gii Nm vn cũn l iu bớ n [29]. Cỏc loi nm hoi sinh úng vai trũ
quan trng trong chu trỡnh tun hon vt cht v nng lng trong t nhiờn. Nm
cú th phõn gii cỏc cht hu c phc tp thnh cỏc cht n gin, c bit l cỏc
cht khú phõn gii nh xenluloza, ligin thnh cht vụ c. Do ú, nú l yu t
quan trng lm tng phỡ nhiờu ca t. Nm cú ý ngha rt quan trng trong
i sng ca con ngi, chỳng cú vai trũ thc tin trong kinh t, khoa hc v cỏc
chu trỡnh vt cht, nng lng trong t nhiờn [30]. Nhiu loi nm c s dng
trong cụng ngh thc phm, s dng lm thc n hoc cỏc sn phm ca quỏ trỡnh
lờn men... Tuy nhiờn, bờn cnh nhng li ớch to ln ú, nhiu loi nm li gõy bnh
cho ngi, ng thc vt [32]. ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v khu h vi nm
trong mụi trng khụng khớ t nhiờn, trờn cỏc sn phm cụng-nụng nghip khỏc
nhau, trong dc phm, trong t,... nhng vi s lng cha nhiu.

nc ta, khớ hu nhit i m rt thớch hp cho s phỏt trin ca nhiu
loi vi nm, chỳng phong phỳ c v s lng v thnh phn chng loi. gúp
phn kho sỏt s a dng v thnh phn chng loi, c tớnh sinh hc v tỡm
kim cỏc chng vi nm mi cha c phỏt hin Vit Nam núi chung v mụi
trng t núi riờng, trong lun vn ny chúng tôi tin hnh Nghiên cứu phân
lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và
xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vực Vờn Bỏch tho-H Ni.

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn




2

Mc tiờu ca chỳng tụi a ra l:
1. Phõn lp, phõn loi mt s chng nm si cú hot tớnh gelainaza v
xenlulaza gp trong mụi trng t khu vc Vn Bỏch tho-H Ni
2. Bảo quản các chủng vi nấm đã phân lập đợc bằng một số phơng pháp
bảo quản hiện nay
3. Góp phần xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym
phục vụ cho các nghiên cứu và vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống chuẩn
Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu

1. Phân lập các chủng nấm sợi từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo
2. Phân loại xác định đến chi, loài các chủng nấm sợi đã phân lập đợc.
3. Xác định hoạt tính enzym phân huỷ một số cơ chất sinh học nh
gelatin, xenluloza của các chủng nấm sợi đã phân lập và phân loại.

4. Bảo quản các loài nấm sợi có hoạt tính enzym cao bằng phơng pháp
silicagel và bảo quản trong glyxerin 10% ở nhiệt độ -200C.
5. Phục hồi các chủng vi nấm đã bảo quản sau 18 tháng, kiểm tra độ
thuần khiết, độ sống sót, độ ổn định về hình thái và khả năng sinh enzym
phân huỷ cơ chất sinh học của chúng.
6. Xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ
cho các nghiên cứu và góp phần vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống
chuẩn Việt Nam.

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn




3

Chơng 1
Tổng quan ti liệu

1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới

Trớc đây, nấm đợc xếp vào một ngành (Mycota) của dới giới thực
vật bậc thấp. Hiện nay nấm không còn đợc xem là một ngành của dới giới
thực vật bậc thấp, mà nấm là một giới riêng biệt trong thế giới sinh vật. Theo
Takhtajan (1973): Không có cơ sở nào đáng kể để xếp nấm vào thực vật. Vi
nấm có hàng loạt các đặc điểm riêng biệt sau õy:
- Dinh dỡng: Nấm không dinh dỡng theo kiểu quang hợp nh thực
vật hoặc bằng kiểu nuốt thức ăn nh động vật. Nấm dị dỡng bằng cách hấp
thụ hay thẩm thấu. Nấm hấp phụ các chất dinh dỡng bằng cách tiết ra ngoài
môi trờng cỏc enzym để phân giải các chất có cấu trúc phức tạp thành nhng

chất có cấu trúc đơn giản sau đó hấp phụ qua màng.
- Cấu trúc tế bào: Các nấm thật (Eumycota) có thành phần hoá học của
vách tế bào là kitin (thực vật có vách tế bào là xenluloza).
- Sinh hoá: Chất dự trữ của nấm là glycogen giống nh ở động vật cũn
thực vật có chất dự trữ là tinh bột. Ngoài ra, nấm còn hình thành các sản phẩm
giống với động vật nh các axớt amin.
- Phơng thức sống: Nấm dị dỡng bằng cách hấp thụ, động vật dị
dỡng bằng cách nuốt thức ăn, thực vật dị dỡng bằng cách quang hợp.
- Cá thể phát sinh: Trong quá trình phát triển cá thể các nấm tiến hoá
cao thì có giai đoạn song hạch ( nm tỳi và nm m), giai đoạn song hạch
không có ở các sinh vật khác.
- Cơ thể dinh dỡng: Sợi phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm, nhng
thực vật có cơ thể dinh dỡng dạng cây có rễ, thân, lá.
- Sinh sản: Nấm sinh sản và phát tán bằng bào tử.

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn




4

Nhờ những thành tựu nghiên cứu v cấu trúc nhân, màng tế bào, ty thể,
cấu trúc phân tử ARN riboxom; thành phần sinh hoá; phơng thức dinh
dỡng thì gianh giới giữa động vật và thực vật bị mờ đi, mà rõ nét là gianh
giới giữa sinh vật không nhân và sinh vật có nhân.
Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau về việc xếp các ngành nấm
vào các giới sinh vật. Theo hệ thống 5 giới của Whittaker (1978) thì các ngành
nấm đợc xếp vào 2 giới khác nhau: Các ngành nấm nhầy tế bào
(Acrasiomycota), nấm nhầy thật (Myxomycota), nấm trứng (Oomycota) và

nấm cổ (Chytridiomycota) đợc xếp vào giới Protoctista; các ngành nấm tiếp
hợp (Zygomycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota), nấm bất
toàn (Deuteromycota) và địa y (Lichenomycota) đợc xếp vào giới nấm. Theo
Whittaker giới nấm chỉ gồm 2 ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota) và ngành
nấm thật (Eumycota), trong dó ngành nấm thật bao gồm 4 phân ngành: nấm
túi

(Ascomycotina),

nấm

đảm

(Basidiomycotina),

nấm

bất

toàn

(Deuteromycotina) và địa y ( Lichenes).
Ngoài ra còn có một số hệ thống khác nh hệ thống 6 giới của Lucile
Mc Cook (năm 2004), hệ thống 7 giới của Bryce Kendrick (2001).
1.2. Tính đa dạng của vi nấm

Vi nấm có khả năng phát triển ở hầu hết các dạng sinh thái, có thể sử
dụng hầu hết các sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm do con ngời làm ra.
Chúng là sinh vật đầu tiên và lý tởng sinh trởng ở vùng hoang dã, vì chúng
có khả năng thay đổi để thích nghi với điều kiện sống. Ví dụ, các loài của chi

Aureobasidium có thể sinh trởng ở nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) trên
các hòn đá ở nhiệt độ từ -100 đến -200, có thể chống chịu ở nhiệt độ thấp từ 700C đến -800C. Nhng chi này cũng có những loài có thể sinh trởng ở vùng
nhiệt đới. Phần lớn các vi nấm là hiếu khí và sinh trởng ở mụi trng cú hoạt
độ nớc cao. Nhng ngời ta đã phát hiện đợc vi nấm kỵ khí ở dạ cỏ của cừu
(Yarlett và CS, 1986) và cũng đã phát hiện đợc nhiều loài sinh trởng đợc ở

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn




5

các cơ chất có hoạt độ nớc thấp (aw <1). Mt nhúm loi nm mc c trng,
ỏng chỳ ý l nhúm loi nm mc a khụ, gm cỏc loi cú kh nng tng
trng trờn sn phm cú hot nc thp, chỳng phỏt trin c trong cỏc
iu kin mụi trng khụ lnh, trờn cỏc sn phm sy khụ, cụ c hoc p
mui, p ng. Nhúm loi nm mc c trng ny gm mt s loi thuc
cỏc chi Nm bt ton ( Deuteromycotina, Fungi imperfecti) nh Aspergillus,
Chrysosporium, Cladosporium,... v Nm tỳi nh Eurotium, Eremascus,...
Cỏc loi A. Restrictus, E. Rubrum, E. Amstelodami, Wallemia sebi,...gp c
cỏc phũng bo qun cú nhit 16 10C v m tng i ca khụng khớ
70 2% [1]. Năm 1991, Viện nấm quốc tế (IMI) đã đa ra danh sách các vật
chủ và cơ chất có thể phân lập nấm. Chúng ta có thể phân lập nấm sống ký
sinh, cộng sinh hoặc gây bệnh cho tảo, rêu, thực vật và các loài nấm khác (bao
gồm cả địa y), động vật chân đốt, các động vật không xơng sống và có xơng
sống. Không khí, đất, nớc, phân, thức ăn, các sản phẩm thực vật, dầu khí và
mt s dợc phẩm cũng là nguồn phân lập c vi nấm.
1.3. Vi nấm trong đất

Vi nấm là thành phần nhiều nhất trong sinh khối của hệ vi sinh vật
trong đất, mặc dù số lợng của chúng trong các đĩa môi trờng pha loãng khi
phân lập thấp hơn vi khuẩn. Nm cú ý ngha rt quan trng trong i sng ca
con ngi, chỳng cú vai trũ thc tin trong nn kinh t, khoa hc v cỏc chu
trỡnh vt cht, nng lng trong t nhiờn. Vi nấm là vi sinh vật gây mục nát
chính trong đất, đặc biệt là đất rừng, chỳng phõn gii cỏc cht hu c, cỏc
cnh lỏ khụ ca thc vt thnh cht mựn, cht khoỏng. Nó tham gia phân huỷ
xenluloza, kitin và licnin trong lớp đất bề mặt, do ú l yu t quan trng lm
tng phỡ nhiờu ca t. Nấm đất bao gồm các loài thuộc lớp: Zygomycetes,
Ascomycetes, Deutermycetes, Basidiomycetes và một vài loài thuộc họ
Pythiaceae của lớp Oomycetes. Hầu hết chúng sống hoại sinh, một số sống ký

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not

read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....